Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הדמיה דינמית של תאי T קולטן אנטיגן כימרי עם [18F]טטרפלואורובורט טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/62334
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4,5, 1,2, 3, 3, 3, 3, 1,2, 1,2,5,6
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

Summary

פרוטוקול זה מתאר את המתודולוגיה למעקב לא פולשני אחר תאי T שהונדסו גנטית כדי לבטא קולטני אנטיגן כימריים ב- vivo עם פלטפורמה זמינה קלינית.

Abstract

תאי T מהונדסים גנטית לבטא קולטני אנטיגן כימריים (CAR) הראו תוצאות חסרות תקדים בניסויים קליניים מרכזיים עבור חולים עם ממאירות תאי B או מיאלומה נפוצה (MM). עם זאת, מכשולים רבים מגבילים את היעילות ואוסרים על שימוש נרחב בטיפולים בתאי CAR T עקב סחר לקוי וחדירה לאתרי גידול, כמו גם חוסר התמדה ב- vivo. יתר על כן, רעילות מסכנת חיים, כגון תסמונת שחרור ציטוקינים או רעלנות עצבית, הם חששות עיקריים. הדמיה ומעקב יעילים ורגישים של תאי CAR T מאפשרים הערכה של סחר בתאי T, הרחבה ואפיון in vivo ומאפשרים פיתוח אסטרטגיות להתגבר על המגבלות הנוכחיות של טיפול בתאי CAR T. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לשילוב סימפורטר הנתרן יודיד (ש"ח) בתאי CAR T ולהדמיית תאי CAR T באמצעות [18F]טטרפלואורובוראט-פוזיטרונים טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים ([18F]TFB-PET) במודלים פרה-קליניים. ניתן ליישם את השיטות המתוארות בפרוטוקול זה על מבני CAR אחרים ועל גנים ממוקדים בנוסף לאלה המשמשים למחקר זה.

Introduction

טיפול תאי קולטן אנטיגן כימרי T (CAR T) הוא גישה מתפתחת במהירות ופוטנציאלית מרפאת ממאירות המטולוגית1,2,2,3,4,5,6. תוצאות קליניות יוצאות דופן דווחו לאחר CD19 מכוון CAR T (CART19) או B התבגרות תאים אנטיגן (BCMA) CAR T טיפול בתאים2. זה הוביל לאישור מינהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) של תאי CART19 ללימפומה אגרסיבית של תאי B (axicabtagene ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3, ו lisocabtagene maraleucel)7, לוקמיה לימפובלסטית חריפה (Tisa-Cel)5,8, לימפומה תאי מעטפת (brexucabtagene autoleuce)9, ולימפומה זקיקית (Axi-Cel)10 . לאחרונה, ה-FDA אישר טיפול בתאי CAR T בהכוונת BCMA בחולים עם מיאלומה נפוצה (MM) (idecabtagene vicleucel)11. יתר על כן, טיפול בתאי CAR T עבור לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) נמצא בפיתוח קליני בשלב מאוחר וצפוי לקבל את אישור ה-FDA בשלוש השנים הקרובות1.

למרות התוצאות חסרות התקדים של טיפול בתאי CAR T, השימוש הנרחב בו מוגבל על ידי 1) לא מספיק בהרחבת תאי vivo CAR T או סחר לקוי לאתרי גידולים, מה שמוביל לשיעורים נמוכים יותר של תגובה עמידה12,13 ו -2) התפתחות של תופעות לוואי מסכנות חיים, כולל תסמונת שחרור ציטוקינים (CRS)14,15 . סימני ההיכר של CRS כוללים לא רק הפעלה חיסונית וכתוצאה מכך רמות גבוהות של ציטוקינים דלקתיים / כימותרפים, אלא גם התפשטות מסיבית של תאי T לאחר עירוי תאי CAR T15,16. לפיכך, פיתוח אסטרטגיה מאומתת ברמה קלינית לתמונה תאי CAR T ב vivo יאפשר 1) מעקב תאי CAR T בזמן אמת ב vivo כדי לפקח על הסחר שלהם לאתרי גידול ולחשוף מנגנונים פוטנציאליים של התנגדות, ו 2) ניטור של התרחבות תאי CAR T ופוטנציאל לחזות את הרעילות שלהם כגון התפתחות CRS.

תכונות קליניות של CRS מתון הן חום גבוה, עייפות, כאב ראש, פריחה, שלשולים, כאבי מפרקים, כאבי שרירים, וחולשה. ב CRS חמור יותר, חולים עלולים לפתח טכיקרדיה/תת לחץ דם, דליפת נימי, תפקוד לקוי של הלב, אי ספיקת כליות/כבד, קרישה תוך וסקולרית מופצת17,18. באופן כללי, מידת הגובה של ציטוקינים, כולל אינטרפרון-גמא, גרנולוציט-מקרופאג' גורם מגרה מושבה, אינטרלוקין (IL)-10, ו IL-6, הוכח בקורלציה עם חומרת הסימפטומים הקליניים17,19. עם זאת, היישום הנרחב של ניטור ציטוקינים בסרום "בזמן אמת" כדי לחזות CRS קשה בשל העלות הגבוהה והזמינות המוגבלת. כדי לנצל את המאפיינים המיטיבים של טיפול בתאי CAR T, הדמיה לא פולשנית של תאי T מאמצים יכולה להיות מנוצלת באופן פוטנציאלי כדי לחזות את היעילות, הרעילות וההישנות לאחר עירוי תא CAR T.

מספר חוקרים פיתחו אסטרטגיות לשימוש בהדמיה מבוססת רדיונוקלידים עם טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) או טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT), המספקת רזולוציה גבוהה ורגישות גבוהה20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 עבור in vivo הדמיה וניטור של סחר בתאי CAR T. בין אסטרטגיות הדמיה מבוססות רדיונוקלידים אלה, סימפורטר הנתרן יוד (NIS) פותח כמודל רגיש לתאי תמונה ווירוסים באמצעות סריקות PET31,32. הדמיית תאים NIS+CAR T עם [18F]TFB-PET היא טכנולוגיה רגישה, יעילה ונוחה להערכה ואבחון של הרחבת תאי CAR T, סחר ורעילות30. פרוטוקול זה מתאר 1) פיתוח של תאי NIS+CAR T באמצעות העברה כפולה עם יעילות גבוהה ו-2) מתודולוגיה להדמיית תאי NIS+CAR T עם [18F]TFB-PET סריקה. תאי BCMA-CAR T עבור MM משמשים כמודל הוכחת קונספט לתיאור NIS ככתב להדמיית תאי CAR T. עם זאת, מתודולוגיות אלה ניתן ליישם על כל טיפול בתאי CAR T אחר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול פועל בהתאם להנחיות של ועדת הביקורת המוסדית של מאיו קליניק, הוועדה המוסדית לאבטחה ביולוגית והוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים של מאיו קליניק.

1. ש"ח+ ייצור תאי BCMA-CAR T

הערה: פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות של ועדת הביקורת המוסדית של מרפאת מאיו (IRB 17-008762) וועדת הבטיחות הביולוגית המוסדית (IBC Bios00000006.04).

