Summary
В статье представлено устройство μTongue (микрофлюидика на языке) для функциональной визуализации вкусовых клеток in vivo путем интеграции микрофлюидики в окно прижизальной визуализации на языке.
Abstract
Прижизневая флуоресцентная микроскопия является инструментом, широко используемым для изучения многоклеточной динамики у живого животного. Однако он не был успешно использован во вкусовом органе чувств. Интегрируя микрофлюидику в окно визуализации языка прижизностно, μTongue обеспечивает надежные функциональные изображения вкусовых клеток in vivo при контролируемом воздействии нескольких вкусовых гастян. В данной работе представлена подробная пошаговая процедура использования системы μTongue. Существует пять подразделов: подготовка вкусных решений, настройка микрофлюидного модуля, монтаж образца, получение функциональных данных изображения и анализ данных. Также представлены некоторые советы и методики решения практических вопросов, которые могут возникнуть при использовании μTongue.
Introduction
Прижизальный флуоресцентный микроскоп широко используется для изучения пространственно-временной динамики на живых тканях. Исследователи быстро разрабатывают генетически закодированные датчики, которые обеспечивают специфические и чувствительные преобразования биологических процессов в флуоресцентные сигналы, которые могут быть легко записаны с помощью флуоресцентных микроскопов, которые широко доступны1,2. Хотя большинство внутренних органов у грызунов были исследованы с помощью микроскопа, его успешное применение к языку еще не было успешным3.
Предыдущие исследования по кальциевой визуализации вкусовых клеток проводились ex vivo путем тонкого срезания ткани языка для получения циркумваллятных вкусовых рецепторов4,5,6 или путем отслаивания вкусового эпителия для получения грибовидных вкусовых рецепторов7,8. Подготовка этих образцов была неизбежно инвазивной, поэтому естественные микросреды, такие как иннервация нервов, барьеры проницаемости и кровообращение, были в значительной степени возмущены. Первое окно визуализации языка прижизненным путем было зарегистрировано в 2015 году Choi et al., но надежная функциональная запись была недостижима из-за движения и оптических артефактов, вызванных жидкими тастантными стимулами9.
Недавно была введена микрофлюидика на языке (μTongue)10. Это устройство объединяет микрофлюидную систему с окном визуализации на языке мыши. Достигая квази-стационарного потока тастантных стимулов в течение всего периода визуализации, артефакты от плавного движения могут быть сведены к минимуму(рисунок 1). Входной порт питается от серии многоканальных регуляторов давления, тогда как выходной порт подключен к шприцевому насосу, который поддерживает 0,3 мл / мин. Кроме того, оптические артефакты, вызванные разницей в показателях преломления растворов вкуса, были сведены к минимуму с помощью ратиометрического анализа с введением индикатора нечувствительности к кальцию (tdTomato), а также индикатора кальция (GCaMP6)11. Такая конструкция обеспечивала микроскопическую стабильность вкусовых клеток in vivo даже при резком переключении между текучими каналами. Следовательно, μTongue реализуют надежный функциональный скрининг нескольких вкусовых рецепторов мыши in vivo.
В этом протоколе подробно объясняются экспериментальные процедуры для визуализации кальция мышиных грибовидных вкусовых рецепторов in vivo с использованием μTongue. Сначала описано приготовление искусственной слюны и растворов вкусности. Во-вторых, вводится настройка микрофлюидной системы для достижения квазистабитичного потока. В-третьих, процедуры, используемые для установки языка мыши на μTongue для получения изображения, очерчены. Наконец, каждый этап анализа изображения, включая коррекцию артефактов бокового движения и ратиометрию, задается. Этот протокол может быть легко адаптирован к любой исследовательской лаборатории с мышиным оборудованием и двухфотонным микроскопом или эквивалентным оборудованием.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все хирургические процедуры были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Сунгюнван и Сеульского национального университета.
1. Приготовление растворов: искусственной слюны и вкусовых постоялых веществ
- Готовят искусственную слюну путем растворения 2 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 3 мМ NaHCO3,3 мМ KHCO3,0,25 мМ CaCl2,0,25 мМ MgCl2,0,12 мМ K2HPO4,0,12 мМ KH2PO4и 1,8 мМ HCl в дистиллированной воде (>1 л) и отрегулировать рН раствора до 7 (см. Таблицу материалов)12.
- Приготовьте вкусности, такие как кислый: 10 мМ лимонной кислоты; соленый: 400 мМ NaCl, опционально с 50 мкМ амилорида; сладкий: 40 мМ ацесульфам К; горький: смесь 5 мМ хинина, 5 мМ денатория и 20 мкМ циклогексимида путем растворения дегустационного химического вещества в искусственной слюне, приготовленной на этапе 1.1.
2. Подготовка микрофлюидной системы
ПРИМЕЧАНИЕ: Тастианты доставлялись на язык мыши с использованием многоканальной жидкостной системы доставки под давлением (см. Рисунок 1 и Таблицу материалов).
- Заполните резервуары перфузионной системы сжатым потоком искусственной слюной и вкуснятными веществами.
- Подключите линию сжатого воздуха к входу регулятора и установите давление воздуха между 30 и 50 psi в системе подачи жидкости.
- Установите выходное давление регулятора на 0,4 psi и проверьте, выходит ли жидкость из трубки под этим давлением.
- Подключите коллектор от резервуаров к входному порту μTongue.
- Подключите выходной порт μTongue к шприцевым насосом и отводите жидкость с ~300 мкл∙мин-1 для установления стационарного состояния. Наблюдайте за постоянным объемом висящей капли под μTongue. Настройте значение параметра настройки в зависимости от высоты образца.
- Отсоедините линию сжатого воздуха и остановите шприцевой насос до тех пор, пока не будет выполнен этап протокола 3.
3. Подготовка мыши к визуализации in vivo (рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все препараты животных проводились в дневное время в асептических условиях на лабораторном верстаке.
- Мышиная анестезия
- Подготовьте 7-недельную или старшую мышь любого пола. Используйте генетически модифицированную линию мыши, которая экспрессирует чувствительные к кальцию флуоресцентные белки во вкусовых клетках.
- Мышь удерживается для анестезии. Смесь 100 мг/кг кетамина и 10 мг/кг ксилазина вводят внутрибрюшинно мыши13.
- TRITC-декстран (500 кДа) в 2,5% мас./V фосфатного буферного физиологического раствора вливается внутривенно в мышь по ретроорбитальному пути для наблюдения за кровообращением во время сеанса визуализации.
- Прикрепите фиксатор головы к черепу мыши, чтобы свести к минимуму артефакты движения.
- Головка мыши опрыскивается 70% ETOH, в то время как мышь помещается в положение лежа. Слегка поднимите кожу головы щипцами и отрежите ножницами примернона 7 мм2.
- Очистите волосы вокруг кожи головы, удалите позубие под кожей, нанесите мгновенный клей на череп и прикрепите индивидуальный фиксатор головы.
- После того, как мгновенный клей затвердеет, нанесите зубной клей вокруг головного фиксатора и осветите синим светом, чтобы затвердеть зубной клей.
- Поместите язык мыши на нижнюю единицу μTongue.
- Прикрепите нижнюю губу мыши к нижнему блоку μTongue с помощью мгновенного клея.
- Поместите мышь на доску (доска подготовки мыши на рисунке 1B)и поместите нижнюю единицу μTongue на столбы (μTongue hold post на рисунке 1B). Убедитесь, что отверстия по краю нижнего блока выровнены по столбу.
- Затяните фиксатор головки мыши к держателю головки на доске. Затем отрегулируйте расстояние между головкой мыши и устройством. Плавно поверните головку мыши примерно на 45° с помощью держателя крепления головки. Этот процесс предотвращает физический контакт носа мыши с целью микроскопа.
- Осторожно нарисуйте язык мыши с помощью пластикового пинцета и прикрепите вентральную сторону языка к верхней стороне нижнего блока μTongue. Затем протрите поверхность языка мыши влажным ватным тампоном.
- Замочите лист бумаги в искусственной слюне и поместите его на открытую поверхность языка мыши, чтобы поддерживать влажное состояние.
- Поместите изогнутые шайбы на стойки, которые удерживают оба конца нижней части μTongue.
- Поместите подготовку мыши на ступень микроскопа. Расположите открытый язык мыши под приблизительным центром области объектива микроскопа. Следите за тем, чтобы не отклоняться от динамического диапазона сцены. Затем затяните доску мыши на сцене винтами.
- Поместите грелку под корпус мыши и поддерживайте температуру 36,5 °C-37,5 °C. Контролируйте температуру тела мыши с помощью датчика температуры и контролируйте температуру грелки с помощью сигнала обратной связи от датчика температуры.
- Скрутите тонкий лист бумаги и поместите его в рот мыши, чтобы предотвратить попадание жидкости в трахею мыши.
- Удалите влажную ткань с языка мыши и поместите подготовленный μTongue на язык мыши. Поместите микрофлюидный канал на язык и отрегулируйте его положение, чтобы наблюдать за поверхностью языка через окно визуализации.
- Закрепите μTongue, аккуратно вкрутив оба конца с минимальным давлением сжатия.
4. Получение изображений
- Включите двухфотонный лазер 920 нм и микроскоп перед использованием.
- Установите водоиммерный объектив (16x, NA 0.80 или 25x, NA 1.1) на микроскоп. Бросьте дистиллированную воду на окно визуализации μTongue и погрузите объектив.
- В режиме камеры включите свет с помощью ртутной лампы и осветите поверхность языка.
- Регулируя ось Z, ищите автофлуоресцентный сигнал от нитевидных сосочков, чтобы найти приблизительную фокальную плоскость. Затем, используя ручку регулировки X и Y, найдите вкусовой рецептор.
- Переключитесь в многофотонный режим. Установите условия получения изображения следующим образом: длина волны возбуждения: 920 нм; комплект эмиссионных фильтров: 447/60 нм, 525/50 нм и 607/70 нм; двунаправленный режим растрового сканирования, размер кадра: 512 x 512.
- Отрегулируйте положения X и Y, чтобы поместить вкусовой рецептор в центр окна изображения.
- Исследуйте кровеносные сосуды, окружающие вкусовую рецептор, примерно на высоте двух третей вкусовой рецептора. Визуализируют кровообращение с помощью инъекции ТРИТК-декстрана (500 кДа) из шага протокола 3.2. Если кровоток засоряется, слегка ослабьте фиксирующие винты, чтобы обеспечить кровоток.
- Отрегулируйте ось Z и найдите Z-плоскость вкусового рецептора, которая содержит достаточное количество вкусовых клеток.
- Продолжайте кальциевую визуализацию с частотой 2-6 Гц в течение 80 с. Обеспечьте вкусовое решение в 20 с, включив резервуар жидкостной системы после начала визуализации. После 20 с стимуляции вкуса переключите резервуар обратно на искусственную слюну.
- После завершения последовательной визуализации подождите около 3-4 минут до следующего сеанса визуализации. Держите искусственную слюну, текущую к языку мыши, чтобы смыть вкусный реманент с предыдущего сеанса визуализации. В зависимости от конструкции эксперимента повторите сеанс по мере необходимости.
- Когда визуализация кальция in vivo будет завершена, усыплены мышь в соответствии с процедурой IACUC. Мышь под наркозом приносится в жертву в камереСО2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте глубину анестезии с помощью рефлекса защемления. Во время сеанса визуализации искусственная слюна из резервуаров должна обеспечиваться последовательно. Если пузырьки появляются в окне визуализации μTongue, удалите пузырьки, протолкнув их через вход или выход μTongue, используя сильное давление жидкости.
5. Анализ изображений(рисунок 3)
- Преобразование изображений
- Откройте файлы необработанных изображений с помощью Fiji14 или аналогичного программного обеспечения для анализа изображений.
- Преобразуйте файл изображения в файл стека RGB для использования кода анализатора NPL Bud.
- Изображения > цвет > разделенные каналы
- Изображение > Цвет > Объединить каналы и выберите изображение из шага 5.2.1.
- Стек цветов > изображения > в RGB
- Регистрация изображений
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте специально написанный код для анализа данных. Пожалуйста, обратитесь к https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.- Запустите кодовоеимя Taste_GUI.m ; появится окно с графическим интерфейсом под названием NPL Bud Analyzer. Нажмите кнопку «Новый анализ» в правом верхнем углу, затем загрузите преобразованное изображение из шага 5.1. Установите частоту кадров выше загруженного изображения.
- Нарисуйте интересуемую область (ROI) над загруженным изображением для регистрации. Дважды щелкните по выбранной ROI, и начнется автоматически рассчитанная регистрация.
- Получение относительных изменений интенсивностифлуоресценции (ΔF/F)
- Вернитесь в окно NPL Bud Analyzer, чтобы автоматически отобразить зарегистрированное изображение из шага 5.2. Если у пользователя уже есть reg-файл, нажмите кнопку Загрузить данные и выберите файл _reg.tif.
- Нажмите на кнопку CIRCLE или POLYGON и расположите окупаемости вкусовой ячейки над изображением вкусового рецептора.
- Это представляет интенсивность флуоресценции в сыром виде и след кальция (ΔF/F)выбранной вкусовой ячейки автоматически под изображением вкусового рецептора.
- Нажмите «Сохранить след», чтобы представить след кальция (ΔF/F)в правой части графического интерфейса, в то время как ROI отображается над изображением вкусового рецептора. Повторяйте шаги 5.3.2–5.3.4 до тех пор, пока не будет завершен выбор окупаеморого окупаемого окупаемость инвестиций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нажмите кнопку «Удалить трассировку», если ROI выбран неправильно, чтобы устранить последнюю выбранную рентабельность инвестиций и след кальция. - После завершения выбора ROI напишите имя файла в правом нижнем углу и нажмите кнопку Finish, чтобы экспортировать кальциевую трассировку ΔF/F в формате .xls и изображение tase bud с ROI в формате .bmp.
- Анализ кальциевого следа
- Анализ следа кальция, полученного из шага 5.3. Учтите, что вкусовые клетки реагировали на вкусовой вкус, когда интенсивность флуоресценции повышается более чем на два стандартных отклонения от исходного уровня после доставки вкусанта4,а p-значенияменьше 0,01, используя парные или непарные t-тесты10.
- Рассмотрим вкусовую клетку как клетку-ответчика, если она реагирует на определенный вкус чаще, чем в двух случаях из трех испытаний (~60%)15.
- Получение репрезентативных следов кальция путем усреднения отдельных следов кальция, полученных на этапе 5.4.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мышь Pirt-GCaMP6f-tdTomato использовалась для получения изображения вкусовых рецепторов. Поверхность мышиного языка была покрыта автофлуоресцентными нитевидными сосочами. Вкусовые рецепторы разложены по поверхности языка(рисунок 4А). Изображения вкусового рецептора и его структуры были получены с помощью трех различных детекторов фильтров. Используя набор фильтров 607/70 нм, сигнал tdTomato от вкусовых ячеек был получен для ратиометрического анализа(рисунок 4B). С помощью набора фильтров 525/50 нм был получен сигнал GCaMP от вкусовых клеток и кровеносных сосудов, которые окружают вкусовую рецептор(рисунок 4B). С помощью набора фильтров 447/60 нм была приобретена коллагеновая соединительная ткань, которая структурно поддерживает вкусовую рецептор(рисунок 4B).
После получения изображений вкусовой рецептора и относительных структур с использованием протокола проводилась визуализация кальция in vivo. Мышь Pirt-GCaMP6f-tdTomato использовалась для скрининга вкусовых клеток(рисунок 5A)16. Вкусовые клетки неоднократно реагировали на соответствующие вкусовые стимулы(рисунок 5B). Считалось, что вкусовые клетки реагировали на вкусовой вкус, когда они соответствовали условиям, представленным в протоколе 5.1.4. В этом испытании клетка 2 реагировала как на сладкие, так и на вкусные вкусители умами. Результат согласуется с предыдущими исследованиями, наблюдающими клеточную активность с использованием электрофизиологии17. Ячейка 3 реагировала как на 400 мМ NaCl, так и на 400 мМ NaCl под амилоридом. Это означает, что клетка 3 использовала независимый путь ENaC для ответа на соленый вкус. Вкусовая рецептор в этом эксперименте не включала клетку, реагируя на кислые вкусы. Скрининг вкусовых клеток проводили в стабильных условиях визуализации, и каждая вкусовая клетка показала повторяемый ответ на определенный тип вкуса.
Рисунок 1:μTongue, функциональная платформа визуализации на основе микрофлюидики. (A) Система доставки жидкости под давлением. i) Регулятор давления жидкостной системы подключен к внешнему источнику воздуха. Давление источника воздуха регулируется между 30-50 psi перед входом в регулятор давления. ii) Давление воздуха от регулятора составляет приблизительно 0,4 psi. iii) Резервуары, содержащие искусственную слюну и различные вкусовые растворы, подключаются к выходу регулятора давления воздуха. iv) каждый резервуар сходится к коллектору, соединенному с входным портом μTongue. v) Шприцевой насос подключается к выходу μTongue и управляет потоком. (B) μTongue, функциональная платформа визуализации на основе микрофлюидики. Название каждой детали указано на рисунке. i) Доска для подготовки мышей. ii) плата установки жидкостной системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Последовательное описание подготовки мыши. Показаны важные этапы подготовки мыши. (A) Ретроорбитальная инъекция TRITC-декстрана. (B) Показан процесс прикрепления головного фиксера к черепу мыши. Очищается кожа головы и подкостница. Для крепления используется клейкий клей и зубной клей. (C)Головной фиксатор на черепе мыши привинчивается к подготовительной доске мыши. (D)Процедура крепления языка на нижней единице μTongue. Для фиксации языка используется мгновенный клей. Язык очищают с помощью влажного ватного тампона и покрывают влажными бумажными салфетками для предотвращения сухости. (E) Изогнутые шайбы наносятся на оба конца нижнего блока μTongue. (F)Кусок скрученой бумажной ткани помещается в ротовую полость мыши. (G)Плата подготовки мыши установлена на ступени микроскопа и плотно привинчена для обеспечения стабильных условий визуализации. (H) μTongue помещается на язык. Объектив настраивается над окном изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Анализ изображения. (A) RGB-изображение преобразуется из каждого одноцветного изображения. Шкала, 10 мкм. (B) Регистрация изображения с использованием проводимого пользовательского кода. (C) Графический интерфейс пользовательского кода. (i) Место ввода для частоты кадров. Частота кадров по умолчанию составляет 0,16 с/кадр. ii) кнопки для розыгрыша ROI. iii) область, в которой показано загруженное изображение. (iv) Кальциевый сигнал выбранной РЕНТАБЕЛЬНОСТИ инвестиций показан в виде зеленого следа, тогда как нечувствительный к кальцию сигнал выбранной окупаемости инвестиций показан в виде красного следа. v) Ратиометрический анализ и ΔF/Fрассчитываются автоматически. График ΔF/F представлен в пурпурном виде. (vi) Кнопки для загрузки изображений. Новый анализ предназначен для загрузки преобразованного RGB изображения. Load Data предназначен для загрузки изображения, которое уже подвергло регистрации. (vii) Кнопка Save Trace (Сохранить трассировку) предназначена для сохранения графика ΔF/F и roI, выбранного на уровне viii. Кнопка Удалить трассировку предназначена для удаления графика ΔF/F из viii. (viii) Показаны сохраненные следы кальция. (ix) Область для заполнения имени файла. Кнопка Finish предназначена для извлечения данных и сохранения их в том же каталоге кода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Поверхность мышиного языка и вкусовой рецептор в грибовидном сосочке. (А)Поверхность мышиного языка захватывается в большом поле. Вкусовая почка ороговеет нитевидными сосочонами, а коллагеновая структура показана. Каждая структура обозначена разными цветами: пурпурным, желтым и зеленым соответственно. Шкала, 100 мкм.(B)Вкусовая рецептор от(A)увеличивается и захватывается с помощью трех различных детекторов эмиссионного фильтра. Нитевидные сосочки желтого цвета захватываются с помощью детектора 525/50 нм. Эта структура наблюдается с самой поверхности языка до ~25 мкм в глубину. Сигналы GCaMP зеленого цвета и сигналы tdTomato красного цвета представляют вкусовые клетки. Эти сигналы обнаруживаются детекторами 525/50 и 607/70 нм соответственно. Родамин декстран, представляющий кровообращение, захватывается как на детекторах 525/50, так и на детекторах 607/70 нм. Структура коллагена, показанная в голубом цвете, приобретается детекторами 447/60 нм. На последнем рисунке показаны все предыдущие изображения, объединенные. Шкала, 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Вкусовой скрининг мыши Pirt-GCaMP6f-tdTomato in vivo. (A) Репрезентативный вкусовой рецептор мыши Pirt-GCaMP6f-tdTomato. Изображение отображается как псевдоцвет на основе интенсивности. Пунктирные линии разграничат каждую вкусовую клетку. Яркость каждой вкусовой клетки зависит от экспрессии флуоресцентного белка и глубины расположения вкусовой ячейки. Шкала батончика, 10 мкм.(B)Кальциевый след каждой вкусовой клетки для пяти основных вкусовых стимулов. Каждое повторное испытание показано серым цветом на спине, а усредненный след представлен над каждым испытанием. Цветные трассировки определяются как адаптивные, тогда как черные следы определяются как не отвечающие. Каждый цвет представляет свой вкус. Соленый (L) представляет собой малосоленный, со смесью 400 мМ NaCl и 50 мкМ амилорида, используемого для стимуляции вкуса. Соленый (H) представляет собой высокосоленный, с 400 мМ NaCl, используемым для стимуляции. Вкусовая стимуляция показана в виде серой коробки на обратной стороне каждого кальциевого следа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь описан подробный протокол применения μTongue к исследованию функциональной активности вкусовых клеток in vivo. В этом протоколе выполняется функциональная визуализация на вкусовых клетках с использованием генетически закодированных показателей кальция. В дополнение к использованию трансгенных мышей, электрофоретическая нагрузка кальциевых красителей (или красителей, чувствительных к напряжению) на вкусовые ячейки может быть альтернативным вариантом.
В этом эксперименте были использованы все вкусовые растворы менее 1,336 показателя преломления. Хотя μTongue обеспечивает стабильную флюидную доставку, а логометрический анализ смягчает артефакты визуализации, исследователям будет сложно использовать более высокую концентрацию вкуса (например, сахарозы >100 мМ с показателем преломления в 1,338). Большая разница в показателе преломления между искусственной слюной и вкусовым раствором смещает фокальную плоскость изображения больше, чем диапазон компенсации постизображетельным процессом. Эмпирически получен определенный диапазон показателя преломления вкусового раствора (менее 1,336), позволяющий стабильно получать клеточную визуализацию в режиме реального времени.
Для исследователей, опытных в флуоресцентной визуализации и обращении с животными, этот протокол можно легко изучить в течение многократной практики. Однако он содержит критические шаги, которые часто препятствуют успешному сбору данных. Во-первых, после экстернализации из оральной вежливости язык следует поддерживать влажным с искусственной слюной, чтобы сохранить естественную микросреду слизистой оболочки. Во-вторых, кровообращение вокруг вкусовой рецептора должно быть неповрежденным, чтобы поддерживать физиологический запас кислорода, питательных веществ и факторов, передающихся через кровь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют о конкурирующих финансовых интересах: J. Han и M. Choi являются изобретателями запатентованной технологии μTongue, описанной в этой статье, а система μTongue коммерчески доступна через SciTech Korea.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Институтом фундаментальных наук (IBS-R015-D1), грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIT) (No 2019M3A9E2061789), и грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым правительством Кореи (MSIT) (No 2019M3E5D2A01058329). Мы благодарны Ынсу Киму и Юджину Ли за их техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
