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Biology

शहरी पर्यावरण को स्वैबिंग - पर्यावरण जलाशयों से सार्स-सीओवी-2 के नमूने और पता लगाने के लिए एक पाइपलाइन

Published: April 9, 2021 doi: 10.3791/62379
Automatic Translation
1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Biology, San Diego State University, 2Viral Information Institute, San Diego State University, 3Big Rose Web Design, LLC

Summary

एक नागरिक विज्ञान परियोजना के लिए सैन डिएगो निवासियों की भर्ती के लिए सार्स-CoV-2 के लिए पर्यावरण के नमूने इकट्ठा डिजाइन किया गया था । उपयोगकर्ता के अनुकूल मोबाइल डिवाइस इंटरफेस का उपयोग करके डेटा सबमिशन के लिए एक बहुभाषी वेब-आधारित मंच बनाया गया था। एक प्रयोगशाला सूचना प्रबंधन प्रणाली ने वास्तविक समय परिणाम ट्रैकिंग के साथ हजारों भौगोलिक रूप से विविध नमूनों के संग्रह की सुविधा प्रदान की।

Abstract

2020 वैश्विक महामारी के दौरान गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) के सामुदायिक संचरण को नियंत्रित करने के लिए, अधिकांश देशों ने प्रत्यक्ष मानव परीक्षण, चेहरे को कवर करने और सतह कीटाणुशोधन के आधार पर रणनीतियों को लागू किया। इस धारणा के तहत कि संचरण के मुख्य मार्ग में एयरोसोल और श्वसन बूंदें शामिल हैं, फोमाइट्स में सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के प्रयासों ने उच्च व्यापकता (जैसे, अस्पताल के वार्ड, क्रूज जहाजों और बड़े पैमाने पर परिवहन प्रणाली) के संदिग्ध स्थानों पर ध्यान केंद्रित किया है। शहरी वातावरण में सतहों पर सार्स-CoV-2 की उपस्थिति की जांच करने के लिए जो शायद ही कभी साफ होते हैं और शायद ही कभी कीटाणुरहित होते हैं, ३५० नागरिकों को ग्रेटर सैन डिएगो काउंटी से सूचीबद्ध किया गया था । कुल मिलाकर इन नागरिक वैज्ञानिकों ने ४,०८० नमूने एकत्र किए । नमूना किट वितरण और पिकअप की निगरानी के साथ-साथ नमूना डेटा एकत्र करने के लिए एक ऑनलाइन मंच विकसित किया गया था। नमूना किट ज्यादातर महामारी पर बल दिया दुकानों में उपलब्ध आपूर्ति से बनाया गया था । नमूनों को रिएजेंट्स का उपयोग करके संसाधित किया गया था जो आवर्ती आपूर्ति की कमी के बावजूद आसान थे। उपयोग किए जाने वाले तरीके अत्यधिक संवेदनशील और अवरोधकों के लिए प्रतिरोधी थे जो आमतौर पर पर्यावरणीय नमूनों में मौजूद होते हैं। प्रस्तावित प्रायोगिक डिजाइन और प्रसंस्करण विधियां कई नागरिक वैज्ञानिकों को उलझाने में सफल रहीं, जिन्होंने विभिन्न सतह क्षेत्रों से प्रभावी ढंग से नमूने एकत्र किए । यहां वर्णित कार्यप्रवाह और विधियां अन्य वायरसों के लिए शहरी वातावरण का सर्वेक्षण करने के लिए प्रासंगिक हैं, जो सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंता के हैं और भविष्य में महामारी के लिए खतरा पैदा करते हैं ।

Introduction

सार्स-सीओवी-2 को मुख्यरूप से संक्रमित व्यक्तियों1,2,3,4 के साथ सीधे संपर्क से दूषित एयरोसोल और बूंदों के साँस लेने के माध्यम से प्रेषित कियाजाताहै। हालांकि, वैश्विक COVID-19 महामारी के प्रारंभिक चरणों के दौरान, सार्स-CoV-2 के संचरण को नियंत्रित करने के प्रयासों को कीटाणुरहित सतहों, हैंडवाशिंग और स्वच्छता पर दृढ़ता से ध्यान केंद्रित किया गया । २०२० के अंत तक, विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ)5 और अमेरिका के रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र (सीडीसी) से संचरण दिशानिर्देश6 एयरबोर्न ट्रांसमिशन को मुख्य रूप से एक खतरा समझा जब एक संक्रमित व्यक्ति के साथ (<2 मीटर) या एयरोसोल पैदा करने वाली चिकित्सा प्रक्रियाओं की उपस्थिति में । दूषित सतहों के संपर्क या एयरोसोलाइज्ड फोमाइट्स के साँस लेने के बाद आत्म-टीका अभी तक सार्स-सीओवी-2 के संचरण के मार्ग के रूप में इंकार किया जाना है ।

COVID-19 मामलों की सूचना दी गई है जहां हवाई संचरण की संभावना नहीं है7,8। सार्स-CoV-2 virions 8 घंटे तक के लिए तांबे पर संक्रामक रहते हैं, गत्ता और स्टेनलेस स्टील पर अप करने के लिए 24 घंटे तक, और प्लास्टिक पर अप करने के लिए ४८ एच9। क्रूज शिप केबिन में, सार्स-CoV-2 आरएनए का पता चला 17 दिन बाद यात्रियों को7रवाना किया था । अस्पतालों और मास-ट्रांजिट सिस्टम से हवा और सतह के नमूनों कासार्स-सीओवी-2 और अन्य कोरोनावायरस8,10, 11,12,13, 14केलिए सकारात्मक परीक्षण किया गया है। स्पर्शोन्मुख और मध्यम/हल्का रोगसूचक COVID-19 रोगियों द्वारा संभाला हैलोवीन कैंडी की बाहरी पैकेजिंग पर किए गए एक अध्ययन में यह निष्कर्ष निकाला गया कि हैंडलर द्वारा हाथ धोने और हाथ साबुन के साथ कैंडी की धुलाई के संयोजन ने सार्स-सीओवी-2 आरएनए को सीमा स्तर से नीचे15तक कम कर दिया ।

सार्स-सीओवी-2 डायग्नोस्टिक्स के लिए कई तरीके वास्तविक समय रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (आरटी-क्यूपीसीआर)16,17,रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (आरटी-लैंप)11,18,19,20,21,और CRISPR-Cas टेक्नोलॉजीज18,19,22, 23केआधार पर प्रकाशित किए गए हैं । सबसे आरएनए निष्कर्षण किट है कि महत्वपूर्ण वैश्विक मांग की अवधि के दौरान कम आपूर्ति में अक्सर कर रहे है की आवश्यकता है, और बहुत कुछ वायरस24के पर्यावरण स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है । आरटी-लैंप का उपयोग करके सार्स-सीओवी-2 आरएनए का पता लगाने को आरटी-क्यूपीसीआर का उपयोग करने के लिए 83% से अधिक कॉनकॉर्डेंट होने का प्रदर्शन किया गया है। इसके अलावा, आरटी-लैंप के परिणामस्वरूप आरटी-क्यूपीसीआर 15 की तुलना में अनिर्णानीय परिणामों में25%की कमी आई ।

आर टी-लैंप एक सरल तकनीक है जो आरएनए टेम्पलेट25से सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज का उपयोग करती है, जिसके बाद मजबूत स्ट्रैंड-विस्थापन गतिविधि के साथ डीएनए पॉलीमरेज होता है जो निरंतर तापमान पर डीएनए को संश्लेषित करता है (यानी, आइसोथर्मल प्रवर्धन)26। वायरल जीनोम का पता लगाने की उच्च विशिष्टता चार या छह प्राइमर का उपयोग करके हासिल की जाती है जो लक्ष्य डीएनए के छह या आठ क्षेत्रों को पहचानते हैं । प्रवर्धन एक आंतरिक प्राइमर से शुरू किया जाता है और एक अर्द्ध डबल फंसे डीएनए संरचना पैदावार । प्रमुख कतरा तो एक बाहरी प्राइमर द्वारा परिलक्षित होता है । ये प्रवर्धन रिवर्स प्राइमर के लिए दोहराए जाते हैं। दोनों छोर पर आंतरिक और बाहरी प्राइमर में एक आंतरिक रिवर्स आत्म-पूरक साइट होती है जो प्रवर्धन उत्पाद26,27में एक पाश बनाती है। आइसोथर्मल स्ट्रैंड विस्थापन में, अतुल्यकालिक डीएनए संश्लेषण उच्च मात्रा में प्रवर्धित उत्पाद उत्पन्न करता है जहां निरंतरबहुलीकरण 11,20,28प्रति 10 प्रतियों के संकेत को बढ़ाता है। कोलोरिमेट्रिक आरटी-लैंप मिश्रण कमजोर रूप से बफर होता है और पीएच संकेतक के रूप में फिनोल लाल का उपयोग करता है। चूंकि पॉलीमरेज में न्यूक्लियोटाइड शामिल है, यह एक प्रोटॉन जारी करता है, और पर्याप्त प्रोटॉन समाधान के पीएच के साथ-साथ गुलाबी से पीलेरंग के11,20, 28,29में बदल देगा।