  1. ייצור של BCMA-CAR, ש"ח, וחלבון פלואורסצנטי ירוק לוציפראז (GFP)-קידוד lentiviruses.
    הערה: מבנה BCMA-CAR מהדור השני היה מסונתז דה נובו (ראה טבלת החומרים) ושוכפל לווקטור lentiviral דור שלישי תחת שליטתו של מקדם גורם התארכות-1 אלפא (EF-1α). מבנה BCMA-CAR (C11D5.3-41BBz) כלל תמחיר של 4-1BB ושבר משתנה בעל שרשרת אחת (scFv) הנגזר משיבוט נוגדני BCMA אנטי-אנושי C11D5.333,34. ה- NIS נמצא בשליטת מקדם EF-1α ונקשר לגן ההתנגדות פורומיצין באמצעות פפטידים המבקעים את עצמם (P2A). לוציפראז-GFP של קידוד וקטור lentiviral (ראה טבלת החומרים) משמש להעתקת תאי הגידול, אשר לאחר מכן מבטאים GFP ולוציפראז.
    1. הכן פלסמידים וקטוריים lentiviral: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 מיקרוגרם), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 מיקרוגרם), ו pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 מיקרוגרם).
      הערה: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro ו pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro מכילים את גן ההתנגדות פורומיצין. לכן, ש"ח- או לוציפראז-GFP-transduced תאים ניתן לבחור עם 1 מיקרוגרם / מ"ל או 2 מיקרוגרם / מ"ל של פורומיצין דיהידרוכלוריד, כפי שתואר בעבר 14,35.
    2. זרע 20 × 106 של 293T תאים בבקבוק T175 ודגר במשך 24 שעות ב 37 °C (5% CO2). ודא שתאי 293T מופצים באופן שווה על הבקבוקון במפגש של 70-90% על ידי הדמיה ישירה מתחת למיקרוסקופ.
    3. הכינו תערובת ראשית של 15 מיקרוגרם של וקטור הביטוי (למשל, CAR, NIS, או לוציפראז-GFP DNA ליניארי), 7 מיקרוגרם של וקטור המעטפה (VSV-G) ו-18 מיקרוגרם של וקטור האריזה (gag, pol, rev ו-tat). לדלל את תערובת מאסטר DNA ב 4.5 מ"ל של מדיום transfection, ולאחר מכן להוסיף 111 μL של ריאגנט מראש מורכב (תערובת A).
    4. הכן צינור חדש, ולדלל 129 μL של ריאגנט טרנספקטיה liposomal ב 4.5 מ"ל של מדיום transfection (תערובת B).
    5. שלב תערובות A ו- B והפעל את הצינור כדי לערבב את התוכן. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    6. לאחר הדגירה, פשוט לשאוף את התא supernatant מבלי לנתק את התאים ולהוסיף 16 מ"ל של מדיום גדילה המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין. לאחר מכן, מוסיפים את התערובת של תערובות A ו- B על 293T תאים dropwise. לבסוף, לדגור את התאים transfected ב 37 °C (5° פרנהייט), 5% CO2 עבור 24 שעות.
    7. בימים 1 ו -2 לאחר טרנספקטוקציה, לקצור את supernatant של 293T, ספין למטה ב 900 × גרם במשך 10 דקות, ולסנן דרך מסנן ניילון 0.45 מיקרומטר. רכז את הסינון ב 24 ו 48 שעות על ידי ultracentrifugation ב 112,700 × גרם עבור 2 שעות, להקפיא ב -80 °C (80 °F).
  2. Ex-vivo בידוד תאי T (איור 1)
    הערה: בצע את כל עבודות תרביות התאים בארון זרימה למינארי באמצעות טכניקה אספטית וציוד מגן אישי. תאים חד גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) נקצרים מדם תורם מתנדב בריא שנאסף במהלך apheresis36. הקרנת פתוגן בוצעה על תאים אנושיים המשמשים במחקר זה.
    1. השתמש בטכניקת מעבר הצבע הסטנדרטית של צפיפות כדי לבודד PBMCs.
      1. הוסיפו בעדינות 15 מ"ל של מדיום הדרגתי בצפיפות (צפיפות של 1.077 גרם/מ"ל) (המכילים אלפא-D-גלוקיראנוסיד, הומופולימר בטא-D-פרוקטופרנוזיל, ו-3-(אצטילאמינו)-5-(אצטילמתילמינו)-2,4,6-6-מלח מונוסודיום חומצה טריודובנזואית) לצינור הפרדה הדרגתי בצפיפות של 50 מ"ל מבלי ליצור בועות אוויר (ראו טבלת החומרים).
      2. כדי למנוע לכידת תאים, לדלל את דגימת הדם עם תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS, 0.2 גרם / ליטר של אשלגן כלורי, 0.2 גרם / ליטר של אשלגן פוספט מונובאסיק, 8 גרם / ליטר של נתרן כלורי, ו 1.15 גרם / ליטר של נתרן פוספט דיבסיק) המכיל 2% FBS ביחס נפח 1:1. מעבירים בעדינות את הדם המדולל על גבי מדיום שיפוע הצפיפות מבלי לשבור את הממשק בין השניים. ספין למטה ב 1,200 × גרם במשך 10 דקות ב RT.
        הערה: צינור הפרדה שיפוע צפיפות 50 מ"ל יכול לשמש לבידוד של 4-17 מ"ל של דגימת דם. צינור ההפרדה השיפוע של צפיפות 50 מ"ל (ראה טבלת החומרים) המשמש בפרוטוקול זה אינו דורש את "הבלם כבוי" במהלך צנטריפוגה. עם זאת, כאשר נעשה שימוש בצינורות סטנדרטיים של 50 מ"ל, הבלם צריך להיות כבוי ודורש צנטריפוגה של 30 דקות.
      3. מעבירים את supernatant לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ"ל, לשטוף עם PBS + 2% FBS על ידי מילוי עד 50 מ"ל, ולאחר מכן לסובב למטה ב 300 × גרם במשך 8 דקות ב RT.
      4. לשאוף את supernatant, ו resuspend התאים גלולה ב 50 מ"ל של PBS + 2% FBS. ספור את מספר התאים ולאחר מכן סובב כלפי מטה ב- 300 × גרם למשך 8 דקות ב- RT. חזור על השלב הקודם עבור סך של 2 כביסות.
    2. לשאוף את supernatant, ולהחזיר את התאים כדוריים לריכוז של 50 × 106 תאים / מ"ל עם PBS + 2% FBS.
    3. בצע בידוד תאי T ממחשבי PBMCs באמצעות ערכת חרוזים מגנטיים לבחירה שלילית.
      הערה: ערכת בחירה שלילית אידיאלית כוללת חרוזים מגנטיים המחוברים לנוגדנים נגד אנטיגנים המתבטאים בתאים שאינם תאי T. ערכה נפוצה מכילה נוגדנים המחוברים לחרוזים מגנטיים כנגד CD15, CD14, CD34, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 ו- CD16 (ראה רשימת חומרים).
      1. העבר PBMCs לצינור עגול 14 מ"ל פוליסטירן עגול תחתון. לאחר מכן, מקם את המחשבים האישיים ואת קוקטייל הנוגדנים של הבחירה השלילית במפריד תאים אוטומטי לחלוטין, ובצע בידוד תאי T בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  3. גירוי תאי T והרחבת תאי T (איור 1)
    1. כדי לתרבות את תאי ה- T המבודדים, הכינו את מדיום הרחבת תאי T (TCM) העשויים מדיום של תאי המטופויטיקה ללא סרום בסרום ללא סרום בסרום בתוספת 10% אלבומין בסרום אנושי ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין14. לאחר בידוד תאי T, ספרו את התאים והתרבית בריכוז של 2 × 106 תאים/מ"ל עם TCM.
    2. יש לשטוף חרוזים נגד CD3/CD28 שלוש פעמים עם TCM לפני הכתות עם תאי T.
      1. מערבבים את הבקבוקון המכיל את החרוזים על ידי ערבוב. לאחר מכן, פיפטה את הנפח הנדרש של חרוזים (3:1 חרוזים:תא) (למשל, כאשר מגרה 1.0 × 106 תאים של תאי T, להשתמש 3.0 × 106 של חרוזים נגד CD3 / CD28) לתוך צינור microcentrifuge סטרילי (1.5 מ"ל) ו resuspend ב 1 מ"ל של TCM.
    3. מניחים את צינור microcentrifuge עם החרוזים על מגנט במשך 1 דקות, ושאיפה את supernatant. הסר את הצינור מן המגנט, ו resuspend החרוזים שטף ב 1 מ"ל של TCM. חזור על שני השלבים הקודמים עבור סך של 3 שטיפות.
    4. resuspend החרוזים ב 1 מ"ל של TCM ולהעביר אותם לתאי T. לאחר מכן, לדלל את תאי T לריכוז סופי של 1.0 × 106 תאים / מ"ל עם TCM. מעבירים את ההשעיה של תאי T/חרוזים לצלחת 6-well שטופלו בתרבית רקמות ומניחים אותה באינקובטור (37 °C (37 °C (5% CO2).
  4. טיטרציה של lentiviruses (איור 2)
    1. הכן תאי T לבדיקת טיטרציה. ודא כי כ 1.0 x 106 תאים זמינים כדי titrate סוג אחד של וירוס.
    2. לעורר תאי T כמתואר בסעיף 1.3.2.
    3. צלחת 1.0 × 105 תאים של תאי T מגורה בצלחת של 96 בארות (צלחת טיטר) ודגרה ב-37 °C (37 °C), 5% CO2 עבור 24 שעות (איור 2A). לבודד ולעורר את תאי T כמתואר בסעיף 1.2.
    4. הכינו לוח דילול (לוחית של 96 בארות) על-ידי הוספת 100 μL של TCM לבארות העמודים המיועדים ולבארות הבקרה שלא שוגרו (איור 2B).
    5. להפשיר בקבוקון אחד של חלקיקים lentiviral על קרח בעדינות pipette למעלה ולמטה לערבב היטב. העבר 50 μL של הנגיף supernatant לתוך הבארות של עמודה 6 של צלחת 96-well (דילול 3) (איור 2B). פיפטה למעלה ולמטה לערבב היטב.
    6. בצע דילול סדרתי (דילול סדרתי פי 2): העבר 50 μL מבאר A6 לבאר B6 ולאחר מכן 50 μL מבאר B6 לבאר C6; חזור על הפעולה עד G6. לאחר מכן, הוסיפו 50 μL של הנגיף המדולל ללוחית הטיטר (איור 2B).
    7. דגרו את צלחת הטיטר ב-37 °C (5% CO2 ) ל-48 שעות, וקבעו את האחוזים של תאים חיוביים לרכב, ש"ח או GFP על ידי ציטומטריית זרימה (איור 2C).
      1. לשטוף את הבארות על ידי ספינינג למטה צלחת טיטר פעמיים ב 650 × גרם ב 4 °C (650 °F) במשך 3 דקות.
      2. להכתים את תאי T המושרה כפי שמתואר בשלבים 1.5.3 עד 1.5.9.
      3. קבעו את הטיטרים בהתבסס על האחוזים של תאים חיוביים לרכב, NIS-או GFP באמצעות נוסחה (1):
        Titers = אחוז של BCMA-CAR + או NIS + תאי T × ספירת תאי T בהתמרה × הדילול הספציפי / נפח (1)
  5. טרנסדוקציה של lentiviruses ו- NIS+הרחבת תאי BCMA-CAR T
    1. עשרים וארבע עד 48 שעות לאחר גירוי תאי T, לבצע transduction lentiviral על תאי T מגורה (תאי T צריך ליצור אשכולות).
      1. להפשיר את lentiviruses קפוא קידוד מכונית או שקלים ב 4 °C (50 °F).
      2. מערבבים היטב את תאי ה- T המעוררים כדי לפרק את האשכולות, ופשוט מוסיפים וירוס שהופשר טרי בריבוי של זיהום (MOI) של 5.0 (בעת המרת 1.0 × 106 תאי T, השתמש ב- 5.0 × 106 של lentivirons). לדגור על התאים המועברים ב 37 °C (5° פרנהייט), 5% CO2.
      3. בימים 3, 4 ו-5, ספרו את תאי ה-T המועברים באמצעות המטוציטומטר37 או מונה תאים אוטומטי לחלוטין 38 והתאמו את ריכוז התא ל-1.0 × 106 תאים/מ"ל על-ידי הוספת TCM טרי שחומם מראש. עבור תאי T המועברים על ידי NIS הנושאים את הגן התנגדות פורומיצין, לטפל בתאים עם 1 מיקרוגרם / מ"ל של פורומיצין דיהידרוכלוריד בימים 3, 4, ו -5.
    2. ביום 6, להסיר את החרוזים נגד CD3/CD28 מתאי T transduced (משלב 1.3.4) על ידי ערבוב היטב כדי לשבור את אשכולות תאי T ולהניח אותם במגנט במשך 1 דקה. לאחר מכן, פשוט למקם את תאי T transduced שנאספו בחזרה בתרבית בריכוז של 1.0 × 106 תאים / מ"ל. לאחר הסרת החרוזים מתאי T, להעריך את הביטוי של CAR ו- NIS על ידי cytometry זרימה.
      הערה: מכיוון ששבר המשתנה בעל השרשרת הבודדת של ה- BCMA-CAR נגזר מעכבר, ניתן להכתים אותו ב- IgG אנטי-עכברי עזים (H+L) המצומד עם Alexa Fluor 647. ניתן לזהות ש"ח באמצעות ETNL אנטי-אנושי [פפטיד סינתטי המתאים ל- aa625-643 (SWTPCVGHDGGRDQETNL)]. נוגדן זה מזהה את טרמינוס C הציטוסולי של ש"ח. לכן, תאי T חייבים להיות חלחל לפני הדגירה עם נוגדן NIS אנטי אנושי.
    3. בצע כתמי משטח של BCMA-CAR באמצעות IgG נגד עכבר עזים (H +L).
      1. קח aliquot של התרבות (למשל, 50,000 תאי T) ולשטוף עם מאגר זרימה (PBS, 1% FBS, ו 1% נתרן אזיד). לאחר מכן, resuspend התאים עם 50 μL של מאגר זרימה, ולהכתים את התאים עם 1 μL של נוגדן נגד עכבר עזים לאיתור ביטוי CAR ו 0.3 μL של אקווה חי מת עבור לא כולל תאים מתים.
      2. דגירה במשך 15 דקות בחושך ב RT, לשטוף את התאים על ידי הוספת 150 μL של מאגר זרימה, צנטריפוגה התאים ב 650 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (4 °F).
    4. לאחר פני השטח CAR כתמים, לתקן לחלחל את התאים על ידי הוספת 100 μL של מדיום קיבוע (PBS עם 4.21% פורמלדהיד) ודגרה במשך 20 דקות ב 4 °C (4 °F). לשטוף את התאים פעמיים עם 100 μL של מאגר המכיל סוכן חלחול תא כגון סאפונין (650 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (650 × גרם ).
    5. resuspend התאים הקבועים/ חלחלו ב 50 μL של מאגר חדירות. לאחר מכן, להוסיף 0.3 ng של נוגדן ETNL ש"ח אנטי אנושי ב 50 μL של מאגר זרימה ודגור במשך 1 שעה ב 4 °C (4 °F).
    6. הוסף 150 μL של מאגר זרימה, וצנטריפוגה התאים ב 650 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (4 °F). לדגור על התאים עם 2.5 μL של נוגדן משני אנטי ארנב ב 50 μL של מאגר זרימה במשך 30 דקות ב 4 °C (4 °F), לשטוף את התאים על ידי הוספת 150 μL של מאגר זרימה, צנטריפוגה ב 650 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (4 °F).
    7. לבסוף, יש לנצל מחדש 200 μL של מאגר זרימה ולבצע cytometry זרימה כדי לקבוע את יעילות התמרה (איור 3A,B).
    8. ביום 8, לספור ולסובב את תאי T ב 300 × גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (4 °F). Resuspend תאי T עם בינוני מקפיא (90% FBS + 10% דימתילסולפוקסיד [DMSO]) בריכוז של 10 × 106/mL, ולאחר מכן להעביר 1 מ"ל כל אחד קריוביאלים מסומנים.
    9. מניחים את הבקבוקונים במקפיא של -80 °C (80 °F) למשך 48 שעות. לאחר 48 שעות (וביום 10), להעביר את תאי T לחנקן נוזלי.
      הערה: ראו איור 1 לסקירה כללית של ייצור תאי NIS+ CAR T. איור 3D מייצג דוגמאות להרחבת תאי ex vivo T משלושה תורמים שונים.

2. הדמיית תאי BCMA-CAR T עם [18F]TFB-PET סריקה

הערה: פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש של מאיו קליניק (IACUC A00001767-16), IRB ו- IBC (Bios00000006.04). OPM-2 הוא קו תאים BCMA + MM, המשמש לעתים קרובות כקו תא יעד עבור תאי BCMA-CAR T39,40.

  1. צור תאי לוציפראז+ BCMA+ OPM-2.
    1. זרע 500,000 תאי OPM-2 בצלחת 24-well שטופלו בתרבית רקמות. להפשיר lentivirus קידוד לוציפראז-GFP ב 4 °C (60 °F).
    2. הוסף את הנגיף שהופשר טרי ב- MOI של 3.0 לתאי OPM-2 וערבב היטב על ידי צינורות. מניחים את הצלחת באינקובטור (37 °C (37 °C (5% CO2).
    3. ארבעים ושמונה שעות לאחר ההמרה, להוסיף 2 מיקרוגרם / מ"ל של puromycin כדי לבחור את התאים שהועברו. ארבעה ימים לאחר ההשמדה, העריכו את התאים החיוביים ל-GFP (לוציפראז-חיובי) לפי ציטומטריית זרימה (איור 3E).
  2. בססו את דגמי עכברי הקסנוגרפט BCMA+ OPM-2 (איור 4).
    1. לספור לוציפראז + OPM-2 תאים לסובב אותם למטה פעמיים כדי להסיר את כל מדיום תרבית התאים. resuspend תאי OPM-2 בריכוז של 10 × 106 תאים / מ"ל עם PBS.
    2. ביום -21, הזריקו 100 μL (1.0 × 106 תאים) של תאי לוציפראז + OPM-2 לזנבות של עכברים immunocompromised NOD-scid בן 8 עד 12 שבועות (איור 4).
    3. ביום 20 לאחר הזרקת התא OPM-2 (יום -1 של הזרקת תאי CAR T), בדוק את נטל הגידול באמצעות הדמיית ביולומינציה (BLI) (איור 4).
      הערה: תאי OPM-2 יוצרים גידול הגדל באיטיות, אשר בדרך כלל לוקח 2-3 שבועות כדי לחרוט.
    4. לנהל 10 μL / g של D-לוציפרין כדי OPM-2 קסנוגרפט עכברים באמצעות הזרקת intraperitoneal (IP). לאחר 10 דקות, בצעו BLI על העכברים מתחת ל-2% גז איזופלוריין (איור 5A). לאחר אישור תחריט הגידול, אקראי העכברים על פי נטל הגידול.
    5. ביום -1 של הזרקת תא CAR T, להפשיר NIS + BCMA-CAR T תאים, ולהסיר את המדיום המקפיא על ידי צנטריפוגה (300 × גרם, 8 דקות, 4 °C (500 °F). לאחר מכן, התאים resuspend עם TCM ב 2.0 × 106 תאים / מ"ל ודגר לילה (37 °C (37 °C (5% CO2).
    6. ביום 0, לספור ולצנטריפוגה את התאים NIS + BCMA-CAR T (300 × גרם, 8 דקות, 4 °C (50 °F). התקן מחדש את תאי NIS+BCMA-CAR T ב-50 × 106 תאים/מ"ל עם PBS.
    7. לנהל 100 μL (5.0 × 106 תאים) של NIS + BCMA-CAR T תאים באמצעות הזרקת וריד הזנב לעכברי OPM-2 קסנוגרפט. בימים 7 ו -15, דמיינו את העכברים באמצעות סריקת PET.
  3. NIS + BCMA-CAR T תא בהדמיית ויוו באמצעות דגם עכבר קסנוגרפט BCMA + OPM-2.
    1. שקול את העכברים לפני ההדמיה, ולהסיר כל תגי אוזן מתכת כדי לחסל חפצים הקשורים למתכת.
    2. הכן [18F]TFB כפי שתואר בעבר41.
      הערה: [18F]TFB חייב להיות מיוצר ביום השימוש בו. טוהר רדיוכימי צריך להיות >99% ופעילות טוחנת >5 GBq / mmol.
    3. הזרקו 9.25 MBq [18F]TFB דרך הווריד באמצעות הזרקת וריד הזנב. אפשר תקופת ספיגה של ~ 40 דקות עבור radiotracer להיות מופץ בגוף ולנקות את הדם.
    4. להרדים את העכבר באמצעות שאיפת איזופלוריין (2%).
      הערה: Isoflurane הוא הרדמה בשאיפה המועדפת כפי שיש לו התפרצות מהירה ואמינה והתאוששות.
    5. לפני המרדים את העכבר, לנקות את כל המשטחים של מכונת ההרדמה עם חומרי חיטוי.
    6. מקם את העכבר בתוך תא האינדוקציה. הפוך את לוח המחוגים לאידוי ל-2% והמתן שהעכבר יהפוך למחלים ולא מגיב תוך 1-2 דקות.
    7. לפקח על העכבר כדי למנוע הרדמה לא מספקת או דיכאון מוגזם של תפקודים נשימתיים. בקצרה, לצבוט בוהן כדי לאשר את ההרדמה לא מספקת.
      הערה: קצב הנשימה הרגיל הוא עד 180/דקה, ושיעור הירידה המקובל הוא 50%.
    8. החל משחה עיניים כדי למנוע ייבוש הקרנית וטראומה.
    9. רכשו תמונות PET/CT 45 דקות לאחר ההזרקה עם העכבר המרדים בתחנת עבודה להדמיית MICRO PET/CT (ראו טבלת החומרים). לאחר מכן, לרכוש תמונות PET סטטיות במשך 15 דקות ואחריו רכישת תמונת CT במשך 5 דקות עם סיבוב 360° ו 180 תחזיות ב 500 μA, 80 keV, ו 200 ms חשיפה.
  4. ניתוח נתוני הדמיה שנרכשו
    1. נתח את התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה PET (איור 5B ווידאו S1 משלים).
    2. הגדר את נפח העניין (VOI).
    3. חשב את ערך הספיגה המתוקנן (SUV) באמצעות נוסחה (2).
      SUV ב VOI = ריכוז הפעילות ב- VOI (MBq/mL) × משקל גוף (g) / מינון מנוהל (MBq) (2)
  5. אישור על סחר בתאי NIS+BCMA-CAR T לאתרי הגידול עם ציטומטריית הזרימה
    1. לאחר הדמיית [18F]TFB-PET, הנח את העכבר בחזרה לכלוב. לאחר הפסקת ההרדמה, לעקוב אחר בעלי החיים עד שהם מסוגלים תנועה תכליתית ולוודא שיש להם גישה למזון ומים.
    2. נטר את העכברים עד לריקבון של [18F]TFB המוזרק. ברגע שהרדיוזוטופ אינו ניתן לזיהוי, הרדים את העכברים עם CO2.
    3. כדי להרדים, למקם את העכברים לתוך הכלוב (לא יותר מ 5 עכברים לכלוב).
    4. לחשוף את העכברים CO2 עד להפסקה מלאה של נשימה בכ 5-10 דקות.
      הערה: שיטת המתת חסד זו חייבת להיות עקבית עם הנחיות AVMA למתת חסד של בעלי חיים (מהדורת 2020).
    5. כדי להבטיח את מותם של העכברים, לבצע נקע צוואר הרחם על ידי אחיזה בחלק האחורי של הראש ואת הבסיס של הזנב של החיה, ולאחר מכן מושך את הידיים לגזרים / הרחק אחד מהשני.
    6. לקצור את מוח העצם כדי לאשר כי NIS + BCMA-CAR T תאים ביעילות תנועה לאתר הגידול.
    7. מעבירים את עצם הירך והשוקה שנקטפו לצלחת של 6 בארות המכילה 5 מ"ל של מדיום תרבית תאים. הסר את השרירים והגידים מן הירך ואת השוקה, ופשוט לחתוך את שני הקצוות (מעל המפרקים) של עצמות הירך והשוקה.
    8. מלאו מזרק אינסולין במדיום תרבית התאים, ושטפו את מח העצם לצלחת של 6 בארות. עבור עצם הירך, להשתמש 22 G מחטים ומזרקים 5 מ"ל כי קוטר עצם הירך גדול יותר מזה של השוקה.
    9. השתמש בקצה השטוח של הבוכנה כדי לטחון את מוח העצם. מניחים מסננת תאים 70 מיקרומטר על צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל, ומסננים את מח העצם הקרקעי. לאחר מכן, למלא את הצינור עם מאגר הזרימה, צנטריפוגה הצינור ב 300 × גרם במשך 8 דקות ב 4 °C (4 °F).
    10. לשאוף את supernatant, ו resuspened מח העצם עם 5 מ"ל של חיץ זרימה. מעבירים 200 מיקרומטר של מח עצם לצלחת של 96 בארות. צנטריפוגה הצלחת ב 300 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (4 °F). Decant supernatant, ו resuspend התאים עם 50 μL של מאגר זרימה.
    11. להכתים את מוח העצם עם נוגדני זרימה נגד 0.25 מיקרוגרם של CD45 עכבר, 0.03 מיקרוגרם של CD45 אנושי, 0.06 מיקרוגרם של CD3 אנושי, 0.24 מיקרוגרם של BCMA אנושי, ו 0.3 μL של אקווה חי / מת. לדגור על הצלחת במשך 15 דקות ב RT בחושך.
    12. צנטריפוגה הצלחת ב 300 × גרם במשך 3 דקות ב 4 °C (4 °F). לאחר מכן, הוסיפו 200 μL של מאגר זרימה, ופעלו על ציטומטר הזרימה (איור 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מייצג את השלבים של יצירת תאי NIS+BCMA-CAR T. ביום 0, בודדו את מחשבי ה-PBMCs ולאחר מכן בודדו תאי T לפי בחירה שלילית. לאחר מכן, לעורר תאי T עם חרוזי אנטי CD3 / CD28. ביום הראשון, יש להעביר תאי T עם lentiviruses NIS ו- BCMA-CAR. בימים 3, 4 ו- 5, לספור תאי T ולהאכיל עם מדיה כדי להתאים את הריכוז להיות 1.0 × 106/mL. עבור תאי T המועברים על ידי NIS, יש להוסיף 1 מיקרוגרם/מ"ל של פורומיצין כדי לבחור תאים NIS+ . ביום 6, להסיר את החרוזים על ידי הצבת התאים במגנט במשך דקה. לאחר מכן, לשים את התאים ללא חרוזים מהצינור לתוך בקבוקון חדש. קח aliquot של תאים (למשל, 50,000 תאים) וכתם עם נוגדנים כדי לבדוק את הביטוי של NIS ו CAR על פני השטח של תאי T באמצעות cytometry זרימה. ביום 8, לספור את תאי T ו cryopreserve עם מדיה קפואה בריכוז של 10 × 106 /mL.

איור 2 מייצג את קווי המתאר של טיטרציה של lentiviruses. ביום 0, resuspend תאי T בריכוז של 1.0 × 106/mL ב- TCM. לאחר מכן, לעורר תאי T עם חרוזים נגד CD3/ CD28 ביחס תא:חרוזים 1:3. הוסף 100 μL (100,000 תאים) של תאי T לבארות הצבעוניות כפי שצוין באיור 2A. צלחת זו נקראת "צלחת טיטר". דגירה צלחת titer ב 37 °C (5° פרנהייט), 5% CO2 עבור 24 שעות. ביום הראשון, הכינו את צלחת הדילול. הוסיפו 100 μL של TCM לבארות הצבעוניות כפי שצוין באיור 2B. לאחר מכן, הוסיפו 50 μL של lentiviruses שהופשרו זה עתה לשורה הראשונה (לדוגמה, A6, A7 או A8 כפי שמתואר באיור 2B). בצע דילול סדרתי על ידי העברת 50 μL מ- A6 ל- B6, ולאחר מכן 50 μL מ- B6 ל- C6, חוזר על עצמו עד G6. בצע דילול סדרתי עבור A7 ו- A8 גם כן. ואז להעביר 50 μL של הנגיף המדולל לצלחת טיטר. עשרים וארבע שעות לאחר העברת הנגיף מצלחת הדילול לצלחת טיטר, להאכיל את התאים עם 100 μL של TCM. ביום 3, כתם תאים עם נוגדנים ולנתח את הביטוי של NIS ו BCMA על תאי T באמצעות cytometry זרימה.

איור 3A,B מציג את חלקות הזרימה הייצוגיות של תאי BCMA-CAR T או NIS+BCMA-CAR T. תאי T מגודרים ב- FSC / SSC, ואחריהם אפליה בודדת ותא חי. יותר מ-90% מהתאים הם תאי NIS+ (איור 3B). איור 3C מציג את מתווה הזרימה הייצוגי להרכב של תאי NIS+BCMA-CAR T. בדומה לאיור 3A,B, תאי T מגודרים ב-FSC/SSC, ואחריהם אפליה בודדת ותא חי. איור 3D מציג את עקומת הרחבת תאי T מימים 0 עד 8. אין הבדלי הרחבת קיפול בין תאי UTD, BCMA-CAR T או NIS+BCMA-CAR T. איור 3E מתאר את ביטוי GFP בתאי OPM-2 לאחר ההמרה של lentivirus המקודד GFP ולוציפראז ואחריו בחירת פורומיצין.

איור 4 הוא קווי המתאר של תאי הדמיה NIS+BCMA-CAR T ב-vivo עם [18F]TFB-PET. לחסן עכברים בני שישה עד שמונה שבועות עם 1.0 × 106 תאים של תאי לוציפראז + OPM-2 באמצעות הזרקת וריד הזנב ביום -21. להעריך את נטל הגידול על ידי BLI ביום -1. ביום 0, אקראי העכברים על פי נטל הגידול להיות מטופלים עם NIS + BCMA-CAR T תאים באמצעות הזרקת וריד הזנב או במעקב ללא כל טיפול (קסנוגרפט מטופל). תמונה העכברים עם BLI ביום 6. בצע [18F]TFB-PET ביום 7 לתמונה NIS +BCMA-CAR T תאים.

איור 5A מציג את BLI הנציג 20 יום לאחר החיסון של תאי לוציפראז + OPM-2 לעכברי NSG. איור 5B מציג את הדמיית PET הייצוגית שבוע לאחר מתן תאי NIS +BCMA-CAR T. [18F] ספיגת TFB נצפתה בעצם החזה, קוצים, אגן, עצם הירך. בנוסף, ספיגה פיזיולוגית של [18F]TFB נראית בבלוטת התריס ובבטן. איור 5C מציג את חלקות הזרימה הייצוגיות של מח עצם המופק מעצם הירך שנקטפו מהקסנוגרפט הלא מטופל או מעכברים שטופלו בתאי NISMA-CAR-CAR T. דגימות מח עצם מוכתמות בעכבר CD45, CD45 אנושי, CD3 אנושי ו- BCMA אנושי. התאים מגודרים ב- FSC / SSC, ואחריהם אפליה בודדת, חיה ותאית אנושית. דגימות מח עצם שמקורן בקסנוגרפט לא מטופל מציגות תאי BCMA+ בעוד שעכבר שמטופל בתאי NIS+BCMA-CAR T מראה תאי CD3+ , התומכים בממצא [18F]TFB-PET.

Figure 1
איור 1: סכימת ייצור תאים של NIS+BCMA-CAR T. תאי CD3 T תורם רגיל (מבודדים מתאי דם חד-גרעיניים של דם היקפי) באמצעות בחירת חרוזים שלילית. תאי T מצופים ב-1.0 × 106/מ"ל ומורחבים ב-TCM באמצעות חרוזי אנטי-CD3/CD28 שנוספו ביום 0 של התרבות והוסרו ביום 6. תאי T מועברים באופן כפול עם lentiviruses קידוד NIS או BCMA-CAR ביום 1 (MOI = 5.0). NIS + BCMA-CAR תאי T מטופלים עם 1 מיקרוגרם / מ"ל של פורומיצין בימים 3, 4, ו -5. תאי T מורחבים בתרבית למשך 8 ימים. תאי T שמורים ב- FBS עם 10% DMSO לניסויים עתידיים. תאי T מופשרים ונחים לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני כל הניסויים. קיצורים: CD = אשכול של בידול; TCM = מדיום הרחבת תאי T; BCMA = אנטיגן להבשלת תאי B; CAR = קולטן אנטיגן כימרי; ש"ח = נתרן יודיד סימפורטר; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; PBMCs = תאים חד-גרעיניים בדם היקפי; MOI = ריבוי של זיהום; FBS = סרום בקר עוברי; DMSO = דימתילסולפוקסיד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: טיטרציה Lentivirus. (A) ביום 0, לעורר תאי T עם חרוזים נגד CD3 / CD28 ביחס חרוזים 3:1:תא. הוסף 100 μL של 1.0 × 106/mL של תאי T מגורה לבארות הצבעוניות כפי שצוין בקריקטורה. לאחר מכן, לדגור על צלחת titer ב 37 °C (5° C), 5% CO2 עבור 24 שעות. (B) הכן צלחת דילול על ידי הוספת 100 μL של TCM לבארות הצבעוניות כפי שצוין בקריקטורה. הוסיפו 50 μL של וירוס שהופשר טרי ל-A6, A7 או A8 (למשל, BCMA-CAR ל-A6, ש"ח ל-A6, ש"ח ל-A7, ולוציפראז-GFP ל-A8). לאחר מכן, לדלל באופן סדרתי את הנגיף על ידי העברת 50 μL מ- A6 ל- B6, ולאחר מכן 50 μL מ B6 ל- C6, חוזר עד G6. בצע דילול סדרתי עבור A7 ו- A8 גם כן. העבר 50 μL של הנגיף המדולל לצלחת titer. (ג) ביום 3, להכתים את התאים עם נוגדנים מתאימים ולנתח את צלחת titer על ידי ציטומטריית זרימה. קיצורים: CD = אשכול של בידול; TCM = מדיום הרחבת תאי T; BCMA = אנטיגן להבשלת תאי B; CAR = קולטן אנטיגן כימרי; ש"ח = נתרן יודיד סימפורטר; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הדור של תאי NIS+BCMA-CAR T ותאי OPM-2 חיוביים של לוציפראז-GFP. (A ו-B )  תאים מגודרים על FSC / SSC, ואחריו אפליה בודדת ותא חי. תוויות זרימה מייצגות של (A) תאי T ו- BCMA-CAR T שאינם מועברים ו- (B) UTD ו- NIS + BCMA-CAR T מוצגים. תאי NIS+BCMA-CAR T נוצרים על ידי העברה משותפת של שני וירוסים ביום הראשון של הרחבת תאי T, כמתואר באיור 2. ביום 6, התאים מוכתמים ב-CARs וב-NIS. (ג) הניתוח הפנוטיפי של NIS+BCMA-CAR T. תרשים הזרימה הייצוגי של תאי NIS+BCMA-CAR T מוצג. (ד) סיכום של UTD, BCMA-CAR T, או NIS + BCMA-CAR T קינטיקה צמיחת תאים. שילוב של BCMA-CAR ו/או ש"ח אינו משפיע על הרחבת תאי T (ANOVA דו-כיווני, n=3 משכפלים ביולוגיים, כלומר ± SD). (ה) ניתוח ציטומטרי זרימה של לוציפראז-GFP-transduced OPM-2. תאי OPM-2 מועברים עם lentivirus קידוד לוציפראז-GFP עם התנגדות פורומיצין. ארבעים ושמונה שעות לאחר ההמרה, תאי OPM-2 מטופלים עם 2 מיקרוגרם / מ"ל של פורומיצין. התאים מורחבים ליומיים נוספים, והביטוי של GFP מנותח באמצעות ציטומטריית זרימה. קיצורים: CD = אשכול של בידול; BCMA = אנטיגן להבשלת תאי B; CAR = קולטן אנטיגן כימרי; ש"ח = נתרן יודיד סימפורטר; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; UTD = untransduced; FSC/SSC = פיזור קדימה/פיזור צד; ANOVA = ניתוח של שונות; n.s.= לא משמעותי; SD = סטיית תקן; FL-1-A = אזור פלואורופור 1; FITC-A = אזור של איזוטיוצינאט פלואורסצין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ערכה לבדיקת סחר in vivo בדגם קסנוגרפט OPM2 מערכתי. הזרקו עכברי NSG בני שישה עד שמונה שבועות עם 1.0 × 106 של תאי OPM-2 חיוביים לוציפראז דרך וריד הזנב ביום -21. ביום -1, לבצע הדמיה bioluminescent על העכברים כדי לאשר את החריטה של תאי OPM-2. ביום 0, להזריק עכברים עם 5.0 × 106 של NIS + BCMA-CAR T תאים. עכברי תמונה עם [18F]TFB-PET/CT ביום 7 כדי להעריך את הסחר בתאי NIS +BCMA-CAR T. קיצורים: BCMA = אנטיגן להבשלת תאי B; CAR = קולטן אנטיגן כימרי; ש"ח = נתרן יודיד סימפורטר; BLI = הדמיה ביו-זוהרת; NSG = immunocompromised NOD-scid IL2rγnull; luc = לוציפראז; [18F] TFB-PET/CT = [18F]טטרפלואורובוראט טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: בדיקת סחר ויוו במודל קסנוגרפט OPM2 מערכתי. (A ו-B ) תאי BCMA + לוציפראז + OPM2 מוזרקים דרך הווריד לעכברי NSG. עכברים מקבלים NIS + BCMA CAR T תאים שלושה שבועות לאחר החיסון של תאי OPM-2. (A) BLI מאשר את החריטה של תאי OPM-2. (ב) [18F]TFB-PET חושף ש"ח+BCMA-CAR T סחר בתאים למח העצם. (ג) כדי לאשר שתאי OPM-2 חקוקים במח העצם ובתעבורת תאי NIS+BCMA-CAR T לאתר הגידול, עכברים מורדמים לאחר ההדמיה, ומח העצם נקטף. ניתוח ציטומטרי של זרימה גילה שתאי OPM-2 חקוקים במח העצם (משמאל), ותאי NIS+BCMA-CAR T נמצאים במח העצם (מימין). קיצורים: BCMA = אנטיגן להבשלת תאי B; CAR = קולטן אנטיגן כימרי; ש"ח = נתרן יודיד סימפורטר; BLI = הדמיה ביו-זוהרת; NSG = immunocompromised NOD-scid IL2rγnull; [18F] TFB-PET/CT = [18F]טטרפלואורובוראט טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת; IVIS = במערכת הדמיה vivo ; CD = אשכול של בידול; SUV = ערך ספיגה מתוקנן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו משלים S1: עיבוד תלת-ממדי (3D) של נתוני PET/CT המציגים את התפלגות in vivo של [18F]TFB בבלוטת התריס, בבטן ובמח העצם. קיצורים: BCMA = אנטיגן להבשלת תאי B; CAR = קולטן אנטיגן כימרי; ש"ח = נתרן יודיד סימפורטר; PET/CT = טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לשילוב ש"ח בתאי CAR T והדמיה חדורה לתאי CAR T ב-vivo באמצעות [18F]TFB-PET. כהוכחת קונספט, תאי NIS+BCMA-CAR T נוצרו באמצעות טרנסדוקציה כפולה. לאחרונה דיווחנו כי שילוב ש"ח בתאי CAR T אינו פוגע בתפקודי תאי CAR T וביעילותו ב-vivo ומאפשר סחר והרחבה של תאי CAR T30. כמו טיפולים בתאי CAR T ממשיכים להתרחב מעבר הממאירות הנוכחית של תאי B ליישומים ב- CLL, יהיה צורך גדול יותר בכלים המאפשרים הדמיה וניטור לא פולשניים של vivo הדמיה וניטור של תאי T מאמצים חדורים. הדמיה דינמית של תאי T תאפשר אימות של סחר תאי T אימוץ ואולי תאפשר גילוי מוקדם יותר של יעילות ורעילות.

NIS נחקר ואומת כמודל רגיש לתאי תמונה ווירוסים בניסויים קליניים32,42. הצטברות פיזיולוגית של עוקבים בסכום של ש"ח ניכרת בעיקר בבלוטת התריס/רוק, בקיבה ובשלפוחית השתן, שאינם איברים נפוצים המושפעים מגידולים נוזליים44. במיוחד ב- MM, תאי פלזמה ממאירים מופצים לעתים קרובות במח העצם או בעצמות, ופלזמה חוץ-רפואית בנגעים, שם מתרחשת הצטברות פיזיולוגית של עוקבים בסכום של ש"ח, היא תופעה נדירה44,45. יתר על כן, NIS אינו אימונוגני ולכן מתאים למחקרי הדמיה אורכית46. NIS הוא חלבון ממברנה מהותי המעביר יודיד לתוך הציטוסול ומכיל 13 מקטעי טרנסממברן פואטיים עם אתר מסוף אמינו חוץ-תאי וטרמינל קרבוקסיבי ציטוסולי47.

ניתן לדמיין ש"ח עם רדיואיזוטופים פולטי גמא או פוזיטרונים כגון טכנציום-99 מ' (99mTc) פרטקנטאט, יוד-123 (123I), 131I, 124I ו-[18F]TFB43. לאחרונה, [18F]TFB התגלה כיודיד אנלוגי מבטיח להדמיית PET מבוססת NIS, שכן יש לו תכונות ביוכימיות דומות והוא radiosynthesized48. יתרון אחד של TFB הוא שהוא אינו עובר התארגנות בתאי בלוטת התריס ולכן יש ספיגה קלה יחסית ברקמת בלוטת התריס הרגילה48. יתרון נוסף של TFB הוא מחצית החיים הקצרה של 109.8 דקות, בעוד מחצית החיים של עוקבים אחרים נע בין 12 שעות ל 8 ימים, אשר יכול להציג בעיות בטיחות עבור יישומים קליניים49. המגבלה העיקרית של הדמיית תאי CAR T מבוססת NIS היא שעוקבים, כולל TFB, אינם חודרים למחסום הדם - מוח (BBB), מה שמקשה על הערכת רעליות עצבית לאחר טיפול בתאי CAR T50,51,52,53.

רעלנות עצבית קשורה לחדירה של תאי T והפעלת תאי מיאלואידים במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, ברוב המקרים של רעלנות עצבית לאחר טיפול בתא CAR T, שלמות ה- BBB משובשת 50,54. לכן, לא ברור אם מכשיר המעקב אינו מסוגל לחצות את ה- BBB בהגדרה זו שנפרצה. מחקרים נוספים צריכים להתבצע כדי לאמת אם neurotoxicity לאחר טיפול בתא CAR T ניתן לדמיין עם [18F]TFB-PET. למרות שמחצית החיים הקצרה של [18F]TFB בטוחה לחולים ולצוות, היא מקשה על הרכש שלה עבור בית החולים. לכן, מכונים חייבים להיות מצוידים ציקלוטרון או יש גישה למתקן אזורי. המתודולוגיה המתוארת בפרוטוקול כאן יכולה להיות מיושמת באופן פוטנציאלי על מגוון של תאי CAR T אחרים באמצעות העברה כפולה כדי לדמיין ולהעריך תאי CAR T ב- vivo באמצעות סריקת [18F]TFB-PET.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SSK היא ממציאה של פטנטים באימונותרפיה לרכב המורשים לנוברטיס (באמצעות הסכם בין מאיו קליניק, אוניברסיטת פנסילבניה ונוברטיס) ומטפורג ' (באמצעות מרפאת מאיו). RS, MJC ו- SSK הם ממציאים על פטנטים בתחום האימונותרפיה של CAR המורשים להומניגן. SSK מקבלת מימון מחקרי מעפיפון, גלעד, ג'ונו, Celgene, נוברטיס, Humanigen, MorphoSys, טולרו, Sunesis, Leahlabs ו- Lentigen. דמויות נוצרו עם BioRender.com.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה באמצעות צינור K2R של מאיו קליניק (SSK), מרכז מרפאת מאיו לרפואה אישית (SSK) וקרן פרדילין (RS). איורים 1, 2 ו- 4 נוצרו עם BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 Gauge needle Covidien 8881250206
28 gauge insulin syringe BD 329461
96 well plate Corning 3595
Anti-human (ETNL) NIS Imanis REA009 ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 BioLegend 357507 Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 BioLegend 304032 Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 BioLegend 103116 Flow antibody
Anti-rabbit IgG R&D F0110 Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generation IDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5 Beckman Coulter C04652 flow cytometer
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips BD 309646
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechnology LUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) Gibco 14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner Siemens Medical Solutions USA, Inc. 10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquid Piramal Critical Care 66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging System PerkinElmer CLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer  124262
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile Thermo Scientific 450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile Thermo Scientific 450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson laboratory 05557
OPM-2 DSMZ CRL-3273 multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) Addgene 80389 lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
PMOD software PMOD PBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Innovative Research IPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) Gibco 21870-076
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450 density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
T175 flask Corning 353112
Terrell (isoflurane, USP) Piramal Critical Care Inc 66794-019-10
Webcol Alcohol Prep Covidien 6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Raje, N., et al. Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 380 (18), 1726-1737 (2019).
  3. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  4. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  5. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  6. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  7. Abramson, J. S., et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas (TRANSCEND NHL 001): a multicentre seamless design study. Lancet. 396 (10254), 839-852 (2020).
  8. Shah, B. D., et al. KTE-X19 for relapsed or refractory adult B-cell acute lymphoblastic leukaemia: phase 2 results of the single-arm, open-label, multicentre ZUMA-3 study. Lancet. 398 (10299), 491-502 (2021).
  9. Wang, M., et al. KTE-X19 CAR T-cell therapy in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 382 (14), 1331-1342 (2020).
  10. Jacobson, C. A., et al. Axicabtagene ciloleucel in relapsed or refractory indolent non-Hodgkin lymphoma (ZUMA-5): a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Oncology. 23 (1), 91-103 (2022).
  11. Munshi, N. C., et al. Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. New England Journal of Medicine. 384 (8), 705-716 (2021).
  12. Sakemura, R., Cox, M. J., Hefazi, M., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Resistance to CART cell therapy: lessons learned from the treatment of hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. , 1-18 (2021).
  13. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies. Frontiers in Immunology. 11, 1973 (2020).
  16. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  17. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  18. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  19. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  20. Krekorian, M., et al. Imaging of T-cells and their responses during anti-cancer immunotherapy. Theranostics. 9 (25), 7924-7947 (2019).
  21. Wei, W., Jiang, D., Ehlerding, E. B., Luo, Q., Cai, W. Noninvasive PET imaging of T cells. Trends in Cancer. 4 (5), 359-373 (2018).
  22. Volpe, A., et al. Spatiotemporal PET imaging reveals differences in CAR-T tumor retention in triple-negative breast cancer models. Molecular Therapy. 28 (10), 2271-2285 (2020).
  23. Minn, I., et al. Imaging CAR T cell therapy with PSMA-targeted positron emission tomography. Science Advances. 5 (7), (2019).
  24. Keu, K. V., et al. Reporter gene imaging of targeted T cell immunotherapy in recurrent glioma. Science Translational Medicine. 9 (373), (2017).
  25. Moroz, M. A., et al. Comparative analysis of T cell imaging with human nuclear reporter genes. Journal of Nuclear Medicine. 56 (7), 1055-1060 (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Imaging CAR T cell trafficking with eDHFR as a PET reporter gene. Molecular Therapy. 28 (1), 42-51 (2019).
  27. Weist, M. R., et al. PET of adoptively transferred chimeric antigen receptor T cells with (89)Zr-oxine. Journal of Nuclear Medicine. 59 (89), 1531-1537 (2018).
  28. Vedvyas, Y., et al. Longitudinal PET imaging demonstrates biphasic CAR T cell responses in survivors. JCI Insight. 1 (19), 90064 (2016).
  29. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion, Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  31. Penheiter, A. R., Russell, S. J., Carlson, S. K. The sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter for gene, viral, and cell-based therapies. Current Gene Therapy. 12 (1), 33-47 (2012).
  32. Msaouel, P., et al. Clinical trials with oncolytic measles virus: current status and future prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  33. Kalled, S. L., Hsu, Y. -M. Anti-BCMA antibodies. , WO/2010/10949 (2010).
  34. Carpenter, R. O., et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clinical Cancer Research. 19 (8), 2048-2060 (2013).
  35. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  36. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
  37. Absher, M. Tissue Culture: Methods and Applications. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press Inc. 395-397 (1973).
  38. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Chow, B., Seshagiri, S. A rapid method for estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), (2006).
  39. Smith, E. L., et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  40. Sakemura, R., et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood. , (2022).
  41. Jiang, H., et al. Synthesis of 18F-tetrafluoroborate via radiofluorination of boron trifluoride and evaluation in a murine C6-glioma tumor model. Journal of Nuclear Medicine. 57 (9), 1454-1459 (2016).
  42. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  43. Ravera, S., Reyna-Neyra, A., Ferrandino, G., Amzel, L. M., Carrasco, N. The sodium/iodide symporter (NIS): molecular physiology and preclinical and clinical applications. Annual Review of Physiology. 79, 261-289 (2017).
  44. Varettoni, M., et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: a longitudinal study on 1003 consecutive patients. Annals of Oncology. 21 (2), 325-330 (2010).
  45. Bladé, J., et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread, and treatment approach. Journal of Clinical Oncology. 29 (28), 3805-3812 (2011).
  46. Brunton, B., et al. New transgenic NIS reporter rats for longitudinal tracking of fibrogenesis by high-resolution imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14209 (2018).
  47. Dohán, O., et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocrine Reviews. 24 (1), 48-77 (2003).
  48. Jiang, H., DeGrado, T. R. 18F]Tetrafluoroborate ([18F]TFB) and its analogs for PET imaging of the sodium/iodide symporter. Theranostics. 8 (14), 3918-3931 (2018).
  49. Ahn, B. -C. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics. 2 (4), 392-402 (2012).
  50. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  51. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  52. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  53. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A Concise Review of Neurologic Complications Associated with Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  54. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).

Tags

חקר הסרטן גיליון 180 תא CAR T כתב NIS [18F]TFB-PET הדמיה לא פולשנית
הדמיה דינמית של תאי T קולטן אנטיגן כימרי עם [<sup>18F</sup>]טטרפלואורובורט טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים/טומוגרפיה ממוחשבת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal,… More

Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal, A., Roman, C. M., Hefazi, M., Vernon, C. J., Glynn, D. L., Pandey, M. K., DeGrado, T. R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography. J. Vis. Exp. (180), e62334, doi:10.3791/62334 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter