Summary
El artículo presenta el dispositivo μTongue (microfluídica en una lengua) para imágenes funcionales de células gustativas in vivo mediante la integración de microfluídica en una ventana de imágenes intravitales en la lengua.
Abstract
La microscopía de fluorescencia intravital es una herramienta ampliamente utilizada para estudiar la dinámica multicelular en un animal vivo. Sin embargo, no se ha utilizado con éxito en el órgano sensorial del gusto. Al integrar la microfluídica en la ventana de imágenes de la lengua intravital, la μTongue proporciona imágenes funcionales confiables de las células gustativas in vivo bajo exposición controlada a múltiples saborantes. En este documento, se presenta un procedimiento detallado paso a paso para utilizar el sistema μTongue. Hay cinco subsecciones: preparación de soluciones de sabor, configuración de un módulo microfluídico, montaje de muestras, adquisición de datos de imágenes funcionales y análisis de datos. También se presentan algunos consejos y técnicas para resolver los problemas prácticos que pueden surgir al usar la μTongue.
Introduction
El microscopio de fluorescencia intravital se utiliza ampliamente para estudiar la dinámica espaciotemporal en los tejidos vivos. Los investigadores están desarrollando rápidamente sensores codificados genéticamente que proporcionan transformaciones específicas y sensibles de los procesos biológicos en señales de fluorescencia, que se pueden registrar fácilmente utilizando microscopios de fluorescencia que están ampliamente disponibles1,2. Aunque la mayoría de los órganos internos en roedores se han investigado utilizando el microscopio, su aplicación exitosa a la lengua aún no ha tenido éxito3.
Estudios previos sobre la imagen de calcio de las células gustativas se realizaron ex vivo mediante la sección delgada de un tejido de la lengua para obtener papilas gustativas circunvaladas4,5,6 omediante la descamación del epitelio gustativo para obtener papilas gustativas fungiformes7,8. La preparación de estas muestras fue inevitablemente invasiva, por lo que los microambientes naturales, como la inervación nerviosa, las barreras de permeabilidad y la circulación sanguínea, se perturbaron en gran medida. La primera ventana de imágenes de la lengua intravital fue reportada en 2015 por Choi et al., pero no se pudo lograr un registro funcional confiable debido al movimiento y los artefactos ópticos causados por los estímulos de sabor fluídico9.
Recientemente, se introdujo la microfluídica en una lengua (μTongue)10. Este dispositivo integra un sistema microfluídico con una ventana de imágenes en la lengua del ratón. Al lograr un flujo de estado cuasi-estacionario de estímulos saborantes a lo largo del período de imagen, los artefactos del movimiento fluídico podrían minimizarse(Figura 1). El puerto de entrada es alimentado por una serie de controladores de presión multicanal, mientras que el puerto de salida está conectado a una bomba de jeringa, que mantiene 0,3 ml / min. Además, los artefactos ópticos causados por la diferencia en los índices de refracción de las soluciones de sabor se minimizaron mediante el análisis ratiométrico introduciendo un indicador insensible al calcio (tdTomato), así como el indicador de calcio (GCaMP6)11. Este diseño proporcionó estabilidad microscópica de las células gustales in vivo incluso con un cambio abrupto entre canales fluídicos. En consecuencia, la μTongue implementa un cribado funcional fiable de múltiples saborantes a las papilas gustativas del ratón in vivo.
En este protocolo, los procedimientos experimentales se explican en detalle para la obtención de imágenes de calcio de las papilas gustativas fungiformes del ratón in vivo utilizando μTongue. En primer lugar, se describe la preparación de saliva artificial y soluciones sabrosas. En segundo lugar, se introduce la configuración del sistema microfluídico para lograr el flujo de estado cuasi estacionario. En tercer lugar, se delinean los procedimientos utilizados para montar la lengua del ratón en la lengua μ para permitir la adquisición de imágenes. Por último, se especifica cada paso para el análisis de imágenes, incluida la corrección de artefactos de movimiento lateral y la ratiometría. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a cualquier laboratorio de investigación con una instalación de ratón y un microscopio de dos fotones o equipo equivalente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los procedimientos quirúrgicos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Sungkyunkwan y la Universidad Nacional de Seúl.
1. Preparación de soluciones: saliva artificial y saborizantes
- Preparar saliva artificial disolviendo 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0.25 mM CaCl2, 0.25 mM MgCl2, 0.12 mM K2HPO4, 0.12 mM KH2PO4y 1.8 mM HCl en agua destilada (>1 L), y ajustar el pH de la solución a 7 (ver Tabla de Materiales)12.
- Prepare saborantes, como ácidos: 10 mM de ácido cítrico; salado: 400 mM NaCl, opcionalmente con amilorida de 50 μM; dulce: 40 mM acesulfamo K; amargo: una mezcla de 5 mM de quinina, 5 mM de denatonio y 20 μM de cicloheximida, disolviendo el producto químico de sabor en la saliva artificial preparada en la etapa 1.1.
2. Preparación del sistema microfluídico
NOTA: Los tastantes se administraron a la lengua del ratón utilizando un sistema de administración fluídica multicanal presurizado (consulte la Figura 1 y la Tabla de Materiales).
- Llene los depósitos del sistema de perfusión de flujo presurizado con saliva artificial y saborizantes.
- Conecte la línea de aire comprimido a la entrada del regulador y ajuste la presión de aire entre 30 y 50 psi en el sistema de suministro fluídico.
- Ajuste la presión de salida del regulador a 0,4 psi y compruebe si sale líquido del tubo bajo esta presión.
- Conecte el colector desde los depósitos al puerto de entrada de μTongue.
- Conecte el puerto de salida de μTongue a una bomba de jeringa y retire el líquido con ~300 μL∙min-1 para establecer la condición de estado estacionario. Observe el volumen constante de una gota colgante debajo de la μTongue. Ajuste el valor del parámetro de ajuste en función de la altura de la muestra.
- Desconecte la línea de aire comprimido y detenga la bomba de la jeringa hasta que se complete el paso 3 del protocolo.
3. Preparación del ratón para imágenes in vivo (Figura 2).
NOTA: Todas las preparaciones de animales se llevaron a cabo durante el día en condiciones asépticas en un banco de trabajo de laboratorio.
- Anestesia de ratón
- Prepare un ratón de 7 semanas de edad o más de cualquier sexo. Use una línea de ratón modificada genéticamente que exprese proteínas de fluorescencia sensibles al calcio en las células gustales.
- El ratón está sujeto para la anestesia. Se inyecta una mezcla de 100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina por vía intraperitoneal en elratón 13.
- TRITC-dextrano (500 kDa) en solución salina tampón de fosfato al 2,5% W/V se administra por vía intravenosa en el ratón a través de una ruta retroorbital para observar la circulación sanguínea durante una sesión de imágenes.
- Coloque un fijador de cabeza en el cráneo del ratón para minimizar los artefactos de movimiento.
- La cabeza del ratón se rocía con un 70% de ETOH mientras que el ratón se coloca en posición supina. Levante la piel de la cabeza ligeramente con fórceps y recorte aproximadamente 7 mm2 con tijeras.
- Limpie el cabello alrededor del cuero cabelludo, retire el periostio debajo de la piel, aplique un adhesivo instantáneo al cráneo y coloque un fijador de cabeza personalizado.
- Después de endurecer el adhesivo instantáneo, aplique pegamento dental alrededor del fijador de cabeza e ilumine con una luz azul para solidificar el pegamento dental.
- Coloque la lengua del ratón en la unidad inferior de μTongue.
- Fije el labio inferior del ratón a la unidad inferior de μTongue con un adhesivo instantáneo.
- Coloque el ratón en la placa (tablero de preparación del ratón en la Figura 1B)y coloque la unidad inferior de la μTongue en los postes (μTongue hold post en la Figura 1B). Asegúrese de que los orificios en el borde de la unidad inferior estén alineados con el poste.