आर टी-लैंप को परिधीय स्वास्थ्य देखभाल सुविधाओं में मच्छर जनित रोगों का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था जिसमें पूरी तरह से सुसज्जित प्रयोगशालाओं की कमीहै 25 और मानव इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस30जैसे अन्य आरएनए वायरस का तेजी से पता लगाने के लिए । महामारी फैलने में सबसे कमजोर आबादी- डब्ल्यूएचओ की परिभाषा के अनुसार- अक्सर पर्याप्त आर्थिक संसाधनों और उचित उपकरणों की कमी का पता लगाने के लिए (संयुक्त राष्ट्र वैश्विक सार्वजनिक स्वास्थ्य एजेंडा) की कमी होती है। वर्तमान सार्स-सीओवी-2 महामारी में, आरएनए निष्कर्षण किट के लिए मेडिकल ग्रेड झाड़ू और अभिकर्मक जैसी आपूर्ति वैश्विक मांग को पूरा करने में सक्षम नहीं रही है, विशेष रूप से गैर-विनिर्माण देशों में । प्रस्तावित प्रोटोकॉल में एक ग्वानिनियम थिओसाइनेट (जीईटीसी) आधारित क्रूड आरएनए निष्कर्षण का उपयोग किया गया, जिसने आरएनए को ठंड-श्रृंखला स्वतंत्र तरीके से प्रभावी ढंग से संरक्षित किया और नमूने से अवरोधकों के हठ को काफी कम कर दिया। इसके अलावा, जीआईसीसी-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण प्रोटोकॉल डीएनए और प्रोटीन से आरएनए के अलगाव पर आधारित है जिसके बाद संबंधित वर्षा होती है, जिससे अधिकांश आनुवंशिक सामग्री की वसूली की अनुमति होती है । यदि उन्हें जोखिमों के बारे में उचित रूप से सूचित करने के लिए उपाय किए जाते हैं तो ये लाभ रसायन से निपटने वाले नागरिक वैज्ञानिकों के संभावित खतरों से पल्ला झाड़ लेते हैं ।

प्रस्तावित कार्यप्रवाह उन सामग्रियों और अभिकर् ती का उपयोग करता है जो सामान्य उपयोग के होते हैं। इसके लिए ऐसे उपकरणों की आवश्यकता होती है जो बुनियादी, अक्सर ग्रामीण, प्रयोगशाला सेटिंग्स में उपलब्ध होते हैं। ये विधियां सस्ती हैं, अक्सर पर्यावरणीय नमूनों या नमूनों में पाए जाने वाले अवरोधकों के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी हैं जिन्हें निष्कर्षण किट के साथ संसाधित नहीं किया जा सकता है, और उच्च सटीक थर्मोसाइकिलर की आवश्यकता को खत्म किया जा सकता है। यह अध्ययन आमतौर पर छुआ और घरों और शहरी पर्यावरण की सतहों को शायद ही कभी कीटाणुरहित करने पर पर्यावरण जलाशयों से सार्स-CoV-2 के नमूने और पता लगाने के लिए एक पाइपलाइन प्रस्तुत करता है ।

Protocol

सूची संख्या, निर्माता और इसी लागत सहित अभिकर् ती और आपूर्ति की विस्तृत सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. शहरी पर्यावरण का नमूना

  1. नागरिक वैज्ञानिक आउटरीच
    1. स्थानीय और सामाजिक मीडिया के माध्यम से जारी एक प्रत्यक्ष और स्पष्ट कॉल करने वाली कार्रवाई का उपयोग कर नागरिक वैज्ञानिकों की भर्ती करें । सोशल मीडिया सामग्री में विषय को जोड़ने के लिए एक सोशल मीडिया हैंडल (जैसे, #swab4corona)बनाएं।
    2. प्रयोगशाला टीम और प्रत्येक नागरिक वैज्ञानिक के बीच सीधे संचार के लिए एक ईमेल खाता बनाएं, जो ब्याज के क्षेत्र की मुख्य भाषाओं में धाराप्रवाह व्यक्ति द्वारा प्रबंधित किया जाता है (उदाहरण के लिए, सैन डिएगो काउंटी के लिए स्पेनिश और अंग्रेजी)।
    3. एक डेटाबेस, एक प्रयोगशाला सूचना प्रबंधन प्रणाली (लिम्स) के रूप में सेवा करने और नागरिक वैज्ञानिकों के साथ संवाद करने के लिए एक सुरक्षित वेब-आधारित नमूना प्रबंधन मंच (एसएमपी) बनाएं।
      नोट: एसएमपी एक केंद्रीकृत स्थान प्रदान करता है जहां उपयोगकर्ता एक किट का अनुरोध करते हैं, नमूना संग्रह प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं, नमूना मेटाडेटा जमा करते हैं, और पूर्ण नमूना किट के लिए पिकअप का अनुरोध करते हैं।
    4. ऑनलाइन फॉर्म में निर्दिष्ट जैव सुरक्षा से संबंधित प्रश्नों का उत्तर देकर पर्यावरणीय नमूनाकरण प्रयास में भाग लेने के लिए आवेदन करने के लिए व्यक्तियों के लिए एसएमपी (उदाहरण के लिए, https://demo.covidsample.org/)(चित्रा 1)का लिंक बनाएं।
    5. क्लाउड कंप्यूटर सेवा प्रदाता द्वारा सुविधाजनक ऑथेंटिकेशन एप्लीकेशन प्रोग्रामिंग इंटरफेस का उपयोग करके एसएमपी तक सुरक्षित पहुंच। अनुमोदित उपयोगकर्ताओं को एसएमपी तक पहुंच दें।
      नोट: प्रमाणीकरण और प्राधिकरण के लिए OAuth 2.0 प्रोटोकॉल31 के विवरण के लिए साहित्य का उल्लेख करें। यह नागरिक वैज्ञानिक स्वयंसेवकों के लिए एक घर्षणरहित साइन-इन प्रक्रिया प्रदान करता है। यह उपयोगकर्ताओं को मौजूदा खाते के साथ साइन-इन करने की अनुमति देता है, एक कस्टम साइन-इन समाधान बनाने और उपयोगकर्ता क्रेडेंशियल्स का प्रबंधन करने की आवश्यकता को समाप्त करता है, जो महत्वपूर्ण समय बचाता है और भागीदारी को प्रोत्साहित करता है। हाल की रिपोर्टों के अनुसार, चुने हुए क्लाउड कंप्यूटर सेवा प्रदाता के लिए उपलब्ध मुफ्त ईमेल सेवा में लगभग 1.5 बिलियन मासिक-सक्रिय ईमेल उपयोगकर्ता हैं; भागीदारी के लिए इस सेवा प्रदाता से एक ईमेल खाते की आवश्यकता एक हतोत्साहित कारक नहीं माना जाता है ।
    6. एसएमपी में नागरिक वैज्ञानिकों को अपनी पहली किट का अनुरोध करने से पहले अध्ययन और जैवसेफ्टी विचारों के उद्देश्य की व्याख्या करें। क्लाउड कंप्यूटर सेवा प्रदाता द्वारा सुविधाजनक बहुभाषी तंत्रिका मशीन अनुवाद सेवा से उपलब्ध किसी भी भाषा में नेविगेशन सक्षम करने के लिए एक बहुभाषी प्लगइन प्रदान करें।
    7. अंग्रेजी और स्पेनिश में नमूना अनुभाग ग्राफिक और ऑडियोविजुअल प्रोटोकॉल में शामिल करें।
    8. प्रत्येक किट के लिए एक अद्वितीय पहचानकर्ता असाइन करें, और डेटा प्रविष्टि प्रक्रिया(चित्रा 1A)को सुव्यवस्थित करने के लिए नमूना आईडी से जुड़े बटन का उपयोग करने के लिए यूजर इंटरफेस डिजाइन करें।
    9. डिलीवरी/पिकअप मार्गों को अनुकूलित करने और आगमन के सटीक अनुमानित समय के नागरिक वैज्ञानिकों को सूचित करने के लिए ड्राइवरों द्वारा उपयोग किए जाने वाले मोबाइल-डिवाइस एप्लिकेशन के साथ डिलीवरी रूट प्लानिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    10. पीएचपी वेब सेवा स्टैक पर लिम्स प्लेटफॉर्म का निर्माण करें, और इसे एक वाणिज्यिक होस्टिंग प्लेटफॉर्म पर होस्ट करें (सुझाए गए ऑपरेटिंग सिस्टम, वेब सर्वर सॉफ्टवेयर और डेटाबेस सॉफ्टवेयर सामग्री की तालिकामें निर्दिष्ट हैं)।
    11. लैब कर्मियों को एलआईएसएस में डेटा को जल्दी और आसानी से प्रबंधित करने में सक्षम बनाने के लिए एक सुरक्षित वेब-आधारित एप्लिकेशन इंटरफेस प्रदान करें। क्लाउड कंप्यूटर सेवा प्रदाता द्वारा सुविधाजनक डेटा चार्टिंग एप्लीकेशन प्रोग्रामिंग इंटरफेस का उपयोग करके डेटा विज़ुअलाइज़ेशन प्रदान करें।
    12. क्लाउड कंप्यूटर सेवा प्रदाता द्वारा सुविधाजनक भू-स्थानिक एप्लिकेशन प्रोग्रामिंग इंटरफेस का उपयोग करके भू-स्थानिक डेटा की कल्पना करें। परियोजना डेटा के केंद्रीकृत भंडारण (1) की सुविधा के लिए एसएमपी के माध्यम से एलिम्प को प्रस्तुत किए गए डेटा को स्टोर करें; (2) नमूना/डेटा प्रोसेसिंग वर्कफ्लो की ट्रैकिंग; और (3) नागरिक वैज्ञानिकों को नमूना किट वितरण के रसद का प्रबंधन ।
    13. सर्वोत्तम प्रथाओं (जैसे, https://demo.covidsample.org/)का उपयोग करके सबमिट किए गए मेटाडेटा को सुरक्षित करें।
    14. डेटा-प्रकार अनुपालन को सक्षम करने और उपयोगकर्ता द्वारा गलत या लापता डेटा के प्रस्तुत करने को कम करने के लिए नमूना किट आईडी, नमूना आईडी, तिथि, समय और ग्लोबल पोजिशनिंग सिस्टम (जीपीएस) जैसी पूर्व-लोड जानकारी (स्वचालित रूप से साइट की तस्वीर से एकत्र) को निर्देशित करती है और उपयोगकर्ता द्वारा गलत या लापता डेटा प्रस्तुत करने को कम करतीहै (चित्र 1बी)। नागरिक वैज्ञानिक द्वारा भरे गए मैन्युअल रूप से और तेजी से (<1 मिनट) के लिए निम्नलिखित फ़ील्ड शामिल करें: संग्रह की तारीख और समय, स्थान का संक्षिप्त विवरण और नमूना साइट की तस्वीर।
    15. सभी अपलोड किए गए डेटा को साफ करें, और डेटा प्रकार के लिए मान्य करें। उदाहरण के लिए, .jpg फ़ाइलों का चयन करने के लिए उपयोगकर्ताओं द्वारा अपलोड किए गए इमेज डेटा को मान्य करें, नमूने के साथ तेजी से सहयोग के लिए नमूना आईडी के साथ उनका नाम बदलें, और उपयोगकर्ताओं के लिए सुलभ नहीं एक अलग सुरक्षित स्थान पर अपलोड की गई छवियों को स्टोर करें।
    16. सभी नमूनों (16) पूरा हो गया है जब किट वितरण और पिक अनुरोध करने के लिए विकल्प सक्रिय करें। इसके अतिरिक्त, पिछले एक(चित्रा 1A)की पिकअप पर वितरित की जाने वाली एक नई किट का अनुरोध करने के विकल्प को सक्रिय करें।
      नोट: स्वयंसेवकों के लिए जो एक गैर वेब आधारित मंच पसंद करते है और उनके जीपीएस स्थान का खुलासा करने के बारे में चिंतित लोगों के लिए (उदाहरण के लिए, उनके प्रवासी स्थिति के बारे में चिंतित समुदाय के सदस्यों), किट एक सहमत बैठक स्थान पर दिया जा सकता है और स्वयंसेवकों को डेटा संग्रह का एक लिखित संस्करण रिकॉर्ड करने के लिए कहा । प्रयोगशाला और प्रत्येक नागरिक वैज्ञानिक के बीच संचार के लिए, टेलीफोन कॉल और ग्रंथों के लिए उपलब्ध परियोजना का एक द्विभाषी सदस्य है ।
  2. कोरोना के लिए झाड़ू
    1. नमूना प्रयास के लिए एक महामारी विज्ञान प्रासंगिक समय खिड़की की पहचान करें।
    2. एक किट बनाएं जिसमें आवश्यक व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (यानी, मुखौटा, दस्ताने), एक नमूना प्रोटोकॉल, और जैव सुरक्षा प्रासंगिक जानकारी(चित्रा 2)सहित सभी नमूना आपूर्ति शामिल हैं। सौंपे गए अद्वितीय पहचानकर्ता (नमूना आईडी) के साथ प्रत्येक ट्यूब को प्री-लेबल करें।
    3. झाड़ू शायद ही कभी कीटाणुरहित सतहों कि घरों और शहरी वातावरण में एयरोसोलाइज्ड fomites के संपर्क में हैं ।
      1. क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक नमूने के संग्रह के लिए सार्वजनिक रूप से प्रदान किए गए मास्क और दस्ताने की एक नई जोड़ी पहनें। सैंपलिंग खत्म करने के बाद दिए गए हैंड सैनिटाइजर का इस्तेमाल करें।
      2. अपने लिफाफे को बाधित करके वायरस को निष्क्रिय करने और RNases32 के खुलासा द्वारा नग्न आरएनए को स्थिर करने के लिए डिटर्जेंट (उदाहरण के लिए, 0.5% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस)) के साथएक 1सेमी 2 पॉलिएस्टर शोषक झाड़ू (उदाहरण के लिए, एमओपी पैड) गीला करें।
      3. झाड़ू 10 सेमी2की सतह । टूथपिक द्वारा सहायता प्राप्त, प्रत्येक नमूना झाड़ू को संबंधित पूर्व-लेबल वाली ट्यूब में पूरी तरह से जलमग्न कर देता है जिसमें 200 माइक्रोन ग्वेनिडिनियम थियासाइनेट समाधान (जीआईसीटीसी) होता है। ट्यूबों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि उन्हें प्रयोगशाला में ले जाया न जाए। एक बार नमूने प्रयोगशाला में पहुंचने के बाद, उन्हें -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
        नोट: जीआईसीटी एक विषाक्त अड़चन है; त्वचा के संपर्क से बचें। जीआईटीसी समाधान आम प्रयोगशाला रसायनों से तैयार करने के लिए सरल है, नुस्खा33, 34देखें। यह वायरस को निष्क्रिय करता है, आरएनएको34, 35,36को विकृत करके स्थिर करता है, और कमरे के तापमान पर नमूनों को स्थिर करता है। हालांकि, किट में भंडारण के लिए घरेलू रेफ्रिजरेटर का उपयोग करने की आवश्यकता के बिना नमूनों को ठंडा रखने के लिए आइस पैक शामिल हैं ।

2. सार्स-CoV-2 का पता लगाने

  1. कुल आरएनए अलगाव
    1. 2 एमएम कॉपर सल्फेट और 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के समाधान के साथ सतहों, उपकरणों और पिपेटर्स को कीटाणुरहित करें; इसके बाद 10% ब्लीच, 90 एमएम सोडियम बाइकार्बोनेट, 5% एसडीएस और 2.5% नाओएच का समाधान किया गया। 75% इथेनॉल के बाद आसुत पानी के साथ अच्छी तरह से पोंछें।
      नोट: ये समाधान व्यावसायिक रूप से उपलब्ध समाधानों के लिए एक विकल्प हैं।
    2. बर्फ पर गल नमूने। मध्यम गति से 2 मिनट के लिए भंवर के नमूने।
    3. जांच की गति बढ़ाने के लिए, पूल में नमूनों की प्रक्रिया करें। यदि कोई पूल सकारात्मक है, तो सकारात्मक नमूना खोजने के लिए स्वतंत्र रूप से प्रत्येक नमूने के आरएनए को निकालें। प्रत्येक नमूना किट (16 कुल) से नमूनों को 8 नमूनों के 2 पूल में मिलाएं।
      नोट: पूल प्रति 8 नमूने होने का मतलब है कि केवल 2 पूल प्रति किट संसाधित करने की आवश्यकता है । यदि एक पूल सकारात्मक है, तो व्यक्तिगत नमूनों को व्यक्तिगत आरटी-लैंप विश्लेषण के लिए फिर से संसाधित किया जाता है। इससे समय, लागत और रिएजेंट्स कम हो जाते हैं।
    4. एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब (कुल मात्रा 400 माइक्रोल) में 8 नमूनों में से प्रत्येक के पूल 50 माइक्रोन; शेष नमूने को -80 डिग्री सेल्सियस पर सहेजें। क्लोरोफॉर्म के 0.2 वॉल्यूम (80 माइक्रोल), 15 एस के लिए भंवर जोड़ें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 13,000 × जी पर सेंट्रलाइज।
    5. जलीय (स्पष्ट तरल) परत को एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। शेष इंटरफ़ेस और गुलाबी तरल को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें; इन अंशों डीएनए और प्रोटीन होते हैं33,36.
    6. आइसोप्रोपेनॉल (~ 200 माइक्रोन) और ग्लाइकोजेन कोप्रिपिजेंट (15 मिलीग्राम एमएल-1)37की बराबर मात्रा जोड़ें। कम से कम 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से मिलाएं, और इसके बाद आरएनए को तेज करने के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस का साथ दिया जाए।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां 1 घंटे के बजाय-20 डिग्री सेल्सियस रात में नमूनों को इनक्यूबेटिंग करके रोका जा सकता है ।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 13,000 × जी पर सेंट्रलाइज। पैलेट को परेशान किए बिना ही सुपरनेट निकाल दें। डायथाइलपाइरोकार्बोनेट (डीईपीसी) के 50 माइक्रोन में गोली को फिर से रीसुस्ल करें- उपचारित पानी, और आरएनएसई-मुक्त 5 मीटर अमोनियम एसीटेट और 2.5 वॉल्यूम (250 माइक्रोल) के 100% इथेनॉल7,38के बराबर मात्रा (50 माइक्रोन) जोड़ें।
      नोट: अमोनियम आयन पॉलीन्यूक्लियोटाइड किनेज को बाधित करते हैं यदि डाउनस्ट्रीम प्रक्रिया38में उपयोग किया जाता है । यह मिश्रण समाधान38में डिऑक्सी न्यूक्लियोसाइड ट्राइफॉस्फेट और ओलिगोसैकराइड्स को छोड़ते समय आरएनए को उपजी है ।
    8. कम से कम 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर अच्छी तरह से मिलाएं, और इसके बाद आरएनए को तेज करने के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस का साथ दिया जाए।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां 1 घंटे के बजाय-20 डिग्री सेल्सियस रात में नमूनों को इनक्यूबेटिंग करके रोका जा सकता है ।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 13,000 × जी पर सेंट्रलाइज। गोली को ठंड (-20 डिग्री सेल्सियस) के 1 मिलील से धोएं, हौसले से बनाया 75% इथेनॉल। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 8,000 × जी पर सेंट्रलाइज। गोली परेशान करने से बचने के लिए एक P10 पिपेट के साथ सुपरनैट निकालें।
    10. हवा 10-15 मिनट के लिए गोली सूखी जब तक वहां कोई शेष इथेनॉल है । डीईपीसी-उपचारित पानी के 50 माइक्रोन में गोली को फिर से ढंकें, 10x DNase बफर + 1μL के 5 माइक्रोन जोड़ें DNase (2 इकाइयोंμL-1),और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    11. DNase निष्क्रियता रिएजेंट के 0.1 वॉल्यूम (5.6 माइक्रोन) जोड़ें, 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें, और हर मिनट धीरे-धीरे मिलाएं। 2 मिनट के लिए 13,000 × ग्राम पर सेंट्रलाइज, और एक नई ट्यूब (~ 50 माइक्रोन) में सुपरनैंट स्थानांतरित करें। आरटी-क्यूपीसीआर या आरटी-लैंप प्रतिक्रियाओं को तैयार करते समय तुरंत बर्फ पर ट्यूब रखें, या -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में स्टोर करें।
      नोट: कैरी-ओवर संदूषण से बचने के लिए एक एम्प्लिकॉन-फ्री कमरे में आरएनए आइसोलेशन करें।
  2. मल्टीप्लेक्स रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (आरटी-लैंप)
    1. प्राइमर (टेबल 2) के प्रत्येक सेट के लिए 20X प्राइमर मिक्स सॉल्यूशन (टेबल 1)तैयार करें। 10% अतिरिक्त मात्रा के साथ कमरे के तापमान पर आरटी-लैंप रिएक्शन मिक्स (टेबल 3) तैयार करें ताकि वे पिपटिंग लॉस के लिए खाते में जाएं।
      नोट: अंटार्कटिक थर्मोलाबिल यूरासिल-डीएनए ग्लाइकोसिलेज (यूडीजी) के साथ कोलोरिमेट्रिक लैंप 2X मास्टर मिक्स पिछली प्रतिक्रियाओं20, 28से डीएनए संदूषण के प्रवर्धन को रोकता है ।
    2. भंवर और मिश्रण नीचे स्पिन। प्रत्येक प्रतिक्रिया नली में मिश्रण के 20 माइक्रोन वितरित करें: नमूना, नुकीला, सकारात्मक नियंत्रणऔर नकारात्मक नियंत्रण। 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों में प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करने के लिए UDG संभावित ले-ओवर संदूषण पर कार्य करने की अनुमति है ।
    3. नमूना प्रतिक्रिया के लिए आरएनए के 5 माइक्रोन जोड़ें, आरएनए के 5 माइक्रोन + 2.5 माइक्रोन (450 प्रतियां) सिंथेटिक सार्स-CoV-2 आरएनए नुकीला प्रतिक्रिया करने के लिए, 2.5 माइक्रोन (450 प्रतियां) सिंथेटिक सार्स-CoV-2 RNA के सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया के लिए, और 5μLके लिए सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया के लिए अच्छी तरह से मिलाएं, और प्रतिक्रियाओं को स्पिन करें; बर्फ पर सभी आरएनए गल।
    4. जबकि थर्मोसाइकिलर, या पानी स्नान, 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जाता है, सभी प्रतिक्रियाओं को कमरे के तापमान पर रहने की अनुमति देता है। यूडीजी को >50 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय किया जाएगा। थर्मोसाइकिलर (गर्मी के ढक्कन का उपयोग करें) में प्रतिक्रियाओं को रखें, 40 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, और प्रतिक्रियाओं को कमरे के तापमान (5 मिनट के लिए ~ 22 डिग्री सेल्सियस) तक पहुंचने दें, या 1 मिनट के लिए बर्फ पर ठंडा करें। कोलोरिमेट्रिक सुविधा (सरल अवलोकन) का उपयोग करके या एक एगर उठे जेल में उत्पादों को चलाकर परिणामों का विश्लेषण करें।
      नोट: हालांकि सीमा का पता लगाने की (LOD) प्रतिक्रिया प्रति 10 प्रतियां है, पता लगाने की आवृत्ति बढ़ जाती है के रूप में प्रतिलिपि संख्या प्रतिक्रिया प्रति ५०० प्रतियां दृष्टिकोण(चित्रा 3A)। कोलोरिमेट्रिक अवलोकन के लिए, ध्यान दें कि गुलाबी (पीएच = 8.8) द्वारा नकारात्मक परिणाम दर्शाया जाता है, जबकि पीले (पीएच = 5)(चित्रा 3 बी)द्वारा सकारात्मक परिणाम दर्शाया जाता है। कोलोरिमेट्रिक विकल्प प्रवर्धन के बाद आरटी-लैंप ट्यूबों के उद्घाटन से बचा जाता है, जो काम के माहौल में आरटी-लैंप उत्पादों की मात्रा को कम करेगा और कैरी-ओवर संदूषण होगा। जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के लिए, 0.5% ट्रिस/बोरेट/ईडीटीए (BE) बफर में 1X डीएनए जेल दाग के साथ 1.5% एग्राजल्ड जेल तैयार करें। प्रत्येक कुएं में 6X लोडिंग डाई के प्रतिक्रिया + 5 माइक्रोन के 25 माइक्रोन लोड करें। 60 मिनट के लिए 100 वी पर जेल चलाएं। एक आणविक मार्कर की जरूरत नहीं है क्योंकि सकारात्मक नमूने एक सीढ़ी पैटर्न(चित्रा 3C) दिखाते हैं।

Representative Results

सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए नागरिक वैज्ञानिकों द्वारा एकत्र किए गए नमूने। 8 महीने की अवधि (मध्य मार्च से नवंबर 2020 के तीसरे सप्ताह) के दौरान, 482 नागरिकों को इस परियोजना में भाग लेने के लिए मंजूरी दी गई थी, जिनमें से 350 (73%) एक किट का अनुरोध किया। कुल 362 किट वितरित किए गए (यानी, कुछ प्रतिभागियों ने कई किटों का अनुरोध किया), और 246 (70%) (चित्रा4A,बी)वापस आ गए थे । इन किटों में शामिल सभी 4,080 नमूनों पर कार्रवाई की गई। काउंटी के उत्तरी तटीय, उत्तर मध्य, मध्य और दक्षिणी जिलों में संग्रह स्थलों का वितरण किया गया, साथ ही पूर्वी जिलों (चित्रा 4A)में कुछ । सैन डिएगो मानव स्वास्थ्य सेवा एजेंसी३९द्वारा दी गई रिपोर्ट के अनुसार इन जिलों में सैन डिएगो काउंटी की सबसे अधिक जनसंख्या घनत्व और सबसे अधिक प्रलेखित COVID-19 मामले हैं ।

नागरिकों ने सबसे नमूना किट (यानी, औसत सफलता दर: ७०.४%) की पिकअप का अनुरोध किया । प्रत्येक दिन, 1-16 किट का अनुरोध किया गया था, और 0-14 किट प्रयोगशाला(चित्रा 4B)को वापस कर दिया गया । नागरिक वैज्ञानिकों के एक सर्वेक्षण से पता चला है कि एक पूर्ण किट (16 नमूनों) के संग्रह में औसतन 8 दिनों(चित्रा 4A और तालिका 4)में वितरित 1-3 घंटे लगे । किट के महान बहुमत पूरा कर रहे थे (९१.१%), जिसका अर्थ है कि वे सभी 16 नमूना ट्यूबों के अंदर एक झाड़ू निहित है, और इसी नमूना डेटा LIMS(चित्रा 4A और तालिका 4)पर अपलोड किया गया था ।

जीआईटीसी-क्लोरोफॉर्म एक्सट्रैकेशन और मल्टीप्लेक्स रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (आरटी-लैंप) का उपयोग करके सार्स-सीओवी-2 का पता लगाना। कोलोरिमेट्रिक आरटी-लैंप परख के लिए, न्यूक्लियोकैप्सिड (एन2) और लिफाफे (E1) जीन (तालिका2) को लक्षित करने के लिए प्राइमर11,20, 28के दो सेट काउपयोग किया गया था। इन प्राइमर द्वारा मान्यता प्राप्त दृश्यों प्राइमर और जांच के रूप में एक ही क्षेत्र में है सीडीसी४० और यूरोपीय संघ (ईयू)४१ द्वारा सीओवीआईडी-19 के मानव निदान के लिए आरटी-qPCR द्वारा अनुमोदित । ये परिणाम इस बात की पुष्टि करते हैं कि झांग एट अल28 ने क्या बताया, जिसमें प्रतिक्रिया में ६० एमएम ग्वानिडीन हाइड्रोक्लोराइड जोड़ने से मल्टीप्लेक्स में चलने पर LOD बढ़ जाता है । 100% की आवृत्ति पर LOD प्रति 25 माइक्रोल प्रतिक्रिया (चित्रा 3 ए,बी) प्रति500 प्रतियां थी। कोलोरिमेट्रिक आरटी-लैंप में, सकारात्मक नमूनों ने ~ 8 से 5.5 (चित्रा 3B)तक पीएच शिफ्ट होने के कारण गुलाबी से पीले रंग में रंग बदल दिया। जब प्रतिक्रिया कम कॉपी संख्या में नारंगी हो गई, तो नमूनों को 1.5% एगर उठे जेल में चलाया गया ताकि यह पुष्टि की जा सके कि ये सकारात्मक थे और इसके परिणामस्वरूप सीढ़ी जैसे पैटर्न (चित्रा 3 सी)थे। आरटी-लैंप का उपयोग पूल्ड आरएनए नमूनों में सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए किया गया था ।

प्रतिक्रिया अवरोधकों के कारण झूठे नकारात्मक के लिए नियंत्रित करने के लिए, प्रत्येक नमूने को सिंथेटिक सार्स-सीओवी-2 की 500 प्रतियों के साथ नुकीला अतिरिक्त प्रतिक्रिया में परीक्षण किया गया था। सकारात्मक पूल किए गए नमूनों को पूल में प्रत्येक व्यक्ति के नमूने के आरएनए को अलग करके और सकारात्मक नमूने की पहचान निर्धारित करने के लिए आरटी-लैंप प्रतिक्रिया में चलाया गया था। इसके बाद डिटेक्शन रिजल्ट्स को लिम्स में अपलोड किया गया जहां यूनिक सैंपल आईडी को डेट, टाइम, जीपीएस निर्देशांक, साइट और सैंपल की इमेज पर जानकारी के साथ जोड़ा गया ।

वास्तविक समय और पारंपरिक आरटी-पीसीआर विधियां: नमूना संदूषकों द्वारा अवरोध। प्रस्तावित डिटेक्शन पाइपलाइन के लिए उपयुक्त सर्वोत्तम विधि का चयन करने के लिए, अन्य आरएनए प्रवर्धन विधियों का परीक्षण नागरिक वैज्ञानिकों के पायलट पलटन द्वारा एकत्र किए गए पर्यावरणीय नमूनों के साथ किया गया था। इन तरीकों में से प्रत्येक के परिणामों के उदाहरण चित्रा 5 में प्रस्तुत करने के लिए कम वायरल प्रतिलिपि संख्या सांद्रता पर पर्यावरण अवरोधकों और पृष्ठभूमि संकेत शोर के लिए उनकी संवेदनशीलता को चित्रित कर रहे हैं ।

सीडीसी द्वारा अनुमोदित छह आरटी-क्यूपीसीआर फॉर्मूलेशन (सामग्री की तालिका) और डब्ल्यूएचओ को पर्यावरणीय नमूनों पर वायरस का पता लगाने के लिए परीक्षण किया गया था । नैदानिक सेटिंग्स40में सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए निर्माता के निर्देशों के साथ-साथ सीडीसी दिशानिर्देशों के अनुसार प्रोटोकॉल का पालन किया गया था। सिंथेटिक सार्स-CoV-2 आरएनए नियंत्रण की विभिन्न सांद्रता युक्त प्रतिक्रियाओं को कच्चे आरएनए अलगाव के बाद स्वैब-सतह के नमूनों में नुकीला किया गया था । सभी मास्टर मिक्स सकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 5A)के LOD सांद्रता में अवरोधकों के प्रति संवेदनशील थे ।

इन वास्तविक समय प्रौद्योगिकियों के अवरोधकों को बाईपास करने के लिए, एक पारंपरिक आरटी-पीसीआर प्रणाली का परीक्षण किया गया था। एक कदम आरटी-पीसीआर प्रणाली (सामग्री की तालिका) का उपयोग प्राइमर सेट N1, N2,और लिफाफे जीन का उपयोग करके सीडीसी (यूएसए) और ईसीडीसी (ईयू) द्वारा अनुमोदित प्राइमर सेट E1 का उपयोग करके क्रमशः (तालिका 2)का उपयोग करने के लिए किया गया था। नैदानिक सेटिंग्स40में सार्स-सीओवी-2 का पता लगाने के लिए निर्माता के निर्देशों के साथ-साथ सीडीसी दिशानिर्देशों के अनुसार प्रोटोकॉल का पालन किया गया था। प्राइमर सेट N1 और N2 सीडीसी द्वारा डिजाइन एक ~ 70 बीपी उत्पाद उपज; हालांकि, कम कॉपी संख्या सकारात्मक नकारात्मक नियंत्रण (चित्रा 5B)के प्रवर्धन पृष्ठभूमि शोर से प्रतिष्ठित नहीं थे, जिसने परिणामों में झूठी सकारात्मक शुरुआत की। ई 1 प्राइमर के उत्पाद में कम कॉपी नंबर (चित्रा 5B)पर एक कमजोर संकेत था, जो परिणामों में झूठे नकारात्मक को पेश करताथा। इसके अलावा, आरटी-पीसीआर विधि का परीक्षण अभी भी पर्यावरणीय नमूनों में मौजूद अवरोधकों के प्रति संवेदनशील था (डेटा नहीं दिखाया गया)।

लक्ष्य अनुक्रम की बहुत कम मात्रा का पता लगाने के लिए अन्य तरीके विकसित किए गए हैं। इन तरीकों में से एक रोलिंग सर्कल प्रवर्धन (आरसीए) है, जिसमें लक्ष्य अनुक्रम, आरएनए या डीएनए की मान्यता, एक विशिष्ट रैखिक जांच द्वारा, एक लिगाज़ टेम्पलेट को परिपत्रीकृत करता है। जांच के साथ संकरण करने के लिए डिज़ाइन किए गए प्राइमर का उपयोग करना, स्ट्रैंड-विस्थापन गतिविधि के साथ डीएनए पॉलीमरेज एक आइसोथर्मल रिएक्शन42में जांच को बढ़ाता है। यह वह जांच है जिसने लक्ष्य की पहचान की है, जो परिलक्षित होती है, न कि लक्ष्य अनुक्रम, जो इस विधि को अत्यधिक संवेदनशील43बनाती है। वांग एट अल४४ सार्स-CoV-1 आरएनए के प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए एक आरसीए प्रोटोकॉल प्रकाशित किया । इस विधि को सार्स-सीओवी-2 के लिए विशिष्ट प्राइमर का उपयोग करने के लिए संशोधित किया गया था। दुर्भाग्य से, गैर-टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) में, जांच आरएनए टेम्पलेट की अनुपस्थिति में उत्पाद को परिपत्रित और पैदावार करती है, यहां तक कि एसएनपी-संवेदनशील लिगाज़ सहित विभिन्न प्रकार की लिगिस का उपयोग करते समय भी। लिगास के अभाव में एनटीसी ने रैखिक जांच (चित्रा 5सी)से प्रवर्धन नहीं दिखाया ।

