Summary

Análisis de las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificación de epítopos de células T CD4 restringidas por HLA-DR basadas en una matriz peptídica

Published: October 20, 2021
doi:

Summary

Sobre la base de una matriz peptídica derivada del virus de la hepatitis B (VHB), las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB podrían evaluarse en paralelo con la identificación de epítopos de células T CD4 específicas del VHB.

Abstract

Las células T CD4 juegan un papel importante en la patogénesis de la hepatitis B crónica. Como población celular versátil, las células T CD4 se han clasificado como subconjuntos funcionales distintos en función de las citoquinas que secretaron: por ejemplo, IFN-γ para las células CD4 T helper 1, IL-4 e IL-13 para las células CD4 T helper 2, IL-21 para las células auxiliares foliculares CD4 T y LA IL-17 para las células CD4 T helper 17. El análisis de las células T CD4 específicas del virus de la hepatitis B (VHB) basadas en la secreción de citoquinas después de la estimulación de péptidos derivados del VHB podría proporcionar información no solo sobre la magnitud de la respuesta de las células T CD4 específicas del VHB, sino también sobre los subconjuntos funcionales de las células T CD4 específicas del VHB. Los enfoques novedosos, como la transcriptómica y el análisis metabolómico, podrían proporcionar información funcional más detallada sobre las células T CD4 específicas del VHB. Estos enfoques generalmente requieren el aislamiento de células T CD4 viables específicas del VHB basadas en multómeros del complejo II de histocompatibilidad mayor peptídico, mientras que actualmente la información sobre los epítopos de células T CD4 específicas del VHB es limitada. Sobre la base de una matriz peptídica derivada del VHB, se ha desarrollado un método para evaluar las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificar epítopos de células T CD4 específicas del VHB simultáneamente utilizando muestras de células mononucleares de sangre periférica de pacientes con infección crónica por VHB.

Introduction

Actualmente, hay 3 enfoques principales para analizar las células T específicas del antígeno. El primer enfoque se basa en la interacción entre el receptor de células T y el péptido (epítopo). Las células T específicas del antígeno podrían teñirse directamente con multómeros del complejo de histocompatibilidad peptídico mayor (MHC). La ventaja de este método es que podría obtener células T viables específicas de antígenos, adecuadas para el análisis transcriptómico / metabolómico posterior. Una limitación de este método es que no pudo proporcionar información sobre toda la respuesta de las células T a un antígeno específico, ya que requiere péptidos de epítopo validados, mientras que el número de epítopos identificados para un antígeno específico es limitado por ahora. En comparación con los epítopos de células T CD8 específicos del virus de la hepatitis B (VHB), se han identificado menos epítopos de células T CD4 específicos del VHB1,2, lo que hizo que este método fuera menos aplicable para el análisis de células T CD4 específicas del VHB actualmente.

El segundo enfoque se basa en la regulación al alza de una serie de marcadores inducidos por activación después de la estimulación peptídica del antígeno3. Los marcadores comúnmente utilizados incluyen CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Este método se ha utilizado ahora para analizar las respuestas de células T específicas de antígenos en individuos vacunados5,6,pacientes con infección por el virus de la inmunodeficiencia humana7y pacientes con infección por coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo8,9. A diferencia del ensayo basado en multómeros péptidos-MHC, este método no está restringido por epítopos validados y podría obtener células viables para el análisis posterior. Una limitación de este método es que no pudo proporcionar información sobre el perfil de citoquinas de las células T específicas del antígeno. Además, la expresión de estos marcadores inducidos por la activación por algunas células no específicas de antígeno activado podría contribuir a las señales de fondo en el análisis, lo que podría ser un problema, especialmente cuando las células T específicas del antígeno objetivo son raras. Actualmente, existe una aplicación limitada de este método en las células T CD4 específicas delVHB 4. Si este método podría utilizarse para analizar las células T CD4 específicas del VHB de una manera confiable necesita más investigación.

El tercer enfoque se basa en la secreción de citoquinas después de la estimulación del péptido antígeno. Al igual que el análisis basado en marcadores inducidos por activación, este método no está restringido por epítopos validados. Este método podría revelar directamente el perfil de citoquinas de las células T específicas del antígeno. La sensibilidad de este método es menor que el método basado en marcadores inducidos por activación, ya que se basa en la secreción de citoquinas de células T específicas de antígenos y el número de citoquinas analizadas suele ser limitado. Actualmente, este método es ampliamente utilizado en el análisis de células T específicas del VHB. Como las células T específicas del VHB secretas de citoquinas difícilmente podrían detectarse mediante la estimulación directa del péptido ex vivo10,11, el perfil de citoquinas de las células T específicas del VHB generalmente se analiza después de 10 días de expansión estimulada por péptidos in vitro12,13,14,15,16. La disposición de grupos de péptidos en forma de matriz se ha utilizado para facilitar la identificación de epítopos específicos de antígenos17,18. Con la combinación de la matriz peptídica y el análisis de secreción de citoquinas, se ha desarrollado un método para evaluar las respuestas de las células T CD4 específicas del VHB e identificar los epítopos de células T CD4 específicas del VHB simultáneamente16. En este protocolo, se describen los detalles de este método. El antígeno central del VHB se elige como ejemplo de demostración en este protocolo.

Protocol

Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada paciente incluido en el estudio. El protocolo del estudio se ajusta a las directrices éticas de la Declaración de Helsinki de 1975 reflejadas en la aprobación a priori del comité de ética médica del Southwest Hospital. 1. Diseño de la matriz peptídica derivada del VHB Descargue secuencias de aminoácidos del antígeno central del VHB de las bases de datos del NCBI (GenBank: AFY98989.1). Compre péptidos deriv…

Representative Results

La frecuencia de las células T CD4 secretoras de citoquinas se calcula como la suma de productores simples y productores dobles. Como se demuestra en la Figura 1,la frecuencia de las células T CD4 secretoras de α TNF-y la frecuencia de las células T CD4 secretoras de IFN-γ en el control de fondo (DMSO) son del 0,154% y 0,013% respectivamente. La frecuencia de TNF-α secretando células T CD4 y la frecuencia de IFN-γ secretando células T CD4 específicas para el grupo de péptidos Core…

Discussion

Los pasos más críticos en este protocolo se enumeran a continuación: 1) suficientes PBMC de alta viabilidad para iniciar la expansión de PBMCs; 2) entorno apropiado para la expansión de pbMC; y 3) eliminación completa de grupos de péptidos residuales en cultivo de PBMC antes de la identificación del epítopo.

Todo el análisis en este protocolo depende de la proliferación robusta de células T CD4. En general, el número de PBMC después de la expansión de 10 días será de 2 a 3 vec…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81930061), la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) y Chinese Key
Proyecto Especializado en Enfermedades Infecciosas (2018ZX10723203).

Materials

Albumin Bovine V (BSA) Beyotime ST023
APC-conjugated Anti-human TNF-α eBioscience 17-7349-82 Keep protected from light
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014 Limit cell clumping
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09126 HLA-DRB1*0803 homozygote
B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER IHW09121 HLA-DRB1*1202 homozygote
Cell Culture Flask (T75) Corning 430641
Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) Corning 3599 Flat bottom
Cell Culture Plate (96-well, round bottom) Corning 3799 Round bottom
Cell Strainer Corning CLS431751 Pore size 70 μm, white, sterile
Centrifuge Tube (15 mL) KIRGEN KG2611 Sterile
Centrifuge Tube (50 mL) Corning 430829 Sterile
Centrifuge, Refrigerated Eppendorf 5804R
Centrifuge, Refrigerated Thermo ST16R
Centrifuge, Refrigerated Thermo Legend Micro 21R
Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) BD Biosciences 562574 Prepare solution before use
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 Keep at room temperature to prevent crystallization
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160  mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave.
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare 17-5442-03
Filter Tips (0.5-10) Kirgen KG5131 Sterile
Filter Tips (100-1000) Kirgen KG5333 Sterile
Filter Tips (1-200) Kirgen KG5233 Sterile
FITC-conjugated Anti-human CD4 BioLegend 300506 Keep protected from light
Fixable Viability Dye eFluor780 eBioscience 65-0865-14 Keep protected from light
GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) BD Biosciences 554724 Protein Transport Inhibitor
Haemocytometer Brand 718620
HBV Core Antigen Derived Peptides ChinaPeptides
HEPES Gibco 15630080 100 ml
Human Serum AB Gemini Bio-Products 100-51 100 ml
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
KCl Sangon Biotech A100395-0500
KH2PO4 Sangon Biotech A100781-0500
LSRFortessa Flow Cytometer BD
L-glutamine Gibco 25030081 100 ml
Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Corning MCT-150-C Autoclaved sterilization before using
Microplate Shakers Scientific Industries MicroPlate Genie
Mitomycin C Roche 10107409001
Na2HPO4.7H2O Sangon Biotech A100348-0500
NaCl Sangon Biotech A100241-0500
PCR Tubes (0.2 mL) Kirgen KG2331
PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 BioLegend 300914 Keep protected from light
PE-conjugated Anti-human IFN-γ eBioscience 12-7319-42 Keep protected from light
Penicillin Streptomycin Gibco 15140122 100 ml
PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 eBioscience 45-0037-42 Keep protected from light
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P1585
Recombinant Human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant Human IL-7 PeproTech 200-07
RPMI Medium 1640 Gibco C11875500BT 500 ml
Sodium pyruvate,100mM Gibco 15360070
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061
Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR BioLegend 307648
Wizard Genomic DNA Purification Kit Promega A1125

References

  1. Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
  2. Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, 5863-5871 (2004).
  3. Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
  4. Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
  5. Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
  6. Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
  7. Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
  8. Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
  9. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
  10. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
  11. Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
  12. Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
  13. Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
  14. de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
  15. Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
  16. Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
  17. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  18. Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).

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Cite This Article
Xiao, J., Wan, X., Wang, H., Deng, G. Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix. J. Vis. Exp. (176), e62387, doi:10.3791/62387 (2021).

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