Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [18F]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi

Published: February 17, 2022 doi: 10.3791/62334
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4,5, 1,2, 3, 3, 3, 3, 1,2, 1,2,5,6
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

Summary

Bu protokol, klinik olarak mevcut bir platformla kimerik antijen reseptörlerini in vivo olarak eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış T hücrelerini invaziv olmayan bir şekilde izleme metodolojisini açıklamaktadır.

Abstract

Kimerik antijen reseptörlerini (CAR) eksprese etmek için genetik olarak tasarlanmış T hücreleri, B hücreli maligniteleri veya multipl miyelom (MM) olan hastalar için önemli klinik çalışmalarda benzeri görülmemiş sonuçlar göstermiştir. Bununla birlikte, çok sayıda engel etkinliği sınırlamakta ve CAR T hücre tedavilerinin yaygın kullanımını, tümör bölgelerine kötü kaçakçılık ve infiltrasyonun yanı sıra in vivo kalıcılık eksikliği nedeniyle yasaklamaktadır. Ayrıca, sitokin salınım sendromu veya nörotoksisite gibi hayatı tehdit eden toksisiteler önemli endişelerdir. CAR T hücrelerinin verimli ve hassas görüntülenmesi ve izlenmesi, T hücresi kaçakçılığının, genişlemesinin ve in vivo karakterizasyonunun değerlendirilmesini sağlar ve CAR T hücre tedavisinin mevcut sınırlamalarının üstesinden gelmek için stratejilerin geliştirilmesine olanak tanır. Bu yazıda sodyum iyodür sempatizanının (NIS) CAR T hücrelerine dahil edilmesi ve preklinik modellerde [18F]tetrafloroborat-pozitron emisyon tomografisi ([18F]TFB-PET) kullanılarak CAR T hücre görüntülemesi için metodoloji anlatılmaktadır. Bu protokolde açıklanan yöntemler, bu çalışmada kullanılanlara ek olarak diğer CAR yapılarına ve hedef genlere uygulanabilir.

Introduction

Kimerik antijen reseptörü T (CAR T) hücre tedavisi, hematolojik malignitelerde hızla ortaya çıkan ve potansiyel olarak küratif bir yaklaşımdır1,2,3,4,5,6. CD19 yönelimli CAR T (CART19) veya B hücre olgunlaşma antijeni (BCMA) CAR T hücre tedavisinden sonra olağanüstü klinik sonuçlar bildirilmiştir2. Bu, agresif B hücreli lenfoma (aksikabagen ciloleucel (Axi-Cel)4, tisagenlecleucel (Tisa-Cel)3 ve lisocabtagene maraleucel)7, akut lenfoblastik lösemi (Tisa-Cel)5,8, mantle hücreli lenfoma (brexucabtagene autoleuce)9 ve foliküler lenfoma (Axi-Cel)10 için ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) CART19 hücrelerinin onaylanmasına yol açmıştır. . Son zamanlarda, FDA, multipl miyelom (MM) (idecabtagene vicleucel)11 hastalarında BCMA yönelimli CAR T hücre tedavisini onayladı. Ayrıca, kronik lenfositik lösemi (KLL) için CAR T hücre tedavisi geç evre klinik gelişim aşamasındadır ve önümüzdeki üç yıl içinde FDA onayı alması beklenmektedir1.

CAR T hücre tedavisinin benzeri görülmemiş sonuçlarına rağmen, yaygın kullanımı 1) yetersiz in vivo CAR T hücre genişlemesi veya tümör bölgelerine zayıf kaçakçılık, daha düşük kalıcı yanıt oranlarına yol açar12,13 ve 2) sitokin salınım sendromu (CRS) dahil olmak üzere hayatı tehdit eden advers olayların gelişmesi14,15 ile sınırlıdır. . CRS'nin ayırt edici özellikleri arasında sadece inflamatuar sitokin/kemokinlerin yüksek düzeyleriyle sonuçlanan immün aktivasyon değil, aynı zamanda CAR T hücre infüzyonundan sonra masif T hücre proliferasyonu da bulunmaktadır15,16. Bu nedenle, CAR T hücrelerini in vivo olarak görüntülemek için doğrulanmış, klinik sınıf bir stratejinin geliştirilmesi, 1) CAR T hücresinin tümör bölgelerine kaçakçılığını izlemek ve potansiyel direnç mekanizmalarını ortaya çıkarmak için in vivo olarak gerçek zamanlı olarak izlenmesine ve 2) CAR T hücresi genişlemesinin izlenmesine ve CRS'nin gelişimi gibi toksisitelerini potansiyel olarak tahmin etmesine izin verecektir.

Hafif KRS'nin klinik özellikleri yüksek ateş, yorgunluk, baş ağrısı, döküntü, ishalji, artralji, miyalji ve halsizliktir. Daha şiddetli KRS'de hastalarda taşikardi/hipotansiyon, kılcal damar kaçağı, kardiyak disfonksiyon, böbrek/karaciğer yetmezliği ve yaygın intravasküler pıhtılaşma gelişebilir17,18. Genel olarak, interferon-gama, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör, interlökin (IL)-10 ve IL-6 dahil olmak üzere sitokinlerin yükselme derecesinin klinik semptomların şiddeti ile ilişkili olduğu gösterilmiştir17,19. Bununla birlikte, CRS'yi tahmin etmek için "gerçek zamanlı" serum sitokin izlemenin kapsamlı bir şekilde uygulanması, yüksek maliyet ve sınırlı kullanılabilirlik nedeniyle zordur. CAR T hücre tedavisinin yararlı özelliklerinden yararlanmak için, evlat edinen T hücrelerinin non-invaziv görüntülemesi, CAR T hücre infüzyonundan sonra etkinliği, toksisiteleri ve nüksetmeyi tahmin etmek için potansiyel olarak kullanılabilir.

Birçok araştırmacı, pozitron emisyon tomografisi (PET) veya tek foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) ile radyonüklid tabanlı görüntülemeyi kullanmak için stratejiler geliştirmiştir, bu da yüksek çözünürlük ve yüksek hassasiyet sağlar20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 CAR T hücre kaçakçılığının in vivo görselleştirilmesi ve izlenmesi. Bu radyonüklid tabanlı görüntüleme stratejileri arasında, sodyum iyodür simporter (NIS), PET taramaları kullanılarak görüntü hücrelerine ve virüslere duyarlı bir yöntem olarak geliştirilmiştir31,32. [18F]TFB-PET ile NIS+CAR T hücre görüntüleme, CAR T hücresi genişlemesini, kaçakçılığını ve toksisitesini değerlendirmek ve teşhis etmek için hassas, verimli ve kullanışlı bir teknolojidir30. Bu protokol 1) yüksek etkinlikli çift transdüksiyon yoluyla NIS + CAR T hücrelerinin gelişimini ve 2) NIS + CAR T hücrelerini [18F] TFB-PET taraması ile görüntülemek için bir metodolojiyi açıklar. MM için BCMA-CAR T hücreleri, NIS'i CAR T hücresi görüntüleme için bir muhabir olarak tanımlamak için bir kavram kanıtı modeli olarak kullanılır. Bununla birlikte, bu metodolojiler başka herhangi bir CAR T hücre tedavisine uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal İnceleme Kurulu, Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi ve Mayo Clinic'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerini takip etmektedir.

1. NIS + BCMA-CAR T hücre üretimi

NOT: Bu protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB 17-008762) ve Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin (IBC Bios00000006.04) yönergelerini takip eder.

  1. BCMA-CAR, NIS ve lusiferaz-yeşil floresan protein (GFP) kodlayan lentivirüslerin üretimi.
    NOT: İkinci nesil BCMA-CAR yapısı de novo olarak sentezlendi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bir uzama faktörü-1 alfa (EF-1α) promotorunun kontrolü altında üçüncü nesil bir lentiviral vektöre klonlandı. BCMA-CAR yapısı (C11D5.3-41BBz), 4-1BB kostimülasyonu ve bir anti-insan BCMA antikor klonu C11D5.333,34'ten türetilen tek zincirli değişken bir fragman (scFv) içeriyordu. NIS, EF-1α promotorunun kontrolü altındadır ve kendiliğinden yarılan peptitler (P2A) aracılığıyla puromisin direnç genine bağlanır. Lusiferaz-GFP'yi kodlayan lentiviral vektör (Malzeme Tablosuna bakınız), daha sonra GFP ve lusiferazı eksprese eden tümör hücrelerini dönüştürmek için kullanılır.
    1. Lentiviral vektör plazmidlerini hazırlayın: pLV-EF1α-BCMA-CAR (15 μg), pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro (15 μg) ve pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro (15 μg).
      NOT: pBMN-CMV-GFP-Luc2-Puro ve pLV-EF1α-NIS-P2A-Puro puromisin direnç genini içerir. Bu nedenle, NIS veya lusiferaz-GFP-transdüke edilmiş hücreler, daha önce tarif edildiği gibi, 1 μg / mL veya 2 μg / mL puromisin dihidroklorür ile seçilebilir14,35.
    2. Tohum 20, bir T175 şişesindeki 293T hücrelerinin 106'sını × ve 37 ° C'de 24 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edilir. 293T hücrelerinin, mikroskop altında doğrudan görselleştirme yoluyla% 70-90 birleşimde şişe üzerinde eşit olarak dağıtıldığını doğrulayın.
    3. İfade vektörünün 15 μg'lık bir ana karışımını (örneğin, CAR, NIS veya lusiferaz-GFP doğrusal DNA), 7 μg zarf vektörünün (VSV-G) ve ambalaj vektörünün 18 μg'sini (gag, pol, rev ve tat) hazırlayın. DNA ana karışımını transfeksiyon ortamının 4.5 mL'sinde seyreltin ve ardından ön kompleksleme reaktifinin 111 μL'sini (Karışım A) ekleyin.
    4. Yeni bir tüp hazırlayın ve lipozomal transfeksiyon reaktifinin 129 μL'sini transfeksiyon ortamının 4.5 mL'sinde seyreltin (Karışım B).
    5. A ve B karışımlarını birleştirin ve içindekileri karıştırmak için tüpü hafifçe kaydırın. Oda sıcaklığında (RT) 30 dakika inkübe edin.
    6. Kuluçkadan sonra, hücreleri ayırmadan hücre süpernatantını aspire edin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin-streptomisin-glutamin içeren bir büyüme ortamının 16 mL'sini ekleyin. Ardından, A ve B karışımlarının karışımını 293T hücrelerine damla damla ekleyin. Son olarak, transfekte edilen hücreleri 37 ° C'de, 24 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
    7. Transfeksiyon sonrası 1. ve 2. günlerde, 293T'nin süpernatantını hasat edin, 10 dakika boyunca 900 × g'da döndürün ve 0.45 μm naylon filtreden süzün. Filtratın 24 ve 48 s'de ultrasantrifüjleme ile 2 saat boyunca 112.700 × g'de konsantre olun ve -80 °C'de dondurun.
  2. Ex-vivo T hücresi izolasyonu (Şekil 1)
    NOT: Tüm hücre kültürü çalışmalarını aseptik teknik ve kişisel koruyucu ekipman kullanarak laminer akış kabininde gerçekleştirin. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler), aferez sırasında toplanan sağlıklı gönüllü donör kanından toplanır36. Bu çalışmada kullanılan insan hücreleri üzerinde patojen taraması yapıldı.
    1. PBMC'leri izole etmek için standart yoğunluk gradyanı tekniğini kullanın.
      1. Hava kabarcıkları oluşturmadan 50 mL yoğunluklu gradyan bir ayırma tüpüne nazikçe 15 mL yoğunluk gradyan ortamı (1.077 g / mL yoğunluğu) (alfa-D-glukopiranosid, beta-D-fruktofuranosil homopolimer ve 3-(asetilamino)-5-(asetilmetilamino)-2,4,6-triodobenzoik asit monosodyum tuzu) ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      2. Hücre sıkışmasını önlemek için, kan örneğini 1:1 hacim oranında %2 FBS içeren fosfat tamponlu salin (PBS, 0,2 g/L potasyum klorür, 0,2 g/L potasyum fosfat monobazik, 8 g/L sodyum klorür ve 1,15 g/L sodyum fosfat dibazik) ile seyreltin. Seyreltilmiş kanı, ikisi arasındaki arayüzü kırmadan yoğunluk gradyanı ortamının üzerine yavaşça aktarın. RT'de 10 dakika boyunca 1.200 × g'de döndürün.
        NOT: Bir kan örneğinin 4-17 mL'sinin izolasyonu için 50 mL yoğunluklu gradyan ayırma tüpü kullanılabilir. Bu protokolde kullanılan 50 mL yoğunluklu gradyan ayırma borusu ( Malzeme Tablosuna bakınız), santrifüjleme sırasında "fren kesme" gerektirmez. Bununla birlikte, standart 50 mL borular kullanıldığında, frenin kapalı olması gerekir ve 30 dakikalık santrifüjleme gerektirir.
      3. Süpernatantı yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın, 50 mL'ye kadar doldurarak PBS +% 2 FBS ile yıkayın ve ardından RT'de 8 dakika boyunca 300 × g'de aşağı doğru döndürün.
      4. Süper nantantı aspire edin ve peletlenmiş hücreleri 50 mL PBS +% 2 FBS'de yeniden askıya alın. Hücre sayısını sayın ve ardından RT'de 8 dakika boyunca 300 × g'de aşağı doğru döndürün.
    2. Süper nantantı aspire edin ve peletlenmiş hücreleri PBS +% 2 FBS ile 50 × 106 hücre / mL konsantrasyonuna yeniden askıya alın.
    3. Negatif seçim manyetik boncuk kiti kullanarak PBMC'lerden T hücresi yalıtımı gerçekleştirin.
      NOT: İdeal bir negatif seçim kiti, T hücreleri dışındaki hücrelerde eksprese edilen antijenlere karşı antikorlara bağlı manyetik boncuklar içerir. Yaygın olarak kullanılan bir kit, CD15, CD14, CD34, CD36, CD56, CD123, CD235a, CD19 ve CD16'ya karşı manyetik boncuklara konjuge edilmiş antikorlar içerir (bkz.
      1. PBMC'leri 14 mL'lik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Ardından, PBMC'leri ve negatif seleksiyon antikor kokteylini tam otomatik bir hücre ayırıcıya yerleştirin ve üreticinin protokolüne göre T hücresi izolasyonu gerçekleştirin.
  3. T hücresi stimülasyonu ve T hücresi genişlemesi (Şekil 1)
    1. İzole T hücrelerini kültürlemek için,% 10 insan serum albümini ve% 1 penisilin-streptomisin-glutamin ile desteklenmiş serumsuz hematopoetik hücre ortamı ile yapılan T hücresi genişleme ortamını (TCM) hazırlayın14. T hücre izolasyonundan sonra, hücreleri ve kültürü TCM ile 2 × 106 hücre / mL konsantrasyonda sayın.
    2. T hücreleri ile kültürlemeden önce anti-CD3 / CD28 boncuklarını TCM ile üç kez yıkayın.
      1. Boncukları içeren şişeyi döndürerek karıştırın. Daha sonra, gerekli boncuk hacmini (3: 1 boncuklar: hücre) pipetleyin (örneğin, 1.0 × 106 T hücresi hücresini uyarırken, 3.0 × 106 anti-CD3 / CD28 boncuk kullanın) steril bir mikrosantrifüj tüpüne (1.5 mL) yerleştirin ve 1 mL'lik TCM'de askıya alın.