- Apriete el fijador de cabeza del ratón al soporte del fijador de cabeza en la placa. Luego, ajuste la distancia entre la cabeza del mouse y el dispositivo. Gire la cabeza del ratón suavemente aproximadamente 45° con el soporte fijador de cabeza. Este proceso evita el contacto físico de la nariz del ratón con el objetivo del microscopio.
- Dibuje la lengua del ratón suavemente con pinzas de plástico y fije el lado ventral de la lengua a la parte superior de la unidad inferior de la μTongue. Luego, limpie la superficie de la lengua del ratón con un hisopo de algodón húmedo.
- Remoje un pedazo de papel en la saliva artificial y colóquelo en la superficie expuesta de la lengua del ratón para mantener una condición húmeda.
- Coloque las arandelas curvas en los postes que sujetan ambos extremos de la parte inferior de μTongue.
- Coloque la preparación del ratón en el escenario del microscopio. Coloque la lengua de ratón expuesta debajo del centro aproximado del área objetivo del microscopio. Asegúrese de no desviarse del rango dinámico del escenario. Luego, apriete la placa del mouse en el escenario con tornillos.
- Coloque la almohadilla térmica debajo del cuerpo del ratón y mantenga la temperatura a 36.5 °C-37.5 °C. Controle la temperatura corporal del ratón con un sensor de temperatura y controle la temperatura de la almohadilla térmica utilizando una señal de retroalimentación del sensor de temperatura.
- Gire un trozo delgado de papel y colóquelo en la boca del ratón para evitar que el líquido entre en la tráquea del ratón.
- Retire el tejido húmedo de la lengua del ratón y coloque la μTongue preparada sobre la lengua del ratón. Coloque un canal microfluídico en la lengua y ajuste su posición para observar la superficie de la lengua a través de la ventana de imágenes.
- Asegure la μTongue atornillando suavemente en ambos extremos con una presión de compresión mínima.
4. Adquisición de imágenes
- Encienda el láser de dos fotones de 920 nm y el microscopio antes de su uso.
- Monte el objetivo de inmersión en agua (16x, NA 0.80 o 25x, NA 1.1) en el microscopio. Deje caer el agua destilada en la ventana de imagen de la μTongue y sumerja el objetivo.
- En el modo de cámara, encienda la luz con la lámpara de mercurio e ilumine la superficie de la lengua.
- Al ajustar el eje Z, busque la señal autofluorescente de las papilas filiformes para encontrar el plano focal aproximado. Luego, usando la perilla de ajuste X e Y, ubique una papila gustativa.
- Cambie al modo multifotón. Establezca las condiciones de adquisición de la imagen de la siguiente manera: longitud de onda de excitación: 920 nm; conjunto de filtros de emisión: 447/60 nm, 525/50 nm y 607/70 nm; modo de escaneo ráster bidireccional, tamaño de fotograma: 512 x 512.
- Ajuste las posiciones X e Y para colocar la papilas gustativas en el centro de la ventana de la imagen.
- Busque los vasos sanguíneos que rodean la papilas gustativas a aproximadamente dos tercios de altura de la papilas gustativas. Visualice la circulación sanguínea mediante la inyección de TRITC-dextrano (500 kDa) a partir del paso 3.2 del protocolo. Si el flujo sanguíneo se obstruye, afloje ligeramente los tornillos de fijación para permitir el flujo sanguíneo.
- Ajuste el eje Z y encuentre el plano Z de la papila gustativa que contenga un número adecuado de células gustativas.
- Proceda con imágenes de calcio con 2-6 Hz durante 80 s. Proporcione una solución de sabor de 20 s encendiendo el depósito del sistema fluídico después de que comiencen las imágenes. Después de 20 s de estimulación del gusto, cambie el reservorio de nuevo a saliva artificial.
- Una vez finalizada la toma de imágenes secuenciales, espere unos 3-4 minutos antes de la siguiente sesión de imágenes. Mantenga la saliva artificial fluyendo a la lengua del ratón para eliminar el remanente sabroso de la sesión de imágenes anterior. Dependiendo del diseño del experimento, repita la sesión según sea necesario.
- Cuando se completen las imágenes de calcio in vivo, eutanasiar al ratón de acuerdo con el procedimiento IACUC. El ratón bajo anestesia se sacrifica en la cámara de CO2.
NOTA: Compruebe la profundidad de la anestesia utilizando un reflejo de pellizco del dedo del dedo del dedo del tudo. Durante una sesión de imágenes, la saliva artificial de los reservorios debe proporcionarse de manera consistente. Si aparecen burbujas en la ventana de imagen de la μTongue, retire las burbujas empujándolas a través de la entrada o la salida de la μTongue utilizando una fuerte presión de líquido.
5. Análisis de imágenes (Figura 3)
- Conversión de imágenes
- Abra los archivos de imagen sin procesar utilizando Fiji14 o un software de análisis de imágenes similar.
- Convierta el archivo de imagen en un archivo de pila RGB para utilizar el código NPL Bud Analyzer.
- Imagen > color > canales divididos
- Imagen > Color > Combinar canales y seleccione la imagen en el paso 5.2.1.
- Imagen > color > pila a RGB
- Registro de imágenes
Nota : utilice el código escrito personalizado para el análisis de datos. Consulte https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.- Ejecute el código denominado Taste_GUI.m; aparecerá una ventana de GUI llamada NPL Bud Analyzer. Haga clic en el botón Nuevo análisis en la esquina superior derecha y, a continuación, cargue la imagen convertida del paso 5.1. Establezca la velocidad de fotogramas por encima de la imagen cargada.
- Dibuje la región de interés (ROI) sobre la imagen cargada para el registro. Haga doble clic en el ROI seleccionado y se iniciará un registro calculado automáticamente.
- Obtener los cambios relativos de intensidadde fluorescencia (ΔF/F)
- Vuelva a la ventana NPL Bud Analyzer para mostrar automáticamente la imagen registrada del paso 5.2. Si el usuario ya tiene un archivo reg, haga clic en el botón Cargar datos y seleccione el archivo _reg.tif.
- Haga clic en el botón CIRCLE o POLYGON y coloque el ROI de la célula gustativa sobre la imagen de la papilas gustativas.
- Esto presenta la intensidad de fluorescencia en bruto y el rastro de calcio (ΔF/F)de la célula gustativa seleccionada automáticamente debajo de la imagen de la papilas gustativas.
- Haga clic en Guardar rastro para presentar el rastro de calcio (ΔF/F)en el lado derecho de la GUI, mientras que el ROI se muestra sobre la imagen de la papila gustativa. Repita los pasos 5.3.2-5.3.4 hasta que finalice la selección del ROI.
NOTA: Haga clic en el botón Eliminar seguimiento si el ROI está mal seleccionado para eliminar el último ROI y el seguimiento de calcio seleccionados. - Una vez finalizada la selección del ROI, escriba el nombre del archivo en la esquina inferior derecha y haga clic en el botón Finalizar para exportar el rastro de calcio ΔF/F como un formato .xls, y la imagen tase bud con ROI en un formato .bmp.
- Análisis del rastro de calcio
- Analizar el rastro de calcio obtenido del paso 5.3. Considere que las células gustales han reaccionado al sabor cuando la intensidad de fluorescencia aumenta más de dos desviaciones estándar de la línea de base después de que se entrega elsaborante 4, y los valores de pson inferiores a 0.01, utilizando pruebas t pareadas o no emparejadas10.
- Considere la célula gusta gustante como una célula respondedora, si responde a un determinado sabor más de dos veces de tres ensayos (~ 60%)15.
- Obtenga los rastros de calcio representativos promediando los rastros de calcio individuales adquiridos a partir del paso 5.4.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El ratón Pirt-GCaMP6f-tdTomato se utilizó para obtener una imagen de papilas gustativas. La superficie de la lengua del ratón estaba cubierta con papilas filiformes autofluorescentes. Las papilas gustativas se extienden escasamente sobre la superficie de la lengua(Figura 4A). Las imágenes de la papilas gustativas y su estructura se adquirieron utilizando tres detectores de filtro diferentes. Utilizando el conjunto de filtros de 607/70 nm, se obtuvo la señal tdTomato de las células gustales para el análisis ratiométrico(Figura 4B). Utilizando el conjunto de filtros de 525/50 nm, se adquirió la señal GCaMP de las células gustativas y los vasos sanguíneos que rodean la papila gustativa(Figura 4B). Utilizando el conjunto de filtros de 447/60 nm, se adquirió el tejido conectivo de colágeno, que soporta estructuralmente la papilas gustativas (Figura 4B).
Después de adquirir las imágenes de la papilas gustativas y las estructuras relativas, se realizaron imágenes de calcio in vivo utilizando el protocolo. El ratón Pirt-GCaMP6f-tdTomato se utilizó para detectar células gustales (Figura 5A)16. Las células gustales respondieron repetidamente a sus respectivos estímulos gustales(Figura 5B). Se consideró que las células gustales habían reaccionado al sabor cuando cumplían las condiciones presentadas en el protocolo 5.1.4. En este ensayo, la célula 2 respondió a los sabores dulces y umami. El resultado es consistente con investigaciones previas que observan la actividad celular utilizando la electrofisiología17. La celda 3 respondió tanto a 400 mM de NaCl como a 400 mM de NaCl bajo amilorida. Implica que la célula 3 ha utilizado una vía independiente de ENaC para la respuesta al sabor salado. La papilas gustativas en este experimento no incluyó una célula que respondiera a los sabores agrios. El cribado de las células gustales se llevó a cabo en condiciones de imagen estables, y cada célula gustal mostró una respuesta repetible a un tipo distinto de sabor.
Figura 1: La μTongue, una plataforma de imágenes funcionales basada en microfluídica. (A) Sistema de administración fluida presurizada. (i) El regulador de presión del sistema fluídico está conectado a la fuente de aire externa. La presión de la fuente de aire se ajusta entre 30-50 psi antes de entrar en el regulador de presión. (ii) La presión de aire del regulador es de aproximadamente 0.4 psi. (iii) Los reservorios que contienen saliva artificial y diferentes soluciones de sabor están conectados a la salida del regulador de presión de aire. iv) Cada depósito converge en un colector que está conectado al puerto de entrada de la μTongue. (v) Una bomba de jeringa está conectada a la salida de la μTongue y controla el flujo. (B) The μTongue, una plataforma de imágenes funcionales basada en microfluídica. El nombre de cada pieza se especifica en la figura. (i) Tablero de preparación del ratón. (ii) Placa de configuración del sistema fluídico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Descripción secuencial de la preparación del ratón. Se muestran pasos importantes en la preparación del ratón. (A) Inyección retroorbital de TRITC-dextrano. (B) Se muestra el proceso de fijación de un fijador de cabeza al cráneo del ratón. La piel de la cabeza y el periostio se eliminan. El pegamento adhesivo y el pegamento dental se utilizan para la fijación. (C) El fijador de cabeza en el cráneo del ratón se atornilla a la placa de preparación del ratón. (D) Procedimiento de montaje de una lengüeta en la unidad inferior de la μTongue. Se utiliza un adhesivo instantáneo para la fijación de la lengua. La lengua se limpia con un hisopo de algodón húmedo y se cubre con pañuelos de papel húmedo para evitar la sequedad. (E) Las arandelas curvas se aplican a ambos extremos de la unidad inferior de la μTongue. (F) Se coloca un trozo de tejido de papel retorcido en la cavidad oral del ratón. (G) La placa de preparación del ratón se monta en la etapa del microscopio y se atornilla herméticamente para garantizar condiciones de imagen estables. (H) La lengua μ se coloca en la lengua. Se ajusta una lente de objetivo sobre la ventana de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de imágenes. (A) Se convierte una imagen RGB a partir de cada imagen de un solo color. Barra de escala, 10 μm. (B) Registro de imágenes utilizando un código personalizado realizado. (C) GUI del código personalizado. (i) Ubicación de entrada para la velocidad de fotogramas. La velocidad de fotogramas predeterminada es de 0,16 s/fotograma. (ii) Botones para dibujar ROIs. iii) La zona en la que se muestra la imagen cargada. (iv) La señal de calcio del ROI seleccionado se muestra como una traza verde, mientras que la señal insensible al calcio del ROI seleccionado se muestra como una traza roja. (v) El análisis ratiométrico y ΔF/F se calculan automáticamente. ElgrafoΔF/F se presenta en magenta. (vi) Botones para la carga de imágenes. Nuevo análisis es para cargar una imagen convertida RGB. Cargar datos es para cargar una imagen que ya se ha realizado el registro. (vii) El botón Guardar seguimiento es para mantener el gráfico ΔF/F y el ROI seleccionado en viii. El botón Eliminar seguimiento es para eliminar el gráfico ΔF/F de viii. (viii) Se muestran los rastros de calcio guardados. (ix) Área para rellenar el nombre del archivo. El botón Finalizar es para extraer datos y guardarlos en el mismo directorio del código. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: La superficie de la lengua de ratón y una papila gustativa en las papilas fungiformes. (A) La superficie de la lengua de ratón se captura en un campo grande. Se muestran las papilas filiformes queratinizadas de las papilas gustativas y la estructura del colágeno. Cada estructura se indica utilizando diferentes colores: magenta, amarillo y verde, respectivamente. Barra de escala, 100 μm. (B) Una papilas gustativas de (A) se magnifica y captura utilizando tres detectores de filtro de emisión diferentes. Las papilas filiformes, en amarillo, se capturan utilizando un detector de 525/50 nm. Esta estructura se observa desde la superficie misma de la lengua hasta ~ 25 μm de profundidad. Las señales GCaMP en verde y las señales tdTomato en rojo representan las células gustales. Estas señales son detectadas por detectores de 525/50 y 607/70 nm, respectivamente. El dextrano de rodamina que representa la circulación sanguínea se captura en detectores de 525/50 y 607/70 nm. La estructura de colágeno que se muestra en el azul cian es adquirida por detectores de 447/60 nm. La última imagen muestra todas las imágenes anteriores fusionadas. Barra de escala, 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cribado del sabor de un ratón Pirt-GCaMP6f-tdTomato in vivo. (A) Una papila gustativa representativa del ratón Pirt-GCaMP6f-tdTomato. La imagen se muestra como un pseudocolor basado en la intensidad. Las líneas discontinuas demarcan cada célula gustada. El brillo de cada célula gustal depende de la expresión de la proteína fluorescente y la profundidad de la ubicación de la célula gustal. Barra de escala, 10 μm. (B) El rastro de calcio de cada célula gustal para los cinco estímulos gustaitulares básicos. Cada ensayo repetido se muestra en gris en la parte posterior y el rastro promediado se presenta encima de cada ensayo. Los rastros de color se definen como sensibles, mientras que los rastros negros se definen como no sensibles. Cada color representa un sabor diferente. Salty(L) representa bajo contenido salado, con una mezcla de 400 mM NaCl y 50 μM amilorida utilizado para la estimulación del gusto. Salty(H) representa alto contenido de sal, con 400 mM de NaCl utilizado para la estimulación. La estimulación del gusto se muestra como una caja gris en la parte posterior de cada rastro de calcio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aquí se describe un protocolo detallado para aplicar μTongue a la investigación de las actividades funcionales de las células gustativas in vivo. En este protocolo, se realiza la imagen funcional en las células gustales utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente. Además del uso de ratones transgénicos, la carga electroforética de colorantes de calcio (o colorantes sensibles al voltaje) en las células gustativas puede ser una opción alternativa.
En este experimento se utilizaron todas las soluciones gustativas inferiores a 1,336 de índice de refracción. Aunque μTongue proporciona una entrega fluídica estable y el análisis ratiométrico mejora los artefactos de imagen, será un desafío para los investigadores utilizar una mayor concentración de saborante (por ejemplo, sacarosa de >100 mM con índice de refracción en 1.338). La gran diferencia en el índice de refracción entre la saliva artificial y la solución gustativa cambia el plano focal de la imagen más que el rango de compensación por el proceso posterior a la imagen. Empíricamente, se obtiene un cierto rango de índice de refracción de la solución gustativa (inferior a 1.336) que permite obtener imágenes celulares estables en tiempo real.
Para los investigadores con experiencia en imágenes de fluorescencia y manejo de animales, este protocolo se puede aprender fácilmente a través de la práctica repetida. Sin embargo, contiene pasos críticos, que a menudo impiden la adquisición exitosa de datos. Primero, una vez exteriorizada del civismo oral, la lengua debe mantenerse húmeda con saliva artificial para preservar el microambiente natural de la mucosa. En segundo lugar, la circulación sanguínea alrededor de la papilas gustativas debe estar intacta, para mantener un suministro fisiológico de oxígeno, nutrientes y factores transmitidos por la sangre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores declaran intereses financieros contrapuestos: J. Han y M. Choi son inventores de la tecnología patentada μTongue descrita en este artículo, y el sistema μTongue está disponible comercialmente a través de SciTech Korea.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Instituto de Ciencias Básicas (IBS-R015-D1), la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (No. 2019M3A9E2061789) y por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno de Corea (MSIT) (No. 2019M3E5D2A01058329). Agradecemos a Eunsoo Kim y Eugene Lee su asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acesulfame K | Sigma Aldrich | 04054-25G | Artificial saliva / tastant |
| calcium chloride solution | Sigma Aldrich | 21115-100ML | Artificial saliva / tastant |
| citric acid | Sigma Aldrich | C0759-100G | Artificial saliva / tastant |
| cycloheximide | Sigma Aldrich | 01810-5G | Artificial saliva / tastant |
| denatonium | Sigma Aldrich | D5765-5G | Artificial saliva / tastant |
| Dental glue | Denkist | P0000CJT-A2 | Animal preparation |
| Image J | NIH | ImageJ | Data analysis |
| IMP | Sigma Aldrich | 57510-5G | Artificial saliva / tastant |
| Instant adhesive | Loctite | Loctite 4161, Henkel | Animal preparation |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P3786-100G | Artificial saliva / tastant |
| KCl | Sigma Aldrich | P9541-500G | Artificial saliva / tastant |
| Ketamine | Yuhan | Ketamine 50 | Animal preparation |
| KH2PO4 | Sigma Aldrich | P0662-25G | Artificial saliva / tastant |
| KHCO3 | Sigma Aldrich | 237205-500G | Artificial saliva / tastant |
| MATLAB | Mathwork | MATLAB | Data analysis |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266-100G | Artificial saliva / tastant |
| MPG | Sigma Aldrich | 49601-100G | Artificial saliva / tastant |
| Mutiphoton microscope | Thorlab | Bergamo II | Microscope |
| NaCl | Sigma Aldrich | S3014-500G | Artificial saliva / tastant |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | 792519-500G | Artificial saliva / tastant |
| Objective | Nikon | N16XLWD-PF | Microscope |
| Octaflow | ALA Scientific Instruments | OCTAFLOW II | Fluidic control |
| PC | LG | Lg15N54 | Fluidic control |
| PH meter | Thermoscientific | ORION STAR AZ11 | Artificial saliva / tastant |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | 806562 | Artificial saliva / tastant |
| quinine | Sigma Aldrich | Q1125-5G | Artificial saliva / tastant |
| Syringe pump | Havard Apparatus | PHD ULTRA 4400 | Fluidic control |
| TRITC-dextran | Sigma Aldrich | 52194-1G | Animal preparation |
| Ultrafast fiber laser | Toptica | FFultra920 01042 | Microscope |
| Xylazine | Bayer Korea | Rompun | Animal preparation |
References
- Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).
- Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment. Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).
- Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells. Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).
- Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds. Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).
- Dando, R., Roper, S. D. Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels. The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).
- Chandrashekar, J., et al. The cells and peripheral representation of sodium taste in mice. Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).
- Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. High salt recruits aversive taste pathways. Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).
- Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation. Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).
- Han, J., Choi, M. Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo. bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).
- Thestrup, T., et al. Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes. Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).
- Danilova, V. Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice. BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).
- Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength. Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tan, H. E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds. The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).
- Kusuhara, Y., et al. Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1. Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).
