Tumor Allotransplantation i Drosophila melanogaster med en programmerbar Auto-Nanoliter Injector

Summary

Denne protokol giver detaljeret vejledning til den indledende og fortsatte generations allotransplantation af Drosophila tumorer i maven hos voksne værter til undersøgelse af forskellige aspekter af neoplasi. Ved hjælp af et autoinjektorapparat kan forskere opnå forbedret effektivitet og tumorudbytte sammenlignet med dem, der opnås ved traditionelle, manuelle metoder.

Abstract

Denne protokol beskriver allotransplantation af tumorer i Drosophila melanogaster ved hjælp af et auto-nanoliter injektionsapparat. Ved brug af et autoinjektorapparat kan uddannede operatører opnå mere effektive og konsistente transplantationsresultater sammenlignet med dem, der opnås ved hjælp af en manuel injektor. Her dækker vi emner på en kronologisk måde: fra krydsning af Drosophila-linjer til induktion og dissektion af den primære tumor, transplantation af den primære tumor til en ny voksen vært og fortsat generationstransplantation af tumoren til udvidede undersøgelser. Som en demonstration bruger vi her Notch intracellulært domæne (NICD) overekspressionsinduceret spytkirtel imaginære ringtumorer til generationstransplantation. Disse tumorer kan først pålideligt induceres i et overgangszonemikromiljø inden for larvespytkirtel imaginære ringe, derefter allografteres og dyrkes in vivo for at studere fortsat tumorvækst, evolution og metastase. Denne allotransplantationsmetode kan være nyttig i potentielle lægemiddelscreeningsprogrammer såvel som til at studere tumor-værtsinteraktioner.

Introduction

Denne protokol giver en trinvis vejledning til allotransplantation af Drosophila larvespytkirtel (SG) imaginære ringtumorer i maven hos voksne værter ved hjælp af et auto-nanoliterinjektionsapparat (f.eks. Nanoject). Denne protokol giver også anvisninger til efterfølgende re-allografting af tumorer i nye generationer af voksne værter, hvilket giver mulighed for fortsat langsgående undersøgelse af tumoregenskaber, såsom tumorudvikling og tumor-værtsinteraktioner. Protokollen kan også anvendes til lægemiddelscreeningseksperimenter.

Denne metode blev udviklet til at forbedre effektiviteten af at udføre tumor allotransplantation i Drosophila ved anvendelse af manuelle injektorer¹, som ofte er inkonsekvente i deres suge- og injektionskræfter, hvilket fører til suboptimale resultater for tumor allotransplantation. Et autoinjektorapparat giver bedre kontrol og kan resultere i lavere fluedødelighed efter allograft. En uddannet operatør kunne opnå en værtsoverlevelsesrate på over 90% med autoinjektoren sammenlignet med omkring 80%, da den manuelle injektor blev brugt¹. Den samlede tumoropkøbsrate er 60% -80% på dag 8-12 post-allograft. Den gennemsnitlige injektionstid er også blevet forbedret fra 30-40 s pr. flue ved hjælp af en manuel injektor til 20-25 s pr. flue ved hjælp af autoinjektoren.

Denne protokol er blandt de første par protokoller til at bruge autoinjektorapparatet i Drosophila tumor allotransplantation. En nylig undersøgelse brugte også autoinjektoren til allotransplantation af tumorøse neurale stamceller². Tidligere blev autoinjektorapparatet anvendt i Drosophila til at studere bakteriel virulens³, parasitære infektioner og værtsforsvar⁴ samt screening for bioaktivitet af forskellige forbindelser⁵. Vores protokol tilpasser autoinjektorapparatet til brug af tumorinjektion og søger at give Drosophila-forskere højere kvalitet og mere ensartede resultater, samtidig med at de sparer betydelig tid. Denne protokol kan ikke kun bruges til allotransplantation af tumorer, men kan også skræddersys til allotransplantation af vildtype og mutantvæv af lignende kaliber⁶.

Drosophila NICD-tumoren, der anvendes i denne protokol, blev først introduceret af Yang et ^al.7 i SG imaginal ring overgangszone, et "tumor hotspot", der udviser høje niveauer af endogen Janus Kinase / Signal Transducer og Activators of Transcription (JAK-STAT) og c-Jun N-terminal Kinase (JNK) aktivitet. Derudover har overgangszonen høje niveauer af matrixmetalloproteinase-1 (MMP1)⁷, hvilket gør denne region særligt befordrende for tumorigenese. Notch pathway aktivering gennem NICD overekspression alene er tilstrækkelig til konsekvent at indlede tumordannelse. Disse tumorer kan efterfølgende allotransplantes for at muliggøre undersøgelse af en bred vifte af emner, herunder tumorcelledeling, invasion og tumor-vært interaktioner.

Protocol

1. Forberedelse af SG imaginal ring tumor

1. Kryds voksne fluer med genotyper af UAS-NICD (Han: 10-15 fluer) og Act-Gal4, UAS-GFP/CyO; tub-Gal80^ts (Jomfruhun: 10-15 fluer) og lad dem yngle i 1 dag ved 18 °C. De udvalgte voksne fluer skal være 5-9 dage gamle for at sikre høj frugtbarhed.
2. Lad de voksne fluer lægge æg i fluefoderet i hætteglas i 24 timer ved 18 °C, og fjern derefter de voksne fluer.
   BEMÆRK: Fluemad tilberedes ved hjælp af standard majsmel mad opskrift fra Drosophila Stock Center⁸. Hvert hætteglas skal indeholde omkring 10 ml fluefoder.
3. Æggene inkuberes i 6 dage ved 18 °C. I løbet af denne periode klækkes larverne.
4. Hætteglassene med larver overføres til en 29 °C inkubator og inkuberes i yderligere 7 dage.
   BEMÆRK: Dette inkubationstrin er valgfrit afhængigt af det specifikke eksperimentelle design.

2. Forberedelse af voksen vildtype Drosophila til allotransplantation

1. Bedøve vildtype eller passende mutante voksne fluer med 100% CO₂ og sorter fluer baseret på køn. Både mandlige og kvindelige fluer kan bruges som tumorværter.
2. Fastgør et 5 cm langt stykke fluebånd til et mikroskopglas med den klæbrige side opad ved at fastgøre det med to mindre stykker tape, et i hver ende.
3. Immobiliser fluerne ved at klæbe deres vinger til båndet. Brug pincet, mens du manøvrerer fluerne.
   1. Gentag ovenstående trin for 60-80 voksne fluer, der anvendes som allograft-acceptorer.
      BEMÆRK: Det er bedst at organisere fluer i pæne rækker med deres kropsakse justeret parallelt med hinanden for en mere tidseffektiv injektionsproces senere. Figur 1 viser rækker af værtsfluer tapet ned på denne måde.

3. Samling af autoinjektorapparatet

1. Tilslut både autoinjektorapparatet og netledningen til controllerboksen.
   1. Indstil injektionsvolumenet til 59,8 nL. Dette vil hjælpe med at opretholde den passende mængde suge- og injektionskræfter under allotransplantation.
2. Placer controllerboksen og autoinjektoren på modsatte sider af lysmikroskopet.
   BEMÆRK: For højrehåndede operatører skal kontrolboksen placeres på venstre side af mikroskopet med injektoren på højre side. Omvendt for venstrehåndede operatører.
3. Klargør 3,5'' glaskapillæren til brug ved at klippe den lukkede ende af med tang.
   1. Behandl den ene ende af glaskapillæren ved hjælp af en fire-trins mikropipette-trækker og opvarm til en smal, lukket ende ved hjælp af følgende specifikationer i instrumentet: Varme = 650, Kraft = 200 og Afstand = 8. Placer kapillærerne pænt i trækkerapparatet og kør programmet efter indtastning af ovenstående indstillinger.
   2. Brug pincet til at klemme kapillæren i en vinkel på ca. 60° for at lave en skarpere ende for nem adgang til den voksne flueunderliv¹. Se figur 2 for et eksempel på en godt klippet kapillær.
4. Skru let hætten på injektoren af. Hold knappen Tom nede for at rykke injektornålen frem, indtil 70%-80% af dens samlede længde vises. For at fremskynde kapillærfremskridt skal du trykke én gang på fyldknappen, mens du samtidig holder knappen Tom nede.
5. Brug en sprøjte til at fylde glaskapillæren med mineralolie. Indsæt derefter forsigtigt glaskapillæren på injektornålen, indtil førstnævnte er fastgjort til injektorens gummiprop. Skru nu injektorhætten tæt.
   1. Tør mineralolieresterne af på den ydre overflade af glaskapillærdækslet for at undgå at forurene mediet under allotransplantation.

4. Dissektion af SG imaginal ring tumor

1. Vælg en af larverne og overfør den til en dissektionsplade fyldt med 100 μL Schneiders medium for at forberede sig på SG imaginal ring tumor dissektion.
   BEMÆRK: Kun de prøver, der huser tumoren, forbliver som larver. Dette skyldes, at tumorvækst forsinker larveudvikling og progression⁹. To tredjedele af prøverne vil ikke huse tumoren og vil således have udviklet sig til pupper / voksne.
   1. Til dissektions- og allotransplantationsformål skal du bruge et stereomikroskop med et 10x-20x forstørrelsesområde.
2. Brug et par tang til at holde den midterste del af larvekroppen, klem larvehovedet ved hjælp af et andet par tang og påfør en strækningskraft på langs.
3. Find larvernes Y-formede SG og isoler den fra resten af larvevævet¹⁰.
4. Disseker og isoler SG imaginal ring tumor ved at fjerne det tilstødende væv. Se figur 3 for en skildring af denne dissektionsproces.
5. Gentag trin 4.1-4.4 for yderligere 10 til 20 SG imaginære ringtumorer baseret på forskningsbehov.

5. Allograft af primær SG imaginal ring tumor

1. Nedsænk kapillæren i Schneiders medium indeholdende de primære SG imaginære ringtumorer. Hold Fill-knappen nede for at fylde glaskapillæren med Schneiders Medium hele vejen til det øverste segment på 0,5 cm. Dette øverste segment skal forblive fyldt med mineralolie.
   BEMÆRK: Accelerer denne proces ved at trykke én gang på knappen Tom , mens knappen Fyld nede samtidig holdes nede.
2. Find en primær tumor, og tryk på Fill-knappen , indtil tumoren suges ind i kapillæren.
   1. Sørg for, at tumoren sidder ved spidsen af kapillæren eller flere millimeter væk fra spidsen af kapillæren. Dette hjælper med at undgå, at tumoren driver og går tabt i opløsningen indeholdt i kapillæren. Se figur 4A for en demonstration af den passende tumorplacering, da den sidder i kapillæren.
3. Find en voksen flue immobiliseret til båndet på mikroskopet. Brug pincet til forsigtigt at holde underlivet nede. Gennembor derefter den nedre laterale neglebånd i maven med kapillæren. Tryk på knappen Tom , indtil tumoren kommer ind i den nye værtsunderliv. Se figur 4B for en demonstration af denne teknik.
4. Brug pincet til forsigtigt at klemme værtsvingerne op for at fjerne det fra båndet. Læg værten i et nyt hætteglas med frisk mad. Det er bedst at placere hætteglasset sidelæns i de første 24 timer efter injektion. Hvert hætteglas må kun indeholde op til maksimalt 20 fluer.
   BEMÆRK: Nogle værtsfluer vil have manglende vinger og andre sår på deres kroppe efter injektion og kan holde sig til fluemaden, hvis hætteglasset er placeret oprejst.
5. Gentag trin 5.2 til 5.4 for at transplantere de resterende primære tumorer til deres nye voksneværter.
6. Bortskaf kapillærerne i beholderen, og mineralolieresterne rengøres fra autoinjektorens yderside, inden apparatet føres tilbage i kassen.
7. Opbevar hætteglasset med værter ved stuetemperatur i 1 dag, og overfør derefter hætteglasset til et inkubationskammer ved 29 °C. Overfør flueværter til nye hætteglas hver 2-3 dage.
8. Overvåg flueværterne dagligt og beregn overlevelsesraten. Efter en uge skal tumorer være synlige under et stereomikroskop med fluorescensadapter og kan løbende overvåges for deres størrelse og progression.

6. Re-allograft af transplanterede tumorer

1. Omkring 10-14 dage efter allograft screener du for tumorer, der er vokset i værtslivet ved hjælp af et fluorescensmikroskop.
2. Bedøv en vært med CO₂ og læg den i en dissektionsplade fyldt med 100 μL Schneider's Medium. Disseker den dyrkede allografterede tumor ud af værten ved hjælp af to par tang.
   1. Brug et par tang til at holde maven nede og det andet par til at skære op i abdominal neglebånd og udsætte den allografterede tumor¹.
   2. Isoler forsigtigt tumoren fra det vedhæftede værtsvæv så meget som muligt ved hjælp af fluorescensmarkører som vejledning.
3. Gentag trin 6.2 for at forberede to til tre yderligere allografterede tumorer.
4. Overfør dissektionspladen indeholdende de høstede tumorer til scenen i et lysmikroskop.
5. Brug sterile nåle og disseker tumorerne i mindre stykker, der passer til kapillærstørrelsen.
6. Gentag trin 4.1-4.5 for at forberede den nye generation af voksne værter, og gentag trin 5.1-5.7 for at fuldføre tumorernes allotransplantation.
   BEMÆRK: Succesrater er generelt højere for ikke-primære tumorer sammenlignet med primære tumorer.
7. Trin 6.1-6.6 gentages for hver efterfølgende generation af fluer, der anvendes i undersøgelsen.
   BEMÆRK: Vælg Drosophila værtslinjer, der passer til de eksperimentelle behov.

Representative Results

Her udførte vi generations allotransplantation af SG imaginære ringtumorer ved hjælp af nanoliterinjektionsautoinjektorapparatet og udførte efterfølgende tumor live-billeddannelse med et konfokalt laserscanningsmikroskop, som muliggjorde et dybere dyk ned i emner om tumorvækst, tumorcellemigration og tumor-værtsinteraktioner. Når du monterer fluer, lim dem på et mikroskopglas og fastgør dem via en polydimethylsiloxan (PDMS) blok¹¹.

Figur 5A viser en live billeddannelsesoptagelse af en 1^. generation (G1) SG imaginal ringtumor, der vokser i en voksen værtsliv på dag 10 efter allotransplantation. Dette niveau af billeddannelse kan bruges til at spore processen med tumordeling. Figur 5B viser en 6^. generations (G6) SG imaginær ringtumor, der optager en stor del af værtslivet på dag 10 efter allotransplantation. Billeddannelse på dette stadium kan hjælpe med at afsløre tumorvækstmønstre såvel som dets migrations- og invasionsadfærd. Det er vigtigt at bemærke, at selvom dette billede blev taget ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop, kunne et stereomikroskop med en GFP-fluorescensadapter også bruges ved 2x til 5x forstørrelse afhængigt af tumorstørrelsen.

Figur 1: Værtsfluer tapet og sikret til allotransplantation. Værtsfluerne tapes ned af deres vinger og orienteres pænt for at forberede sig på den efterfølgende transplantationsprocedure. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: En godt klippet injektionskapillær. Den røde pil peger på en skarp kant, der er nødvendig for effektivt at gennembore abdominal neglebånd hos voksne Drosophila-værter . Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Dissektion af den primære spytkirtel ImR tumor. Processen med at dissekere og isolere to primære spytkirtel ImR-tumorer demonstreres kronologisk fra panel (A) til panel (B) ved hjælp af to separate snit. Panel (A) viser spytkirtlen før tumordissektion. De røde pilespidser angiver de første snitpunkter. De blå pilespidser angiver de andet snitpunkter. Tumoren ligger mellem de røde og blå pilespidser. Panel (B) viser den isolerede ImR-tumor, efter at de to snit er lavet for at adskille den fra normalt spytkirtelvæv. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Passende tumor placering i kapillær og injektion af tumor i Drosophila værts abdomen. Panel (A) viser den mest passende tumorplacering i kapillæren. Tumoren udtrykker eGFP (488 nm). Panel (B) viser injektionsprocessen. Den røde pil angiver tumorinjektionsstedet. Den blå pil viser placeringen af tang for at hjælpe med at holde fluens terminalia nede for lettere injektion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: En G1 og G6 ImR tumor set i WT Drosophila vært maven på dag 10 post-allotransplantation. Disse er ventrale visninger af flue maven med de transplanterede tumorer i grønt. Panel (A) viser en G1-tumor på dag 10 post-allotransplantation, der udtrykker eGFP (488 nm). Panel (A) fanges ved hjælp af et konfokalt mikroskop ved hjælp af en 20x linse med 0,8 NA og 3x zoom. Panel (B) viser en G6-tumor på dag 10 post-allotransplantation, der udtrykker eGFP (488 nm). Panel (B) fanges ved hjælp af et konfokalt mikroskop ved hjælp af en 5x linse med 0,25 NA og 1x scanningszoom. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Tumor allotransplantation kan hjælpe forskere med at løse visse problemer, der opstår under Drosophila tumorvækst og progression. En sådan udfordring er omgåelse af for tidlige dødsfald af tumorbærende larver eller voksne under primær tumorkultur¹². I denne sammenhæng tillader fortsat tumor allotransplantation tumorer at vokse på ubestemt tid, hvilket letter langsgående undersøgelser af tumorvækst, metastase og evolution. Tumor allotransplantation er også nyttig til vurdering af forskellige aspekter af vært-tumor interaktioner ^7,13. Værtsgenotyper kan manipuleres før tumor allograft for at muliggøre evaluering af værtseffekten på tumorvækst og migration og på tumorinduceret kakeksi^14,15. Flueværter med forskellige genotyper kan udvise forskellige manifestationer af kakeksilignende spild som reaktion på den samme tumor. Efter allotransplantation kan tumorværterne monteres som forberedelse til in vivo-billeddannelse ved hjælp af en protokol tilpasset fra Koyama et al. og Ji et ^al.11,16.

Anvendelsen af autoinjektorapparatet mod Drosophila tumor allotransplantation giver en bekvem og ligetil protokol, der besidder forbedret effektivitet. Sammenlignet med den manuelle injektor¹ giver denne metode mulighed for reproducerbare og store allotransplantationer, som kan fremskynde og standardisere tumoradfærdsundersøgelser og lægemiddelscreeningsprocedurer. Denne forbedrede metode producerer imponerende værtsoverlevelse og tumorudbytte. En uddannet forsker kan opnå post-allograft værtsoverlevelsesrater på >90%. Tumorudbyttet kan variere afhængigt af om tumoren er primær eller re-allografted. Forskere kan forvente at opnå tumorudbytter på >50% for primære tumorer og >70% for re-allografted tumorer. Derudover reducerer denne metode injektionstiden pr. værtsflue med næsten 50% sammenlignet med den manuelle injektormetode.

Denne procedure har sine begrænsninger, men hovedsageligt på grund af inkonsekvens af tumorindsnit, injektionssted og sårstørrelse. Hvis de primære tumorer ikke skæres i fragmenter af ensartet størrelse inden allotransplantation, kan visse flueværter modtage større fragmenter end andre. Dette er en forvirrende faktor, der påvirker undersøgelser, der sigter mod at spore tumorvæksthastigheden. Dette kan potentielt afbødes ved at måle den differentielle hastighed af tumorvækst med to-dages intervaller efter allograft. Derudover skal operatøren under injektionen vælge et ensartet sted i abdominal neglebånd på tværs af alle værtsfluer. Dette hjælper med at afbøde en anden forvirrende variabel, der kan påvirke flueværtens overlevelse og den endelige placering af tumorbinding.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal Laser Scanning Microscope	Zeiss	LSM 980	Also known as "Zeiss LSM 980"
Cornmeal Fly Food	Bloomington Drosophila Stock Center	N/A	Also known as "BDSC Standard Cornmeal Food"
Dissection Needle (30Gx1/2)	BD PrecisionGlide	305106
Dissection Plate	Fisher Scientific	12-565B
Fly Tape	Fisherbrand	159015A
Fluoresence Adapter for Stero Microscope	Electron Microscopy Sciences	SFA-UV	Also known as "NightSea Fluorescence Adapter"
Fluoresence Microscope	Zeiss	495015-0001-000	Also known as "Zeiss Stereo Discovery.V8"
Forceps	Fine Science Tools	11251-10	Also known as "Dumont #5 Forceps"
Glass Capillary (3.5'')	Drummond	3-000-203-G/X
Glue	Elmer	E305	Also known as "Elmer Washabale Clear Glue"
Light Microscope	Zeiss	435063-9010-100	Also known as "Zeiss Stemi 305"
Micropipette Puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Also known as "Four Step Micropipette Puller"
Nanoject Apparatus	Drummond	3-000-204	Also known as "Nanoject II Auto-Nanoliter Injector"
Schneider's Medium	ThermoFisher	21720001
Syringe (27G x1/2)	BD PrecisionGlide	305109
Vial	Fisherbrand	AS507