    3. Mikrosantrifüj tüpünü boncuklarla birlikte 1 dakika boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirin ve süpernatanı aspire edin. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve yıkanmış boncukları 1 mL TCM'de yeniden askıya alın. Toplam 3 yıkama için önceki iki adımı tekrarlayın.
    4. Boncukları 1 mL TCM'de yeniden askıya alın ve T hücrelerine aktarın. Daha sonra, T hücrelerini TCM ile 1.0 × 106 hücre / mL'lik bir son konsantrasyona seyreltin. T-hücresi/boncuk süspansiyonunu doku kültürü ile muamele edilmiş 6 delikli bir plakaya aktarın ve inkübatöre yerleştirin (37 °C, %5 CO2).
  4. Lentivirüslerin titrasyonunun yapılması (Şekil 2)
    1. T hücrelerini titrasyon testi için hazırlayın. Bir virüs türünü titre etmek için yaklaşık 1,0 x 106 hücrenin kullanılabilir olduğundan emin olun.
    2. Bölüm 1.3.2'de açıklandığı gibi T hücrelerini uyarın.
    3. Plaka 1.0, 96 delikli bir plakada (titre plakası) 105 hücreli uyarılmış T hücresi × ve 37 ° C'de, 24 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edilir (Şekil 2A). Bölüm 1.2'de açıklandığı gibi T hücrelerini izole edin ve uyarın.
    4. Belirlenen kolonların kuyucuklarına ve dönüştürülmemiş kontrol kuyularına 100 μL TCM ekleyerek bir seyreltme plakası (96 delikli plaka) hazırlayın (Şekil 2B).
    5. Bir şişe lentiviral partikülü buz üzerinde çözün ve iyice karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipet çekin. Virüs süpernatantının 50 μL'sini, 96 delikli plakanın Sütun 6'sının kuyularına aktarın (seyreltme 3) (Şekil 2B). İyice karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin.
    6. Seri seyreltmeler gerçekleştirin (2 katlı seri seyreltme): A6 kuyusundan B6 kuyusuna 50 μL ve daha sonra B6 kuyusundan C6 kuyusuna 50 μL aktarın; G6'ya kadar tekrarlayın. Daha sonra, seyreltilmiş virüsün 50 μL'sini titre plakasına ekleyin (Şekil 2B).
    7. Titer plakasını 37 °C'de, 48 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edin ve akış sitometrisi ile CAR-, NIS veya GFP-pozitif hücrelerin yüzdelerini belirleyin (Şekil 2C).
      1. Titre plakasını 3 dakika boyunca 4 °C'de 650 × g'de iki kez döndürerek kuyuları yıkayın.
      2. Dönüştürülen T hücrelerini 1.5.3 ila 1.5.9 arasındaki adımlarda açıklandığı gibi sabitleyin.
      3. Titreleri CAR-, NIS veya GFP-pozitif hücrelerin yüzdelerine göre formül (1) kullanarak belirleyin:
        Titers = BCMA-CAR + veya NIS + T hücrelerinin yüzdesi × spesifik seyreltme / hacim × transdüksiyonda T hücre sayısı (1)
  5. Lentivirüslerin ve NIS'in transdüksiyonu+BCMA-CAR T hücre genişlemesi
    1. T hücresi stimülasyonundan yirmi dört ila 48 saat sonra, uyarılmış T hücreleri üzerinde lentiviral transdüksiyon yapın (T hücreleri kümeler oluşturmalıdır).
      1. CAR veya NIS kodlayan donmuş lentivirüsleri 4 °C'de çözün.
      2. Kümeleri parçalamak için uyarılmış T hücrelerini iyice karıştırın ve 5.0'lık bir enfeksiyon çokluğuna (MOI) taze çözülmüş virüs ekleyin (1.0 × 106 T hücrelerini dönüştürürken, 5.0 × 106 lentivdemir kullanın). Dönüştürülmüş hücreleri 37 °C'de,% 5 CO2'de inkübe edin.
      3. 3, 4 ve 5. günlerde, bir hematositometre37 veya tam otomatik bir hücre sayacı38 kullanarak dönüştürülmüş T hücrelerini sayın ve taze, önceden ısıtılmış TCM ekleyerek hücre konsantrasyonunu 1.0 × 106 hücre / mL'ye ayarlayın. Puromisin direnç genini taşıyan NIS ile dönüştürülmüş T hücreleri için, hücreleri 3, 4 ve 5. günlerde 1 μg / mL puromisin dihidroklorür ile tedavi edin.
    2. 6. günde, anti-CD3 / CD28 boncuklarını dönüştürülmüş T hücrelerinden (adım 1.3.4'ten) T hücre kümelerini parçalamak için iyice karıştırarak ve 1 dakika boyunca bir mıknatısa yerleştirerek çıkarın. Daha sonra, toplanan dönüştürülmüş T hücrelerini kültüre 1.0 × 106 hücre / mL'lik bir konsantrasyonda geri yerleştirin. Boncukları T hücrelerinden çıkardıktan sonra, akış sitometrisi ile CAR ve NIS ekspresyonunu değerlendirin.
      NOT: BCMA-CAR'ın tek zincirli değişken parçası fareden türetildiğinden, Alexa Fluor 647 ile konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG (H + L) ile boyanabilir. NIS, anti-insan ETNL [aa625-643'e (SWTPCVGHDGGRDQQETNL) karşılık gelen sentetik peptid] kullanılarak tespit edilebilir. Bu antikor, NIS'in sitozolik C-terminusunu tanır. Bu nedenle, T hücreleri inkübasyondan önce bir anti-insan NIS antikoru ile geçirgenleştirilmelidir.
    3. BCMA-CAR'ın yüzey boyamasını keçi fare karşıtı IgG (H+L) kullanarak gerçekleştirin.
      1. Kültürün bir alikotunu alın (örneğin, 50.000 T hücresi) ve akış tamponu (PBS,% 1 FBS ve% 1 sodyum azid) ile yıkayın. Daha sonra, hücreleri 50 μL akış tamponu ile yeniden askıya alın ve hücreleri CAR ekspresyonunu tespit etmek için 1 μL keçi anti-fare antikoru ve ölü hücreleri dışlamak için 0.3 μL canlı-ölü su ile lekeleyin.
      2. RT'de karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin, 150 μL akış tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve hücreleri 4 ° C'de 3 dakika boyunca 650 × g'de santrifüj edin.
    4. Yüzey CAR boyamasından sonra, 100 μL fiksasyon ortamı (% 4.21 formaldehit içeren PBS) ekleyerek hücreleri sabitleyin ve geçirgenleştirin ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. Hücreleri, saponin gibi hücre geçirgenleştirici bir ajan içeren 100 μL'lik bir tamponla iki kez yıkayın (4 ° C'de 3 dakika boyunca 650 × g).
    5. Sabit / geçirgenleştirilmiş hücreleri, geçirgenleştirici bir tamponun 50 μL'sinde yeniden askıya alın. Daha sonra, 50 μL akış tamponuna 0.3 ng anti-insan ETNL NIS antikoru ekleyin ve 4 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
    6. 150 μL akış tamponu ekleyin ve hücreleri 4 ° C'de 3 dakika boyunca 650 × g'de santrifüj edin. 4 °C'de 30 dakika boyunca 50 μL akış tamponunda 2.5 μL anti-tavşan sekonder antikoru ile hücreleri inkübe edin, 150 μL akış tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve 4 ° C'de 3 dakika boyunca 650 × g'da santrifüj yapın.
    7. Son olarak, 200 μL akış tamponunda yeniden askıya alın ve iletim verimliliğini belirlemek için akış sitometrisi yapın (Şekil 3A, B).
    8. 8. günde, T hücrelerini 300 × g'de 4 ° C'de 8 dakika boyunca sayın ve döndürün. T hücrelerini dondurucu ortam (% 90 FBS +% 10 dimetilsülfoksit [DMSO]) ile 10 × 106 / mL konsantrasyonda yeniden askıya alın, ardından her biri 1 mL'yi etiketli kriyovyallere aktarın.
    9. Şişeleri 48 saat boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya koyun. 48 saat sonra (ve 10. günde), T hücrelerini sıvı azota aktarın.
      NOT: NIS+ CAR T hücre üretimine genel bakış için Şekil 1'e bakın. Şekil 3D, üç farklı donörden ex vivo T hücre genişlemesi örneklerini temsil etmektedir.

2. [ 18F] TFB-PET taraması ile NIS + BCMA-CAR T hücre görüntüleme

NOT: Bu protokol, Mayo Clinic'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC A00001767-16), IRB ve IBC'nin (Bios00000006.04) yönergelerini takip eder. OPM-2, genellikle BCMA-CAR T hücreleri için hedef hücre hattı olarak kullanılan bir BCMA + MM hücre hattıdır39,40.

  1. Lusiferaz + BCMA + OPM-2 hücreleri oluşturun.
    1. Doku kültürü ile muamele edilmiş 24 kuyucuklu bir plakada 500.000 OPM-2 hücresi tohumlayın. 4 °C'de lusiferaz-GFP kodlayan lentivirüs kodlamasını çözün.
    2. Yeni çözülmüş virüsü 3.0'lık bir MOI'de OPM-2 hücrelerine ekleyin ve pipetleyerek, iyice karıştırın. Plakayı inkübatöre yerleştirin (37 °C,% 5 CO2).
    3. Transdüksiyondan kırk sekiz saat sonra, dönüştürülen hücreleri seçmek için 2 μg / mL puromisin ekleyin. Transdüksiyondan dört gün sonra, GFP-pozitif hücreleri (lusiferaz-pozitif) akış sitometrisi ile değerlendirin (Şekil 3E).
  2. BCMA+ OPM-2 xenograft fare modellerini oluşturun (Şekil 4).
    1. Lusiferaz + OPM-2 hücrelerini sayın ve tüm hücre kültürü ortamını çıkarmak için bunları iki kez aşağı doğru döndürün. OPM-2 hücrelerini PBS ile 10 × 106 hücre / mL konsantrasyonda yeniden askıya alın.
    2. -21. günde, 8-12 haftalık bağışıklık sistemi baskılanmış NOD-scid IL2rγnull (NSG) farelerin kuyruklarına 100 μL (1.0 × 106 hücre) lusiferaz + OPM-2 hücresi enjekte edin (Şekil 4).
    3. OPM-2 hücre enjeksiyonundan sonraki 20. günde (CAR T hücre enjeksiyonunun -1. günü), biyolüminesans görüntüleme (BLI) yoluyla tümör yükünü kontrol edin (Şekil 4).
      NOT: OPM-2 hücreleri, engraft edilmesi genellikle 2-3 hafta süren yavaş büyüyen bir tümör oluşturur.
    4. İntraperitoneal (IP) enjeksiyon yoluyla OPM-2 ksenogreft farelere 10 μL / g D-lusiferin uygulayın. 10 dakika sonra,% 2 izofluran gazının altındaki fareler üzerinde BLI yapın (Şekil 5A). Tümör engraftmanını doğruladıktan sonra, fareleri tümör yüküne göre randomize edin.
    5. CAR T hücre enjeksiyonunun -1. gününde, NIS + BCMA-CAR T hücrelerini çözün ve donma ortamını santrifüjleme ile çıkarın (300 × g, 8 dakika, 4 ° C). Daha sonra, TCM'li hücreleri 2.0 × 106 hücre / mL'de yeniden askıya alır ve gece boyunca inkübe eder (37 ° C,% 5 CO2).
    6. 0. günde, NIS + BCMA-CAR T hücrelerini (300 × g, 8 dakika, 4 ° C) sayın ve santrifüj edin. NIS + BCMA-CAR T hücrelerini PBS ile 50 × 106 hücre / mL'de yeniden askıya alın.
    7. OPM-2 ksenogreft farelere kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla NIS + BCMA-CAR T hücrelerinin 100 μL (5.0 × 106 hücre) uygulayın. 7. ve 15. günlerde, fareleri bir PET taraması kullanarak görüntüleyin.
  3. BCMA+OPM-2 ksenograft fare modeli kullanılarak NIS+BCMA-CAR T hücreli in vivo görüntüleme.
    1. Görüntülemeden önce fareleri tartın ve metalle ilgili eserleri ortadan kaldırmak için metal kulak etiketlerini çıkarın.
    2. [18F]TFB'yi daha önce açıklandığı gibi hazırlayın41.
      NOT: [18F]TFB, kullanıldığı gün üretilmelidir. Radyokimyasal saflık% >99 ve molar aktivite >5 GBq / mmol olmalıdır.
    3. 9.25 MBq [18F]TFB'yi kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla intravenöz olarak enjekte edin. Radyotracer'in vücutta dağıtılması ve kanın temizlenmesi için ~ 40 dakikalık bir alım süresine izin verin.
    4. İzofluran inhalasyonu kullanarak fareyi uyuşturun (%2).
      NOT: İzofluran hızlı ve güvenilir başlangıç ve iyileşmeye sahip olduğu için tercih edilen inhale anesteziktir.
    5. Fareyi anestezi yapmadan önce, anestezi makinesinin tüm yüzeylerini dezenfektan temizleyicilerle temizleyin.
    6. Fareyi indüksiyon odasının içine yerleştirin. Buharlaştırıcı kadranını %2'ye getirin ve farenin 1-2 dakika içinde yaslanmış ve yanıt vermemesini bekleyin.
    7. Yetersiz anesteziden veya solunum fonksiyonlarının aşırı depresyonundan kaçınmak için fareyi izleyin. Kısacası, yetersiz anesteziyi doğrulamak için ayak parmağınızı sıkıştırın.
      NOT: Normal solunum hızı 180/dk'ya kadardır ve kabul edilebilir düşme oranı %50'dir.
    8. Kornea kurumasını ve travmayı önlemek için oftalmik merhem uygulayın.
    9. Bir mikro PET/BT görüntüleme iş istasyonunda anestezi uygulanan fare ile enjeksiyondan 45 dakika sonra PET/BT görüntüleri elde edin (bkz. Ardından, 15 dakika boyunca statik PET görüntüleri elde edin, ardından 500 μA, 80 keV ve 200 ms pozlamada 360 ° döndürme ve 180 projeksiyonla 5 dakika boyunca BT görüntü alımı elde edin.
  4. Elde edilen görüntüleme verilerinin analizi
    1. PET görüntü işleme yazılımını kullanarak görüntüleri analiz edin (Şekil 5B ve Ek Video S1).
    2. İlgi hacmini (VOI) tanımlayın.
    3. (2) formülünü kullanarak standartlaştırılmış alım değerini (SUV) hesaplayın.
      VOI'de SUV = VOI'deki aktivite konsantrasyonu (MBq / mL) × vücut ağırlığı (g) / uygulanan doz (MBq) (2)
  5. Akım sitometrisi ile tümör bölgelerine NIS+BCMA-CAR T hücre kaçakçılığının doğrulanması
    1. [18F]TFB-PET görüntülemeden sonra, fareyi tekrar kafese yerleştirin. Anestezinin kesilmesini takiben, hayvanları amaçlı hareket edebilene kadar izleyin ve yiyecek ve suya erişimlerinin olduğundan emin olun.
    2. Enjekte edilen [18F] TFB'nin çürümesine kadar fareleri izleyin. Radyoizotop tespit edilemediğinde, fareleri CO2 ile ötenazileştirin.
    3. Ötenazi yapmak için, fareleri kafese yerleştirin (kafes başına en fazla 5 fare).
    4. Yaklaşık 5-10 dakika içinde solunumun tamamen durmasına kadar fareleri CO2'ye maruz bırakın.
      NOT: Bu ötenazi yöntemi, AVMA Hayvanların Ötenazisi Kılavuzu (2020 Sürümü) ile tutarlı olmalıdır.
    5. Farelerin ölümünü sağlamak için, başın arkasını ve hayvanın kuyruğunun tabanını kavrayarak, ardından elleri birbirinden ayırarak / birbirinden uzaklaştırarak servikal çıkık gerçekleştirin.
    6. NIS + BCMA-CAR T hücrelerinin tümör bölgesine verimli bir şekilde trafik çektiğini doğrulamak için kemik iliğini toplayın.
    7. Hasat edilen femurları ve tibiayı, 5 mL hücre kültürü ortamı içeren 6 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Kasları ve tendonları femurlardan ve tibiadan çıkarın ve femurların ve tibiaların her iki ucunu da (eklemlerin üstünde) kesin.
    8. Bir insülin şırıngasını hücre kültürü ortamıyla doldurun ve kemik iliğini 6 delikli plakaya yıkayın. Femurlar için, 22 G iğne ve 5 mL şırınga kullanın, çünkü femur çapı tibianınkinden daha büyüktür.
    9. Kemik iliğini öğütmek için pistonun düz ucunu kullanın. Steril 50 mL konik tüp üzerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve öğütülmüş kemik iliğini filtreleyin. Ardından, tüpü akış tamponuyla doldurun ve tüpü 4 ° C'de 8 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj edin.
    10. Süpernatanı aspire edin ve kemik iliğini 5 mL akış tamponu ile yeniden askıya alın. 200 μL kemik iliğini 96 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Plakayı 4 °C'de 3 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın. Süper natantı boşaltın ve hücreleri 50 μL akış tamponu ile yeniden askıya alın.
    11. Kemik iliğini, 0.25 μg fare CD45, 0.03 μg insan CD45, 0.06 μg insan CD3, 0.24 μg insan BCMA ve 0.3 μL canlı/ölü suya karşı akış antikorları ile lekeleyin. Plakayı karanlıkta RT'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
    12. Plakayı 4 °C'de 3 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj yapın. Ardından, 200 μL akış tamponu ekleyin ve akış sitometresinde çalıştırın (Şekil 5C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1 , NIS + BCMA - CAR T hücreleri oluşturma adımlarını göstermektedir. 0. günde, PBMC'leri izole edin ve ardından negatif seleksiyonla T hücrelerini izole edin. Daha sonra, T hücrelerini anti-CD3 / CD28 boncuklarla uyarın. 1. günde, T hücrelerini hem NIS hem de BCMA-CAR lentivirüsleri ile dönüştürün. 3, 4 ve 5. günlerde, T hücrelerini sayın ve konsantrasyonu 1.0 × 106 / mL olarak ayarlamak için medya ile besleyin. NIS ile dönüştürülmüş T hücreleri için, NIS + hücrelerini seçmek üzere 1 μg / mL puromisin ekleyin. 6. günde, hücreleri bir dakika boyunca mıknatısa yerleştirerek boncukları çıkarın. Ardından, boncuksuz hücreleri tüpten yeni bir şişeye koyun. Bir hücre aliquot alın (örneğin, 50.000 hücre) ve akış sitometrisi kullanarak T hücrelerinin yüzeyindeki NIS ve CAR ekspresyonunu kontrol etmek için antikorlarla lekeleyin. 8. günde, T hücrelerini sayın ve 10 × 106 / mL konsantrasyonunda dondurucu ortamlarla kriyoproteksiyon yapın.

Şekil 2, lentivirüslerin titre edilmesinin ana hatlarını temsil etmektedir. 0. günde, T hücrelerini TCM'de 1.0 × 106 / mL konsantrasyonunda yeniden askıya alın. Daha sonra, T hücrelerini anti-CD3 / CD28 boncuklarla 1: 3 hücre: boncuk oranında uyarın. Şekil 2A'da gösterildiği gibi renkli kuyucuklara 100 μL (100.000 hücre) T hücresi ekleyin. Bu plakaya "titre plakası" denir. Titer plakasını 37 °C'de inkübe edin, 24 saat boyunca% 5 CO2. 1. günde, seyreltme plakasını hazırlayın. Şekil 2B'de gösterildiği gibi renkli kuyucuklara 100 μL TCM ekleyin. Ardından, ilk sıraya 50 μL taze çözülmüş lentivirüs ekleyin (örneğin, Şekil 2B'de gösterildiği gibi A6, A7 veya A8). 50 μL'yi A6'dan B6'ya ve ardından 50 μL'yi B6'dan C6'ya aktararak seri seyreltme gerçekleştirin ve G6'ya kadar tekrarlayın. A7 ve A8 için de seri seyreltme gerçekleştirin. Daha sonra seyreltilmiş virüsün 50 μL'sini titre plakasına aktarın. Virüsü seyreltme plakasından titre plakasına aktardıktan yirmi dört saat sonra, hücreleri 100 μL TCM ile besleyin. 3. günde, hücreleri antikorlarla boyayın ve akış sitometrisi ile T hücreleri üzerindeki NIS ve BCMA ekspresyonunu analiz edin.

Şekil 3A,B, BCMA-CAR T veya NIS + BCMA-CAR T hücrelerinin temsili akış grafiklerini göstermektedir. T hücreleri FSC / SSC üzerinde kapılıdır, bunu singlet ve canlı hücre ayrımı izler. Hücrelerin% 90'ından fazlası NIS + hücreleridir (Şekil 3B). Şekil 3C, NIS + BCMA-CAR T hücrelerinin bileşimi için temsili akış grafiğini göstermektedir. Şekil 3A, B'ye benzer şekilde, T hücreleri FSC / SSC'de kapılıdır, bunu singlet ve canlı hücre ayrımı izler. Şekil 3B, 0 ila 8. günler arasındaki T hücresi genişleme eğrisini göstermektedir. UTD, BCMA-CAR T veya NIS + BCMA-CAR T hücreleri arasında katlama genleşme farkı yoktur. Şekil 3E, GFP ve lusiferazı kodlayan lentivirüsün transdüksiyonundan sonra OPM-2 hücreleri üzerindeki GFP ekspresyonunu ve ardından puromisin seçimini göstermektedir.

Şekil 4, NIS + BCMA-CAR T hücrelerinin [18F] TFB-PET ile in vivo olarak görüntülenmesinin ana hatlarıdır. Altı ila sekiz haftalık fareleri, -21. günde kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla 1.0 × 106 hücre lusiferaz + OPM-2 hücresi ile aşılayın. Tümör yükünü -1. günde BLI ile değerlendirin. 0. günde, fareleri kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla NIS + BCMA-CAR T hücreleri ile tedavi edilecek tümör yüküne göre randomize edin veya herhangi bir tedavi olmadan izleyin (tedavi edilmemiş ksenogreft). 6. günde fareleri BLI ile görüntüleyin. NIS + BCMA-CAR T hücrelerini görüntülemek için 7. günde [18F] TFB-PET gerçekleştirin.

Şekil 5A, lusiferaz + OPM-2 hücrelerinin NSG farelerine aşılanmasından 20 gün sonra temsili BLI'yi göstermektedir. Şekil 5B, NIS + BCMA-CAR T hücrelerinin uygulanmasından bir hafta sonra temsili PET görüntülemesini göstermektedir. [18F] TFB alımı sternum, dikenler, pelvis ve femurlarda gözlenir. Ek olarak, [18F] TFB'nin fizyolojik alımı tiroid ve midede görülür. Şekil 5C, tedavi edilmemiş ksenogreft veya NIS + BCMA-CAR T hücresi ile muamele edilmiş farelerden toplanan femur kaynaklı kemik iliğinin temsili akış grafiklerini göstermektedir. Kemik iliği örnekleri fare CD45, insan CD45, insan CD3 ve insan BCMA ile boyanır. Hücreler FSC / SSC'ye kapatılır, bunu tekli, canlı ve insan hücresi ayrımcılığı izler. Tedavi edilmemiş ksenogreftten elde edilen kemik iliği örnekleri BCMA + hücrelerini gösterirken, NIS + BCMA-CAR T hücresi ile muamele edilmiş fare, [18F] TFB-PET bulgusunu destekleyen CD3 + hücrelerini gösterir.

Figure 1
Resim 1: NIS+BCMA-CAR T hücresi üretim şeması. Normal donör CD3 T hücreleri (periferik kan mononükleer hücrelerinden izole edilmiş) negatif boncuk seçimi kullanarak. T hücreleri 1.0 × 106 / mL'de kaplanır ve kültürün 0. gününde eklenen ve 6. günde çıkarılan anti-CD3 / CD28 boncukları kullanılarak TCM'de genişletilir. T hücreleri, 1. günde NIS veya BCMA-CAR kodlayan lentivirüslerle ikili olarak dönüştürülür (MOI = 5.0). NIS + BCMA-CAR T hücreleri, 3, 4 ve 5. günlerde 1 μg / mL puromisin ile tedavi edilir. T hücreleri kültürde 8 gün boyunca genişler. T hücreleri, gelecekteki deneyler için% 10 DMSO ile FBS'de kriyokorunmuştur. T hücreleri, tüm deneylerden önce 37 ° C'de gece boyunca çözülür ve dinlendirilir. Kısaltmalar: CD = farklılaşma kümesi; TCM = T hücresi genişleme ortamı; BCMA = B hücre olgunlaşma antijeni; CAR = kimerik antijen reseptörü; NIS = sodyum iyodür simportörü; GFP = yeşil floresan protein; PBMC'ler = periferik kan mononükleer hücreleri; MOI = enfeksiyon çokluğu; FBS = fetal sığır serumu; DMSO = dimetilsülfoksit. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Lentivirüs titrasyon. (A) 0. günde, T hücrelerini anti-CD3/CD28 boncuklarla 3:1 boncuk: hücre oranında uyarın. Karikatürde belirtildiği gibi renkli kuyucuklara 1.0 μL 1.0 × 106 / mL uyarılmış T hücresi ekleyin. Ardından, titre plakasını 37 ° C'de, 24 saat boyunca% 5 CO2'de inkübe edin. (B) Karikatürde belirtildiği gibi renkli kuyucuklara 100 μL TCM ekleyerek bir seyreltme plakası hazırlayın. A6, A7 veya A8'e 50 μL taze çözülmüş virüs ekleyin (örneğin; A6'ya BCMA-CAR, A7'ye NIS ve A8'e lusiferaz-GFP). Daha sonra, 50 μL'yi A6'dan B6'ya ve daha sonra 50 μL'yi B6'dan C6'ya aktararak virüsü seri olarak seyreltin ve G6'ya kadar tekrarlayın. A7 ve A8 için de seri seyreltme gerçekleştirin. Seyreltilmiş virüsün 50 μL'sini titre plakasına aktarın. (C) 3. günde, hücreleri karşılık gelen antikorlarla boyayın ve titre plakasını akış sitometrisi ile analiz edin. Kısaltmalar: CD = farklılaşma kümesi; TCM = T hücresi genişleme ortamı; BCMA = B hücre olgunlaşma antijeni; CAR = kimerik antijen reseptörü; NIS = sodyum iyodür simportörü; GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: NIS + BCMA-CAR T hücrelerinin ve lusiferaz-GFP pozitif OPM-2 hücrelerinin oluşumu. (A ve B) Hücreler FSC / SSC'de kapılıdır, bunu singlet ve canlı hücre ayrımı izler. (A) dönüştürülmemiş T ve BCMA-CAR T hücrelerinin ve (B) UTD ve NIS + BCMA-CAR T'nin temsili akış grafikleri gösterilmiştir. NIS + BCMA-CAR T hücreleri, Şekil 2'de açıklandığı gibi, T hücresi genişlemesinin 1. gününde iki virüsün birlikte transdüksiyonu ile üretilir. 6. günde, hücreler CAR'lar ve NIS için boyanır. (C) NIS+BCMA-CAR T.'nin fenotipik analizi. NIS + BCMA-CAR T hücrelerinin temsili akış grafiği gösterilmiştir. (D) UTD, BCMA-CAR T veya NIS + BCMA-CAR T hücre büyüme kinetiğinin özeti. BCMA-CAR ve/veya NIS'in dahil edilmesi T hücresi genişlemesini etkilemez (iki yönlü ANOVA, n=3 biyolojik replikasyonlar, ortalama ± SD). (E) Lusiferaz-GFP-transdüke OPM-2'nin akış sitometrik analizi. OPM-2 hücreleri, puromisin direncine sahip lentivirüs kodlamalı lusiferaz-GFP ile dönüştürülür. Transdüksiyondan kırk sekiz saat sonra, OPM-2 hücreleri 2 μg / mL puromisin ile tedavi edilir. Hücreler iki gün daha genişletilir ve GFP'nin ekspresyonu akış sitometrisi ile analiz edilir. Kısaltmalar: CD = farklılaşma kümesi; BCMA = B hücre olgunlaşma antijeni; CAR = kimerik antijen reseptörü; NIS = sodyum iyodür simportörü; GFP = yeşil floresan protein; UTD = dönüştürülmemiş; FSC/SSC = ileri saçılma/yan saçılma; ANOVA = varyans analizi; n.s.= önemli değil; SD = standart sapma; FL-1-A = florofor 1 alanı; FITC-A = floresein izotiyosiyanat alanı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Sistemik OPM2 ksenogreft modelinde in vivo kaçakçılık testi şeması. Altı ila sekiz haftalık NSG farelerine, -21. günde kuyruk damarından 1.0 × 106 lusiferaz pozitif OPM-2 hücresi enjekte edin. -1. günde, OPM-2 hücrelerinin engraftmanını doğrulamak için fareler üzerinde biyolüminesan görüntüleme yapın. 0. günde, farelere 5.0 × 106 NIS + BCMA-CAR T hücresi enjekte edin. NIS + BCMA-CAR T hücrelerinin kaçakçılığını değerlendirmek için 7. günde [18F] TFB-PET / CT ile görüntü fareleri. Kısaltmalar: BCMA = B hücre olgunlaşma antijeni; CAR = kimerik antijen reseptörü; NIS = sodyum iyodür simportörü; BLI = biyolüminesan görüntüleme; NSG = bağışıklık sistemi baskılanmış NOD-scid IL2rγnull; luc = lusiferaz; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tetrafloroborat pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Sistemik OPM2 ksenogreft modelinde in vivo insan ticareti testi. (A ve B) BCMA + lusiferaz + OPM2 hücreleri NSG farelere intravenöz olarak enjekte edilir. Fareler, OPM-2 hücrelerinin aşılanmasından üç hafta sonra NIS + BCMA CAR T hücrelerini alırlar. (A) BLI, OPM-2 hücrelerinin engraftasyonunu doğrular. (B) [18F]TFB-PET, NIS + BCMA-CAR T hücre kaçakçılığını kemik iliğine kadar ortaya koymaktadır. (C) OPM-2 hücrelerinin kemik iliğine ve NIS + BCMA-CAR T hücrelerinin tümör bölgesine trafik çektiğini doğrulamak için, görüntülemeden sonra fareler ötenazi yapılır ve kemik iliği toplanır. Akım sitometrik analiz, OPM-2 hücrelerinin kemik iliğinde (solda) aşılandığını ve NIS+BCMA-CAR T hücrelerinin kemik iliğinde (sağda) bulunduğunu ortaya koymuştur. Kısaltmalar: BCMA = B hücre olgunlaşma antijeni; CAR = kimerik antijen reseptörü; NIS = sodyum iyodür simportörü; BLI = biyolüminesan görüntüleme; NSG = bağışıklık sistemi baskılanmış NOD-scid IL2rγnull; [18F] TFB-PET/CT = [18F]tetrafloroborat pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi; IVIS = in vivo görüntüleme sistemi; CD = farklılaşma kümesi; SUV = standartlaştırılmış alım değeri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Video S1: Tiroid, mide ve kemik iliğinde [18F] TFB'nin in vivo dağılımını gösteren PET / BT verilerinin üç boyutlu (3D) oluşturulması. Kısaltmalar: BCMA = B hücre olgunlaşma antijeni; CAR = kimerik antijen reseptörü; NIS = sodyum iyodür simportörü; PET/BT = pozitron emisyon tomografisi/bilgisayarlı tomografi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda NIS'in CAR T hücrelerine dahil edilmesi ve [18F]TFB-PET aracılığıyla infüze edilmiş CAR T hücrelerinin in vivo görüntülenmesi için bir metodoloji açıklanmaktadır. Kavramın kanıtı olarak, NIS + BCMA-CAR T hücreleri çift iletim yoluyla üretildi. Son zamanlarda, NIS'in CAR T hücrelerine dahil edilmesinin CAR T hücresi fonksiyonlarını ve etkinliğini in vivo olarak bozmadığını ve CAR T hücresi kaçakçılığına ve genişlemesine izin verdiğini bildirmiştik30. CAR T hücre tedavileri, mevcut B hücresi malignitelerinin ötesine geçerek KLL'deki uygulamalara genişlemeye devam ettikçe, invaziv olmayan in vivo görüntülemeye ve infüze edilmiş evlat edinilmiş T hücrelerinin izlenmesine izin veren araçlara daha fazla ihtiyaç duyulacaktır. T hücrelerinin dinamik görüntülenmesi, evlat edinilen T hücresi trafiğinin doğrulanmasını sağlayacak ve potansiyel olarak etkinlik ve toksisitenin daha erken tespit edilmesine izin verecektir.

NIS, klinik çalışmalarda görüntü hücrelerine ve virüslere duyarlı bir yöntem olarak araştırılmış ve doğrulanmıştır32,42. NIS için izleyicilerin fizyolojik birikimi esas olarak sıvı tümörlerden etkilenen yaygın organlar olmayan tiroid/tükürük bezlerinde, midede ve mesanede görülür44. Özellikle MM'de, malign plazma hücreleri sıklıkla kemik iliğinde veya kemiklerde dağılır ve NIS için izleyicilerin fizyolojik birikiminin meydana geldiği lezyonlarda ekstramedüller plazmasitoma nadir görülen bir fenomendir44,45. Ayrıca, NIS immünojenik değildir ve bu nedenle uzunlamasına görüntüleme çalışmaları için uygundur46. NIS, iyodürü sitosol içine taşıyan ve hücre dışı amino terminus bölgesi ve sitozolik karboksi terminus47 ile 13 varsayılan transmembran segmenti içeren içsel bir membran proteinidir.

NIS, teknesyum-99m (99mTc) perteknetat, iyodür-123 (123I), 131I, 124I ve [18F]TFB43 gibi gama veya pozitron yayan radyoizotoplarla görselleştirilebilir. Son zamanlarda, [18F] TFB, benzer biyokimyasal özelliklere sahip olduğu ve radyosentezlendiği için NIS tabanlı PET görüntüleme için umut verici bir iyodür analoğu olarak ortaya çıkmıştır48. TFB'nin bir avantajı, tiroid hücrelerinde organize olmaması ve bu nedenle normal tiroid dokusunda nispeten hafif bir alıma sahip olmasıdır48. TFB'nin bir diğer avantajı 109,8 dakikalık kısa yarılanma ömrüdür, diğer izleyicilerin yarı ömürleri ise 12 saat ila 8 gün arasında değişmekte ve bu da klinik uygulamalar için güvenlik sorunları ortaya çıkarabilmektedir49. NIS tabanlı CAR T hücre görüntülemenin ana sınırlaması, TFB de dahil olmak üzere izleyicilerin kan-beyin bariyerine (BBB) nüfuz etmemesi ve CAR T hücre tedavisinden sonra nörotoksisiteyi değerlendirmeyi zorlaştırmasıdır50,51,52,53.

Nörotoksisite, T hücrelerinin infiltrasyonu ve merkezi sinir sistemindeki miyeloid hücrelerin aktivasyonu ile ilişkilidir. Bununla birlikte, CAR T hücre tedavisinden sonra nörotoksisite vakalarının çoğunda, BBB'nin bütünlüğü bozulur50,54. Bu nedenle, izleyicinin bu tehlikeye atılmış ortamda BBB'yi geçip geçemediği belirsizdir. CAR T hücre tedavisinden sonra nörotoksisitenin [18F] TFB-PET ile görüntülenip görüntülenemeyeceğini doğrulamak için daha ileri çalışmaların yapılması gerekmektedir. [18F] TFB'nin kısa yarı ömrü hastalar ve personel için güvenli olsa da, hastane için tedarikini zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, enstitüler siklotronlarla donatılmalı veya bölgesel bir tesise erişebilmelidir. Buradaki protokolde açıklanan metodoloji, [18F]TFB-PET taraması kullanılarak CAR T hücrelerini in vivo olarak görselleştirmek ve değerlendirmek için ikili transdüksiyon yoluyla çeşitli diğer CAR T hücrelerine potansiyel olarak uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SSK, Novartis'e (Mayo Clinic, Pennsylvania Üniversitesi ve Novartis arasındaki bir anlaşma yoluyla) ve Mettaforge'a (Mayo Clinic aracılığıyla) lisanslı CAR immünoterapisindeki patentlerin mucididir. RS, MJC ve SSK, CAR immünoterapisi alanında Humanigen'e lisanslı patentlerin mucitleridir. SSK, Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs ve Lentigen'den araştırma fonu almaktadır. Figürler BioRender.com ile oluşturuldu.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen Mayo Clinic K2R boru hattı (SSK), Mayo Clinic Bireyselleştirilmiş Tıp Merkezi (SSK) ve Predolin Vakfı (RS) aracılığıyla desteklenmiştir. Şekil 1, 2 ve 4 BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
22 Gauge needle Covidien 8881250206
28 gauge insulin syringe BD 329461
96 well plate Corning 3595
Anti-human (ETNL) NIS Imanis REA009 ETNL antibody binds the cytosolic C-terminus of NIS
Anti-human BCMA, clone 19F2, PE-Cy7 BioLegend 357507 Flow antibody
Anti-human CD45, clone HI30, BV421 BioLegend 304032 Flow antibody
Anti-mouse CD45, clone 30-F11, APC-Cy7 BioLegend 103116 Flow antibody
Anti-rabbit IgG R&D F0110 Secondary antibody for NIS staining
BCMA-CAR construct, second generation IDT, Coralville, IA
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD 554714
CD3 Monoclonal Antibody (OKT3), PE, eBioscience Invitrogen 12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 Gibco 40203D
CytoFLEX System  B5-R3-V5 Beckman Coulter C04652 flow cytometer
Dimethyl sulfoxide Millipore Sigma D2650-100ML
Disposable Syringes with Luer-Lok Tips BD 309646
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechnology LUCK-1G
D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) Gibco 14190-144
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14190-144
Dynabeads MPC-S (Magnetic Particle Concentrator) Applied Biosystems A13346
Easy 50 EasySep Magnet STEMCELL Technologies 18002
EasySep Human T Cell Isolation Kit STEMCELL Technologies 17951 negative selection magnetic beads; 17951RF includes tips and buffer
Fetal bovine serum Millipore Sigma F8067
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A-21235
Inveon Multiple Modality PET/CT scanner Siemens Medical Solutions USA, Inc. 10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquid Piramal Critical Care 66794-017-10
IVIS Lumina S5 Imaging System PerkinElmer CLS148588
IVIS® Spectrum In Vivo Imaging System PerkinElmer  124262
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent Invitrogen L3000075
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit, for 405 nm excitation Invitrogen L34966
Lymphoprep STEMCELL Technologies 07851
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.22 uM, sterile Thermo Scientific 450-0020
Nalgene Rapid-Flow 500 mL Vacuum Filter, 0.45 uM, sterile Thermo Scientific 450-0045
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ Jackson laboratory 05557
OPM-2 DSMZ CRL-3273 multiple myeloma cell line
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro) Addgene 80389 lentiviral vector encoding luciferase-GFP
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x), Liquid Gibco 10378-016
PMOD software PMOD PBAS and P3D
Pooled Human AB Serum Plasma Derived Innovative Research IPLA-SERAB-H-100ML
Puromycin Dihydrochloride MP Biomedicals, Inc. 0210055210
RoboSep-S STEMCELL Technologies 21000 Fully Automated Cell Separator
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium) Gibco 21870-076
SepMate-50 (IVD) STEMCELL Technologies 85450 density gradient separation tubes
Sodium Azide, 5% (w/v) Ricca Chemical 7144.8-16
T175 flask Corning 353112
Terrell (isoflurane, USP) Piramal Critical Care Inc 66794-019-10
Webcol Alcohol Prep Covidien 6818
X-VIVO 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium Lonza 04-418Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Raje, N., et al. Anti-BCMA CAR T-cell therapy bb2121 in relapsed or refractory multiple myeloma. New England Journal of Medicine. 380 (18), 1726-1737 (2019).
  3. Schuster, S. J., et al. Tisagenlecleucel in adult relapsed or refractory diffuse large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 380 (1), 45-56 (2019).
  4. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  5. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. New England Journal of Medicine. 378 (5), 439-448 (2018).
  6. Anagnostou, T., Riaz, I. B., Hashmi, S. K., Murad, M. H., Kenderian, S. S. Anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy in acute lymphocytic leukaemia: a systematic review and meta-analysis. Lancet Haematology. 7 (11), 816-826 (2020).
  7. Abramson, J. S., et al. Lisocabtagene maraleucel for patients with relapsed or refractory large B-cell lymphomas (TRANSCEND NHL 001): a multicentre seamless design study. Lancet. 396 (10254), 839-852 (2020).
  8. Shah, B. D., et al. KTE-X19 for relapsed or refractory adult B-cell acute lymphoblastic leukaemia: phase 2 results of the single-arm, open-label, multicentre ZUMA-3 study. Lancet. 398 (10299), 491-502 (2021).
  9. Wang, M., et al. KTE-X19 CAR T-cell therapy in relapsed or refractory mantle-cell lymphoma. New England Journal of Medicine. 382 (14), 1331-1342 (2020).
  10. Jacobson, C. A., et al. Axicabtagene ciloleucel in relapsed or refractory indolent non-Hodgkin lymphoma (ZUMA-5): a single-arm, multicentre, phase 2 trial. Lancet Oncology. 23 (1), 91-103 (2022).
  11. Munshi, N. C., et al. Idecabtagene Vicleucel in Relapsed and Refractory Multiple Myeloma. New England Journal of Medicine. 384 (8), 705-716 (2021).
  12. Sakemura, R., Cox, M. J., Hefazi, M., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Resistance to CART cell therapy: lessons learned from the treatment of hematological malignancies. Leukemia & Lymphoma. , 1-18 (2021).
  13. Cox, M. J., et al. Leukemic extracellular vesicles induce chimeric antigen receptor T cell dysfunction in chronic lymphocytic leukemia. Molecular Therapy. 29 (4), 1529-1540 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Neurotoxicity and Cytokine Release Syndrome After Chimeric Antigen Receptor T Cell Therapy: Insights Into Mechanisms and Novel Therapies. Frontiers in Immunology. 11, 1973 (2020).
  16. Khadka, R. H., Sakemura, R., Kenderian, S. S., Johnson, A. J. Management of cytokine release syndrome: an update on emerging antigen-specific T cell engaging immunotherapies. Immunotherapy. 11 (10), 851-857 (2019).
  17. Hay, K. A., et al. Kinetics and biomarkers of severe cytokine release syndrome after CD19 chimeric antigen receptor-modified T-cell therapy. Blood. 130 (21), 2295-2306 (2017).
  18. Lee, D. W., et al. ASTCT consensus grading for cytokine release syndrome and neurologic toxicity associated with immune effector cells. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 25 (4), 625-638 (2019).
  19. Sterner, R. M., Kenderian, S. S. Myeloid cell and cytokine interactions with chimeric antigen receptor-T-cell therapy: implication for future therapies. Current Opinion in Hematology. 27 (1), 41-48 (2020).
  20. Krekorian, M., et al. Imaging of T-cells and their responses during anti-cancer immunotherapy. Theranostics. 9 (25), 7924-7947 (2019).
  21. Wei, W., Jiang, D., Ehlerding, E. B., Luo, Q., Cai, W. Noninvasive PET imaging of T cells. Trends in Cancer. 4 (5), 359-373 (2018).
  22. Volpe, A., et al. Spatiotemporal PET imaging reveals differences in CAR-T tumor retention in triple-negative breast cancer models. Molecular Therapy. 28 (10), 2271-2285 (2020).
  23. Minn, I., et al. Imaging CAR T cell therapy with PSMA-targeted positron emission tomography. Science Advances. 5 (7), (2019).
  24. Keu, K. V., et al. Reporter gene imaging of targeted T cell immunotherapy in recurrent glioma. Science Translational Medicine. 9 (373), (2017).
  25. Moroz, M. A., et al. Comparative analysis of T cell imaging with human nuclear reporter genes. Journal of Nuclear Medicine. 56 (7), 1055-1060 (2015).
  26. Sellmyer, M. A., et al. Imaging CAR T cell trafficking with eDHFR as a PET reporter gene. Molecular Therapy. 28 (1), 42-51 (2019).
  27. Weist, M. R., et al. PET of adoptively transferred chimeric antigen receptor T cells with (89)Zr-oxine. Journal of Nuclear Medicine. 59 (89), 1531-1537 (2018).
  28. Vedvyas, Y., et al. Longitudinal PET imaging demonstrates biphasic CAR T cell responses in survivors. JCI Insight. 1 (19), 90064 (2016).
  29. Sakemura, R., Can, I., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. In vivo CART cell imaging: Paving the way for success in CART cell therapy. Molecular Therapy Oncolytics. 20, 625-633 (2021).
  30. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion, Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunology Research. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  31. Penheiter, A. R., Russell, S. J., Carlson, S. K. The sodium iodide symporter (NIS) as an imaging reporter for gene, viral, and cell-based therapies. Current Gene Therapy. 12 (1), 33-47 (2012).
  32. Msaouel, P., et al. Clinical trials with oncolytic measles virus: current status and future prospects. Current Cancer Drug Targets. 18 (2), 177-187 (2018).
  33. Kalled, S. L., Hsu, Y. -M. Anti-BCMA antibodies. , WO/2010/10949 (2010).
  34. Carpenter, R. O., et al. B-cell maturation antigen is a promising target for adoptive T-cell therapy of multiple myeloma. Clinical Cancer Research. 19 (8), 2048-2060 (2013).
  35. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using CRISPR/Cas9 to knock out GM-CSF in CAR-T cells. Journal of Visualized Experiments. (149), e59629 (2019).
  36. Dietz, A. B., et al. A novel source of viable peripheral blood mononuclear cells from leukoreduction system chambers. Transfusion. 46 (12), 2083-2089 (2006).
  37. Absher, M. Tissue Culture: Methods and Applications. Kruse, P. F., Patterson, M. K. , Academic Press Inc. 395-397 (1973).
  38. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Chow, B., Seshagiri, S. A rapid method for estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Journal of Virological Methods. 132 (1-2), (2006).
  39. Smith, E. L., et al. GPRC5D is a target for the immunotherapy of multiple myeloma with rationally designed CAR T cells. Science Translational Medicine. 11 (485), (2019).
  40. Sakemura, R., et al. Targeting Cancer-Associated Fibroblasts in the Bone Marrow Prevents Resistance to CART-Cell Therapy in Multiple Myeloma. Blood. , (2022).
  41. Jiang, H., et al. Synthesis of 18F-tetrafluoroborate via radiofluorination of boron trifluoride and evaluation in a murine C6-glioma tumor model. Journal of Nuclear Medicine. 57 (9), 1454-1459 (2016).
  42. Dispenzieri, A., et al. Phase I trial of systemic administration of Edmonston strain of measles virus genetically engineered to express the sodium iodide symporter in patients with recurrent or refractory multiple myeloma. Leukemia. 31 (12), 2791-2798 (2017).
  43. Ravera, S., Reyna-Neyra, A., Ferrandino, G., Amzel, L. M., Carrasco, N. The sodium/iodide symporter (NIS): molecular physiology and preclinical and clinical applications. Annual Review of Physiology. 79, 261-289 (2017).
  44. Varettoni, M., et al. Incidence, presenting features and outcome of extramedullary disease in multiple myeloma: a longitudinal study on 1003 consecutive patients. Annals of Oncology. 21 (2), 325-330 (2010).
  45. Bladé, J., et al. Soft-tissue plasmacytomas in multiple myeloma: incidence, mechanisms of extramedullary spread, and treatment approach. Journal of Clinical Oncology. 29 (28), 3805-3812 (2011).
  46. Brunton, B., et al. New transgenic NIS reporter rats for longitudinal tracking of fibrogenesis by high-resolution imaging. Scientific Reports. 8 (1), 14209 (2018).
  47. Dohán, O., et al. The sodium/iodide symporter (NIS): characterization, regulation, and medical significance. Endocrine Reviews. 24 (1), 48-77 (2003).
  48. Jiang, H., DeGrado, T. R. 18F]Tetrafluoroborate ([18F]TFB) and its analogs for PET imaging of the sodium/iodide symporter. Theranostics. 8 (14), 3918-3931 (2018).
  49. Ahn, B. -C. Sodium iodide symporter for nuclear molecular imaging and gene therapy: from bedside to bench and back. Theranostics. 2 (4), 392-402 (2012).
  50. Gust, J., et al. Endothelial activation and blood-brain barrier disruption in neurotoxicity after adoptive immunotherapy with CD19 CAR-T cells. Cancer Discovery. 7 (12), 1404-1419 (2017).
  51. Gofshteyn, J. S., et al. Neurotoxicity after CTL019 in a pediatric and young adult cohort. Annals of Neurology. 84 (4), 537-546 (2018).
  52. Shalabi, H., et al. Systematic evaluation of neurotoxicity in children and young adults undergoing CD22 chimeric antigen receptor T-cell therapy. Journal of Immunotherapy. 41 (7), 350-358 (2018).
  53. Ruff, M. W., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. A Concise Review of Neurologic Complications Associated with Chimeric Antigen Receptor T-cell Immunotherapy. Neurologic Clinics. 38 (4), 953-963 (2020).
  54. Santomasso, B. D., et al. Clinical and biological correlates of neurotoxicity associated with CAR T-cell therapy in patients with B-cell acute lymphoblastic leukemia. Cancer Discovery. 8 (8), 958-971 (2018).

Tags

Kanser Araştırmaları Sayı 180 CAR T hücresi NIS muhabiri [18F]TFB-PET non-invaziv görüntüleme
Kimerik Antijen Reseptör T Hücrelerinin [<sup>18F</sup>]Tetrafloroborat Pozitron Emisyon Tomografisi/Bilgisayarlı Tomografi ile Dinamik Görüntülenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal,… More

Sakemura, R., Cox, M. J., Bansal, A., Roman, C. M., Hefazi, M., Vernon, C. J., Glynn, D. L., Pandey, M. K., DeGrado, T. R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Dynamic Imaging of Chimeric Antigen Receptor T Cells with [18F]Tetrafluoroborate Positron Emission Tomography/Computed Tomography. J. Vis. Exp. (180), e62334, doi:10.3791/62334 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter