Summary
여기에 제시된 것은 약 1 주일 내에 인간 다 능성 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화를위한 간단한 프로토콜이다.
Abstract
혈관은 신체의 모든 조직에 편재하게 분포되어 있으며 다양한 기능을 수행합니다. 따라서 인간 만능 줄기 세포에서 혈관 내강을 감싸는 성숙한 혈관 내피 세포를 유도하는 것은 다양한 조직 공학 및 재생 응용 분야에 중요합니다. 생체 내에서 원시 내피 세포는 중배엽 계통에서 파생되며 동맥, 정맥, 모세 혈관, 혈구 및 림프를 포함한 특정 하위 유형에 대해 지정됩니다. 혈구 내피 세포는 발달 과정에서 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하여 평생 동안 모든 혈통을 생성하기 때문에 특히 중요합니다. 따라서, 시험관 내에서 혈구 내피 세포를 생성하는 시스템을 만드는 것은 내피에서 조혈로의 전이를 연구할 기회를 제공할 것이며, 인간 혈액 제제의 생체외 생산 및 인간 기증자에 대한 의존도 감소로 이어질 수 있다. 전구 및 원시 내피 세포의 유도를 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 인간 줄기 세포로부터 잘 특성화된 혈구 내피 세포의 생성은 설명되지 않았습니다. 여기에서는 약 1 주일 만에 인간 배아 줄기 세포로부터 조혈 내피 세포를 유도하는 방법을 제시합니다 : GSK3β 억제제 (CHIR99021)에 반응하여 형성된 원시 줄무늬 세포를 이용한 분화 프로토콜, bFGF에 의해 매개되는 중배엽 계통 유도, BMP4 및 VEGF-A에 의해 촉진 된 원시 내피 세포 발달, 마지막으로 레티노 산에 의해 유도 된 혈구 내피 세포 사양. 이 프로토콜은 분자 조절 및 내피에서 조혈로의 전이를 더 이해하는 데 사용할 수 있는 잘 정의된 혈구 내피 세포 집단을 생성하며, 이는 다운스트림 치료 응용 분야에 적용될 가능성이 있습니다.
Introduction
내피 세포(EC)는 인체 전체와 조작된 조직에서 여러 기능을 수행하는 이질적인 세포 집단입니다. 다른 세포 유형(즉, 심근세포1, 조골세포2)을 지지하고 조절하는 것 외에도, 이러한 기능에는 혈액과 조직 사이에 선택적 장벽을 형성하고 조직 형성을 돕는것3이 포함됩니다. 정상적인 발달 과정에서 성숙한 EC를 차별화하려면 다양한 신호 경로가 필요합니다. 원시 EC는 중배엽 전구 세포에서 파생 된 다음 성숙한 동맥, 정맥, 모세 혈관 및 림프 표현형으로 지정됩니다4. 또한, 배아 외 난황낭 및 배아 대동맥-생식선-메소네프로스(AGM) 영역에 있는 EC의 작은 하위 집합도 조혈성 EC가 되도록 지정되며, 이는 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)를 생성하여 태아 간 및 태아 골수로 이동하여 출생 후에도남아 평생 동안 모든 유형의 혈액 세포를 생성합니다4. 다양한 범위의 EC 표현형은 모든 조직 발달 및 유지에 필수적입니다.
따라서 EC와 그 파생물은 인간 발달 및/또는 질병의 모델링 및 해명 메커니즘뿐만 아니라 재생 의학 및 조직공학 응용 5,6,7,8을 목표로 하는 연구의 중요한 구성 요소입니다. 그러나 이러한 유형의 연구에 대한 주요 한계는 필요한 양에서 1 차 인간 EC의 가용성이 부족하다는 것입니다. 대부분의 치료 응용 프로그램에 최소 3 x 108 EC가 필요한 것으로 추정됩니다6. 이 문제를 해결하기 위해 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)의 사용이 다양한 혈통 잠재력과 많은 수의 자손을 생성 할 수있는 능력으로 인해 제안되었습니다 6,9.
실제로, hESC 또는 hiPSC에서 유래 한 세포의 유용성은 질병 모델링 및 약물 스크리닝10,11,12에 초점을 맞춘 여러 연구에서 입증되었습니다. OOC(Organ-on-a-Chip) 기술은 세포와 조직을 3차원 스캐폴드로 통합하여 인체의 생리학을 보다 충실하게 요약하는 데 사용되었습니다. 또한, 다수의 개별 OOC(소위 바디- 또는 휴먼-온-어칩, BOC/HOC)의 연결은 미세유체공학을 통해 달성되어 관심 기관(13,14,15) 간의 혼선을 허용할 수 있다. 혈관구조와 같은지지 조직은 OOC 및 BOC / HOC의 중요한 구성 요소입니다. 혈관 구조를 통합하면 조직 전체에 영양분, 산소 및 파라 크린 인자를 운반 할 수 있으므로 필요한 조직 특이 적 미세 환경 3,12을 촉진 할 수 있습니다. 따라서 동맥, 정맥, 림프 및 hemogenic EC와 같은 성숙한 인간 EC를 유도하는 방법은 이러한 조직 공학 접근법을 발전시키는 데 중요합니다.
hESC 또는 hiPSC 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26에서 인간 원시 또는 전구 EC를 파생하는 단계를 자세히 설명하는 여러 프로토콜이 게시되었습니다. . 이러한 프로토콜의 대부분은 배아체(EB) 형성 또는 기질 세포의 쥐 영양층이 있는 ESC/iPSC의 공동 배양에 의존합니다. 이러한 전략은 낮은 EC 수율 및/또는 쥐 세포로 인한 인간 EC의 오염으로 인해 어렵고 시간이 많이 소요되는 경향이 있습니다. 기질 세포를 사용하지 않고 2D 배양에만 의존하는 프로토콜은 종종 긴 유도가 필요하거나, 유도를 위해 성장 인자 및/또는 억제제의 복잡한 조합을 사용하거나, 세포 분리 후 확장 기간이 연장되거나, 이러한 요인의 조합이 필요합니다. 생체 내에서 성숙한 EC 유형의 유도와 관련된 신호 경로 및 요인에 대한 지식을 발전시키면 간단하고 강력한 체외 차별화 프로토콜의 토대를 마련할 수 있습니다.
이전에는 개발 중에 쥐 동맥 및 호모닉 EC의 사양에서 각각 Notch 및 Retinoic Acid (RA) 신호 전달 경로의 주요 역할이 확인되었습니다. Notch 신호 전달 경로는 동맥 EC 표현형의 사양 및 유지에 여러 역할을 합니다. 쥐 망막 혈관화 모델을 사용한 연구는 유체 전단 응력이 Notch-Cx37-p27 신호 축을 유도하여 G1 세포 주기 정지를 촉진하는 경로를 식별하여 동맥 EC 사양27을 가능하게 했습니다. 세포주기 상태는 세포가 유전자 발현 및 표현형 변화를 유도 할 수있는 특정 신호를 수용하는 뚜렷한 기회 창을 제공함으로써 세포 운명 결정에 역할을하는 것으로 가정되었습니다28. 이 노치 매개 G1 정지는 에프린B2, Cx40, DLL4, 노치1 및 노치 4를 포함한 동맥 EC에서 풍부한 유전자의 발현을 가능하게 했습니다(29,30에서 검토됨). 또한 혈구 EC 사양은 RA 신호 전달31,32를 통해 생체 내에서 촉진되는 것으로 나타났습니다. 추가 연구에서는 RA 신호전달의 하류, c-Kit 및 Notch의 발현이 p27을 상향조절하여 뮤린 난황낭 및 AGM33에서 혈구 사양을 가능하게 한다는 것을 확인했습니다. 뮤린 헤모닉 EC는 내피 (즉, CD31, KDR) 및 조혈 (즉, c-Kit, CD34) 마커4 둘 다의 발현에 의해 최소한으로 확인될 수 있다. 마지막으로, 혈구 EC는 내피에서 조혈로의 전이 (EHT)를 거쳐 HSPC를 형성하며, 이는 모든 혈액 세포 유형 4,34,35를 생성 할 수 있습니다.
최근 연구에서는 이 동일한 신호 계층 구조가 인간 hemogenic EC 사양을 촉진할 수 있는지 여부를 테스트했습니다. 이를 위해 hESC에서 헤모닉 EC를 유도하기 위한 혈청 및 피더가 없는 2D 배양 프로토콜이 개발되었으며, 이러한 헤모닉 EC는 단일 세포 수준에서 CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-로 특성화되었습니다. 이 연구는 또한 FUCCI 리포터 구조체(H9-FUCCI-hESC)36를 발현하는 H9-hESC를 사용하여 다양한 세포 주기 상태를 식별하는 형광 유비퀴틴화 세포 주기 지표(FUCCI) 리포터를 활용했습니다. 이들 세포를 사용한 연구에서, RA는 ECs에서 초기 G1 세포 주기 정지를 촉진하고, 초기 G1 상태는 시험관내37에서 헤모겐 스펙을 가능하게 한다는 것이 입증되었다. 본원에서, 이들 인간 조혈성 내피 세포의 분화를 위한 상세한 프로토콜 및 이들의 정체를 확인하는 분석법이 제공된다. 이 간단한 방법은 인간 혈액 세포 발달 메커니즘에 대한 향후 연구를 위해 EC의 특수 하위 집합을 생성하는 유용한 수단을 제공합니다.
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Protocol
1. 시약 및 시약 준비
참고: 시약 목록은 재료 표에 나와 있습니다.
- 인간 만능 줄기 세포주를 얻습니다: H1-hESC, H9-푸치-hESC.
참고: hemogenic EC의 생성은 H1 세포주에서 더 효율적일 수 있습니다. - 매트릭스 단백질 스톡을 준비합니다: 매트릭스 단백질을 사전 냉각된 1.5mL 튜브(얼음 위)에 분취하여 각 튜브에 1mg의 매트릭스 단백질이 포함되도록 합니다. 1mg의 매트릭스 단백질은 2 개의 6 웰 플레이트 (총 12 웰)의 모든 웰을 코팅하기에 충분합니다. 사용 될 때까지 분취량을 -20 ° C에서 보관하십시오.
참고: 얼음 위 또는 4°C에서 매트릭스 단백질과 관련된 모든 단계를 수행하십시오. 매트릭스 단백질의 동결된 스톡 바이알을 얼음 위에서 밤새 해동시킨다. 해동되면 바이알을 휘저어 내용물이 혼합되도록 합니다. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브를 -20°C에서 최소 1시간 동안 예열하고 분취 직전에 얼음으로 옮깁니다. - 매트릭스 단백질 코팅 플레이트 준비: 매트릭스 단백질 분취량을 4°C의 얼음에서 해동합니다. 얼음 위의 미리 냉각된 원뿔형 튜브에 12.5mL의 얼음처럼 차가운 DMEM:F12를 추가합니다. 사전 냉각된 피펫 팁을 사용하여 1개의 분취량(1mg)의 매트릭스 단백질을 원뿔형 튜브로 옮기고 위아래로 피펫팅하여 잘 혼합합니다. 희석된 매트릭스 단백질 1mL를 사전 냉각된 혈청학적 피펫을 사용하여 미리 냉각된 6-웰 플레이트(얼음 위)의 각 웰에 분취한다. 전체 우물이 고르게 코팅되도록 판을 소용돌이 치고 흔든다. 매트릭스 단백질이 고형화될 수 있도록 플레이트를 실온에서 최소 30분 동안 배양합니다. 플레이트를 파라필름으로 감싸고 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오. 매트릭스 단백질 코팅 플레이트는 준비 후 2주 이내에 사용하십시오.
참고: 매트릭스 단백질로 코팅된 6웰 플레이트를 사용하여 세포의 일상적인 계대와 원시 및 조수 내피 세포로의 분화를 수행하십시오. 얼음 위에서 모든 단계를 수행하십시오. 사용하기 전에 6웰 플레이트, 피펫 팁, 혈청학적 피펫 및 원뿔형 튜브를 -20°C에서 최소 1시간 동안 사전 냉각합니다. 사용할 준비가 되면 이러한 항목을 얼음으로 옮깁니다. - 만능줄기세포 분화배지 100mL에 PFHM 5mL를 첨가하여 염기 분화배지를 준비한다. 4 °C에서 보관하십시오.
- 0.1 g BSA를 100 mL PBS에 용해시켜 0.1% BSA-PBS를 제조한다. 필터는 0.22 μm 필터를 통과시켜 BSA-PBS를 살균하고 4 °C에서 보관합니다.
- 스톡 HCl(12M) 1:2,400을 물로 희석하여 5mM HCl을 준비합니다. NaOH를 사용하여 pH를 3.0으로 조정합니다. 필터는 0.22 μm 필터를 통과시켜 용액을 멸균하고 4°C에서 보관한다.
- bFGF, BMP4, VEGF-A, 레티노산(RA) 및 DLL4 스톡을 준비합니다.
- bFGF: 동결건조된 분말을 0.1% BSA-PBS에서 100μg/mL로 재구성합니다. 분취량을 -20°C에서 보관한다. 준비 후 3개월 이내에 bFGF 재고를 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
- BMP4: 동결건조된 분말을 5mM HCl, pH 3.0에서 1mg/mL로 재구성합니다. 0.1% BSA-PBS에서 50μg/mL로 추가로 희석합니다. 분취량을 -20°C에서 보관한다. 준비 후 4개월 이내에 BMP3 주식을 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
- VEGF-A: 동결건조된 분말을dH2O중 1mg/mL로 재구성한다. 0.1% BSA-PBS에서 100μg/mL로 추가로 희석합니다. 분취량을 -20°C에서 보관한다. 준비 후 3 개월 이내에 VEGF-A 주식을 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
- RA: 동결건조된 분말을 DMSO 중에서 100 mM으로 재구성한다. 분취량을 -80°C에서 보관한다. 준비 후 1개월 이내에 RA 재고를 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
알림: RA 주식을 빛으로부터 보호하십시오. - DLL4: 동결건조된 분말을 PBS에서 1mg/mL로 재구성합니다. 분취량을 -20°C에서 보관한다. 준비 후 12개월 이내에 DLL4 재고를 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
- 최종 농도가 각각 25ng/mL 및 50ng/mL가 되도록 염기 분화 배지(단계 1.4)에서 VEGF-A 및 BMP4를 희석하여 사용 직전에 내피세포 분화 배지를 준비합니다.
- DMSO 중의 100 mM 스톡 1:1,000을 100 μM로 희석함으로써 사용 직전에 작업 RA를 준비한다.
알림: 작동하는 RA를 빛으로부터 보호하십시오. - 최종 농도가 각각 25ng/mL, 50ng/mL 및 0.5μM이 되도록 염기 분화 배지(단계 1.4)에서 VEGF-A, BMP4 및 작동 RA를 희석하여(단계 1.4) 사용 직전에 조혈 내피 세포 분화 배지를 준비합니다.
- 10% FBS를 함유한 HBSS를 만들어 항체 염색 완충액을 준비하고 1:500 희석 항균 시약으로 보충합니다. 멸균 여과액을 즉시 사용하십시오.
- 1% FBS가 포함된 HBSS를 만들어 세포 분류 완충액을 준비하고 1:500 희석 항균 시약으로 보충합니다. 멸균 여과액을 즉시 사용하십시오.
- 동결건조된 피브로넥틴 5mg에 멸균수 5mL를 추가하여 1mg/mL 피브로넥틴 스톡을 준비합니다. 분취량을 -20°C에서 보관한다. 동결건조된 제품 라벨의 만료일 이전에 피브로넥틴 스톡을 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
- 피브로넥틴으로 코팅 된 35mm 접시를 준비하십시오. 피브로넥틴 스톡(1 mg/mL)을 멸균 수에서 4 μg/mL로 희석합니다. 이 피브로넥틴 코팅 용액 1mL를 각 접시에 넣고 37°C에서 30분에서 1시간 동안 배양합니다. 코팅 직후 접시를 사용하십시오.
- 제조업체의 지침에 따라 3 또는 4mL의 메틸셀룰로오스 기반 배지 분취량을 준비합니다. 사용 될 때까지 분취량을 -20 ° C에서 보관하십시오. 재고 제품 라벨에 표시된 만료일 전에 메틸셀룰로오스 기반 중간 분취량을 사용하십시오. 사용 직전에 분취량을 해동하십시오.
- 재조합 인간 DLL4 스톡을 PBS에서 최종 농도 10μg/mL로 희석하여 DLL4 코팅 용액을 준비합니다.
- 내피 세포 성장 배지를 제조자의 지시에 따라 준비하고 보관하십시오.
- 0.1% BSA를 포함하는 PBS를 만들어 유세포 분석 완충액을 준비한다. 멸균 완충액을 여과하고 사용 시까지 4°C에서 보관한다.
2. hESC의 세포 배양 및 계대 배양
- 매트릭스 단백질 코팅 플레이트, 줄기 세포 성장 배지 및 DMEM:F12를 실온으로 예열합니다.
- hESC 세포주를 37°C, 5%CO2 인큐베이터의 매트릭스 단백질이 코팅된 6웰 플레이트의 줄기세포 성장 배지(2mL/웰)에서 성장시킵니다.
- 매일 세포를 확인하고 필요에 따라 p200 피펫 팁을 사용하여 플레이트에서 부드럽게 긁어내어 분화된 세포를 제거합니다.
참고: 분화된 세포는 콜로니 주변에 나타납니다. 줄기세포 성장 배지 제품 매뉴얼에서 배양된 분화된 세포의 예를 참조하십시오. - 세포가 70%-80% 컨플루언스에 도달하면 통과시킵니다. 세포를 계대하려면 다음 단계를 수행하십시오.
참고: 분화가 증가하면 70%-80% 컨플루언시에 도달하기 전에 세포를 분할해야 합니다.- 세포 위의 배지를 제거하고 웰당 1mL DMEM:F12로 부드럽게 세척합니다.
- 웰당 DMEM:F12 1mL를 추가합니다.
- 웰당 160 μL/mL의 디스파제를 첨가하고, 세포를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 45분 동안 배양한다.
- Dispase 배양 후 웰당 1mL의 DMEM:F12를 추가하고 부드럽게 피펫하여 세포를 들어 올립니다.
알림: 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리하지 마십시오. 세포를 작은 덩어리로 통과시킵니다. - 세포를 12mL의 DMEM:F12가 들어 있는 원추형 튜브로 옮기고 세포가 중력에 의해 침전되도록 합니다(~5-10분).
- 상청액을 제거하고 들어 올린 세포의 웰당 줄기 세포 성장 배지 0.5mL에 펠릿을 부드럽게 재현탁하여 작은 세포 덩어리를 얻습니다.
알림: 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리하지 마십시오. 세포를 작은 덩어리로 통과시킵니다. - 준비된 매트릭스 단백질 코팅 플레이트의 웰에서 매트릭스 단백질 코팅 용액을 흡입하고 웰당 줄기세포 성장 배지 1.5mL를 추가합니다.
- 원하는 부피의 재현탁 세포(단계 2.4.6)를 준비된 매트릭스 단백질 코팅된 플레이트의 각 웰에 추가합니다.
- 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 24 시간마다 배지를 신선한 줄기 세포 성장 배지로 교체하십시오.
3. hESCs의 원시 내피 세포로의 분화
- -1일: 상기 섹션 2에 기재된 바와 같이 세포를 배양하고 계대배양한다. 세포를 (단계 2.4.6) 평방 센티미터 당 약 2 덩어리의 밀도로 작은 덩어리 (~ 50 μm)로 시드합니다38.
참고: 시드 밀도를 평가하고 필요한 경우 경험적으로 구체화합니다. - 0일차: 세포를 파종한 후 24시간 후에 각 웰에서 배지를 흡인하고 웰당 1mL DMEM:F12로 세포를 부드럽게 세척합니다. 5μM GSK3i(CHIR99021, 신선하게 첨가)를 포함하는 염기 분화 배지 1mL를 각 웰에 추가하고 24시간(37°C, 5%CO2) 동안 배양합니다.
알림: 모든 세척 단계에서 표시된 세척 매체를 플레이트 웰 벽에 피펫팅하여 플레이트에 천천히 추가합니다. 우물의 전체 표면이 세척 매체로 덮이도록 플레이트를 부드럽게 소용돌이 치십시오. 세척 매체가 6시 위치에 풀링되도록 플레이트를 약간 기울이고 세척 매체를 조심스럽게 흡입합니다. - 1일차: 각 웰에서 배지를 흡입하고 웰당 1mL DMEM:F12로 세포를 부드럽게 세척합니다. 50ng/mL bFGF(냉동 재고에서 신선 첨가, 1:2,000 첨가)를 포함하는 염기 분화 배지 1mL를 각 웰에 추가하고 24시간(37°C, 5%CO2)에서 배양합니다.
- 2일차: 각 웰에서 배지를 흡인하고 웰당 1mL의 DMEM:F12로 세포를 부드럽게 세척합니다. 내피 세포 분화 배지 1mL를 각 웰에 추가하고 24시간 배양합니다(37°C, 5%CO2).
- 3일차: 세포 위의 배지를 웰당 새로 준비된 내피 세포 분화 배지 1mL로 교체하고 24시간(37°C, 5%CO2)에서 배양합니다.
- 4일차: 세포 위의 배지를 웰당 새로 준비된 내피 세포 분화 배지 1mL로 교체하고 24시간(37°C, 5%CO2)에서 배양합니다.
- 5일차: FACS는 세포를 정제하여 EC 표현형을 평가하거나(섹션 4-5) 배양을 유지하고 조혈 내피 세포로 분화합니다(섹션 6).
4. 원시 내피 세포의 FACS 정제
- 세포 위의 배지를 흡인하고 웰당 1mL의 DMEM:F12로 부드럽게 한 번 씻습니다.
- 웰당 1mL의 세포 분리 용액을 추가하고 37°C, 5% CO2 인큐베이터에서 또는 세포가 해리될 때까지12 분 동안 세포를 배양합니다.
- 해리된 세포를 12mL의 DMEM:F12가 들어 있는 원뿔형 튜브로 옮기고 펠릿을 5분 동안 원심분리하여 1,000 x g로 옮깁니다.
- 상청액을 제거하고 펠릿을 12mL의 DMEM:F12에 재현탁하여 세척합니다.
- 세포를 5분, 1,000 x g 동안 원심분리하여 펠릿화합니다.
- 상청액을 제거하고 세포 펠릿을 빙냉 항체 염색 완충액에 재현탁하고 세포를 계수합니다. 얼음처럼 차가운 항체 염색 완충액을 사용하여 농도를 1 x 105 cells/mL로 조정합니다.
- 항체 염색을 위해 세포를 얼음 위의 미세 원심분리 튜브로 고르게 나누고, 각각은 1 x 105 cells/mL에서 최소 600μL 세포를 포함합니다.
참고: 원시 EC의 염색에는 염색되지 않은 대조군, CD31 단일 항체 대조군, CD45 단일 항체 대조군, CD31 및 CD45 항체가 모두 포함된 샘플의 4개의 세포 튜브가 필요합니다. 항체에 대한 정보는 재료 표에 나와 있습니다. - 세포를 포함하는 튜브에 항체를 적절하게 첨가하고 얼음 위에서 배양하고 30분 동안 빛으로부터 보호합니다.
- 염색되지 않은 대조군: 항체를 추가하지 마십시오.
- CD31 단일 항체 대조군: CD31 항체만 추가합니다.
- CD45 단일 항체 대조군: CD45 항체만 추가합니다.
- 샘플: CD31 및 CD45 항체를 모두 추가합니다.
참고: 샘플의 최종 항체 농도와 형광 접합체는 사용된 특정 항체 및 세포 분류기를 기반으로 최적화되어야 합니다.
- 세포를 4°C 탁상 마이크로원심분리기에서 1,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화합니다.
- 상청액을 제거하고 600μL의 얼음처럼 차가운 분류 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 5mL FACS 튜브의 메쉬 필터 캡을 통해 샘플을 변형시키고 즉각적인 FACS를 위해 빛으로부터 보호되는 얼음 위에 세포를 보관하십시오.
- 다음 단계를 수행하여 원시 내피 세포(CD31+ CD45-)를 얻습니다.
- CD45 음성 세포 집단 및 게이트(CD45-)를 식별합니다.
- (CD45-) 내에서 CD31 양성(CD31+) 세포 집단을 식별하고 세포를 6mL 빙냉 세포 분류 완충액으로 분류합니다. 다운스트림 응용 프로그램에 이러한 셀을 사용합니다(섹션 5 참조).
5. 원시 내피 세포 표현형을 확인하기위한 분석
- 6웰 플레이트의 3웰을 1mL/웰 DLL4 코팅 용액으로 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 30분 동안 코팅합니다. 대조군으로 플레이트의 다른 3웰을 1mL/웰 PBS로 모의 코팅합니다.
- DLL4 코팅 용액을 PBS 및 흡인하고, 웰당 2 mL의 내피 세포 성장 배지에 25,000개의 분류된 원시 내피 세포 (단계 4.12 참조)를 플레이트팅한다.
- 세포를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
- 세포 위의 배지를 흡인하고 2mL/웰 PBS로 한 번 세척합니다. qPCR 또는 유동 세포측정법(FUCCI 구축물을 발현하는 세포의 경우)에 의해 세포를 분석한다.
- qPCR로 세포를 분석하려면 다음 단계를 수행하십시오.
- 세포 위의 액체를 흡인하고 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA 추출 키트를 사용하여 세포에서 RNA를 분리합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 역전사 마스터 믹스로 역전사 반응을 수행합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 SYBR 그린 마스터 믹스로 qPCR 반응을 수행합니다.
참고: 사용된 프라이머(EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2)는 표 1에 나열되어 있습니다.
- 유동 세포분석에 의해 FUCCI 구축물을 발현하는 세포를 분석하기 위해, 하기 단계를 수행한다.
- 세포 위의 액체를 흡입하고 500μL/웰 0.25% 트립신-EDTA를 추가합니다.
- 세포를 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 들어 올려질 때까지, ~5분 동안 배양한다.
- 세포를 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 4°C 미세 원심분리기에서 1,000 x g에서 5분 동안 세포를 펠릿화합니다.
- 상청액을 흡인하고 500 μL의 빙냉 유세포 분석 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다.
- 즉각적인 유세포 분석을 위해 5mL FACS 튜브의 메쉬 필터 캡을 통해 샘플을 변형시키고 빛으로부터 보호되는 얼음에 세포를 보관합니다.
- 초기 G1(색상 없음), 후기 G1(mCherry+/mVenus-), G1/S(mCherry+/mVenus+) 및 S/G2/M(mCherry-/mVenus+)에서 DLL4 대 PBS 대조군에 도말된 세포의 백분율을 분석합니다.
- qPCR로 세포를 분석하려면 다음 단계를 수행하십시오.
6. hESCs의 혈액 내피 세포로의 분화
참고: 위의 섹션 3.1-3.6에서 설명한 대로 세포를 4일차 원시 EC로 분화합니다.
- 5일차: 세포 위의 배지를 흡인하고 웰당 1mL의 DMEM:F12로 세포를 부드럽게 세척합니다. 웰당 새로 준비된 혈구 내피 세포 분화 배지 1mL를 추가하고 24시간(37°C, 5%CO2)에서 배양합니다.
- 6일차: 세포 위의 배지를 웰당 새로 준비된 조혈 내피 세포 분화 배지 1mL로 교체하고 24시간(37°C, 5%CO2)에서 배양합니다.
- 7일차: 세포 위의 배지를 웰당 새로 준비된 조혈 내피 세포 분화 배지 1mL로 교체하고 24시간(37°C, 5%CO2)에서 배양합니다.
- 8일차: FACS는 혈성 내피 세포를 분리합니다(섹션 7 참조).
7. 조혈 내피 세포의 FACS 분리
- 위의 섹션 4.1-4.6에서 설명한대로 세포를 들어 올리고 씻습니다.
- 항체 염색을 위해 세포를 얼음 위의 미세 원심분리 튜브로 고르게 나누고, 각각은 1 x 105 cells/mL에서 최소 600μL 세포를 포함합니다.
참고: 헤모닉 EC의 항체 염색에는 염색되지 않은 대조군, CD31 단일 항체 대조군, CD45 단일 항체 대조군, KDR 단일 항체 대조군, c-Kit 단일 항체 대조군, CD34 단일 항체 대조군, VE-cadherin 단일 항체 대조군 및 6개의 항체가 모두 포함된 샘플 등 8개의 세포 튜브가 필요합니다.
참고: 항체 정보는 재료 표에 나와 있습니다. - 세포를 포함하는 튜브에 항체를 적절하게 첨가하고 얼음 위에서 배양하고 30분 동안 빛으로부터 보호합니다.
- 염색되지 않은 대조군: 항체를 추가하지 마십시오.
- CD31 단일 항체 대조군: CD31 항체만 추가합니다.
- CD45 단일 항체 대조군: CD45 항체만 추가합니다.
- KDR 단일 항체 대조군: KDR 항체만 추가합니다.
- c-Kit 단일 항체 대조군: c-Kit 항체만 추가합니다.
- CD34 단일 항체 대조군: CD34 항체만 추가합니다.
- VE-카데린 단일 항체 대조군: VE-카데린 항체만 추가합니다.
- 샘플: CD31, CD45, KDR, c-키트, CD34 및 VE-카데린 항체를 추가합니다.
참고: 샘플의 최종 항체 농도와 형광 접합체는 사용된 특정 항체 및 세포 분류기를 기반으로 최적화되어야 합니다.
- 세포를 4°C 미세원심분리기에서 1,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 펠렛화한다.
- 상청액을 제거하고 600μL의 얼음처럼 차가운 분류 완충액에 펠릿을 재현탁합니다.
- 5mL FACS 튜브의 메쉬 필터 캡을 통해 샘플을 변형시키고 즉각적인 FACS를 위해 빛으로부터 보호되는 얼음에 세포를 저장합니다.
- 혈성 내피 세포(CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-카데린-CD45-)를 얻으려면 다음 단계를 수행하십시오.
- CD45- 세포 집단 및 게이트(CD45-)를 동정한다.
- (CD45-) 내에서 CD31+ 세포 집단과 게이트(CD31+)를 식별합니다.
- (CD31+) 내에서 VE-카데린- 세포 집단 및 게이트(CDH5-)를 식별합니다.
- (CDH5-) 내에서 c-Kit+ 세포 집단과 게이트(KIT+)를 식별합니다.
- (KIT+) 내에서 CD34+ 세포 집단과 게이트(CD34+)를 식별합니다.
- (CD34+) 내에서 KDR+ 세포를 식별하고 6mL 얼음처럼 차가운 세포 분류 완충액으로 분류합니다. 다운스트림 애플리케이션에서 이러한 셀을 사용합니다(섹션 8 참조).
8. 콜로니 형성 단위 분석
- 제조업체의 지침에 따라 메틸셀룰로오스 기반 배지의 분취량을 해동합니다.
참고: 2개의 샘플에는 1개의 3mL 분취량으로 충분하고 3개의 샘플에는 1개의 4mL 분취량으로 충분합니다. - 단계 7.7에서 수득된 분류된 혈성 내피 세포를 계수한다.
- 제조업체의 지침에 따라 각 샘플에 최소 1,000개의 혈성 내피 세포가 포함되도록 각 메틸셀룰로오스 기반 배지 분취량에 추가할 분류된 세포의 부피를 계산합니다.
참고: 필요에 따라 셀 수를 조정할 수 있습니다. - 계산된 부피의 세포를 메틸셀룰로오스계 배지 분취량에 넣고 완전히 와동시킵니다. 메틸셀룰로오스 기반 배지 배양물을 실온에서 10분 동안 또는 기포가 소멸될 때까지 그대로 두십시오.
- 준비된 35mm 접시에서 피브로넥틴 코팅 용액을 흡인합니다. 제조업체의 지침에 따라 35mm 접시당 1mL의 메틸셀룰로오스 기반 배지 배양액을 분주합니다. 접시를 부드럽게 돌려 문화를 고르게 분배하십시오.
- 이 35mm 접시와 멸균수로 채워진 두 개의 추가 35mm 접시를 15cm 조직 배양 접시 안에 놓습니다.
- 배양물을 37°C, 5%CO2 배양기에서 배양하고, 8일 및 14일에 배양물을 관찰하였다.
- 8 일째에 CFU-E 및 BFU-E 콜로니를 계산합니다.
- 14일째에 CFU-GM 및 CFU-GEMM 콜로니를 계산합니다.
참고: 콜로니 유형의 형태학적 식별에 대해서는 메틸셀룰로오스 기반 배지 설명서를 참조하십시오.
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Representative Results
hESC의 원시 EC 및 호모닉 EC의 사양을 요약한 개략도와 도금 후 24시간 후의 세포의 대표 이미지가 그림 1에 나와 있습니다. 사양에 따라 원시 EC와 호모닉 EC는 각각 5일과 8일에 정제된 FACS입니다. 원시 EC는 CD31+ CD45-로 정의되고 헤모제닉 EC는 CD31+ KDR+ c-키트+ CD34+ VE-카데린-CD45-로 정의됩니다. 원시 EC 및 hemogenic EC 정제를 위한 대표적인 유세포 분석 게이팅 전략이 그림 2에 나와 있습니다. 세포는 정제된 원시 EC를 얻기 위해 초기에 CD45의 음성 발현 및 CD31의 양성 발현을 기반으로 게이트됩니다(그림 2A). 정제된 헤모겐 EC를 얻기 위해 세포는 처음에 그림 2A와 같이 게이트된 다음 VE-Cadherin(CDH5), c-Kit(KIT), CD34 및 KDR의 양성 또는 음성 발현(순서대로)을 기반으로 추가로 정제됩니다(그림 2B).
분화 5일째(프로토콜 섹션 4)에 FACS를 통해 분리된 H9-Fucci-hES 유래 원시 CD31+ CD45- 내피 세포의 내피 아형을 생성할 가능성을 평가하기 위해, 정제된 세포를 동맥 규격을 유도하기 위해 Notch 리간드 DLL4 또는 PBS(대조군)로 코팅된 플레이트 상에 시딩하고, 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 5 % CO2 인큐베이터. 그런 다음 세포를 RNA 용해 완충액으로 용해시키고 RNA를 추출하고 cDNA로 역전사하고 qPCR을 수행하여 DLL4 처리 세포와 대조군 세포의 유전자 발현 수준을 비교합니다. 예상대로, DLL4에서 성장한 내피 세포는 노치 반응 유전자 HEY2 및 동맥 관련 유전자 EFNB2, GJA5 및 GJA4의 발현을 증가시켰다. 또한, 이들 세포는 또한 정맥 전사 인자 NR2F2의 발현을 감소시켰다 (도 3A). 별법으로, 세포 주기 상태에 대한 DLL4 처리의 효과를 결정하기 위해, FACS 정제된 CD31+ CD45-세포를 DLL4 또는 PBS로 코팅된 플레이트 상에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 리프트하고, hCdt1(30/120)-m체리(후기 G1) 및 hGem(1/110)- mVenus (S/G2/M)의 발현에 기초하여 분석하였다. Notch 신호 전달이 후기 G1 세포 주기 정지27을 촉진한다는 결과와 일치하여, 대조군 세포에 비해 DLL4가 있는 상태에서 성장한 후 G1 후기에 더 많은 비율의 원시 EC가 체포됩니다(그림 3B, C).
조혈 내피 세포의 조혈 잠재력을 확인하기 위해 FACS를 통해 분리된 CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-내피 세포(섹션 7의 방법)를 콜로니 형성 단위(CFU) 분석에서 조혈 전구 세포의 성장을 위해 제조된 메틸셀룰로오스 기반 배지에 시딩하고 14일 동안 성장시킵니다. CFU-E 적혈구 콜로니 및 BFU)-E 적혈구 콜로니는 8일째에 계수되고(그림 4A,B), CFU-GM 과립구/대식세포 및 GFU-GEMM(과립구, 적혈구, 대식세포 및 거핵구) 다분화능 조혈 전구 콜로니는 14일째에 계수됩니다(그림 4C 및 D). 도금된 1,000개의 hemogenic EC당 약 20개의 CFU가 생성됩니다(그림 4F). 내피 세포 형태를 갖는 세포는 또한 배양물에서 볼 수 있다 (도 4E); 이들은 단일 세포 수준37에서 다중 계통 조혈 전구 세포를 생성하는 혈구 내피 세포입니다.
그림 1: 원시 및 호모닉 EC의 사양을 위한 프로토콜. (A) 차별화 프로토콜의 개략도. 배아 줄기 세포는 매트릭스 단백질-코팅된 플레이트에 -1일에 도말하고, 밤새 부착되도록 허용된다. 이어서, 세포를 0일 및 1일에 각각 GSK3i 억제제(CHIR99021) 및 bFGF로 처리하여, 각각 원시 줄무늬 및 중배엽 스펙을 유도한다. 제2일째부터 세포를 BMP4 및 VEGF-A의 조합으로 처리하여 원시 EC 발달을 촉진한다. 원시 EC(빨간색 원)는 5일째에 정제된 FACS입니다. 대안적으로, 호모성 EC를 생성하기 위해, 원시 ECs 위의 배지는 5일째에 BMP4, VEGF-A 및 RA를 함유하는 새로운 헤모닉 분화 배지로 교환된다. 이 배지는 hemogenic EC (빨간색 별)가 FACS 정제되는 8 일까지 매일 교체됩니다. (B) 분화 0일차의 콜로니, 스케일 바= 100 μm. 패널 A는 엘스비어의 허가를 받아 Qiu et al.37 에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: hESC에서 파생된 호모성 EC의 FACS 분석. (A) 원시 EC 및 (B) hemogenic EC의 정제를 위한 대표적인 유세포 분석 게이팅 전략. hemogenic EC는 원시 EC에서 파생되기 때문에 CD45 및 CD31에 대한 유세포 분석 게이팅 전략은 두 세포 집단에 대해 동일합니다. 각 패널(샘플)의 맨 윗줄에는 프로토콜 섹션 6에 설명된 대로 혼성 EC로 분화되고 프로토콜 섹션 7.3.8에 설명된 대로 항체로 염색된 세포가 표시됩니다. 각 패널(대조군)의 맨 아래 줄에는 RA 처리 없이 8일 동안 분화시킨 염색되지 않은 세포들이 도시되어 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: H9-Fucci CD31+ CD45-원시 내피 세포의 DLL4 유도는 늦은 G1 정지 및 동맥 유전자 발현 증가를 초래합니다. (a) 분화 5일째에 정제된 Fucci 구축물을 발현하는 CD31+ CD45-H9-hESC-유래 원시 내피 세포의 DLL4 처리는 동맥 유전자 (i-iii) 및 Notch 반응 유전자 Hey2의 발현을 증가시키고, 이는 정맥 유전자 NR2F2 (iv)의 발현의 수반되는 감소를 동반한다. (B) 24시간 동안 PBS (대조군) 또는 DLL4 상에서 성장한 5,000 H9-Fucci-유래 CD31+ CD45-의 세포 주기 상태 분포를 보여주는 대표적인 FACS 플롯. (C) DLL4 유도는 대조군에 비해 G1 기 후반의 세포에서 15% 증가를 초래한다. 데이터는 패널 (B)에 나타낸 동일한 실험으로부터의 삼중 샘플의 평균이다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: hESC에서 파생된 hemogenic EC의 조혈 잠재력 분석. H1-hESC 유래 (A) CFU-E 적혈구 콜로니 (스케일 바 = 35 μm), (B) BFU-E 적혈구 콜로니 (스케일 바 = 75 μm), (C) CFU-GM 과립구 / 대 식세포 콜로니, (D) CFU-GEMM 다 능성 조혈 전구 콜로니, (E) 기본 내피 세포 (EC)가있는 CFU-GM 과립구 / 대 식세포 콜로니의 형태를 보여주는 대표 이미지. (F) 1,000개의 도금된 혈구 내피 세포당 형성된 CFU의 수 및 분포. 스케일 바 = 100 μm in (C-E). 이 프로토콜을 사용하여 차별화된 CFU의 추가 이미지는 Qiu et al.37에서 찾을 수 있습니다. 패널 F는 엘스비어의 허가를 받아 Qiu et al.37에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 이름 | 전달 | 후진 |
| EFNB2 | TATGCAGAACTGCGATTTCCAA | TGGGTATAGTACCAGTCCTTGTC |
| EPHB4 | CGCACCTACGAAGTGTGTGA | GTCCGCATCGCTCATAGTA |
| GJA5 | CCGTGGTAGGCAAGGTCTG | ATCACACCGGAATCAGCCTG |
| GJA4 | ACACCCACCCTGGTCTAC | 캑트그크가카타태그그씨 |
| 헤이2 | GCCCGCCCTTGTCAGTATC | CCAGGGTCGGTAAGGTTTATTG |
| NR2F2 | GGACCACATACGGATCTTCCAA | 아카가카그캣 |
표 1: qPCR 프라이머 정보
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Discussion
본원에는 뮤린 피더 및 무혈청 2D 배양 시스템(그림 1)을 사용하여 약 1주일 내에 인간 배아 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포를 생산하는 단계가 요약되어 있습니다. 이 프로토콜은 원시 ECs38을 얻기 위해 Sriram et al. (2015) 에 의해 설명 된 방법을 확장합니다. CD31+ CD45-EC의 원시적 특성 및 사양 잠재력은 DLL4 코팅 플레이트에서 이러한 세포를 배양하고 동맥 사양과 일치하는 유전자 발현 변화를 관찰함으로써 입증됩니다(그림 3). 또한, 동맥 정체성의 획득은 후기 G1 세포주기 정지와 관련이 있으며(그림 3), 이는 이전 연구(27)와 일치합니다. 0.5μM RA, 25ng/mL BMP4 및 50ng/mL VEGF-A의 존재 하에 추가로 3일 동안 원시 EC를 배양한 후, CFU-적혈구, BFU-적혈구, CFU-과립구/대식세포 및 CFU-과립구, 적혈구, 대식세포 및 거핵구 콜로니를 생성할 수 있는 HCS-분리 혼성 EC를 생성하고 FACS 분리(그림 2)를 생성할 수 있었습니다(그림 4 ). 최근 발표 된 연구에서이 방법을 사용하여 다 능성, 원시 줄무늬 및 중배엽 유도, 내피 세포 정체성의 획득 및 최종적으로 조혈 정체성의 상실과 일치하는 8 일 기간 동안의 유전자 발현 변화가 관찰되었습니다37. 더욱이, RA 치료는 조혈성 EC 규격37을 가능하게 하기 위해 초기 G1 세포 주기 정지를 유도하였다.
최근 Ohta et al. (2019)는 hPSCs39에서 hemogenic EC의 분화를위한 프로토콜을 설명했다. 그러나, 전술한 프로토콜은 상당한 이점을 제공한다: 1) 이 방법은 스페로이드의 형성을 필요로 하지 않는다; 2)이 프로토콜은 저산소 인큐베이터가 아닌 표준 37 ° C, 5 % CO2 인큐베이터를 사용하므로 전용 특수 장비가 필요하지 않습니다. 3) 이 프로토콜은 하나의 배지(PFHM이 보충된 만능줄기세포 분화 배지)만 사용하는 반면 Ohta 프로토콜은 유도를 위해 두 개의 배지가 필요합니다. Galat et al. (2017)은 CHIR99021 유도를 활용하여 CD34+ 혈구 내피 세포40 집단을 생성하는 프로토콜을 설명했습니다. 이들 세포는 또한 CD31을 발현하고, 단층 조건 하에서 배양 될 때 내피 세포 또는 추가 사이토 카인의 존재하에 각각 OP9 또는 OP9-DLL4 세포와 공동 배양 한 후 골수성 및 림프 마커를 발현하는 세포를 생성 할 수 있었다. 추가 공동 배양에 대한 요구 사항은 원하는 세포 집단을 쥐 세포로 잠재적으로 오염시킬 수 있습니다. 또한 Ohta et al. 및 Galat et al.은 여기에 설명된 것보다 짧은 혈구 유도 기간(각각 4일 및 5일 대 8일)을 사용했지만 둘 다 혼성 EC를 CD34+로 정의한 반면 이 프로토콜은 더 엄격한 정의를 사용했습니다. CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- . CD34는 조혈 세포의 마커로서 인식되는 반면, 이는 또한 다른 비-조혈 세포 유형, 예컨대 중간엽 기질 세포 및 내피 세포41에 의해 발현된다. 따라서 이 프로토콜(CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-)에서 hemogenic EC의 정의는 더 엄격하고 더 정의된 모집단을 나타냅니다.
치료 응용 분야에서 hESC 또는 hiPSC를 사용하는 한 가지 한계는 많은 수의 세포가 필요하다는 것이며, 표준 2D 유도 방법은 주로 소규모 분화로 제한됩니다. Olmer 등(2018)은 hiPSC 라인을 활용하여 현탁 배양 또는 교반 탱크 바이오리액터를 사용하여 동맥(DLL4) 및 정맥(EPHB4) 세포 마커를 모두 발현하는 기능성 CD31+ EC의 생산 확대 가능성을 입증했습니다6. 중요하게도, 그들은 20mL 현탁 배양이 포함된 단일 플라스크에서 CD34와 KDR을 공동 발현하는 1.18 x 107 CD31+ EC를 얻을 수 있음을 보여주었습니다. 대부분의 치료 응용 분야에 필요한 필수 3 x 108 EC를 얻으려면 2개 이상의 500mL 플라스크가 필요합니다6. 향후 실험에서는 hemogenic EC의 대규모 생산을 위해 여기에 제시된 프로토콜에 스케일링 기술을 적용하는 방법을 모색해야 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH 보조금 HL128064 및 U2EB017103에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 추가 지원은 CT Innovations 15-RMB-YALE-04 보조금으로 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm dishes | Corning | 430599 | tissue culture treated |
| 35 mm dishes | Corning | 430165 | tissue culture treated |
| 6-well plates | Corning | 3516 | tissue culture treated |
| Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin |
Invitrogen | ant-nr-1 | |
| bFGF | R&D systems | 233-FB-025 | use at 50 ng/mL |
| BMP4 | BioLegend | 595202 | use at 25 ng/mL |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-1 | |
| Cell Detatchment Solution Brand Name: Accutase |
Stemcell Technologies | 7920 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | |
| DLL4 | R&D systems | 1506-D4/CF | recombinant human; use at 10 μg/mL |
| DMEM:F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2) |
Lonza | CC-3162 | |
| FACS tubes | Corning | 352235 | polystyrene round bottom with filter cap |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33016015 | use at 4 μg/cm2 |
| GSK3i/CHIR99021 | Stemgent | 04-0004-02 | 10 mM stock; use at 5 μM |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175-095 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Matrix protein Brand Name: Matrigel |
Corning | 356230 | Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein. |
| Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched |
Stemcell Technologies | 4435 | |
| Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2 |
Stemcell Technologies | 5270 | |
| Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI | WiCell | WA09 (H9), WA01 (H1) | human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute |
| Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) | Gibco | 12040077 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625-50mg | use at 0.5 μM |
| Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix |
BioRad | 1708840 | |
| RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit |
Qiagen | 74104 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1 |
Stemcell Technologies | 85850 | |
| SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix |
BioRad | 1725121 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25299956 | 0.25% |
| VEGF165 (VEGF-A) | PeproTech | 100-20 | use at 50 ng/mL |
| α-CD31-FITC | BioLegend | 303104 | 2 μg/mL* |
| α-CD34-Pacific Blue | BioLegend | 343512 | 2 μg/mL* |
| α-CD45-APC/Cy7 | BioLegend | 304014 | 2 μg/mL* |
| α-c-Kit-APC | BioLegend | 313206 | 2 μg/mL* |
| α-Flk-1-PE/Cy7 | BioLegend | 359911 | 2 μg/mL* |
| α-VE-Cadherin-PE | BioLegend | 348506 | 2 μg/mL* |
| * Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study. |
References
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