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方法文章

人多能干细胞向造血内皮细胞的定向分化

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DOI：

10.3791/62391

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2021年3月31日

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Medicine, Yale University School of Medicine, 4Department of Genetics, Yale University School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种在约1周内将人多能干细胞定向分化为生血性内皮细胞的简单方案。

摘要

血管广泛分布于机体所有组织中，并执行多种功能。因此，从人多能干细胞中获得成熟的血管内皮细胞——即衬于血管腔内壁的细胞——对于多种组织工程与再生医学应用至关重要。在体内，原始内皮细胞起源于中胚层谱系，并进一步特化为多种亚型，包括动脉、静脉、毛细血管、生血性及淋巴管内皮细胞。其中，生血性内皮细胞尤其引人关注，因为在发育过程中，它们可产生造血干细胞和祖细胞，继而终生生成所有类型的血细胞。因此，建立一种在体外生成生血性内皮细胞的体系，将有助于研究内皮向造血转变的过程，并可能实现体外人源血液制品的生产，从而减少对人类供体的依赖。尽管目前已有一些方案可用于获得祖细胞和原始内皮细胞，但尚无明确报道能够从人干细胞中生成特征清晰的生血性内皮细胞。本文介绍了一种在约1周内从人胚胎干细胞中诱导生成生血性内皮细胞的方法：首先通过GSK3β抑制剂（CHIR99021）诱导形成原始条纹样细胞，随后在bFGF作用下促进中胚层谱系分化，接着由BMP4和VEGF-A协同促进原始内皮细胞的发育，最后通过视黄酸诱导实现生血性内皮细胞的特化。该方案可获得表型明确的生血性内皮细胞群体，可用于深入探究其分子调控机制及内皮向造血转变过程，具有应用于后续治疗性研究的潜力。

引言

内皮细胞（ECs）是一类具有异质性的细胞群体，在人体和工程化组织中执行多种功能。除了支持和调控其他细胞类型（如心肌细胞1、成骨细胞2）外，这些功能还包括在血液与组织之间形成选择性屏障，并参与组织的形成3。在正常发育过程中，成熟内皮细胞的分化依赖于多种信号通路。原始内皮细胞来源于中胚层前体细胞，随后被特化为成熟的动脉、静脉、毛细血管和淋巴管表型4。此外，在胚外卵黄囊和胚胎期主动脉-性腺-中肾（AGM）区域中还有一小部分内皮细胞被特化为生血性内皮细胞，这些细胞可产生造血干细胞和祖细胞（HSPCs），后者迁移至胎儿肝脏和胎儿骨髓，并在出生后持续存在，终生生成所有类型的血细胞4。内皮细胞表型的多样性对于所有组织的发育和维持至关重要。

因此，内皮细胞（ECs）及其衍生物是研究人类发育和/或疾病机制、再生医学以及组织工程应用的关键组成部分5，6，7，8。然而，此类研究面临的主要限制在于难以获得足够数量的原代人源内皮细胞。据估计，大多数治疗应用至少需要 3 × 108 个内皮细胞6。为解决这一问题，已有研究提出可利用人胚胎干细胞（hESCs）和人诱导性多能干细胞（hiPSCs），因其具有多向分化潜能以及能够大量扩增子代细胞的能力6，9。

事实上，多项研究已证明来源于人胚胎干细胞（hESCs）或人诱导多能干细胞（hiPSCs）的细胞在疾病建模和药物筛选中的实用性10,11,12。器官芯片（Organ-on-a-Chip, OOC）技术通过将细胞和组织整合到三维支架中，更真实地模拟人体生理环境。此外，借助微流控技术可将多个独立的器官芯片连接起来（即所谓的“身体芯片”或“人体芯片”，BOC/HOC），实现目标器官之间的相互作用13,14,15。血管等支持性组织是OOC和BOC/HOC的关键组成部分；引入血管系统可实现营养物质、氧气及旁分泌因子在组织间的输送，从而促进形成必要的组织特异性微环境3,12。因此，建立获得成熟人类内皮细胞（如动脉、静脉、淋巴管及生血性内皮细胞）的方法，对于推动这些组织工程策略的发展至关重要。

已有多种实验方案发表，详细描述了从人胚胎干细胞（hESCs）或人诱导多能干细胞（hiPSCs）中获得人原始或前体血管内皮细胞（ECs）的步骤5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26。这些方案中许多依赖于拟胚体（embryoid body, EB）的形成，或通过将ESC/iPSC与小鼠源性基质细胞饲养层共培养来实现。这些策略通常操作困难且耗时较长，获得的内皮细胞产量较低，且可能存在人内皮细胞被小鼠细胞污染的问题。完全依赖二维（2D）培养且不使用基质细胞的方案，往往需要长时间的诱导过程，使用复杂的生长因子和/或抑制剂组合进行诱导，在细胞分离后还需经历较长的扩增周期，或同时具备上述多种局限性。目前对体内成熟内皮细胞类型分化过程中所涉及的信号通路及相关因子的认识不断深入，这为建立一种简便且高效的体外分化方案奠定了基础。

此前研究已发现，Notch 和视黄酸（RA）信号通路在小鼠动脉内皮细胞（EC）和生血性内皮细胞的发育命运决定中分别发挥关键作用。Notch 信号通路在动脉内皮细胞表型的决定和维持过程中具有多重功能。利用小鼠视网膜血管化模型的研究揭示了一条信号通路：流体剪切应力诱导 Notch-Cx37-p27 信号轴的激活，从而促进 G1 期细胞周期阻滞，进而使动脉内皮细胞得以特化27。有假说认为，细胞周期状态可通过提供不同的时间窗口，在这些窗口期内细胞对特定信号具有响应能力，从而诱导基因表达和表型改变，进而影响细胞命运决定28。这种由 Notch 介导的 G1 期阻滞促进了在动脉内皮细胞中富集的基因表达，包括 ephrinB2、Cx40、DLL4、Notch1 和 Notch4（综述见29,30）。此外，已有研究表明，体内生血性内皮细胞的特化可通过 RA 信号通路促进31,32。进一步研究发现，在 RA 信号通路的下游，c-Kit 和 Notch 的表达上调 p27，从而促进小鼠卵黄囊和主动脉-性腺-中肾区（AGM）中生血性内皮细胞的特化33。小鼠生血性内皮细胞可通过同时表达内皮细胞标志物（如 CD31、KDR）和造血标志物（如 c-Kit、CD34）进行最基本鉴定4。最后，生血性内皮细胞经历内皮-造血转化（EHT）形成造血干细胞和祖细胞（HSPCs），后者可分化为所有类型的血细胞4,34,35。

近期研究验证了相同的信号通路层级是否能够促进人源造血性内皮细胞（EC）的特化。为此，开发了一种无血清且无需饲养层的二维培养方案，用于从人胚胎干细胞（hESCs）中诱导生成造血性内皮细胞，并在单细胞水平上对这些造血性内皮细胞进行了表征，其表型为 CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-。该研究还利用了荧光泛素化细胞周期指示剂（FUCCI）报告系统，该系统可用于识别不同的细胞周期状态，实验中采用了表达FUCCI报告结构的H9-hESC细胞系（H9-FUCCI-hESC）36。在使用这些细胞的研究中发现，视黄酸（RA）可促进内皮细胞早期G1期的细胞周期阻滞，而处于早期G1期的状态能够在体外促进造血性特化37。本文提供了上述人源造血性内皮细胞分化的详细实验方案，以及确认其身份的检测方法。这一简便的方法为生成此类特殊的内皮细胞亚群提供了有效途径，有助于未来对人类血细胞发育机制的深入研究。

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方案

1. 试剂与试剂制备

注意：试剂列表见材料表。

  1. 获取人多能干细胞系：H1-hESC、H9-Fucci-hESC。
    注意：H1细胞系中生成造血性内皮细胞的效率可能更高。
  2. 准备基质蛋白储备液：将基质蛋白分装至预冷的1.5 mL离心管（置于冰上），每管含1 mg基质蛋白。1 mg基质蛋白足以包被两块6孔板的所有孔（共12孔）。分装后于-20 °C保存备用。
    注意：所有涉及基质蛋白的操作均需在冰上或4 °C进行。将冻存的基质蛋白储备液在4 °C冰上过夜解冻。解冻后轻轻涡旋混匀。提前至少1小时将1.5 mL微量离心管置于-20 °C预冷，并在分装前立即转移至冰上。
  3. 制备基质蛋白包被的培养板：在冰上于4 °C条件下解冻基质蛋白分装液。在冰上的预冷锥形管中加入12.5 mL冰冻DMEM:F12培养基。使用预冷的移液枪头，将一份分装液（1 mg）基质蛋白转移至锥形管中，并通过反复吹打充分混匀。使用预冷的移液管将稀释后的基质蛋白溶液各1 mL加入预冷的6孔板（置于冰上）的每个孔中。轻轻摇晃并旋转培养板，使孔底均匀覆盖。室温孵育至少30分钟，使基质蛋白凝固。用封口膜包裹培养板，并于4 °C保存备用。制备后的基质蛋白包被板应在两周内使用。
    注意：该基质蛋白包被的6孔板用于细胞常规传代以及向原始内皮细胞和造血性内皮细胞的分化。所有操作均需在冰上进行。使用前至少1小时将6孔板、移液枪头、移液管和锥形管置于-20 °C预冷，使用时立即转移至冰上。
  4. 通过向100 mL多能干细胞分化培养基中加入5 mL PFHM，配制基础分化培养基。4 °C保存。
  5. 通过将0.1 g BSA溶解于100 mL PBS中，配制0.1% BSA-PBS。使用0.22 μm滤器过滤除菌，4 °C保存。
  6. 通过将浓盐酸（12 M）用水按1:2,400稀释，配制5 mM HCl。用NaOH调节pH至3.0。使用0.22 μm滤器过滤除菌，4 °C保存。
  7. 配制bFGF、BMP4、VEGF-A、视黄酸（RA）和DLL4的储备液。
    1. bFGF：将冻干粉用0.1% BSA-PBS重悬至100 μg/mL。分装后于-20 °C保存。储备液应在配制后3个月内使用。使用前立即解冻分装液。
    2. BMP4：将冻干粉用pH 3.0的5 mM HCl重悬至1 mg/mL。再用0.1% BSA-PBS进一步稀释至50 μg/mL。分装后于-20 °C保存。储备液应在配制后3个月内使用。使用前立即解冻分装液。
    3. VEGF-A：将冻干粉用dH2O重悬至1 mg/mL。再用0.1% BSA-PBS进一步稀释至100 μg/mL。分装后于-20 °C保存。储备液应在配制后3个月内使用。使用前立即解冻分装液。
    4. RA：将冻干粉用DMSO重悬至100 mM。分装后于-80 °C保存。储备液应在配制后1个月内使用。使用前立即解冻分装液。
      注意：RA储备液需避光保存。
    5. DLL4：将冻干粉用PBS重悬至1 mg/mL。分装后于-20 °C保存。储备液应在配制后12个月内使用。使用前立即解冻分装液。
  8. 使用前立即配制内皮细胞分化培养基：将VEGF-A和BMP4加入基础分化培养基（步骤1.4）中，使其终浓度分别为25 ng/mL和50 ng/mL。
  9. 使用前立即配制工作浓度RA：将100 mM储备液用DMSO按1:1,000稀释至100 μM。
    注意：工作浓度RA需避光保存。
  10. 使用前立即配制造血性内皮细胞分化培养基：将VEGF-A、BMP4和工作浓度RA加入基础分化培养基（步骤1.4）中，使其终浓度分别为25 ng/mL、50 ng/mL和0.5 μM。
  11. 通过配制含10% FBS的HBSS，并添加1:500稀释的抗菌试剂，制备抗体染色缓冲液。过滤除菌后立即使用。
  12. 通过配制含1% FBS的HBSS，并添加1:500稀释的抗菌试剂，制备细胞分选缓冲液。过滤除菌后立即使用。
  13. 将5 mg冻干纤连蛋白溶于5 mL无菌水中，配制1 mg/mL纤连蛋白储备液。分装后于-20 °C保存。在冻干产品标签标明的有效期内使用。使用前立即解冻分装液。
  14. 制备纤连蛋白包被的35 mm培养皿。将纤连蛋白储备液（1 mg/mL）用无菌水稀释至4 μg/mL。每皿加入1 mL包被液，37 °C孵育30分钟至1小时。包被后立即使用。
  15. 按照生产商说明书配制甲基纤维素培养基，分装为3或4 mL每份。-20 °C保存备用。在储备产品标签标明的有效期内使用。使用前立即解冻分装液。
  16. 将重组人DLL4储备液用PBS稀释至终浓度10 μg/mL，制备DLL4包被溶液。
  17. 根据生产商说明书配制并保存内皮细胞生长培养基。
  18. 通过配制含0.1% BSA的PBS，制备流式细胞术分析缓冲液。过滤除菌后于4 °C保存备用。

2. 人类胚胎干细胞的培养与传代

  1. 将包被基质蛋白的培养板、干细胞生长培养基和DMEM:F12恢复至室温。
  2. 在37 °C、5% CO2培养箱中，将hESC细胞系接种于包被基质蛋白的6孔板中，使用干细胞生长培养基（每孔2 mL）进行培养。
  3. 每日观察细胞状态，必要时用p200移液器吸头轻轻刮除已分化的细胞。
    注意：已分化的细胞通常出现在克隆边缘。有关培养中分化细胞的示例，请参阅干细胞生长培养基产品说明书。
  4. 当细胞融合度达到70%–80%时进行传代。传代操作步骤如下：
    注意：若出现明显分化现象，应在细胞融合度达到70%–80%前进行传代。
    1. 吸除细胞上方的培养基，每孔用1 mL DMEM:F12轻轻洗涤一次。
    2. 每孔加入1 mL DMEM:F12。
    3. 每孔加入160 μL/mL的Dispase，于37 °C、5% CO2培养箱中孵育45分钟。
    4. Dispase孵育结束后，每孔再加入1 mL DMEM:F12，轻轻吹打使细胞脱离培养板。
      注意：避免将细胞解离为单细胞悬液。应以小细胞团块形式进行传代。
    5. 将细胞转移至含12 mL DMEM:F12的锥形管中，静置沉降约5–10分钟。
    6. 吸除上清液，将沉淀物轻轻重悬于适量干细胞生长培养基中（每孔收获的细胞使用0.5 mL），以获得小团块状细胞悬液。
      注意：避免将细胞解离为单细胞悬液。应以小细胞团块形式进行传代。
    7. 吸除已准备好的基质蛋白包被板各孔中的包被液，每孔加入1.5 mL干细胞生长培养基。
    8. 将适量重悬的细胞悬液（步骤2.4.6）加入至已准备好的基质蛋白包被板的各孔中。
    9. 将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中培养。每24小时更换一次新鲜的干细胞生长培养基。

3. 人类胚胎干细胞向原始内皮细胞的分化

  1. 第 -1 天：按照第 2 节所述方法培养和传代细胞。以每平方厘米约 2 个细胞团的密度，将细胞（步骤 2.4.6）以小团块形式（约 50 μm）接种38。
    注意：评估接种密度，并根据需要进行经验性优化。
  2. 第 0 天：细胞接种后 24 小时，吸除每个孔中的培养基，并用每孔 1 mL DMEM:F12 轻柔洗涤细胞。每孔加入 1 mL 含 5 μM GSK3i（CHIR99021，新鲜添加）的基础分化培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO2）。
    注意：所有洗涤步骤中，应将指定的洗涤培养基缓慢沿孔板壁加入孔中。轻柔摇晃孔板，使孔的整个表面均被洗涤培养基覆盖。将孔板略微倾斜，使洗涤液聚集于六点钟方向，然后小心吸除洗涤液。
  3. 第 1 天：吸除每个孔中的培养基，并用每孔 1 mL DMEM:F12 轻柔洗涤细胞。每孔加入 1 mL 含 50 ng/mL bFGF（新鲜添加，按 1:2,000 从冷冻储备液稀释）的基础分化培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO2）。
  4. 第 2 天：吸除每个孔中的培养基，并用每孔 1 mL DMEM:F12 轻柔洗涤细胞。每孔加入 1 mL 内皮细胞分化培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO2）。
  5. 第 3 天：将每孔细胞上方的培养基更换为 1 mL 新鲜配制的内皮细胞分化培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO2）。
  6. 第 4 天：将每孔细胞上方的培养基更换为 1 mL 新鲜配制的内皮细胞分化培养基，孵育 24 小时（37 °C，5% CO2）。
  7. 第 5 天：通过 FACS 对细胞进行纯化以评估内皮细胞表型（第 4–5 节），或继续培养并进一步向生血性内皮细胞分化（第 6 节）。

4. 原始内皮细胞的FACS纯化

  1. 吸弃细胞上方的培养基，每孔用 1 mL DMEM:F12 轻轻洗涤一次。
  2. 每孔加入 1 mL 细胞解离溶液，在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 12 分钟，或直至细胞完全解离。
  3. 将解离后的细胞转移至含有 12 mL DMEM:F12 的锥形管中，于 1,000 × g 离心 5 分钟，收集细胞沉淀。
  4. 弃去上清液，用 12 mL 冰冷的抗体染色缓冲液重悬沉淀以进行洗涤。
  5. 于 1,000 × g 离心 5 分钟，再次收集细胞沉淀。
  6. 弃去上清液，用冰冷的抗体染色缓冲液重悬细胞沉淀，并计数细胞。用冰冷的抗体染色缓冲液调整细胞浓度至 1 × 105 个细胞/mL。
  7. 将细胞均匀分装至预冷的微量离心管中，每管至少含 600 μL 细胞悬液（浓度为 1 × 105 个细胞/mL），用于抗体染色。
    注：原始内皮细胞染色需准备四管细胞：未染色对照、CD31 单抗体对照、CD45 单抗体对照，以及同时加入 CD31 和 CD45 抗体的样品管。抗体相关信息见材料表。
  8. 根据需要向含细胞的各管中加入相应抗体，置于冰上避光孵育 30 分钟。
    1. 未染色对照：不添加任何抗体。
    2. CD31 单抗体对照：仅加入 CD31 抗体。
    3. CD45 单抗体对照：仅加入 CD45 抗体。
    4. 样品管：同时加入 CD31 和 CD45 抗体。
      注：样品中抗体的最终浓度及荧光偶联物的使用应根据所用具体抗体和流式分选仪进行优化。
  9. 在 4 °C 台式微量离心机中以 1,000 × g 离心 5 分钟，收集细胞。
  10. 弃去上清液，每管细胞沉淀用 600 μL 冰冷的分选缓冲液重悬。
  11. 将样品通过 5 mL FACS 管的滤网帽过滤，将细胞置于冰上避光保存，立即进行流式细胞分选（FACS）。
  12. 通过以下步骤获取原始内皮细胞（CD31+ CD45-）：
    1. 识别 CD45 阴性细胞群并设门（CD45-）。
    2. 在 CD45- 群体内，识别 CD31 阳性（CD31+）细胞群，并将细胞分选至 6 mL 冰冷的细胞分选缓冲液中。将分选出的细胞用于后续实验（见第 5 节）。

5. 验证原始内皮细胞表型的检测方法

  1. 在37 °C、5% CO2 培养箱中，用1 mL/孔的DLL4包被液对6孔板中的三个孔进行包被，孵育30分钟。作为对照，用1 mL/孔的PBS对另外三个孔进行模拟包被。
  2. 吸除DLL4包被液和PBS，每孔加入2 mL内皮细胞生长培养基，接种25,000个分选得到的原始内皮细胞（见步骤4.12）。
  3. 将细胞在37 °C、5% CO2 培养箱中孵育24小时。
  4. 吸除细胞上方的培养基，每孔用2 mL PBS洗涤一次。通过qPCR或流式细胞术分析细胞（适用于表达FUCCI构建体的细胞）。
    1. 若通过qPCR分析细胞，请执行以下步骤。
      1. 吸除细胞上方的液体，根据试剂盒生产商的说明书，使用RNA提取试剂盒提取细胞中的RNA。
      2. 根据生产商说明书，使用逆转录预混液进行逆转录反应。
      3. 根据生产商说明书，使用SYBR Green预混液进行qPCR反应。
        注：所用引物（EFNB2、GJA5、GJA4、NR2F2、EPHB4、HEY2）列于表1中。
    2. 若通过流式细胞术分析表达FUCCI构建体的细胞，请执行以下步骤。
      1. 吸除细胞上方的液体，每孔加入500 μL 0.25%胰蛋白酶-EDTA。
      2. 在37 °C、5% CO2 培养箱中孵育细胞，直至细胞脱落，约5分钟。
      3. 将细胞转移至微量离心管中，在4 °C下以1,000 × g 离心5分钟，收集细胞沉淀。
      4. 吸除上清液，将沉淀重悬于500 μL预冷的流式细胞术分析缓冲液中。
      5. 通过5 mL FACS管的滤网帽过滤样品，将细胞置于冰上避光保存，立即进行流式细胞术分析。
      6. 分析接种在DLL4与PBS对照孔中的细胞处于早期G1期（无颜色）、晚期G1期（mCherry+/mVenus-）、G1/S期（mCherry+/mVenus+）以及S/G2/M期（mCherry-/mVenus+）的比例。

6. 将人胚胎干细胞分化为生血内皮细胞

注意：按照上述第 3.1-3.6 节所述，将细胞分化至第 4 天的原始内皮细胞。

  1. 第5天：吸除细胞上方的培养基，每孔用1 mL DMEM:F12培养基轻轻洗涤细胞。每孔加入1 mL freshly prepared hemogenic endothelial cell differentiation medium，培养24小时（37 °C，5% CO2）。
  2. 第6天：更换细胞上方的培养基，每孔加入1 mL freshly prepared hemogenic endothelial cell differentiation medium，培养24小时（37 °C，5% CO2）。
  3. 第7天：更换细胞上方的培养基，每孔加入1 mL freshly prepared hemogenic endothelial cell differentiation medium，培养24小时（37 °C，5% CO2）。
  4. 第8天：通过FACS分离生血性内皮细胞（参见第7节）。

7. 血源性内皮细胞的FACS分离

  1. 按照上文第 4.1–4.6 节所述方法收集并洗涤细胞。
  2. 将细胞均匀分装至预冷的微量离心管中，每管至少含有 600 μL 浓度为 1 × 105 个细胞/mL 的细胞悬液，用于抗体染色。
    ​注意：造血性内皮细胞（hemogenic ECs）的抗体染色需要八个细胞管：未染色对照、CD31 单抗体对照、CD45 单抗体对照、KDR 单抗体对照、c-Kit 单抗体对照、CD34 单抗体对照、VE-cadherin 单抗体对照，以及包含全部六种抗体的样品管。
    注意：抗体相关信息见《材料表》（Table of Materials）。
  3. 根据需要向含细胞的各管中加入相应抗体，置于冰上避光孵育 30 分钟。
    1. 未染色对照：不添加任何抗体。
    2. CD31 单抗体对照：仅加入 CD31 抗体。
    3. CD45 单抗体对照：仅加入 CD45 抗体。
    4. KDR 单抗体对照：仅加入 KDR 抗体。
    5. c-Kit 单抗体对照：仅加入 c-Kit 抗体。
    6. CD34 单抗体对照：仅加入 CD34 抗体。
    7. VE-cadherin 单抗体对照：仅加入 VE-cadherin 抗体。
    8. 样品管：加入 CD31、CD45、KDR、c-Kit、CD34 和 VE-cadherin 抗体。
      注意：样品中抗体的最终浓度以及荧光偶联物的使用应根据所用的具体抗体和流式分选仪进行优化。
  4. 在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟，沉淀细胞。
  5. 弃去上清液，将沉淀重悬于 600 μL 冰冷的分选缓冲液中。
  6. 将样品通过 5 mL FACS 管的滤网帽过滤，细胞置于冰上避光保存，立即进行流式细胞分选（FACS）。
  7. 为获得造血性内皮细胞（CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-），执行以下步骤：
    1. 识别 CD45- 细胞群并设门（CD45-）。
    2. 在 CD45- 群体内，识别 CD31+ 细胞群并设门（CD31+）。
    3. 在 CD31+ 群体内，识别 VE-Cadherin- 细胞群并设门（CDH5-）。
    4. 在 CDH5- 群体内，识别 c-Kit+ 细胞群并设门（KIT+）。
    5. 在 KIT+ 群体内，识别 CD34+ 细胞群并设门（CD34+）。
    6. 在 CD34+ 群体内，识别并分选出 KDR+ 细胞，收集至 6 mL 冰冷的细胞分选缓冲液中。将这些细胞用于后续实验（见第 8 节）。

8. 菌落形成单位实验

  1. 按照制造商说明解冻甲基纤维素培养基的分装样品。
    注意：每3 mL分装量足够用于两个样品，每4 mL分装量足够用于三个样品。
  2. 计数在步骤7.7中获得的分选造血内皮细胞。
  3. 根据制造商说明，计算需加入每份甲基纤维素培养基分装样品中的分选细胞体积，使每个样品至少含有1,000个造血内皮细胞。
    注意：可根据需要调整细胞数量。
  4. 将计算好的细胞体积加入甲基纤维素培养基分装样品中，充分涡旋混匀。将甲基纤维素培养基培养物置于室温静置10分钟，或直至气泡完全消散。
  5. 从已准备好的35 mm培养皿中吸除纤连蛋白包被液。根据制造商说明，向每个35 mm培养皿中加入1 mL甲基纤维素培养基培养物。轻轻旋转培养皿，使培养物均匀分布。
  6. 将这些35 mm培养皿以及另外两个盛有无菌水的35 mm培养皿一同放入15 cm组织培养皿中。
  7. 将培养物置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育，并在第8天和第14天观察培养情况。
    1. 第8天，计数CFU-E和BFU-E集落。
    2. 第14天，计数CFU-GM和CFU-GEMM集落。
      注意：请参考甲基纤维素培养基说明书，进行集落类型的形态学鉴定。

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结果

图1 展示了从人胚胎干细胞（hESCs）分化为原始内皮细胞（primordial ECs）和生血性内皮细胞（hemogenic ECs）的示意图，以及细胞接种后24小时的代表性图像。图1。在分化完成后，分别于第5天和第8天通过FACS对原始内皮细胞和生血性内皮细胞进行纯化。原始内皮细胞定义为CD31+ CD45-，生血性内皮细胞定义为CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-。原始内皮细胞和生血性内皮细胞纯化的代表性流式细胞术设门策略如图2所示。首先根据CD45阴性表达和CD31阳性表达对细胞设门，以获得纯化的原始内皮细胞（图2A）。为获得纯化的生血性内皮细胞，首先按照图2A进行设门，随...

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讨论

本文概述了在约1周内使用小鼠饲养层和无血清的二维培养系统从人胚胎干细胞诱导生成造血性内皮细胞的步骤（图1）。该方案基于Sriram等（2015）描述的方法，用于获得原始内皮细胞（ECs）38。通过将CD31+ CD45- ECs培养在DLL4包被的培养板上，并观察其基因表达变化呈现出动脉特化的特征，从而验证了这些原始ECs的发育潜能（图3）。此外，动脉身份的获得伴随着晚期G1期细胞周期阻滞（图3），这与先前的研究结果一致27。将原始ECs在含有0.5 μM RA、25 ng/mL BMP4和50 ng/mL VEGF-A的条件下再培养3天后，可生成造血性内皮细胞，并通过FACS分离获得（图2），这些细胞能够形成CFU-红系、BFU-红系、CFU-粒细胞/巨噬细胞以...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）基金项目HL128064和U2EB017103的支持。此外，还获得了康涅狄格州创新基金15-RMB-YALE-04的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 厘米培养皿Corning430599组织培养处理
35 毫米培养皿Corning430165组织培养处理
6 孔板Corning3516组织培养处理
抗菌试剂
品牌名称：Normocin		Invitrogenant-nr-1
bFGFR&D systems233-FB-025使用浓度为 50 ng/mL
BMP4BioLegend595202使用浓度为 25 ng/mL
牛血清白蛋白（BSA）Fisher ScientificBP1600-1
细胞解离溶液
品牌名称：Accutase		Stemcell Technologies7920
二甲基亚砜（DMSO）Sigma AldrichD2650-100mL
分散酶（Dispase）Stemcell Technologies7913
DLL4R&D systems1506-D4/CF重组人源；使用浓度为 10 μg/mL
DMEM:F12Gibco11320-033
杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）Gibco14190144
内皮细胞生长培养基
品牌名称：EGM-2 内皮细胞生长培养基-2 BulletKit（EGM-2）		LonzaCC-3162
FACS 管Corning352235带滤帽的聚苯乙烯圆底管
胎牛血清（FBS）Gemini Bio100-106
纤连蛋白ThermoFisher Scientific33016015使用浓度为 4 μg/cm2
GSK3i/CHIR99021Stemgent04-0004-0210 mM 储存液；使用浓度为 5 μM
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）Gibco14175-095
盐酸（HCl）Fisher ScientificA144S-500
基质蛋白 
品牌名称：Matrigel		Corning356230生长因子减少型。请参考分析证书中的批号以确定蛋白（Matrigel）浓度。该浓度用于计算含有 1 mg 蛋白的 Matrigel 体积。
甲基纤维素培养基
品牌名称：MethoCult H4435 Enriched		Stemcell Technologies4435
多能干细胞分化培养基
品牌名称：STEMdiff APEL 2		Stemcell Technologies5270
多能干细胞：H1、H9、H9-FUCCIWiCellWA09 (H9), WA01 (H1)人源；H9-FUCCI 来自剑桥干细胞研究所 Ludovic Vallier 博士实验室
无蛋白杂交瘤培养基（PFMH）Gibco12040077
视黄酸Sigma AldrichR2625-50mg使用浓度为 0.5 μM
逆转录预混液
品牌名称：iScript Reverse Transcription Supermix		BioRad1708840
RNA 提取试剂盒
品牌名称：RNeasy Mini Kit		Qiagen74104
氢氧化钠（NaOH）Fisher ScientificSS255-1
干细胞生长培养基
品牌名称：mTeSR1		Stemcell Technologies85850
SYBR Green 预混液
品牌名称：iTaq Universal SYBR Green Master Mix		BioRad1725121
胰蛋白酶-EDTAGibco252999560.25%
VEGF165（VEGF-A）PeproTech100-20使用浓度为 50 ng/mL
α-CD31-FITCBioLegend3031042 μg/mL*
α-CD34-Pacific BlueBioLegend3435122 μg/mL*
α-CD45-APC/Cy7BioLegend3040142 μg/mL*
α-c-Kit-APCBioLegend3132062 μg/mL*
α-Flk-1-PE/Cy7BioLegend3599112 μg/mL*
α-VE-Cadherin-PEBioLegend3485062 μg/mL*
* 抗体荧光偶联物的使用浓度应根据所用流式分选仪进行优化。此处列出的是本研究中使用的最终浓度。

参考文献

  1. Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
  2. Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering. RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).
  3. Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems. MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).
  4. Gritz, E., Hirschi, K. K. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).
  5. Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
  6. Olmer, R., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).
  7. Cossu, G., et al. Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine. The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
  8. Fox, I. J., et al. Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease. Science. 345 (6199), 1247391(2014).
  9. Mahla, R. S. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).
  10. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  11. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  12. Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
  13. Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).
  14. Ramme, A. P., et al. Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).
  15. Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
  16. Kane, N. M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).
  17. Costa, M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization. Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).
  18. Nguyen, M. T. X., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).
  19. Ikuno, T., et al. Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP. PLOS One. 12 (3), 0173271(2017).
  20. Aoki, H., et al. Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B. Heliyon. 6 (3), 03493(2020).
  21. Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
  22. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  23. Kusuma, S., Gerecht, S. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. Human Embryonic Stem Cell Protocols. Turksen, K. , Humana Press. New York, NY. 213-222 (2014).
  24. Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions. Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).
  25. Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200(2019).
  26. Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -C. Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143(2019).
  27. Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communications. 8 (1), 2149(2017).
  28. Dalton, S. Linking the cell cycle to cell fate decisions. Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).
  29. Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).
  30. Rocha, S. F., Adams, R. H. Molecular differentiation and specialization of vascular beds. Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).
  31. Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
  32. Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development. Cell. 155 (1), 215-227 (2013).
  33. Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
  34. Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8 (1), 14361(2017).
  35. Ottersbach, K. Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).
  36. Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
  37. Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification. Cell Reports. 33 (9), 108465(2020).
  38. Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261(2015).
  39. Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823(2019).
  40. Galat, Y., et al. Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67(2017).
  41. Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), Dayton, Ohio. 1380-1389 (2014).

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CD34
人多能干细胞向造血内皮细胞的定向分化
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