Summary
Uyku yoksunluğu, uyku fonksiyonunu ve düzenlemesini araştırmak için güçlü bir araçtır. Uyku Nullifiye Aparatı'nı kullanarak Drosophila'yı uykudan yoksun bırakmak ve yoksunluğun neden olduğu ribaund uykusunun kapsamını belirlemek için bir protokol açıklıyoruz.
Abstract
Uyku homeostazisi, uyku kaybının ardından gözlenen uykudaki artış, hayvanlar alemi boyunca uykuyu tanımlamak için kullanılan belirleyici kriterlerden biridir. Sonuç olarak, uyku yoksunluğu ve uyku kısıtlaması, uyku işlevi hakkında fikir vermek için yaygın olarak kullanılan güçlü araçlardır. Bununla birlikte, uyku yoksunluğu deneyleri, yoksunluk uyaranının fizyoloji ve davranışta gözlenen değişikliklerin nedeni olabileceği için doğası gereği sorunludur. Buna göre, başarılı uyku yoksunluğu teknikleri hayvanları uyanık tutmalı ve ideal olarak, çok sayıda istenmeyen sonuç doğurmadan sağlam bir uyku ribaundu ile sonuçlanmalıdır. Burada, Drosophila melanogasteriçin bir uyku yoksunluğu tekniğini tarif ediyoruz. Uyku Nullifiye Aparatı (SNAP), negatif jeotaksisi teşvik etmek için her 10'da bir uyaran uygular. Uyaran öngörülebilir olsa da, SNAP, yüksek uyku sürücüsüne sahip sineklerde bile gece uykusunun% 95'> etkili bir şekilde önler. Daha da önemlisi, sonraki homeostatik yanıt, el yoksunluğu kullanılarak elde edilene çok benzer. Uyaranların zamanlaması ve aralığı, uyku kaybını en aza indirmek ve böylece uyaranın fizyoloji ve davranış üzerindeki spesifik olmayan etkilerini incelemek için değiştirilebilir. SNAP, uyku kısıtlaması ve uyarılma eşiklerini değerlendirmek için de kullanılabilir. SNAP, uyku işlevini daha iyi anlamak için kullanılabilecek güçlü bir uyku bozulması tekniğidir.
Introduction
Uyku hayvanlarda evrensele yakındır, ancak işlevi belirsizliğini korumaktadır. Uyku homeostazisi, uyku yoksunluğundan sonra uykudaki telafi edici artış, bir dizi hayvanda uyku durumlarını karakterize etmek için kullanılan uykunun belirleyici bir özelliğidir1, 2,3,4,5.
Sinekte uyku, uyku kaybına sağlam bir homeostatik yanıt da dahil olmak üzere insan uykusu ile birçok benzerliğe sahiptir4,5. Sinekte çok sayıda uyku çalışması, hem uzun uyanmadan tahakkuk eden olumsuz sonuçları inceleyerek uyku fonksiyonunu çıkarmak hem de uykunun homeostatik düzenlemesini kontrol eden nörobiyolojik mekanizmaları belirleyerek uyku düzenlemesini anlamak için uyku yoksunluğunu kullanmıştır. Böylece uykusuz sineklerin öğrenme ve hafızada bozukluklar gösterdiği gösterilmiştir6,7,8,9,10,11,12, yapısal plastisite13,14,15, görsel dikkat16, nöronal yaralanmadan iyileşme17,18, çiftleşme ve agresif davranışlar19, 20, hücre çoğalması21ve oksidatif strese yanıtlar22,23 birkaç isim. Ayrıca, rebound uykuyu kontrol eden nörobiyolojik mekanizmalar üzerine yapılan araştırmalar, uyku homeostat 8 , 9 , 23 , 24,25,26,27,28,29'ı oluşturan nöronal makineler hakkında kritik içgörüler sağladı. . Son olarak, sağlıklı hayvanlarda uyku işlevine dair temel içgörüleri ortaya çıkarmanın yanı sıra, uyku yoksunluğu çalışmaları da hastalıklı durumlarda uyku fonksiyonu hakkında içgörüleri bilgilendirmiş30,31.
Uyku yoksunluğu inkar edilemez derecede güçlü bir araç olsa da, herhangi bir uyku yoksunluğu deneyi ile, genişletilmiş uyanmadan kaynaklanan fenotipleri, hayvanı uyanık tutmak için kullanılan uyaranın neden olduğulardan ayırt etmek önemlidir. El yoksunluğu veya nazik kullanım ile uyku yoksunluğu, genellikle minimal bozucu uyku yoksunluğu için standardı belirlemek olarak kabul edilir. Burada, Uyku Nulllaştırma Aparatı'nı (SNAP) kullanarak sinekleri uykudan yoksun bırakmak için bir protokol açıklıyoruz. SNAP, her 10'larda bir sineklere mekanik bir uyaran sağlayan, negatif jeotaksiyi indükle ederek sinekleri uyanık tutan bir cihazdır (Şekil 1). SNAP, yüksek uyku sürücüsüne sahip sineklerde bile gece uykusunun% >98'inden verimli bir şekilde mahrum eder8,32. SNAP patlamaya duyarlı sineklerde kalibre edilmiştir, SNAP'teki sineklerin ajitasyonu sineklere zarar vermez; SNAP ile uyku yoksunluğu, el yoksunluğu ile elde edilenle karşılaştırılabilir bir ribaund sağlar7. Snap böylece uyandırıcı uyaranın etkilerini kontrol ederken sinekleri mahrum bırakmak için sağlam bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Deneysel hazırlık
- Erkek ve dişi sinekleri ayırarak şişelere dökerken sinekleri toplayın.
NOT: Uyku deneyleri genellikle dişi sineklerle yapılır. Bakire dişileri toplamak önemlidir. Çift çift dişiler, verilerin analizini zorlaştıran larvalara yumurtadan çıkan yumurtaları bırakacaktır. - Ev, <20'lik gruplar halinde tek bir cinsiyetin sinekleri.
NOT: Konutlar sosyal olarak zenginleştirilmiş bir ortamda uçar (>50 grupları) uyku sürücüsü6,13 potansiyel olarak şaşırtıcı ribaund uykusu ölçümlerini modüle eder. Ayrıca, sosyal zenginleşmenin ardından, uyku birkaç gün içinde azalacaktır6. Bu nedenle, temel uyku, ribaund uykusunun analizini zorlaştıran kararlı değildir. Sinekleri <20'lik gruplar halinde tutmak bu potansiyel kafa karıştırıcılığı önler. - Sinekleri ışık ve nem kontrollü bir ortamda 3-5 gün boyunca şişelerde tutun.
NOT: Sineklerin yaşı ve olgunluğu uykuyu güçlü bir şekilde etkiler. Uyku bir günlük sineklerde yüksektir ve 3-5 günlük4yaşına kadar stabilize edilir. Sinekler tipik olarak 12 saat ışıkta tutulur: % 50 nemde 12 saat karanlık program.
2. Uyku kaydı için tüplerin hazırlanması
NOT: Uyku, lokomotor aktivite monitörleri kullanılarak izlenir. Bir monitör, 5 mm çapında tüplerde ayrı ayrı barındırılanmış 32 sinek tutabilir. Tipik olarak, genotipler 16 veya 32 sinekli gruplar halinde analiz edilir.
- Bir ucunda sinek yemi olan uygun sayıda tüp hazırlayın.
NOT: Diyet ve metabolizmanın uyku33,34' ü etkilediği bilinmektedir, bu nedenle sinekleri yetiştirildikleri aynı yiyeceğe yerleştirmek özellikle önemlidir. - Tüplerin ucunu balmumu ile kapatın.
NOT: Uyku yoksunluğu ve ribaund beş günlük bir deneydir ve uygun şekilde kapatılmazsa yiyecekler kuruyabilir. Düzgün kapatılmış tüplerde, yiyecekler 10 gün veya daha fazla tutulabilir. Bu nedenle, tüplerin uçlarının iyi kapatıldığından emin olmak önemlidir. Bununla birlikte, sinekler ıslak yiyeceklere de yapışabilir. Böylece, deneyin başlamasından 1-2 gün önce tüplerin yapılmasına yardımcı olur. - Bir aspiratör kullanarak uyku kaydı için 65 mm uzunluğunda cam tüplere tek tek uyku cihazı yerleştirin ve tüplerin ucunun bir köpük durdurucu ile takın.
NOT: Sinekler, uyku kaydı için tüplere yerleştirirken asla CO2 anestezisine tekrar maruz kalmaz. Aspiratör, bir ucu cheesecloth ile kaplı kauçuk borudan yapılır ve 1 mL pipet ucuna yerleştirilir.
3. Uyku kaydı
- Uykuyu izlemek için tüplerdeki sinekleri aktivite monitörlerine yükleyin.
NOT: SNAP kayaçları her ~10 sn'de bir -60° ila +60° arasında ileri geri izler. Monitörler ~5.9s için -60° seviyesinde tutulur; monitörleri tutan tepsinin -60° ila +60° ve ~1 sn'den +60° ila -60° arasında geri hareket etmesi ~2,9 sn sürer. Motora verilen voltaj ayarlanarak çevrim uzunluğu gerektiği gibi değiştirilebilir.- Tüplerin aktivite monitörlerine doğru yönde yerleştirildiklerinden emin olun. Doğru yönde, sineklerin yiyeceğe itilmesini sağlamak için gıda içeren tüpün ucu SNAP'in üst kısmındadır. Ek olarak, yiyecekle ilgili son, uyku kayıt jakı ile monitörün yanındadır. Bu, etkinlik izleyicilerinin aynı anda etkinliği izlerken verimli uyku yoksunluğu için SNAP'te doğru yönlendirilmesini sağlar.
- Uykuyu izlemek için etkinlik monitörlerini kayıt odasına yerleştirin.
- Temel uykuyu tahmin etmek için uykuyu en az iki tam gün izleyin.
NOT: Sineklerin aktivite monitörlerine yüklendiği gün, sineklerin tüplerde barındırılmaya uyum sağlamasına izin vermek için genellikle bir adaptasyon günü olarak hariç tutulur. Temel uyku, sineklerin yüklendiği günü takip eden sabahla başlayarak en az iki tam gün (48 saat) kaydedilir. - Belirli bir günde ışıkların zamanından önceki gün ışıklara kadar 1 dakikalık kutulardaki sineklerin lokomotor aktivite sayılarını etkinlik kayıt yazılımı kullanarak kaydedin (örneğin, 08:00-08:00).
- Bir uyku35için eşik olarak 5 dakikalık hareketsizlik kullanarak özel makrolarla lokomotor etkinlik verilerinden uykuyu tahmin edin.
NOT: Bir dizi uyku ölçümü, lokomotor etkinlik sayılarından hesaplanır. Bunlar arasında 24 saatin üzerinde min / s uyku, 24 saatte toplam uyku süresi, ortalama ve maksimum gündüz ve gece uykusu bout uzunlukları36.
4. Uyku yoksunluğu ve iyileşme
- Sinekler değişken süreler boyunca (örneğin, 12 saat, 24 saat ve 36 saat) uykusuz bırakılabildiğinden ve iyileşme uykusu çeşitli aralıklarla (örneğin, 6 saat, 12 saat, 24 saat ve 48 saat) değerlendirilebildiğinden, deneysel ihtıyatı ile iyileşme süresini belirler. Uyku iyileşmesi, bir uyku kazancı/ kaybı grafiği kullanılarak veya önceden belirlenmiş bir aralıkla (örneğin, 6 saat) kurtarılan yüzde uyku incelenerek görselleştirilebilir.
- Uyku iki temel gün boyunca sabitse, üçüncü gün, gece uykusuzluğu için etkinlik monitörlerini SNAP'e yerleştirin.
NOT: Sinekler, 8 , 32,37,38uyku zamanları aralığında sağlam bir uyku ribaundu sergiler, ancak uykunun ribaund uykuyu güvenilir bir şekilde değerlendirmek için kararlı olması gerekir. Temel günler arasındaki uyku farkı 100 dakika ± olduğunda uyku sabittir. - Etkinlik monitörlerinin monitör tutucu pimleri, monitör kabloları takılı ve arkası gıda ve önde plastik bariyerlerle doğru yönlendirilmiş monitörlerle sabitlendiğini unutmayın (Şekil 1).
NOT: SNAP, kam her 10 sn'de bir dönecek şekilde tasarlanmıştır (Şekil 1). Plastik kesici uç, aparat "yukarı" konumundayken tüpleri geri iterek tüpleri sıfırlar. Tüplerin sıfırlanması, tüm tüplerin her döngünün başında tam hareket aralığına sahip olmasını sağlamak için önemlidir. - Etkinlik monitörlerinin fişini çekin ve gece uykusuzluğundan sonra ışıklar yandıktan hemen sonra monitörleri SNAP'den çıkarın.
NOT: Uyku yoksunluğunun sona erdirilmesi ve sineklerin 12 saat gece uykusuzluğundan sonra ışıklar yansın hemen iyileşmeye yerleştirilmesi kritik öneme sahiptir. Sinekleri iyileşmeye yerleştirmede 20-30 dakikalık bir gecikme bile ribaund uykusunun boyutunu engelleyebilir. - İyileşme uykularını izlemek için sinekleri iki gün (48 saat) rahatsız edilmeyecekleri bir kayıt odasına yerleştirin.
NOT: Kayıt odası diğer deneyler için kullanılıyorsa, geri kazanıcı sinekleri uyarmamak için ekstra özen uygulanmalıdır. - Kaybedilen uyku miktarını hesaplayın. Her bir sinek için, uyku yoksunluğu sırasında elde edilen uyku ile taban çizgisi sırasında ilgili saat arasındaki saatlik farkı hesaplayın; kaybedilen toplam uykuyu hesaplamak için saatlik farkları toplayın.
- Kurtarılan uyku miktarını hesaplayın. Her bir sinek için, kurtarma sırasında elde edilen uyku ile taban çizgisi sırasında ilgili saat arasındaki saatlik farkı hesaplayın; kazanılan toplam uykuyu hesaplamak için saatlik farkları toplayın.
NOT: Bir sineğin gerçekten uykusuz olup olmadığı ampiriktir. Bu nedenle, deneyci kaybedilen uyku yüzdesini incelemelidir. Sinek yeterli miktarda uyku kaybetmediyse, analizden hariç tutulabilir. Bu diğer uyku yoksunluğu yaklaşımları için gerekli olsa da, SNAP için nadiren gereklidir. Daha yaygın olarak, uyku yoksunluğu başlatıl işlemden önce belirli bir sinekte uyku sabit olmayabilir. Uyku stabil değilse, homeostaz hesaplanamaz. Uyku yoksunluğunun başlatılmasından önce hesaplanan maksimum ± 100 dakikalık uyku farkını dahil etme adayı olarak kabul ediyoruz. Bazen, bireysel bir sinek uykusu 24 saat boyunca eşit olmayan bir şekilde dağıtılır (örneğin, bazı bireyler gün boyunca uyku kotalarının% 60-70'ini alabilir ve böylece geceleri 12 saat boyunca yoksun bırakıldığında 24 saat uyku kotalarının sadece küçük bir oranını kaybedebilir). Bu sinekler ayrı ayrı değerlendirilebilir. - Her genotip için kurtarma süresinin 12 h, 24 h ve 48 h üzerinde kurtarılan ortalama uyku yüzdesini (taban çizgisine göre) hesaplayın.
- Uyku verilerinden, taban çizgisi ve her genotip için kurtarma gün ortalama ve maksimum gündüz uyku bout uzunluğunu hesapla.
NOT: Sineklerde ribaund uykusu, iyileşme günlerinde artan uyku miktarı ve artan uyku derinliği ile karakterizedir. Uyku konsolidasyonu, uyku derinliğinin ölçüsü olarak kullanılır. Uyarılma eşikleri uyku derinliğinin bir ölçüsü olarak da kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kanton S (Cs) vahşi tip suş olarak kullanılmıştır. Sinekler 12 saat ışıkta tutuldu: 12 saat karanlık program ve gece boyunca 12 saat uykusuz kaldı. Temel günde Cs sineklerinin uyku profillerinin incelenmesi (bs), uyku yoksunluğu günü (sd) ve iki iyileşme günü (rec1 ve rec2) (Şekil 2A),sineklerin SNAP'te etkili bir şekilde uykusuz kaldığını ve literatürde gözlemlenen raporlarla tutarlı olarak gün içinde iyileştiğini göstermektedir4,5. SNAP'in sinekleri uyanık tutmadaki etkinliği, uyku yoksunluğu sırasında sinekler tarafından sergilenen yüksek aktivitede (300-350 sayım/ saat) de görülür (Şekil 2B). Gerçekten de, uyku yoksunluğu sırasında sineklerin aktivite sayılarını izlemek, yoksunluk protokolünün etkinliğinin yararlı bir barometresi ve / veya dolaylı bir uyku sürüşü ölçüsü olabilir. Uyku yoksunluğu etkisiz olduğunda, sinekler yoksunluk döneminde aktif değildir. Yüksek uyku sürücüsü altında olan sinekler her uyarandan sonra hızla uykuya dalar ve tüpü35kadar geçmez. Hem cihazın eğim açısı hem de düşme hızı, sineklerin zarar vermeden etkili bir şekilde uyanık tutulmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Her laboratuvar yay (Şekil 1B) ve / veya kamın boyutunu ve şeklini ( Şekil1C ve Şekil 1D , sağ ) ayarlayarak açıyı ve hızı optimize edebilir.
Uyku yoksunluğunun ve iyileşmenin etkinliğini nicel olarak tahmin etmek için, yoksunluk sırasında kaybedilen ve daha sonra iyileşme günlerinde yeniden başlatılan uyku her bir sinek için hesaplanmıştır (Şekil 2C). Daha da önemlisi, yoksunluk günü ile temel gün arasında temel uykuda önemli bir değişiklik olmadı (Şekil 2C'de 0-12h'ye bakınız) bu sineklerde uykunun stabil olduğunu gösteren. Bu 12 saatlik dönemde (örneğin, 100 dakika ±) uykudaki büyük bir fark, uykunun sabit olmadığını düşündürür. SNAP, sinekleri gece uykularının% 98'> etkili bir şekilde mahrum etti. Sinekler ilk 12 saat içinde uykularının ~ % 20'sini kurtardı ve daha önce bildirildiği gibi gece boyunca ek uykuyu geri kazanmadı. Bununla birlikte, sinekler ertesi gün uykularını kurtarmaya başladılar, böylece uykularının ~ % 36'sını 48 saat iyileşme üzerinde kurtardılar (Şekil 2D). 48 saat boyunca 30 - 40% iyileşmiş uyku, SNAP kullanılarak yoksun vahşi tip sinekler için oldukça tipiktir.
Uyku homeostazisi, yoksunluğu takip eden iyileşme döneminde hem artan uyku süresi hem de artan uyku derinliği ile karakterizedir. Gündüz uyku konsolidasyonu genellikle uyku derinliğinin okunması olarak kullanılır. Uyku konsolidasyonu, tüm gün boyunca ortalama uyku süresi olarak değerlendirilebilir (Şekil 2E). Bununla birlikte, iyileşme sırasında uyku basıncı dağıldıkça, gün ilerledikçe ortalama uyku bout süresi azalacaktır. Bu nedenle, daha hassas bir ölçüm sağlayabilen maksimum uyku süresindeki değişiklikleri de incelemek sıklıkla yararlıdır (Şekil 2F).
| Uyku Yoksunluğu Yöntemi | Toplam kağıt sayısı | % kağıt / teknik | Ort. |
| ÇIT | 52 | 37.14% | 33 ± 3 |
| Girdap/Rastgele Sallama | 49 | 35.00% | 18 ± 3 |
| El Yoksunluğu | 9 | 6.43% | 36 ± 11 |
| Termogenetik SD | 15 | 10.71% | 36 ± 12 |
| Belirtilme -miş | 15 | 10.71% | 29 ± 10 |
Tablo 1: Literatürde kullanılan farklı uyku yoksunluğu yöntemlerinin incelenmesi. Sadece 116/254 kağıt uyku yoksunluğu kullandı. Her yöntemi kullanan makale sayısı = "Toplam kağıt sayısı". Her yöntemi kullanan kağıtların fraksiyonu = "% kağıt / teknik". Her yöntem için değerlendirilen ortalama iyileşme uzunluğu = "Ort iyileşmesi değerlendirildi". SD - Uyku yoksunluğu. SNAP - Uyku Nulllaştırma Aparatı
| SD Uzunluğu | Toplam çalışmalar |
| < 6 saat | 12 |
| 6 saat | 23 |
| >6 saat ve < 12 saat | 17 |
| 12 saat | 69 |
| >12 saat & <24 saat | 7 |
| 24 saat | 19 |
| > 24 saat | 9 |
| Kronik SD | 4 |
| Herhangi bir SD | 160 |
Tablo 2. Farklı çalışmalarda yapılan uyku yoksunluğunun uzunluğu. SD - Uyku yoksunluğu
Şekil 1. Uyku Nullifying APparatus (SNAP). A)Cihazın ön görünümü. SNAP, iki satırda 8 etkinlik izleyicisi barındırabilir; tutucu pimleri monitörleri yerinde sabitler. Bacaklar, cihazın doğru yönde yerleştirilmesine yardımcı olacak şekilde ayarlanabilir. B)Cihazı ileri geri sallayan motorun ve yayı yakın çekim görünümü. Motor, cihazı "yukarı" konumuna geri eğen ve yayı sıkıştıran bir kam çevirir. Yayı sıkıştırmadan serbest bırakmak, cihazı "aşağı" konumuna geri döndür. C) Sol - Cihazın "aşağı" konumdaki yan görünümü. Tutucu pimleri monitörleri dizginler; monitör kablosu yuvası, monitör kablolarının yerinde tutulmasına sağlar. Pedler, cihazın 'aşağı' konumuna yapışmasının etkisini hafifletmeye yardımcı eder. Sağ - Kameranın yakın görünümü. D) Cihazın "yukarı" konumdaki sol tarafı görünümü. Sağ - Kamın saat yönünün tersine dönmesi, cihazı 'yukarı' konumuna yatırır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Deneysel sonuçlar. A) Deneyin dört günü boyunca Cs'nin uyku alanları uçar: temel gün (bs), uyku yoksunluğu günü (sd) ve iki günlük iyileşme (rec1 ve rec2). B) Uyku yoksunluğu gününde sineklerin ortalama lokomotor aktivitesi sayılır. Sinekler 12-24 saatlerinden yoksun bir şekilde uyudu. C) Uyku yoksunluğu ve iyileşme süresi. Cs sinekleri 12 - 24 saatlerinden yoksun bir şekilde uyudu ve 24 - 72 saatinden iyileşmesine izin verildi. SNAP, 48 saat (> n = 12 sinek, zaman için Tekrarlanan Önlemler ANOVA, F [70,1470] =12,97, s < 10-15)üzerindekısmen kurtarılan% 98 uykudan etkili bir şekilde yoksundu. D) Uyku yüzdesi 48 saat üzerinde kurtarıldı. Sinekler uykularının ~%20'sini 12 saatin üzerinde, uykularının ise ~%36'sını 48 saatin üzerinde kurtardılar. Uyku, ilk iyileşme gününde taban çizgisine kıyasla daha konsolidedir (p <0.05, t-test). F) Deney gününün her günü için gün içinde maksimum uyku süresi ile ölçülen uyku konsolidasyonu. Uyku, ilk iyileşme gününde taban çizgisine kıyasla daha konsolidedir (p <0.05, t-test). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila'da uyku bağımsız olarak 2000 yılında, iki grup tarafından karakterize edildi4,5. Bu öncü çalışmalarda sinekler nazik bir şekilde ele alarak uykudan mahrum bırakıldı (yani el yoksunluğu) ve gece uykusuzluğuna karşı sağlam bir homeostatik tepki sergiledikleri gösterilmiştir. Daha da önemlisi, herhangi bir uyku yoksunluğu deneyi ile, hayvanı uyanık tutmak için kullanılan yöntemin potansiyel şaşırtıcı etkilerini kontrol etmek çok önemlidir. El yoksunluğu çalışmaları, sinek homeostazı çalışmalarının kriterlerini, sinekleri yoksun bırakmanın minimal bozucu bir aracı olarak belirlemektedir. SNAP, sinekleri gece uykusunun% >98'inden verimli bir şekilde mahrum eder ve önemli ölçüde el yoksunluğu4,7ile elde edilenle karşılaştırılabilir bir uyku ribaundu sağlar.
Sineklerde uykuyu tanımlayan temel çalışmalardan bu yana, sineklerde uyku homeostazını yüksek verimle değerlendirmek için bir dizi yöntem geliştirilmiştir 7,9,39,40,41. Sineklerde uyku hakkında ~ 250 makaleyi araştırdık ve yayınlanan bu makalelerin ~ % 46'sının uyku düzenlemesini veya işlevini değerlendirmek için uyku yoksunluğu kullandığını bildirdi (Tablo 1). Bir dizi farklı yöntem, sineklerde bir uyku ribaundu etkili bir şekilde indükledi. İlginçtir ki, uyku geri tepmesini değerlendiren çalışmalarda, uyku yoksunluğu ve uyku ribaundu için kullanılan protokoller farklılık gösterdi. Özellikle, hem uyku yoksunluğu süresi (Tablo 2) hem de geri tepmenin değerlendirildiği süre (Tablo 1) önemli ölçüde değişti ve farklı protokollerle elde edilen sonuçların karşılaştırmalarını potansiyel olarak karmaşık hale geldi. Sineklerde uyku geri tepmesi, uyku yoksunluğunu takiben 48 saate kadar devam ettiği bilinmektedir5. Buna göre, belirli bir uyku manipülasyonunun homeostaz üzerindeki etkilerinin kapsamlı bir açıklamasının en iyi 48 h iyileşme süresi boyunca homeostatik ribaund değerlendirildiğinde elde edildiğini düşünüyoruz.
Gün boyunca sinekleri uykudan mahrum etmenin uyku sürücüsünü sürekli olarak artırmadığını belirtmek önemlidir4. Bu nedenle, ışıklar açıkken 24 saat uyku yoksunluğu protokolü başlatmak ve ertesi güne kadar devam etmek, ışıklar kapalı başlayan 12 saatlik uyku yoksunluğu protokolüne kıyasla iyileşme uykuyu artırmaz. Aslında, hesaplanan uyku ribaundu daha düşük olabilir, çünkü gece uykusuna ek olarak homeostatik olarak düzenlenmemiş gündüz uykusu içerecektir. Gündüz uykusu yoksunluğunun homeostatik bir geri tepmeye neden olmadığı gözlemi, ancak uyku yoksunluğu yönteminin potansiyel şaşırtıcı etkilerini kontrol etmek için kullanılabilir. Bu nedenle, SNAP'te bir gecede uykusuz kalan sinekler, gündüz benzer bir uyaran alan sineklerle karşılaştırılmıştır7.
Toplam uyku yoksunluğu için kullanılmaya ek olarak, uyaranın sıklığını değiştirerek, SNAP ayrıca uyku7,42'yikronik olarak kısıtlamak ve parçalamak için de kullanılabilir, böylece insanlarda kronik uyku kaybı koşullarını taklit edebilir. Ayrıca, sıklığı artırma adımlarında uyaranlar sağlayarak, SNAP uyarılma eşiklerini ölçmek için de kullanılabilir8. Snap böylece sineklerin uykuyu etkili bir şekilde mahrum etmenin ve kısıtlamanın, homeostatik yanıtı değerlendirmenin ve diğer uyku özelliklerini ölçmenin facile bir yoludur.
SNAP standart bir laboratuvar sinek inkübatörüne sığabilir, ancak inkübatördeki deneyin bir parçası olmayan sinekleri kesinlikle rahatsız edecektir. Neyse ki, SNAP, devam eden diğer deneyleri rahatsız etmeden sinekleri mahrum bırakmak için izole bir yere yerlenebilir. İyileşme uykusu kırılgan olduğundan, iyileşme uykusunun sessiz bir yerde gerçekleşmesini sağlamaya özen edilmelidir.
Sineklerde uykuyu iyileştirmek için uyku yoksunluğu, genetik ve farmakolojik araçlarla ilgili tamamlayıcı çalışmalar geliştirilmiştir8,43,44. Bu nedenle, uykuyu çift yönlü olarak kolayca modüle etme yeteneği, sinek uykusu araştırmalarının uyku düzenlemesi ve işlevi hakkında derin içgörüler sağlamaya devam etmesine izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH tarafından PJS'ye 5R01NS051305-14 ve 5R01NS076980-08 hibeleri ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Locomotor activity tubes | |||
| Fisher Tissue Prep Wax | Thermo Fisher | 13404-122 | Wax used for sealing tubes |
| Glass tubes | Wale Apparatus | 244050 | We cut 5mm diameter Pyrex glass tubes into 65mm long tubes to record sleep. Pre-cut tubes can also be purchased. |
| Nutri Fly Bloomington Formulation fly food | Genesee Scientific | 66-113 | Labs might use their own fly food recipe. It is important that sleep be recorded on the same food that flies were reared in. |
| Rotary glass cutting tool | Dremel Multi Pro | 395 | Used to cut 65mm long glass tubes |
| Monitoring Sleep | |||
| DAM System and DAMFileScan software | Trikinetics | Software used to acquire data from DAM monitors and save the acquired data in an appropriate format | |
| Data acquisition computer | Lenovo | Idea Centre AIO3 | A equivalent computer from any manufacturer can substitute |
| Drosophila Activity Monitors | Trikinetics | DAM2 | These monitors are used to record flies' locomotor activity |
| Environment Monitor | Trikinetics | DEnM | Not essential, but an easy way to monitor environmental conditions in the chamber where sleep is recorded |
| Light Controller | Trikinetics | LC4 | A convenient way to control the timing of when the SNAP is turned on and off |
| Power Supply Interface Unit for DAM | Trikinetics | PSIU-9 | Required for data acquisition computers to record Trikinetics locomotor acitvity data |
| RJ11 connector | 7001-64PC | Multicomp | DAM monitors accept RJ11 jacks |
| Splitters | Trikinetics | SPLT5 | Used to connect upto 5 DAM monitors |
| Telephone cable wire | Radioshack | 278-367 | Phone cables to acquire data from DAM monitors |
| Sleep Deprivation | |||
| Power supply | Gw INSTEK | GPS-30300 | Power supply for the SNAP |
| Sleep Nullifying Apparatus | Washington University School of Medicine machine shop |
References
- Nath, R. D., et al. The Jellyfish Cassiopea Exhibits a Sleep-like State. Current Biology. 27 (19), 2984-2990 (2017).
- Vorster, A. P., Krishnan, H. C., Cirelli, C., Lyons, L. C.
- Zhdanova, I. V., Wang, S. Y., Leclair, O. U., Danilova, N. P.
- Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
- Ganguly-Fitzgerald, I., Donlea, J., Shaw, P. J. Waking experience affects sleep need in Drosophila. Science. 313 (5794), 1775-1781 (2006).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Vine, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. D1 receptor activation in the mushroom bodies rescues sleep-loss-induced learning impairments in Drosophila. Current Biology. 18 (15), 1110-1117 (2008).
- Donlea, J. M., Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Inducing sleep by remote control facilitates memory consolidation in Drosophila. Science. 332 (6037), 1571-1576 (2011).
- Seidner, G., et al. Identification of Neurons with a Privileged Role in Sleep Homeostasis in Drosophila melanogaster. Current Biology. 25 (22), 2928-2938 (2015).
- Li, X., Yu, F., Guo, A. Sleep deprivation specifically impairs short-term olfactory memory in Drosophila. Sleep. 32 (11), 1417-1424 (2009).
- Melnattur, K., et al. A conserved role for sleep in supporting Spatial Learning in Drosophila. Sleep. , 197 (2020).
- Seugnet, L., Suzuki, Y., Donlea, J. M., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Sleep deprivation during early-adult development results in long-lasting learning deficits in adult Drosophila. Sleep. 34 (2), 137-146 (2011).
- Donlea, J. M., Ramanan, N., Shaw, P. J. Use-dependent plasticity in clock neurons regulates sleep need in Drosophila. Science. 324 (5923), 105-108 (2009).
- Bushey, D., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila. Science. 332 (6037), 1576-1581 (2011).
- Huang, S., Piao, C., Beuschel, C. B., Götz, T., Sigrist, S. J. Presynaptic Active Zone Plasticity Encodes Sleep Need in Drosophila. Current Biology. 30 (6), 1077-1091 (2020).
- Kirszenblat, L., et al. Sleep regulates visual selective attention in Drosophila. Journal of Experimental Biology. 221, Pt 24 (2018).
- Singh, P., Donlea, J. M. Bidirectional Regulation of Sleep and Synapse Pruning after Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1063-1076 (2020).
- Stanhope, B. A., Jaggard, J. B., Gratton, M., Brown, E. B., Keene, A. C. Sleep Regulates Glial Plasticity and Expression of the Engulfment Receptor Draper Following Neural Injury. Current Biology. 30 (6), 1092-1101 (2020).
- Kayser, M. S., Yue, Z., Sehgal, A. A critical period of sleep for development of courtship circuitry and behavior in Drosophila. Science. 344 (6181), 269-274 (2014).
- Kayser, M. S., Mainwaring, B., Yue, Z., Sehgal, A. Sleep deprivation suppresses aggression in Drosophila. Elife. 4, 07643 (2015).
- Szuperak, M., et al. A sleep state in Drosophila larvae required for neural stem cell proliferation. Elife. 7, (2018).
- Vaccaro, A., et al. Sleep Loss Can Cause Death through Accumulation of Reactive Oxygen Species in the Gut. Cell. 181 (6), 1307-1328 (2020).
- Kempf, A., Song, S. M., Talbot, C. B., Miesenböck, G. A potassium channel β-subunit couples mitochondrial electron transport to sleep. Nature. 568 (7751), 230-234 (2019).
- Donlea, J. M., Pimentel, D., Miesenböck, G. Neuronal machinery of sleep homeostasis in Drosophila. Neuron. 81 (4), 860-872 (2014).
- Liu, S., Liu, Q., Tabuchi, M., Wu, M. N. Sleep Drive Is Encoded by Neural Plastic Changes in a Dedicated Circuit. Cell. 165 (6), 1347-1360 (2016).
- Pimentel, D., et al. Operation of a homeostatic sleep switch. Nature. 536 (7616), 333-337 (2016).
- Sitaraman, D., et al. Propagation of Homeostatic Sleep Signals by Segregated Synaptic Microcircuits of the Drosophila Mushroom Body. Current Biology. 25 (22), 2915-2927 (2015).
- Foltenyi, K., Greenspan, R. J., Newport, J. W. Activation of EGFR and ERK by rhomboid signaling regulates the consolidation and maintenance of sleep in Drosophila. Nature Neuroscience. 10 (9), 1160-1167 (2007).
- Seugnet, L., et al. Notch signaling modulates sleep homeostasis and learning after sleep deprivation in Drosophila. Current Biology. 21 (10), 835-840 (2011).
- Seugnet, L., Galvin, J. E., Suzuki, Y., Gottschalk, L., Shaw, P. J. Persistent short-term memory defects following sleep deprivation in a Drosophila model of Parkinson disease. Sleep. 32 (8), 984-992 (2009).
- Tabuchi, M., et al. Sleep interacts with aβ to modulate intrinsic neuronal excitability. Current Biology. 25 (6), 702-712 (2015).
- Melnattur, K., Zhang, B., Shaw, P. J. Disrupting flight increases sleep and identifies a novel sleep-promoting pathway in Drosophila. Science Advances. 6 (19), 2166 (2020).
- Thimgan, M. S., Suzuki, Y., Seugnet, L., Gottschalk, L., Shaw, P. J. The perilipin homologue, lipid storage droplet 2, regulates sleep homeostasis and prevents learning impairments following sleep loss. PLOS Biology. 8 (8), (2010).
- Keene, A. C., et al. Clock and cycle limit starvation-induced sleep loss in Drosophila. Current Biology. 20 (13), 1209-1215 (2010).
- Shaw, P. J., Tononi, G., Greenspan, R. J., Robinson, D. F. Stress response genes protect against lethal effects of sleep deprivation in Drosophila. Nature. 417 (6886), 287-291 (2002).
- Andretic, R., Shaw, P. J. Essentials of sleep recordings in Drosophila: moving beyond sleep time. Methods Enzymol. 393, 759-772 (2005).
- Seugnet, L., et al. Identifying sleep regulatory genes using a Drosophila model of insomnia. Journal of Neuroscience. 29 (22), 7148-7157 (2009).
- Bushey, D., Huber, R., Tononi, G., Cirelli, C. Drosophila Hyperkinetic mutants have reduced sleep and impaired memory. Journal of Neuroscience. 27 (20), 5384-5393 (2007).
- Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026 (2017).
- Faville, R., Kottler, B., Goodhill, G. J., Shaw, P. J., van Swinderen, B. How deeply does your mutant sleep? Probing arousal to better understand sleep defects in Drosophila. Scientific Reports. 5, 8454 (2015).
- Huber, R., et al.
- Klose, M., Shaw, P. Sleep-drive reprograms clock neuronal identity through CREB-binding protein induced PDFR expression. bioRxiv. , (2019).
- Dissel, S., et al. Sleep restores behavioral plasticity to Drosophila mutants. Current Biology. 25 (10), 1270-1281 (2015).
- Gerstner, J. R., Vanderheyden, W. M., Shaw, P. J., Landry, C. F., Yin, J. C. Fatty-acid binding proteins modulate sleep and enhance long-term memory consolidation in Drosophila. PLoS One. 6 (1), 15890 (2011).
