Summary
Hier werden Methoden zur Untersuchung der funktionellen Wirkung von RYR1-Mutationen beschrieben, die endogen in immortalisierten menschlichen B-Lymphozyten und muskelbiopsiebasierten Satellitenzellen exprimiert werden, die in Myotuben differenziert sind.
Abstract
Mehr als 700 Varianten des RYR1-Gens wurden bei Patienten mit verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen identifiziert, darunter maligne Hyperthermie-Anfälligkeit, Kernmyopathien und zentronukleäre Myopathie. Aufgrund der vielfältigen Phänotypen, die mit RYR1-Mutationen verbunden sind, ist es von grundlegender Bedeutung, ihre funktionellen Wirkungen zu charakterisieren, um Varianten, die von Patienten getragen werden, für zukünftige therapeutische Interventionen zu klassifizieren und nicht-pathogene Varianten zu identifizieren. Viele Labore waren daran interessiert, Methoden zur funktionellen Charakterisierung von RYR1-Mutationen zu entwickeln, die in Patientenzellen exprimiert werden. Dieser Ansatz hat zahlreiche Vorteile, darunter: Mutationen werden endogen exprimiert, RyR1 ist nicht überexprimiert, die Verwendung von heterologen RyR1-exprimierenden Zellen wird vermieden. Da Patienten jedoch neben RYR1 Mutationen in verschiedenen Genen aufweisen können, ist es wichtig, Die Ergebnisse aus biologischem Material von Individuen mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund zu vergleichen. Das vorliegende Manuskript beschreibt Methoden, die entwickelt wurden, um die funktionellen Effekte endogen exprimierter RYR1-Varianten zu untersuchen: (a) Epstein-Barr-Virus immortalisierte menschliche B-Lymphozyten und (b) Satellitenzellen, die aus Muskelbiopsien gewonnen und in Myotuben differenziert wurden. Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration, die durch die Zugabe eines pharmakologischen RyR1-Aktivators ausgelöst werden, werden dann überwacht. Der ausgewählte Zelltyp wird mit einem ratiometrischen fluoreszierenden Calciumindikator beladen und intrazelluläre [Ca2+]Veränderungen werden entweder auf Einzelzellebene durch Fluoreszenzmikroskopie oder in Zellpopulationen mit einem Spektrofluorometer überwacht. Die Ruhedosis-Wirkungskurven [Ca2+]werden dann zwischen Zellen gesunder Kontrollen und Patienten mit RYR1-Varianten verglichen, was zu einem Einblick in die funktionelle Wirkung einer bestimmten Variante führt.
Introduction
Bis heute wurden mehr als 700 RYR1-Varianten in der menschlichen Bevölkerung identifiziert und mit verschiedenen neuromuskulären Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter maligne Hyperthermie-Suszeptibilität (MHS), belastungsinduzierte Rhabdomyolyse, zentrale Kernerkrankung (CCD), Multi-Minicore-Erkrankung (MmD), zentronukleäre Myopathie (CNM)1,2,3 ; Dennoch hinken Studien zur Charakterisierung ihrer funktionellen Effekte hinterher und nur etwa 10% der Mutationen wurden funktionell getestet. Verschiedene experimentelle Ansätze können verwendet werden, um die Auswirkungen einer bestimmten RyR1-Variante zu bewerten, einschließlich der Transfektion von heterologen Zellen wie HEK293 und COS-7-Zellen mit Plasmid, das für die WT und die mutierte RYR1 cDNA4kodiert,5, Transduktion von dyspedischen Mausfibroblasten mit Plasmiden und Vektoren, die für die WT und die mutierte RYR1 cDNA kodieren, gefolgt von Transduktion mit Myo-D und Differenzierung in Myotuben6 , Generierung transgener Tiermodelle mit mutiertem RyR1s7,8,9, Charakterisierung von Zellen von Patienten, die die RYR1-Variante endogen exprimieren10,11,12. Solche Methoden haben dazu beigetragen, festzustellen, wie sich verschiedene Mutationen funktionell auf den RyR1 Ca2+-Kanal auswirken.
Hier werden Methoden beschrieben, die entwickelt wurden, um die funktionellen Effekte von RYR1-Mutationen zu bewerten. Verschiedene Parameter der intrazellulären Calciumhomöostase werden in menschlichen Zellen untersucht, die den RyR1-Calciumkanal endogen exprimieren, einschließlich Myotuben und Epstein Barr Virus (EBV) immortalisierter B-Lymphozyten. Zellen werden von Patienten gewonnen, in Kultur expandiert und mit ratiometrisch fluoreszierenden Calciumindikatoren wie Fura-2 oder Indo-1 beladen. Parameter, von denen berichtet wurde, dass sie aufgrund pathogener RYR1-Mutationen verändert sind, einschließlich der Ruhephase [Ca2+],der Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen pharmakologischen Agonisten und der Größe der intrazellulären Ca2+-Speicher, werden entweder auf Einzelzellebene mittels Fluoreszenzmikroskopie oder in Zellpopulationen mit einem Fluorimeter gemessen. Ergebnisse, die in Zellen von Mutationsträgern erhalten werden, werden dann mit denen verglichen, die von gesunden Mitgliedern der Kontrollfamilie erhalten wurden. Dieser Ansatz hat gezeigt, dass: (i) viele Mutationen im Zusammenhang mit MHS zu einer Zunahme des Ruhezustands[Ca2+]und einer Verschiebung der Dosis-Wirkungs-Kurve nach links entweder zur KCl-induzierten Depolarisation oder zur pharmakologischen RyR1-Aktivierung mit 4-Chlor-m-Kresol10,11,12,13führen ; ii) Mutationen, die mit CCD in Verbindung gebracht werden, führen zu einer Abnahme des Peaks[Ca2+],der durch pharmakologische Aktivierung des RyR1 freigesetzt wird, und zu einer Abnahme der Größe, wenn das intrazelluläreCa2+ 12,13,14,15speichert ; (iii) einige Varianten haben keinen Einfluss auf ca2+ homöostase13. Vorteile dieses experimentellen Ansatzes sind: Das RyR1-Protein ist nicht überexprimiert und physiologische Werte vorhanden, Zellen können verewigt werden (sowohl Muskelzellen als auch B-Lymphozyten), die Zelllinien mit Mutationen liefern. Einige Nachteile beziehen sich auf die Tatsache, dass Patienten Mutationen in mehr als einem Gen tragen können, das für Proteine kodiert, die an der Calciumhomöostase und / oder erregungskontraktionskopplung (ECC) beteiligt sind, und dies kann experimentelle Schlussfolgerungen erschweren. Zum Beispiel wurden zwei JP-45-Varianten in der MHS- und Kontrollpopulation identifiziert und es wurde gezeigt, dass ihre Anwesenheit die Empfindlichkeit des Dihydropyridinrezeptors (DHPR) gegenüber der Aktivierungbeeinflusst 16. Patienten müssen verfügbar sein, biologisches Material muss frisch gesammelt werden und ethische Genehmigungen müssen von den lokalen Ethikkommissionen eingeholt werden.