Figure 1
चित्रा 1:मोबाइल उपकरणों के लिए नमूना संग्रह डेटा इंटरफेस के साथ वेब आधारित नमूना मंच । (A)एक वेबसाइट, जिसमें बहुभाषी प्लगइन होता है, प्रयोगशाला और नागरिक वैज्ञानिकों के बीच बातचीत में मध्यस्थता करने के लिए बनाया गया था । प्लेटफार्म का उपयोग नमूना किट डिलीवरी/पिकअप अनुरोध और नमूना डेटा प्रस्तुत करने के लिए किया गया था। मंच विस्तृत अंग्रेजी/स्पेनिश ग्राफिक और ऑडियोविजुअल नमूना प्रोटोकॉल निहित । (ख)नमूना डेटा अपलोड करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मोबाइल डिवाइस दृश्य: तिथि, समय, जीपीएस निर्देशांक, नमूना साइट विवरण, और संग्रह साइट की एक छवि। संक्षिप्त नाम: सार्स-CoV-2 = गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2; जीपीएस = ग्लोबल पोजिशनिंग सिस्टम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:नमूना संग्रह किट। नागरिक वैज्ञानिकों ने एक कूलर जिसमें दो आइस पैक, एक सुरक्षा डेटा शीट से स्वयंसेवकों को जीआईटीसी समाधान से निपटने के खतरों के बारे में सूचित करने के लिए, एक विस्तृत नमूना और मुखौटा पहने प्रोटोकॉल, एक KN95 मास्क, एक अपशिष्ट बैग, हाथ सैनिटाइजर के साथ एक स्प्रे बोतल, प्राप्त किया, 0.5% एसडीएस के साथ एक स्प्रे बोतल, दस्ताने के 16 जोड़े, 16 टूथपिक्स और 16 पॉलिएस्टर स्वैब्स के साथ एक छोटा बैग, जीईटीसी समाधान के 200 माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब, नमूना लेने वाले बॉक्स और एक स्पिल की स्थिति में ट्यूब बॉक्स के लिए माध्यमिक कंटेनर के रूप में उपयोग किया जाने वाला एक बैग। संक्षिप्त: जीआईसीसी = ग्वानिउद्दीनियम थिओसाइनेट; SDS = सोडियम डॉडेक्सिल सल्फेट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:मल्टीप्लेक्स रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता इसोथर्मल प्रवर्धन (आरटी-लैंप) परख। सार्स-CoV-2 न्यूक्लियोकैप्सिड(N2)और लिफाफा(E1)जीन के लिए प्राइमर का उपयोग कर मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रियाओं के रूप में प्रतिक्रिया में वायरस की 10 प्रतियां के रूप में कुछ का पता लगाने के लिए । सिंथेटिक सार्स-CoV-2 आरएनए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । }मल्टीप्लेक्स में डिटेक्शन की फ्रीक्वेंसी कलरस-सीओवी-2 के अलग-अलग जीनोम कॉपी नंबर ों पर प्रति रिएक्शन। गुलाबी रंग में पांच प्रतिकृति का मतलब मूल्य। (B)मल्टीप्लेक्स में सार्स-सीओवी-2 की लिमिट-ऑफ-डिटेक्शन (LOD) मल्टीप्लेक्स कोलोरिमेट्रिक आरटी-लैंप में; पीला = सकारात्मक (पीएच ~ 5); गुलाबी = नकारात्मक (पीएच ~ 8) । (ग)पॉजिटिव सार्स-सीओवी-2 आरटी-लैंप रिएक्शन्स का सीढ़ी पैटर्न 1.5% एगरल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस में। संक्षिप्त नाम: सार्स-CoV-2 = गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2; rxn = प्रतिक्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:सैन डिएगो काउंटी में नागरिक वैज्ञानिक नमूना किट का स्थान और अनुरोधित किट की सफलता दर। (ए)ऑरेंज डॉट्स 1 सैंपलिंग किट के स्थान का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसमें 16 नमूने होते हैं । नीले पाई चार्ट किट है कि जब वे नागरिक वैज्ञानिकों को दिया गया जब वे प्रयोगशाला में वापस आ गए थे से विभिन्न दिनों के लिए ले लिया का प्रतिशत से पता चलता है । कोष्ठक में दिनों की संख्या। नारंगी पाई चार्ट कुल 16 नमूनों से पूरा नमूनों की अलग संख्या के साथ किट का प्रतिशत दिखाता है । नमूने ट्यूब के अंदर एक झाड़ू युक्त पूर्ण नमूनों की संख्या और कोष्ठक में लिम्स को अपलोड किए गए संबंधित नमूना डेटा। (ख)किट का प्रतिशत जो प्रयोगशाला (डॉट्स) को लौटाया गया था, और किट का अनुरोध किए जाने की तारीख के सापेक्ष अनुरोधित किट (बार) की कुल संख्या। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:वैकल्पिक सार्स-CoV-2 RNAdetection तरीके । (A)आरटीएस-सीओवी-2 न्यूक्लियोकैप्सिड(एन)जीन का पता लगाने वाले प्राइमर सेट एन 2का उपयोग करते हुए । पूल किए गए पर्यावरणीय नमूने सार्स-सीओवी-2 की 900 (हरे), या 9 (नारंगी) प्रतियों के साथ नुकीला। नीले रंग में एक ही कॉपी नंबर के सकारात्मक नियंत्रण। एरो पर्यावरणीय नमूना मौजूद होने पर कम कॉपी संख्या सकारात्मक नियंत्रण के फ्लोरेसेंस डिटेक्शन में कमी को इंगित करता है। (ख)सार्स-सीओवी-2 का पारंपरिक आरटी-पीसीआर डिटेक्शन । शीर्ष: प्राइमर सेट N1 और N2का उपयोग कर न्यूक्लियोकैप्सिड जीन के आरटी-पीसीआर उत्पाद । नो-टेम्पलेट कंट्रोल में एक बेहोश बैकग्राउंड सिग्नल मनाया जाता है। नीचे: प्राइमर सेट E1का उपयोग कर लिफाफा जीन के आरटी-पीसीआर उत्पादों । लोड एकाग्रता पर बहुत कम संकेत मनाया जाता है। नीले तीर अपेक्षित सकारात्मक उत्पाद दिखाते हैं: (ऊपर) ~ 70 बीपी और (नीचे) 113 बीपी 2% एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस में। (C)सार्स-CoV-2 आरएनए के आरसीए। सर्कुलर प्रोब लिगाज़ और आरएनए टेम्पलेट (एनटीसीसीआईआर)की अनुपस्थिति में बढ़ाता है; लिगाज़ और आरएनए टेम्पलेट रैखिक जांच की अनुपस्थिति में (एनटीसीलिन)बढ़ाना नहीं है। संक्षिप्त नाम: सार्स-CoV-2 = गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2; RFU = सापेक्ष फ्लोरेसेंस इकाइयां; बीपी = आधार जोड़े; rxn = प्रतिक्रिया; एमएम = आणविक मार्कर; आरटी-पीसीआर = रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन; आरटी-क्यूपीसीआर = वास्तविक समय मात्रात्मक आरटी-पीसीआर; आरसीए = रोलिंग सर्कल प्रवर्धन; एनटीसी = नो-टेम्पलेट नियंत्रण; LOD = पता लगाने की सीमा; rxn = प्रतिक्रिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्रवेशिका 20X एकाग्रता (μM) 1X एकाग्रता (μM)
एफआईपी 32 1.6
बीआईपी 32 1.6
F3 4 0.2
B3 4 0.2
लूपफ 8 0.4
लूपब 8 0.4

तालिका 1: 20X आरटी-लैंप प्राइमर मिश्रण के लिए फॉर्मूलेशन। आरटी-लैंप रिएक्शन में 6 प्राइमर लक्षित डीएनए के 8 क्षेत्रों को पहचानते हैं । संक्षिप्तरूप: रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन; FIP = आगे आंतरिक प्राइमर; बीआईपी = बैकवर्ड इनर प्राइमर; F3 = आगे विस्थापन प्राइमर; B3 = पिछड़ा विस्थापन प्राइमर; लूपएफ = फॉरवर्ड लूप प्राइमर; लूपब = बैकवर्ड लूप प्राइमर।

प्रवेशिका अनुक्रम लक्ष्य उत्पाद का आकार
आरटी-लैंप9,18,19
E1-F3 TGAGTACGAACTTTTACTCAT ई सीढ़ी जैसा पैटर्न
E1-B3 टीटीसीएगेट्टाएसागागग्ट
E1-FIP ACCACGAAGCAAGAAGAAGAAGATTTCTCGGAGAAGACAG
E1-BIP टीटीजीसीटीसीटीटीसीएसीटीसीकैक्टैकैकेटैटेटागेटेटैकागैकैकगगट
E1-लूपब जीसीजीसीटीसीजीटीजीटीजीजीटी
E1-लूपएफ सीजीसीटीएटीएक्टाएसीजी
N2-F3 ACCAGGAACTAATCAGACAAG एन
N2-B3 GACTTGATCTTTGAAATTGATATCT
N2-FIP TTCCGAAGAACGCTAGACGAACTAGAAACACATTCCCC
N2-BIP CGCATTGGCATGGAGTCACAATTGATGATCACCTGTGTA
N2-लूपएफ GGGGGCAAATTGTGCAATTTTG
N2-लूपब सीटीटीसीजीजीजीएसगेगासीसी
आरटी-क्यूपीसीआर38
2019-nCoV_N1-एफ GACCAAAAAATCAGCGAAAT एन 72 बीपी
2019-nCoV_N1-आर TCTGGTTTTACTGCCAGTTGAATCTTTTTTTTTTG
2019-nCoV_N1-पी 5'-FAM-एसीसी CCG कैट टीएसी जीटीटी टीजीजी टीजीजी एसीसी-BHQ1-3 '
2019-nCoV_N2-एफ TTACAAACACATTGGCCCAAA एन 67 बीपी
2019-nCoV_N2-आर GCGCGACATTCCAGAAGAAGAAGA
2019-nCoV_N2-पी 5'-FAM-ACA ATT टीजीसी सीसीसी कैग सीजीसी टीटीसी एजी-BHQ1-3 '
आरटी-पीसीआर39
E1_Sarbeco_F ACAGGTACGTTATATAGTATAGCGT ई 113 बीपी
E1_Sarbeco_R ATATTGCAGCAGTACCACA

तालिका 2: आरटी-लैंप, आरटी-क्यूपीसीआर और आरटी-पीसीआर के लिए उपयोग किए जाने वाले प्राइमर। प्राइमर दृश्यों, लक्ष्य जीन, अपेक्षित उत्पाद आकार, और इसी संदर्भ सूचीबद्ध हैं। संक्षिप्त: आरटी-लैंप = रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन; आरटी-पीसीआर = रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन पॉलीमरेज चेन रिएक्शन; बीपी = आधार जोड़े; आरटी-क्यूपीसीआर = वास्तविक समय मात्रात्मक आरटी-पीसीआर; E1 = लिफाफा जीन; N2 = न्यूक्लियोकैप्सिड जीन; एफ = फॉरवर्ड प्राइमर; आर = रिवर्स प्राइमर; पी = जांच ; FIP = आगे आंतरिक प्राइमर; बीआईपी = बैकवर्ड इनर प्राइमर; F3 = आगे विस्थापन प्राइमर; B3 = पिछड़ा विस्थापन प्राइमर; लूपएफ = फॉरवर्ड लूप प्राइमर; लूपब = बैकवर्ड लूप प्राइमर।

अभिकर्मक (दूसरे तत्वों की खोज में सहायक पदार्थ) वॉल्यूम (माइक्रोन)
यूडीजी के साथ वार्मस्टार्ट कोलोरिमेट्रिक लैंप 2X मास्टर मिक्स 12.5
N2 प्राइमर मिक्स (20x) 1.25
E1 प्राइमर मिक्स (20x) 1.25
ग्वानिडीन हाइड्रोक्लोराइड (600 mM)* 2.5
लक्ष्य आरएनए 5
नाभिक मुक्त एच2ओ 2.5
कुल वॉल्यूम 25

तालिका 3: मल्टीप्लेक्स कोलोरिमेट्रिक आरटी-लैंप के लिए रिएक्शन मास्टर मिक्स। (*) ग्वानिडीन हाइड्रोक्लोराइड को एक अस्वाभाविक तंत्र द्वारा प्रतिक्रिया कीसंवेदनशीलता और गति को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है । संक्षिप्त रूप: लैंप = लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन; UDG = uracil-DNA ग्लाइकोसिलेज; N2 = न्यूक्लियोकैप्सिड जीन; E1 = लिफाफा जीन; डीईपीसी = डायथिलपिरोकार्बोनेट।

स्वीकृत नागरिक नागरिकों को जो एक किट का अनुरोध किया वितरित किट लौटाई गई सैंपल किट नमूना लेने के लिए समर्पित दिन % पूर्ण किट % अधूरी किट प्रोसेस किए गए नमूने
482 72.6% (350/482) 362 70.4% (255/362) औसत 8 91.1 (224/246) 8.9 (22/246) 4,080
माध्यिका 3

तालिका 4:संख्या से सार्स-CoV-2 के लिए स्वैबिंग । आउटरीच और नमूना सफलता दर। संक्षिप्त नाम: सार्स-CoV-2 = गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2।

Discussion

सिटीजन साइंटिस्ट एंगेजमेंट। नागरिक वैज्ञानिकों को नमूना और शहरी वातावरण में सार्स-CoV-2 की उपस्थिति का पता लगाने के लिए सैन डिएगो काउंटी भर में सतहों झाड़ू के लिए भर्ती किया गया । वितरित नमूना किट के बहुमत (70%) प्रयोगशाला में वापस आ गए थे, और उन में से, लगभग सभी नमूने पूरे थे (91%) (चित्रा 3A,बी और तालिका 4)। स्वयंसेवक आसानी से वेब आधारित मंच के माध्यम से किट वितरण/पिक का अनुरोध कर सकते हैं, और वितरण मार्ग-योजना सॉफ्टवेयर ने आगमन के अनुमानित समय के नागरिक वैज्ञानिकों को अधिसूचित किया, दोनों ने देखी गई सफलता के लिए संभावित महत्वपूर्ण कारकों को । जब किट नागरिक वैज्ञानिक को दिया गया था जब यह प्रयोगशाला में वापस आ गया था से औसत समय 8 दिन था, 3 दिनों की एक औसत और 1-64 दिनों की एक सीमा के साथ (चित्रा 3A और तालिका 4)। स्वयंसेवकों को अधिक लगातार अनुस्मारक की संभावना इस अंतराल समय को कम करेगा ।

डेटा संग्रह प्लेटफ़ॉर्म का सफलतापूर्वक उपयोग अधिकांश उपयोगकर्ताओं द्वारा किया गया था (73%) (टेबल 4)। हालांकि नागरिक वैज्ञानिकों के प्रयासों को मापा नहीं गया, लेकिन फील्ड परीक्षणों से पता चला कि डेटा संग्रह मंच ने नमूना संग्रह को ठीक से पूरा करने के लिए आवश्यक प्रयास और समय को काफी कम कर दिया । इस प्रकार, बहीखाता की मात्रा को कम करने से नागरिक वैज्ञानिक जुड़ाव को प्रोत्साहित किया गया । वेब-आधारित मंच का उद्देश्य बहुभाषी तंत्रिका मशीन अनुवाद सेवा प्रदान करके और अंग्रेजी और स्पेनिश में ग्राफिक और ऑडियोविजुअल प्रोटोकॉल प्रदान करके जनसांख्यिकीय सीमाओं को दूर करना था। यह केवल आंशिक रूप से सफल रहा क्योंकि दक्षिण खाड़ी और उत्तरी काउंटी दोनों से कम नमूने एकत्र किए गए थे, जहां काउंटी की अधिकांश हिस्पैनिक/लैटिनोआबादी ४५रहती है । इन क्षेत्रों में सैन डिएगो काउंटी में कुल COVID-19 मामलों में 63% (1,700 मामले प्रति 100,000) भी आश्रय दिया गया, जिसमें रोग की उच्चतम व्यापकता46 और अस्पताल में भर्ती (62%)47,48की दर है। हालांकि नमूनों के अधिकांश केंद्रीय काउंटी से आया था, एक प्रतिनिधि संख्या सबसे COVID-19 प्रभावित जिलों से एकत्र किया गया था और नमूनों का केवल एक छोटा सा अंश सकारात्मक था, जो पता चलता है कि सार्स के सतह जलाशयों-CoV-2 शहरी वातावरण में अपेक्षाकृत दुर्लभ हैं ।

नमूना प्रसंस्करण। नमूने झाड़ू एसडीएस के साथ गीला किया गया था, जो अपने लिफाफे को बाधित करके वायरस को निष्क्रिय कर दिया और RNases३२खुलासा करके नग्न आरएनए स्थिर । संग्रह के दौरान सुविधाजनक रूप से, झाड़ू में डिटर्जेंट ने नमूना सतह को साफ किया। पर्यावरण के नमूनों में अक्सर आरएनए की बहुत कम मात्रा होती है। वसूली को अधिकतम करने के लिए, आरएनए अलगाव एक GITC आधारित, कॉलम मुक्त, कच्चे तेल निष्कर्षण विधि का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था । जीआईसीसी, एक मजबूत चैट्रोपिक एजेंट, हाइड्रोजन बांड को बाधित करता है जो प्रोटीन फोल्डिंग (यानी हाइड्रोफोबिक प्रभाव) को बनाए रखता है। इस क्रिया के परिणामस्वरूप वायरल कणों की निष्क्रियता होती है, और आरएनएस34, 35, 36के अवरोध के कारण आरएनए स्थिररहताहै। GITC समाधान सख्त ठंड श्रृंखला विचार है, जो नागरिकों को कमरे के तापमान पर नमूनों को बनाए रखने के लिए अगर प्रदान की बर्फ पैक के लिए एक फ्रीजर उपलब्ध नहीं था बिना आरएनए नमूनों की स्थिरता बनाए रखा । संभावित खतरे को कम करने के लिए यह अभिकर् प बन गया है जब प्रत्यक्ष त्वचा या म्यूकोसल संपर्क होता है, नागरिकों को किट में प्रदान की गई सामग्री सुरक्षा डेटा शीट को शामिल करके इन जोखिमों के बारे में जागरूक किया गया था और ट्यूबों वाले बॉक्स में एक चेतावनी सील रखी गई थी।

क्रूड जीआईसीसी-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण विधि ने झाड़ू से आरएनए के निशान की वसूली में सहायता की, और जैसा कि नुकीला नमूनों के प्रवर्धन द्वारा दिखाया गया है, अवरोधक शायद ही कभी निष्कर्षण के बाद नमूनों में कायम थे। नमूने, जो सार्स-CoV-2 के लिए नकारात्मक थे और कोई आरटी-लैंप अवरोध दिखाया, सच नकारात्मक का प्रतिनिधित्व किया या १००% आवृत्ति पर LOD की तुलना में एक कम प्रतिलिपि संख्या थी । इसके विपरीत, एक सतह पर वायरल आरएनए का पता लगाने से सीधे संपर्क के माध्यम से संचरण का खतरा नहीं होता है क्योंकि सकारात्मक नमूनों से वायरस की संक्रमण का परीक्षण करने की आवश्यकता होती है । पर्यावरण की त्वरित स्क्रीनिंग, परिष्कृत आपूर्ति या उच्च योग्य कर्मियों की उपलब्धता से सीमित नहीं है, यह आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है कि क्या सतहों एक वायरल जलाशय का गठन और बेहतर प्रत्यक्ष रोकथाम और रोकथाम के प्रयासों के लिए ।

प्रस्तावित डिटेक्शन पाइपलाइन के लिए उपयुक्त सर्वोत्तम विधि के लिए आरटी-लैंप का चयन किया गया था। यह एक तेजी से और सस्ती विधि साबित हुई जो शेष अवरोधकों के अधिकांश के लिए अत्यधिक प्रतिरोधी थी और अन्य आरटी-क्यूपीसीआर विधियों के रूप में संवेदनशील और विशिष्ट थी। सार्स-सीओवी-2 महामारी के दौरान नैदानिक सेटिंग्स में उनके उपयोग के कारण, आरटी-क्यूपीसीआर किट की उपलब्धता वैश्विक मांग से प्रभावित हुई। इसके अलावा, आर टी-क्यूपीसीआर तकनीकें- यहां तक कि अवरोधकों का विरोध करने के लिए तैयार की गई थीं- एंजाइम बाध्यकारी49के लिए अवरोधक प्रतिस्पर्धा को कम करने के लिए अन्य सामान्य रणनीतियों के उपयोग के बाद भी नागरिक वैज्ञानिकों के पायलट पलटन द्वारा एकत्र किए गए पर्यावरणीय नमूनों में निहित पदार्थों के प्रति संवेदनशील थे। इन निष्कर्षों को हाल ही में एक अध्ययन द्वारा पुष्ट किया जाता है कि दोनों तरीकों की तुलना में COVID-19 रोगियों द्वारा संभाला कैंडी से झाड़ू नमूनों पर सार्स-CoV-2 का पता लगाने के लिए और ८३% से अधिक परिणाम सामंजस्य पाया, आरटी द्वारा विश्लेषण नमूनों में 25% कम अवरोध के साथ-दीपक15। इसके अलावा, आरटी-लैंप के साथ मिलकर जीईटीसी-क्लोरोफॉर्म क्रूड निष्कर्षण ने आरएनए किट निष्कर्षण और आरटी-क्यूपीसीआर (सामग्रियों की तालिका) कीतुलना में 42% तक रिएजेंट्स और आपूर्ति की लागत कम कर दी।

इस विधि सतह झाड़ू नमूनों के हजारों के उच्च थ्रूपुट विश्लेषण के लिए अनुमति दी। 80 पूल तक, 640 नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हुए, आरटी-लैंप द्वारा आरएनए निष्कर्षण से सार्स-सीओवी-2 डिटेक्शन तक 2 दिनों में संसाधित किया गया था। प्रस्तावित प्रोटोकॉल अर्धकांवणात्मक है, जो वायरल आरएनए का पता लगाने तक सीमित है, और संक्रमित वायरल कणों की उपस्थिति का संकेत नहीं देता है। इसके अलावा विश्लेषण के लिए swabbed सतहों पर मौजूद संक्रमित fomites से सार्स-CoV-2 के संचरण के जोखिम का आकलन करने की आवश्यकता है ।

यह अध्ययन एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो जल्दी से एक परीक्षण रणनीति स्थापित करता है जिसमें संचारी रोग के साथ स्वास्थ्य आपातकाल का सामना करते समय एक प्रभावी कार्यप्रवाह शामिल है। प्रस्तावित नमूना प्रोटोकॉल सरल है और आमतौर पर घरों में पाया आपूर्ति का उपयोग करता है, और वायरल का पता लगाने की विधि एक थर्मोसाइकिलर के बदले में एक पानी स्नान के रूप में बुनियादी प्रयोगशाला सेटिंग्स में उपलब्ध उपकरणों पर किया जाता है । आरटी-लैंप रिएजेंट्स की लागत आरटी-क्यूपीसीआर के लिए आवश्यक लोगों की तुलना में काफी कम है और उच्च वैश्विक मांग परिदृश्यों के लिए कम संवेदनशील है। यह अध्ययन भविष्य में महामारी फैलने और वैश्विक महामारी में पर्यावरण वायरल जलाशयों के आकलन के लिए एक ढांचे के रूप में कार्य करता है ।

Disclosures

सभी लेखकों की घोषणा है कि कोई प्रतिस्पर्धी हितों मौजूद हैं ।

Acknowledgments

हम वायरल सूचना संस्थान (सातवीं) जांचकर्ताओं, डॉ Anca एम Segall, विलो Segall, पेट्रीसिया एल Rohwer, गैरी Rohwer, कैरी एल Rohwer, Magda सिल्विया Pinetta, एलिजाबेथ क्रूज़ कैनो, डॉ ग्रेगरी पीटर्स, डॉ स्टुअर्ट ए सैंडिन, और डॉ जेनिफर स्मिथ को कई नमूने इकट्ठा करने के लिए समय लेने के लिए धन्यवाद देते हैं । हम सकारात्मक नियंत्रण और उपयोगी प्रतिक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए सैन डिएगो कैलिफोर्निया (UCSD) के स्कूल में बाल रोग विभाग से डॉ रोब नाइट, डॉ जैक गिल्बर्ट, डॉ पेड्रो बाल्डा-फेरे, और डॉ सारा Allard को भी धन्यवाद देते हैं । हम स्टेसी कैरोटा (एसडीएसयू कॉलेज ऑफ साइंसेज) और जीना स्पीडेल (एसडीएसयू) को साजो-सामान के समर्थन और नमूना प्रोटोकॉल के ग्राफिक डिजाइन के लिए जुआन रोड्रिगेज का धन्यवाद करते हैं। हम बहुत मुश्किल समय के दौरान इस परियोजना के प्रति उनकी प्रतिबद्धता और समर्पण के लिए सभी प्रतिभागियों को धन्यवाद देते हैं । इस काम को डॉ जो ऐन लेन (एसडीएसयू कॉलेज ऑफ साइंसेज) और नेशनल साइंस फाउंडेशन रैपिड: सार्स-सीओवी-2 ग्रांट (अवार्ड नंबर: 2030479) के पर्यावरण जलाशयों से उदार दान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SMP, LIMS, and community outreach:
Authentication Application Programming Interface Google Google Sign-In
Commercial hosting platform GoDaddy
Data Charting Application Programming Interface Google Google Charts
Database software MySQL 
Delivery route planning software  Circuit Circuit for Teams
Free email service Google Google Email
Geospatial Application Programming Interface Google Google Maps API
Multilingual neural machine translation service Google Google Translate
Online form Google Google Form
Operating system Linux
Web and database development  Big Rose Web Design
Web server software Apache 
Sampling kit:
Coolers Coleman (Amazon) B00363X3F2 Cost (US$) per 100 rxns: 70
Gallon Ziploc bags Solimo (Amazon) B07BJ495GL Cost (US$) per 100 rxns: 18
Glycerol (hand sanitizer) FischerScientific G33-4 Cost (US$) per 100 rxns: 9
Ice packs Ice-Brix (Amazon) B075GLD3X1 Cost (US$) per 100 rxns: 110
Isopropanol (hand sanitizer) FischerScientific AA36644K7 Cost (US$) per 100 rxns: 43
KN95 masks Echo-Sigma Echo-Sigma Cost (US$) per 100 rxns: 400
Paper for Protocols and Trizol Safety Sheet Office Depot 348037 Cost (US$) per 100 rxns: 36
30 mL spray bottles (SDS and hand sanitizer) Anyumocz (Amazon) B07T64FHXR Cost (US$) per 100 rxns: 80
RNase, DNase, DNA & PCR inhibitors free Microcentrifuge tubes Genesee Scientific 22-281 Cost (US$) per 100 rxns: 83
Sample ID solvent resistant labels LABTAG XST-10C1-1WH Cost (US$) per 100 rxns: 68
Swiffer WetJet pads (swabs) Swiffer (Amazon) B001F0RBT2 Cost (US$) per 100 rxns: 8
Toothpicks Kitchen Essential (Amazon) B00PBK4NG6 Cost (US$) per 100 rxns: 8
Trizol Reagent (guanidinium isothiocyanate solution - GITC), not LS Invitrogen 15596018 Cost (US$) per 100 rxns: 40
Tube boxes Genesee Scientific 21-119 Cost (US$) per 100 rxns: 180
Small Ziploc bags Ziploc (Amazon) B01LRKEI9K Cost (US$) per 100 rxns: 8
Zebra Thermal Transfer Desktop Printer  Zebra GK420t
Total Sampling kit Cost (US$) per 100 rxns: 1,160
Trizol RNA extraction:
Ammonium Acetate RNase-free Invitrogen AM9070G Cost (US$) per 100 rxns: 2
Chloroform FisherScientific C298-500 Cost (US$) per 100 rxns: 2
GlycoBlue (glycogen 15 mg/mL) Invitrogen AM9515 Cost (US$) per 100 rxns: 80
Molecular-grade absolute (200 proof) Ethanol FisherScientific BP2818500 Cost (US$) per 100 rxns: 30
Molecular-grade Isopropanol FisherScientific BP2618500 Cost (US$) per 100 rxns: 3
TURBO DNA-free Kit  Invitrogen AM1907 Cost (US$) per 100 rxns: 110
Multiplexed colorimetric RT-LAMP:
Guanidine Hydrochloride Alfa Aesar AAJ6548522 Cost (US$) per 100 rxns: 1
RT-LAMP E1-Primers IDT n/a Cost (US$) per 100 rxns: 7
RT-LAMP N2-Primers IDT n/a Cost (US$) per 100 rxns: 7
Synthetic SARS-CoV-2 RNA ATCC VR-3276SD Cost (US$) per 100 rxns: 14
WarmStart Colorimetric LAMP 2X Master Mix with UDG NEB M1800S Cost (US$) per 100 rxns: 210
Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler Eppendorf 950030010
Total Trizol RNA extraction + LAMP Cost (US$) per 100 rxns: 470
Kit for RNA extraction:
QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit Qiagen 61904 Cost (US$) per 100 rxns: 570
RT-qPCR:
Synthetic SARS-CoV-2 RNA ATCC VR-3276SD Cost (US$) per 100 rxns: 14
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix Applied Biosystems 4444432 Cost (US$) per 100 rxns: 180
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Primers and Probes IDT 10006713 Cost (US$) per 100 rxns: 20
qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix Quantabio 95132-100
QuantiNova Pathogen  Qiagen 208652
QuantiNova Probe Qiagen 208352
UltraPlex 1-Step ToughMix  Quantabio 95166-100
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System BioRad 1855196
Kit for RNA extraction + RT-qPCR Cost (US$) per 100 rxns: 790 
RT-PCR:
SuperScript IV One-Step RT-PCR  Invitrogen 12594025
Lab cleanup:
DNAZap Invitrogen AM9890
RNAZap Invitrogen AM9780

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References

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Rojas, M. I., Giles, S. S., Little,… More

Rojas, M. I., Giles, S. S., Little, M., Baron, R., Livingston, I., Dagenais, T. R. T., Baer, J., Cobián-Güemes, A. G., White, B., Rohwer, F. Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs. J. Vis. Exp. (170), e62379, doi:10.3791/62379 (2021).

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