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Protocol
Die nachfolgend beschriebenen Protokolle entsprechen den Ethikrichtlinien der Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.
1. Herstellung von Epstein Barr immortalisierten B-Lymphozyten-Zelllinien11
- Sammeln Sie nach Einverständniserklärung 30 ml Vollblut in EDTA-behandelten sterilen Röhrchen aus dem Probanden, der eine RYR1-Mutation trägt, und von gesunden Familienmitgliedern ohne Mutation.
HINWEIS: Halten Sie alle Lösungen steril und arbeiten Sie in einer Gewebekulturhaube. - Isolierung mononukleärer Zellen aus Vollblut durch Dichtegradientenzentrifugationsmedien (z. B. Ficoll-Hypaque, 0,077 g/L).
- Geben Sie 30 ml steriles Blut in ein 50 ml konisches steriles Röhrchen.
- Legen Sie die Spitze einer Pasteurpipette, die das Dichtegradientenzentrifugationsmedium enthält, auf den Boden des Röhrchens und schichten Sie 20 ml sterile Dichtegradientenzentrifugationsmedienlösung langsam unter das Blut.
- Zentrifuge für 30 min bei 900 x g bei 18°-20°C, ohne Bruch.
HINWEIS: Die mononukleare Zellschicht erscheint als wolkiger Ring in der Interphase zwischen der Medienschicht der Dichtegradientenzentrifugation und der obersten Schicht, die plättchenangereichertes Plasma enthält.
- Mit einer sterilen Pipette vorsichtig die Interphasenschicht mit mononukleären Zellen (ca. 3-5 ml) entfernen und die Lösung in ein sauberes 50 ml steriles konisches Röhrchen überführen.
- 20 ml Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) in die Spülzellen geben, 10 min bei 600 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren und das Pellet in PBS resuspenieren. Insgesamt dreimal wiederholen; Dadurch wird sichergestellt, dass alle Medien entfernt werden.
- Nach der letzten Wäsche resuspendieren Sie die Zellen in 1-2 ml Gewebekulturmedium (RPMI-Medium ergänzt mit 10% fetalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin und 100 Einheiten Penicillin und Streptomycin). Mononukleäre Zellen (ca. 1 x 106 Zellen) werden in einen T125-Gewebekulturkolben mit 20 ml Gewebekulturmedium gegeben.
- Infizieren Sie mononukleäre Zellen mit dem Epstein-Barr-Virus.
- Verwenden Sie Überstände aus B95.8 Zelllinienkulturen (mit 102-103 Transformationseinheiten/ml bei -80 °C gelagert) als EBV-Quelle.
- Resuspendieren Sie 1 x 106 mononukleäre Zellen aus Schritt 1,5 in 20 ml Gewebekulturmedium und setzen Sie sie 2 mL Überstand aus der B95,8-Zelllinie in Gegenwart von Cyclosporin A (0,2 μg/ml Endkonzentration) zur Infektion aus.
- Stellen Sie den Kolben in einen 37 °C Zellkultur-Inkubator und lassen Sie die Zellen wachsen. Nach einer Woche wechseln Sie das Kulturmedium.
HINWEIS: Sobald sich B-Zellen zu vermehren beginnen, bilden sie erkennbare Klumpen und wachsen schnell, so dass die Kulturen erweitert und eingefroren werden können. - Extrahieren Sie die genomische DNA aus den EBV-immortalisierten B-Lymphozyten-Zelllinien11, um das Vorhandensein oder Fehlen der gegebenen Mutation zu bestätigen.
2. Intrazelluläre Ca2+ Messungen
ANMERKUNG: Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration der EBV-transformierten B-Lymphozytenzelllinien können in Zellpopulationen mit einem Spektrofluorometer mit Magnetrührer und Küvettenhalter auf 37 °C überwacht werden. Alternativ könnenCa2+-Veränderungen in einzelnen Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie überwacht werden. In beiden Fällen werden Zellen aus dem Gewebekulturkolben entnommen, zweimal mit Krebs Ringers Lösung (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 ,20mM HEPES, 1 mM NaHPO4, 5,5 mM Glucose, pH 7,4 enthaltend 1 mMCaCl2) gewaschen und gezählt.
- Für Experimente in Zellpopulationen mit einem Spektrofluorometer11,13,14
- Resuspendieren Sie Die Zellen in einer Endkonzentration von 1 x 107 Zellen/ ml in der Lösung von Krebs Ringer und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 min mit einer Endkonzentration von 5 μM Fura-2/AM.
- Zentrifugieren Sie Die Zellen bei 900 x g für 10 min und resuspenieren Sie sie in der Lösung von Krebs Ringer in einer Konzentration von 2 x 106 Zellen/ml.
- Messen Sie Fluoreszenzänderungen (Verhältnis 340/380 nm) mit einem Spektrofluorometer, das mit einem Magnetrührer ausgestattet ist, der auf maximale Geschwindigkeit eingestellt und auf 37 °C eingestellt ist.
- Kurz vor dem Experiment spinnen Sie Zellen bei 900 x g für 5 min in einer Mikrozentrifuge und resuspendieren Sie schnell das Pellet in 1,5 ml Krebs Ringers Lösung mit 0,5 mM EGTA, aber ohne Zusatz von Ca2+.
- Legen Sie die Zellen in eine 3 mL Glasspektrofluorometer-Küvette und zeichnen Sie das Fluoreszenzverhältnis (340 nm/380 nm Anregung, 510 nm Emission) auf.
- Erreichen Sie eine stabile Basislinie (ca. 30 Sekunden), fügen Sie die ausgewählte Konzentration des RyR1-Agonisten (4-Chlor-m-Kresol oder 4 cmc) hinzu und zeichnen Sie das transiente Kalzium auf.
HINWEIS: Eine 300 mM Stammlösung von 4-cmc aus DMSO wird als Ausgangsreagenz verwendet. Diese Lösung kann im Voraus hergestellt, aliquoted und bei -20 °C für mehrere Monate gelagert werden. - Führen Sie Experimente für verschiedene 4-cmc-Konzentrationen durch.
HINWEIS: Schließen Sie 75 μM, 150 μM, 300 μM, 450 μM, 600 μM, 750 μM bis 1 mM ein, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve von Agonist versus Änderung in [Ca2+ ]zu erzeugen. Die verschiedenen 4-cmc-Konzentrationen werden erhalten, indem das entsprechende Volumen von 4-cmc aus der Stammlösung direkt in die Küvette gegeben wird, die die Fura-2-beladenen Zellen enthält. Zum Beispiel werden für eine Endkonzentration von 300 μM 4-cmc 1,5 μL der Stammlösung in die Küvette gegeben, die 1,5 ml Zellen in der Lösung von Krebs Ringer enthält. Bei niedrigeren Agonistenkonzentrationen sollte die 300 mM Stammlösung mit DMSO auf 75 mM verdünnt und das entsprechende Volumen in die Küvette gegeben werden, die 1,5 ml Zellen in der Lösung von Krebs Ringer enthält. - Fügen Sie 400 nM Thapsigargin zu Zellen hinzu, um die Gesamtmenge an Ca2+ in intrazellulären Speichern zu berechnen. Zeichnen Sie den Peak Ca2+ auf.
- Zeichnen Sie das durch eine gegebene Konzentration von 4 cmc induzierte Peak-Calcium im Vergleich zum durch Thapsigargin induzierten Peak-Calcium auf, das als 100% angesehen wird, und erstellen Sie eine 4-cmc-Dosis-Wirkungs-Kurve, die Zellen aus einem Probanden und einem gesunden Verwandten vergleicht
- Für Experimente an Einzelzellen13
- Poly-L-Lysin 1:10 in sterilemH2Overdünnen und die Glasdeckgläser 30 min vorbehandeln. Unter einer sterilen Gewebekulturhaube an der Luft trocknen lassen.
- Suspendieren Sie EBV-transformierte B-Lymphozyten auf eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml in Krebs Ringers Lösung, die 1 mMCaCl2 enthält, und fügen Sie eine Endkonzentration von 5 μM Fura-2/AM hinzu.
- 1 ml Zellen auf die mit Poly-L-Lysin behandelten Deckgläser geben und bei 37 °C in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator für 30 min inkubieren, damit die EBV-Zellen während der Beladung am Glasdeckglas haften können.
- Legen Sie den Deckglas in die Perfusionskammer und beginnen Sie mit der Perfusion (mit einer Rate von 2 ml/min) mit der Lösung von Krebs Ringer, die 1 mM Ca2+enthält.
- Verwenden Sie ein inverses Fluoreszenzmikroskop (ausgestattet mit einem 40-fachen Ölimmersionsobjektiv (0,17 numerische Apertur), Filter (BP 340/380, FT 425, BP 500/530), um Online-Messungen mit einem softwaregesteuerten CCD-Kameraaufsatz (Charge Coupled Device) aufzuzeichnen.
- Aufnahme von Bildern in 1 s-Intervallen bei einer festen Belichtungszeit (100 ms für Anregungswellenlängen von 340 nm und 380 nm). Verwenden Sie Bildgebungssoftware, um Veränderungen der Fluoreszenz zu analysieren. Messen Sie den durchschnittlichen Pixelwert für jede Zelle bei Anregungswellenlängen von 340 und 380 nm13.
- Um eine Zellstimulation zu erreichen, verwenden Sie einen Zellperfusionsstimulator mit 12 Ventilen und fügen Sie verschiedene Konzentrationen von 4 cmc hinzu. Das Spülventil enthält die Lösung von Krebs Ringer ohne Zusatz von Ca2+ plus 100 μM La3+, um nur die Kalziumfreisetzung aus intrazellulären Speichern zu überwachen.
- Konstruieren Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve von 4 cmc gegenüber der Veränderung von [Ca2+],wie oben beschrieben.
3. Herstellung menschlicher Myotuben aus Muskelbiopsien10,12,15
HINWEIS: Verschiedene Labore haben unterschiedliche Methoden verwendet, um aus Satellitenzellen gewonnene Myoblasten und Myotuben zu erhalten. Nachfolgend finden Sie eine Beschreibung der in Basel verwendeten Methode.
- Spülen Sie die Muskelbiopsie mit sterilem PBS aus, um überschüssiges Blut zu entfernen, und schneiden Sie sie in kleine Fragmente von etwa 0, 5-1 mm.
- Bereiten Sie 6 Gut-Gewebekulturschalen mit Einsatz zu. Fügen Sie jedem Bohrloch 1,5 ml menschliches Muskelwachstumsmedium und jedem Einsatz 0,5 ml menschliches Muskelwachstumsmedium hinzu.
HINWEIS: Das Wachstumsmedium setzt sich wie folgt zusammen: 500 ml dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium mit hoher Glucose oder DMEM (4,5 mg/ml), enthaltend 10% Pferdeserum, 5 ng/ml Insulin, 3 mM Glutamin, 600 ng/ml Penicillin G und Streptomycin sowie 7 mM HEPES, pH 7,4. Handelsübliches Skelettmuskelwachstumsmedium kann ebenfalls verwendet werden. - Legen Sie 2-3 kleine Muskelfragmente in jeden Einsatz (Abbildung 1A) und legen Sie Kulturschalen in den Zellkultur-Inkubator (5%CO2,37 °C). Nach etwa 8-10 Tagen können Satellitenzellen gesehen werden, die aus der Muskelbiopsie wachsen und diese umgeben, die am Insert befestigt ist(Abbildung 1,B und C, Pfeile).
- Setzen Sie eine ausreichende Anzahl von Zellen aus der Biopsie frei (nach ca. 10-14 Tagen), trypsinisieren Sie wie folgt:
- Entfernen Sie alle Kulturmedien, spülen Sie die Zellen einmal mit 1 ml PBS aus, fügen Sie 0,5 ml Trypsin / EDTA-Lösung (0,025% Trypsin und 0,01% EDTA) hinzu und inkubieren Sie bei 37 ° C für 5 min.
- 1 ml Wachstumsmedium zu den Zellen hinzufügen, um die Wirkung von Trypsin zu neutralisieren und die Satellitenzellen in einen neuen T25-Zellkulturkolben zu übertragen; 3 ml Wachstumsmedium zugeben und die Zellen in einen Zellkultur-Inkubator (5%CO2,37 °C) geben.
- Wechseln Sie das Wachstumsmedium am nächsten Tag, um die EDTA zu entfernen, und wechseln Sie anschließend das Medium einmal pro Woche.
- Wenn Myoblasten zu etwa 75% konfluent sind, trypsinisieren und auf lamininbehandeltes Glasdeckglas übertragen.
HINWEIS: Im Verhältnis sollten Zellen, die in einem T25-Kolben wachsen, auf einen lamininbehandelten Glasdeckglas mit einem Durchmesser von 43 mm übertragen werden. Der Glasdeckglas sollte in eine Gewebekulturplatte mit einem Durchmesser von 60 mm gelegt werden, die 3 ml Wachstumsmedium enthält. - Züchten Sie Zellen auf dem Glasdecker im Wachstumsmedium in einem Zellkultur-Inkubator (5%CO2,37 °C) und wechseln Sie das Medium einmal pro Woche. Wechseln Sie bei 90% Konfluenz zu einem Differenzierungsmedium, das sich wie folgt zusammensetzt: DMEM mit hohem Glukosegehalt (4,5 mg/ml), 0,5% Rinderserumalbumin, 10 ng/ml epidermaler Wachstumsfaktor, 0,15 mg/ml Kreatin, 5 ng/ml Insulin, 200 mM Glutamin, 600 ng/ml Penicillin G und Streptomycin sowie 7 mM HEPES, pH 7,4). Handelsübliche Differenzierungsmedien können ebenfalls verwendet werden. Wechseln Sie das Differenzierungsmedium einmal pro Woche.
- Nach 7-10 Tagen im Differenzierungsmedium sind mehrkernige Myotuben sichtbar. Bewerten Sie Änderungen in [Ca2+] innerhalb einer Woche, wie unten beschrieben.
4. [Ca2+]i Verhältnismessungen mit Fura-2 bestimmt
- Laden Sie glasgewachsene Myotuben mit Fura-2/AM (Endkonzentration von 5 μM), verdünnt in DMEM für 30 min bei 37 °C. Entfernen Sie kurz das Differenzierungsmedium aus den glasgewachsenen Zellen und fügen Sie 2 ml frisches Differenzierungsmedium hinzu. 10 μL Fura-2 AM aus einer Stammlösung von 1 mM zugeben und 30 min in einem Zellkulturinkubator (5%CO2,37 °C) inkubieren.
- Glasdeckglas in die Perfusionskammer überführen und Zellen mit Krebs Ringers Lösung spülen, die 2 mMCaCl2 enthält.
- Führen Sie Online-Messungen [Ca2+]durch, wie oben im EBV-Einzelzellabschnitt beschrieben, unter Verwendung eines 20-fachen Wasserimmersions-FLUAR-Objektivs (numerische Apertur 0,17).
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Representative Results
[Ca2+]i Messungen in Populationen von EBV-immortalisierten B-Lymphozyten
Primäre B-Lymphozyten exprimieren die RyR1-Isoform, die während B-Zell-Antigenrezeptor-stimulierten Signalprozessen als Ca2+-Freisetzungskanal fungiert17. Die Immortalisierung von B-Zellen mit EBV, ein Verfahren, das routinemäßig von Genetikern verwendet wird, um Zelllinien zu erhalten, die genomische Informationen von Patienten enthalten, bietet den Vorteil, Zelllinien zu erzeugen, die mutierte RyR1 Ca2+ Kanäle bei Patienten exprimieren, die RYR1-Mutationenbeherbergen 11,13. [Ca2+] i Änderungen, die durch die Zugabe spezifischer RyR1-Agonisten wie 4-Chlor-m-Kresol18 und Koffein herbeigeführt werden, können leicht überwacht werden, um festzustellen, ob eine gegebene RYR1-Mutation die Empfindlichkeit gegenüber einem Agonisten, die freigesetzte Kalziummenge, das Ruhen [Ca2+] oder andere Parameter verändert, die nachweislich von Mutationen beeinflusst werden. [Ca2+] i Veränderungen können entweder in Populationen von Fura-2-beladenen Zellen in Suspension mit einem Spektrofluorometer oder an Gruppen von Zellen, die an Glasabdeckungen befestigt und durch Epifluoreszenz untersucht werden, überwacht werden. Abbildung 2 zeigt ein repräsentatives Experiment, das an Zellsuspensionen durchgeführt wurde. Unmittelbar vor dem Einsetzen in die Küvette wurden Zellen gesponnen, um Fura-2 zu entfernen, das möglicherweise ausgetreten ist; Die Zellen wurden dann auf eine Endkonzentration von 1 x 106 Zellen/ml in warmer (37 °C) Krebs Ringer-Lösung resuspendiert, die kein zusätzlichesCa2+ plus 0,5 mM EGTA enthielt, und in das Spektrofluorometer gegeben. Der Magnetrührer wurde auf Position 4 (die höchste Position) eingeschaltet, um die Zellen in Suspension zu halten, und die Fluoreszenz wurde aufgezeichnet. Nachdem eine stabile Spur erhalten wurde, wurde der ausgewählte Agonist zugegeben (in Abbildung 2A waren dies 300 μM 4-Chlor-m-Kresol), was zu einem schnellenCa2+-Anstieg führte, der dann langsam wieder auf Ruhewerte zurückging. Die vorübergehende Natur der Veränderung der Fluoreszenz ist wichtig, da sie darauf hinweist, (i) dass es sich nicht um ein Artefakt handelt, das durch die Zugabe einer fluoreszierenden oder abschreckenden Verbindung verursacht wird, (ii) dass es nicht auf die Calciumbindung an extrazelluläre Fura-2 zurückzuführen ist und (iii) dass die Zellen gesund sind und Aktiv Kalzium aus ihrem Zytoplasma entfernen können.
Das gleiche Experiment muss mehrmals wiederholt werden, um statistisch analysiert zu werden. Für jede Zelllinie und jeden Tag werden die Experimente durchgeführt und die Gesamtmenge an schnell freisetzbarem Kalzium in den Speichern muss durch Zugabe des SERCA-Inhibitors Thapsigargin11,13,14bestimmt werden . Wie in Abbildung 2Bgezeigt, verursacht die Zugabe von 400 nM Thapsigargin einen großen Calciumtransienten, der einen Spitzenfluoreszenzwert von 2,4 beliebigen Einheiten (a.u.) erreicht; Somit entspricht die Gesamtmenge an Calcium, die aus den intrazellulären Speichern der in Abbildung 2B dargestellten EBV-immortalisierten B-Zellen freigesetzt werden kann, 2,4 a.U. (Thapsigargin-Peak) - 1,45 a.U. (Ruheverhältnis) oder 0,95 Dieser Fluoreszenzwert wurde bei der Konstruktion der in Abbildung 2Cgezeigten Dosis-Wirkungs-Kurve als 100%betrachtet.
Einzelzellige [Ca2+]i Messungen in EBV-immortalisierten B-Lymphozyten
Dieser zweite Ansatz beruht auf der Verfügbarkeit eines Fluoreszenzmikroskops und eines Mikroperfusionsaufbaus, der die Stimulation einer einzelnen Zelle oder kleiner Zellgruppen mit einer bestimmten Konzentration von Agonisten und die gleichzeitige Aufzeichnung der Fluoreszenzänderungen ermöglicht. Die Spritzen des Mikroperfusionssystems sind mit unterschiedlichen Konzentrationen des ausgewählten RyR1-Agonisten (entweder Koffein oder 4-Chlor-m-Kresol) beladen, die zur Erzeugung von Dosis-Wirkungs-Kurven verwendet werden. In dem in Abbildung 3gezeigten Beispiel wurden zellen mit 0,5-10 mM Koffein stimuliert, das in der Lösung von Krebs Ringer gelöst war, die kein zugesetztes Kalzium plus 100 μM La3+ enthielt, um dieCa2+-Freisetzung aus intrazellulären Speichern zu überwachen. Glasabdeckungen, auf denen Fura-2-geladene EBV-immortalisierte B-Lymphozyten anhaften durften, werden in die Perfusionskammer gelegt und mit der Krebs Ringer-Lösung mit 1 mMCa2+durchblutet. Die meisten Zellen haben sich an den mit Poly-L-Lysin behandelten Deckglas geklebt und kleine Gruppen von Zellen sollten identifiziert und auf Fura-2-Belastung überprüft werden. Die Spitze des Perfusionssystems wird in der Nähe der Zellen platziert, um sie (und nicht alle Zellen auf dem Deckglas) mit Koffein zu baden. Normalerweise werden Zellen von der niedrigsten bis zur höchsten Konzentration von Koffein stimuliert; für jede Konzentration wird eine neue Zelle oder Gruppe von Zellen ausgewählt. Ratiometrische Fluoreszenzmessungen (Anregung bei 340 nm und 380 nm, Emission bei 510 nm) werden jede Sekunde für bis zu 2 min aufgezeichnet. Vor der Perfusion werden einige Bilder aufgenommen, um eine stetige Baseline zu erhalten, anschließend wird die Zellperfusion eingeleitet, indem die Zellen zunächst mit einer Lösung der Krebs Ringer-Lösung, die 100 μM La3+ enthält, für 5 Sekunden gespült werden. Dies sollte nicht zu einer Veränderung der Blütenstandsbildung führen und ist eine Kontrolle, um sicherzustellen, dass die Zelle(n) während des gesamten Experiments an dem Deckglas haften. anschließend wird eine Lösung, die die ausgewählte Agonistenkonzentration enthält, über die Zelle(n) gespült. In dem in Abbildung 3Agezeigten Beispiel wurden die Zellen 20 Sekunden lang mit 5 mM Koffein stimuliert. Der gezeigte Pfeil zeigt an, wann das Koffeinventil geöffnet wurde und dies führt zu einer sofortigen Erhöhung des Fluoreszenzverhältnisses von 340/380 nm. Nach 20 Sekunden schließt sich das Koffeinventil und die Zellen werden mit Krebs Ringers Lösung gespült, die 100 μM La3+enthält; Die Fluoreszenz wird aufgezeichnet, bis die Grundlinie erreicht ist. Für jede Koffeinkonzentration wird die ΔF, also der koffeininduzierte Peak 340/380 nm Fluoreszenz - die anfängliche Ruhefluoreszenz von 340/380 nm berechnet und verwendet, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erstellen, wie in Abbildung 3Bgezeigt . Das mittlere ΔF von 5-10 Zellen wird für jede Koffeinkonzentration gemittelt. Die Menge an Kalzium in intrazellulären Speichern kann ebenfalls überwacht werden. In diesem Fall werden die Zellen mit einer Krebs Ringer-Lösung, die 0,5 mM EGTA enthält, und einer Lösung von 1 μM Thapsigargin, 1 μM Ionomycin und 0,5 mM EGTA von Hand zu den Zellen gegeben (nicht durch das Mikroperfusionssystem, da Ionomycin am Schlauch haftet und nicht abgewaschen werden kann) und die Fluoreszenz wird für ca. 4-5 min aufgezeichnet. Zur Berechnung des ΔF wird eine Region of Interest (ROI) erhalten, die eine Zelle umreißt, und die Änderungen der Fluoreszenz innerhalb des ROI werden mit einer Bildgebungssoftware berechnet.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass bei der Verwendung von EBV immortalisierten B-Zellen zur Messung der Empfindlichkeit des RyR1 gegenüber einem bestimmten Agonisten wiederholte Experimente an Zellen eines Individuums an verschiedenen Tagen durchgeführt werden sollten. Für Messungen an Zellpopulationen muss der Status der intrazellulären Calciumspeicher bewertet und die EC50 zu Agonist induzierte Calciumfreisetzung relativ zur Gesamtmenge an Calcium, die aus den Speichern freigesetzt werden kann, aufgetragen werden. Ein Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die [Ca2+] Antwort von Millionen von Zellen gemittelt wird; außerdem sind kein Mikroperfusionssystem und fluoreszierende Mikroskope notwendig. Die Einzelzellenmethode ermöglicht die Verwendung einer kleineren Anzahl von Zellen und die Online-Visualisierung von Änderungen in [Ca2+] ausgewählter Zellen.
Einzelzellige [Ca2+]i Messungen in von menschlichen Satellitenzellen abgeleiteten Myotuben
Glasdeckglas gewachsene und differenzierte Myotuben werden mit Fura-2 beladen, in die Perfusionskammer überführt und in Krebs Ringers Lösung gebadet, die 2 mMCa2+ enthält, wie oben für EBV-Zellen beschrieben. Die Spritzen des Perfusionssystems werden mit dem ausgewählten Agonisten gefüllt und Myotuben wie oben beschrieben stimuliert. Da nicht alle Zellen auf dem Deckglas mehrkernige Myotuben sind, ist es wichtig, die geeigneten Zellen auszuwählen, die gemessen werden. Kleine Gruppen von Myotuben können gleichzeitig stimuliert werden. In dem in Abbildung 4gezeigten Beispiel wurde eine einzelne Myotube mit einer Lösung gespült, die KCl, unterschiedliche Konzentrationen von 4-Chlor-m-Kresol und schließlich Koffein enthielt, jedoch werden normalerweise Dosis-Wirkungs-Kurven zu Agonisten konstruiert, wie im vorherigen Abschnitt angegeben, um die Agonistenempfindlichkeit von Zellen verschiedener Individuen zu vergleichen12,15,16 . KCl wird verwendet, um die Plasmamembran zu depolarisieren. Im Skelett wird die Depolarisation der Muskelplasmamembran durch die Spannungserfassung DHPR wahrgenommen, die dadurch eine Konformationsänderung erfährt, die zur Aktivierung und Öffnung des RyR1 führt. Auf der anderen Seite sind 4-Chlor-m-Kresol und Koffein direkte pharmakologische Aktivatoren des RyR1.
Abbildung 1: Erzeugung primärer menschlicher Muskelbiopsie-Myoblastenkulturen. (A) Kleine Muskelfragmente (Pfeile) werden in Einsätzen mit 0,5 ml Wachstumsmedium platziert. Nach 7-14 Tagen sind Satellitenzellen (kleine Pfeile) neben dem Muskelgewebe zu sehen und wachsen auf der Unterseite des Einsatzes. Bild aufgenommen durch ein 10-faches Objektiv (B) und ein 20-faches Objektiv (C). Die grauen Kästchen in Panel A wurden verwendet, um die Identität des Patienten abzudecken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Calciumfreisetzungsexperimente in EBV immortalisierten B-Lymphozyten. Ratiometrische [Ca2+]i Messungen in einer Population von Fura-2 beladenen Zellen in Suspension. A) Die Zugabe von 300 μM 4-Chlor-m-Kresol (Pfeil) bewirkt einen sofortigen Anstieg des Zytoplasmas[Ca2+],das anschließend innerhalb von 500 Sekunden wieder auf Ruhewerte zurückfällt. In diesem Beispiel beträgt das durch zugabe von 300 μM 4-Chlor-m-kresol induzierte ΔF 1,7 Fluoreszenzeinheiten - 1,4 Fluoreszenzeinheiten = 0,3 Fluoreszenzeinheiten. B) Die Zugabe des SERCA-Inhibitors Thapsigargin (400 nM, Pfeil) bewirkt einen stärkeren Anstieg des Fura-2-Fluoreszenzverhältnisses, das bei 2,4 Fluoreszenzeinheiten seinen Höhepunkt erreicht und anschließend bei 1,45 Fluoreszenzeinheiten auf Ruhewerte zerfällt. Der Thapsigargin-induzierte[Ca2+]-Transientstellt die Gesamtmenge an schnell freisetzbarem Kalzium in den intrazellulären Speichern dar, die in der Zellpopulation vorhanden sind. Der erhaltene Peak-Transient (2,4-1,45 = 0,95 Einheiten) wird verwendet, um den Prozentsatz des Kalziums zu berechnen, der durch eine gegebene Konzentration von 4-Chlor-m-Kresol freigesetzt wird. C) Repräsentative Dosis-Wirkungs-Kurven, die das ΔF als Prozentsatz der Gesamtmenge an schnell freisetzbarem Calcium in intrazellulären Speichern korrelieren. Für 300 μM 4-Chlor-m-kresol beträgt dieser Wert 0,3/0,95x100=31,6%. Jedes Symbol repräsentiert den Mittelwert± SEM% von 5-10 Werten aus EBV-immortalisierten Zellen aus einer Kontrolle (geschlossene Kreise, gepunktete Linie) und einem MHS-Individuum (geschlossene Quadrate, kontinuierliche Linie), die eine RYR1-Mutation tragen. Die Kurven wurden unter Verwendung einer sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Kurvenfunktion erzeugt. Die Panels A und B sind von Girard et al.11adaptiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Koffein-induzierte Ca2+-Freisetzung in einzelnen EBV-immortalisierten B-Lymphozyten von einer Kontrollperson. A) Obere Tafeln, Zeitrafferbilder (A) Phasenkontrast; (B-E), einzellige [Ca2+]I Messungen von Fura-2-beladenen EBV-immortalisierten Lymphozyten: (B) t=0, (C) t=36 s, (D) t=50 s und (E) t=77 s nach der Anwendung von 5 mM Koffein. Die Zellen wurden individuell durch die Zugabe von in Krebs-Ringer-Lösung verdünntem Koffein stimuliert. Maßstabsleiste=10 μm. Unterseite, repräsentative Spur, die nach Stimulation einer einzelnen Zelle mit 5 mM Koffein (Pfeil) erhalten wurde. B) Dosis-Wirkungs-Kurven, die die koffeinabhängige Veränderung in [Ca2+]izeigen, ausgedrückt als Änderung des Fluoreszenzverhältnisses (Peak-Verhältnis 340/380 nm−Ruheverhältnis 340/380 nm). Jeder Punkt stellt die mittlere ± REM der Fluoreszenzänderung von 4-15 Zellen dar. Die Kurven wurden unter Verwendung einer sigmoidalen Dosis-Wirkungs-Kurvenfunktion erzeugt. Geschlossene Quadrate, gepunktete Linie, Kontrollzellen; geschlossene Dreiecke, kontinuierliche Linie, MHS-Individuum mit einer RYR1-Mutation. Diese Abbildung ist eine Adaption von Ducreux et al.13. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Calciumfreisetzung stimuliert durch KCl, 4-Chlor-m-Kresol und Koffein in menschlichen Myotuben von einer Kontrollperson. Linke Panels: A) Phasenkontrast (B-H), einzellige intrazelluläre Ca2+ Messungen von Fura-2-beladenen menschlichen Myotuben. B) Ruhe [Ca2+]i ; C) t=2 s nach Der Anwendung von 150 mM KCl. D) t= 2 s nach der Anwendung von 150 μM 4-Chlor-m-Kresol; E) t=2 s nach Der Anwendung von 300 μM 4-Chlor-m-Kresol; F) t=2 s nach Der Anwendung von 600 μM 4-Chlor-m-Kresol; G) t=2 s nach Der Anwendung von 10 mM Koffein; H) t=20 s nach der Anwendung von Koffein. Rechtes Feld: Diagramm der Zeit (n) im Vergleich zum Fluoreszenzverhältnis (340/380 nm) in der stimulierten Zelle. Myotuben wurden individuell durch Zugabe des Agonisten in Krebs-Ringer-Puffer mit 100 μMLa3+stimuliert, so dass der Anstieg von[Ca2+]i nur die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle wurden von mehreren Labors erfolgreich eingesetzt, um die Auswirkungen von RYR1-Mutationen auf die Calciumhomöostase zu untersuchen. Die kritischen Schritte der in diesem Papier beschriebenen Ansätze befassen sich mit Sterilität, Zellkulturfähigkeiten und -techniken sowie der Verfügbarkeit von biologischem Material. Prinzipiell ist die Verwendung von EBV-immortalisierten B-Lymphozyten einfacher und ermöglicht es, Zelllinien zu erzeugen, die mutierte RyR1-Kanäle enthalten. Die Zellen können eingefroren und in flüssigem Stickstoff für viele Jahre gelagert werden und Kulturen können jederzeit neu gestartet werden. Darüber hinaus kann man wählen, ob die Calciumhomöostase in Zellpopulationen oder auf Einzelzellebene überwacht werden soll. Die erste Methode ist einfacher, erfordert kein Fluoreszenzmikroskop und ermöglicht es dem Forscher, Zelllinien zu testen, die von verschiedenen Individuen innerhalb kurzer Zeit erzeugt wurden. Die Einschränkung ist die Geschwindigkeit des Zellwachstums und die Verfügbarkeit eines voll ausgestatteten (beheizten und mit Magnetrührer) Spektrofluorometers. Als alternativer Ansatz kann die Durchflusszytometrie in Kombination mit fluoreszierenden Calciumindikatoren zur Messung von Calciumflüssen in EBV-immortalisierten B-Lymphozyten eingesetzt werden; auf diese Weise können Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration bestimmt werden19. Wenn ein Fluoreszenzmikroskop, eine Perfusionskammer und ein Mikroperfusionssystem verfügbar sind, hat die Einzelzellbildgebung den Vorteil, dass sie empfindlicher ist und detailliertere Informationen liefert, einschließlich Zellvariabilität, kinetischer Analyse und Identifizierung subzellulärer Domänen, die an der Calciumfreisetzung beteiligt sind. Der letztgenannte Ansatz ist technisch anspruchsvoller und erfordert mehr Ausrüstung.
Die Verwendung von EBV-immortalisierten B-Lymphozyten hat mehrere Vorteile, einschließlich der Tatsache, dass neben [Ca2+] auch andere Parameter der Homöostase gemessen werden können. Zum Beispiel wurde die 4-Chlor-m-Kresol-induzierte Versauerung von B-Zellen verwendet, um Zellen von Kontrollpersonen von MHS-Patienten zu unterscheiden20,21. Dennoch muss man bedenken, (i) dass B-Zellen viele der Proteine, die an der Erregungskontraktionskopplung der Skelettmuskulatur beteiligt sind, die indirekt die Kalziumfreisetzung beeinflussen können, nicht exprimieren, (ii) sie sind nicht erregbare Zellen, die daher physiologisch nicht durch Plasmamembrandepolarisation aktiviert werden können, und schließlich fand ein Bericht von Monnier et al. heraus, dass eine bei einem Patienten identifizierte Mutation in EBV-immortalisierten B-Zellen aufgrund einer kryptischen Spleißstelle nicht exprimiert wurde22.
Von Patienten abgeleitete primäre Muskelzellkulturen wurden von mehreren Gruppen verwendet, die daran interessiert waren, die Wirkung von Mutationen in verschiedenen Genen zu untersuchen, die für Proteine kodieren, die an der Calciumhomöostase beteiligt sind10,23,24. Diese Zellen können zu mehrkernigen Myotuben differenziert werden, reagieren auf plasmamembrandepolarisation und können elektrophysiologisch beurteilt werden. Darüber hinaus können sie verewigt werden, um Zelllinien mit RYR1-Mutationen25zu erhalten, obwohl das Verfahren weitaus komplexer ist als bei B-Lymphozyten. Während es auch wahr ist, dass die Muskelzellen langsam wachsen und die Zeit, die von einer Biopsie bis zu einer ausreichenden Anzahl von Zellen erforderlich ist, mehr als einen Monat betragen kann, ist es auch möglich, die kleinen Stücke von Muskelbiopsien in Gefriermedium in flüssigem Stickstoff zu speichern, um Myoblasten Jahre später zu erhalten. Die langen Kultivierungszeiten bergen das zusätzliche Risiko einer Kontamination durch Bakterien, Hefen oder Schimmelpilze und sobald eine ausreichend große Anzahl von Myoblasten gewonnen wurde, ist es wichtig, sie einzufrieren und in flüssigem Stickstoff zu lagern. Unser Labor hat die oben beschriebene Technik erfolgreich für Myotuben angewendet, um Kalziumveränderungen in menschlichen Hautfibroblasten zu untersuchen, die mit MyoD transduziert und in Myotuben differenziert wurden26. Dies wurde getan, um die funktionelle Wirkung von RYR1-Mutationen zu untersuchen, wenn aus der Muskelbiopsie stammende Myoblasten nicht verfügbar waren. Was die B-Lymphozyten betrifft, so wurde die 4-Chlor-m-Kresol-induzierte Übersäuerung von Myotuben von Patienten mit RYR1-Mutationen im Zusammenhang mit MHS erfolgreich getestet27.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung von biologischem Material von Patienten zur Untersuchung der Genotyp-Phänotyp-Korrelation viele Vorteile, den Nachteil hat und erfolgreich verwendet werden kann, um die Wirkung von Mutationen in RYR1 zu untersuchen. Bei der Verwendung dieses Ansatzes ist es jedoch wichtig zu bedenken, dass Mutationen in anderen Genen die Calciumhomöostase beeinflussen können. Daher sollte die Verwendung von Zellen aus verschiedenen Familien, die die gleiche Mutation beherbergen, sowie von Familienmitgliedern, die die RYR1-Mutation nicht beherbergen, als Kontrollen durchgeführt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Die in diesem Manuskript beschriebene Arbeit wurde durch Beiträge des Schweizerischen Nationalfonds (SNF) und der Swiss Muscle Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
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