Summary
Här presenteras ett enkelt protokoll för riktad differentiering av hemogena endotelceller från humana pluripotenta stamceller på cirka 1 vecka.
Abstract
Blodkärl distribueras allestädes närvarande i alla vävnader i kroppen och utför olika funktioner. Således är härledning av mogna vaskulära endotelceller, som leder blodkärlslumen, från humana pluripotenta stamceller avgörande för en mängd vävnadsteknik och regenereringsapplikationer. In vivo härleds primordiala endotelceller från den mesodermala härstamningen och specificeras mot specifika subtyper, inklusive arteriella, venösa, kapillära, hemogena och lymfatiska. Hemogena endotelceller är av särskilt intresse eftersom de under utvecklingen ger upphov till hematopoetiska stam- och stamceller, som sedan genererar alla blodlinjer under hela livet. Att skapa ett system för att generera hemogena endotelceller in vitro skulle således ge en möjlighet att studera endotelial till hematopoietisk övergång och kan leda till ex vivo-produktion av humana blodprodukter och minskat beroende av mänskliga givare. Medan det finns flera protokoll för härledning av stamceller och primordiala endotelceller, har generering av välkarakteriserade hemogena endotelceller från mänskliga stamceller inte beskrivits. Här presenteras en metod för härledning av hemogena endotelceller från mänskliga embryonala stamceller på cirka 1 vecka: ett differentieringsprotokoll med primitiva streckceller bildade som svar på GSK3β-hämmare (CHIR99021), sedan mesodermlinjeinduktion medierad av bFGF, följt av primordial endotelcellutveckling som främjas av BMP4 och VEGF-A, och slutligen hemogen endotelcellspecifikation inducerad av retinsyra. Detta protokoll ger en väldefinierad population av hemogena endotelceller som kan användas för att ytterligare förstå deras molekylära reglering och endotel-till-hematopoetiska övergång, som har potential att tillämpas på nedströms terapeutiska tillämpningar.
Introduction
Endotelceller (ECs) är en heterogen population av celler som utför flera funktioner i hela människokroppen och i konstruerade vävnader. Förutom att stödja och reglera andra celltyper (dvs. kardiomyocyter1, osteoblastiska celler2), innefattar dessa funktioner att bilda en selektiv barriär mellan blod och vävnader och hjälpa till med vävnadsbildning3. Differentiering av mogna ECs under normal utveckling kräver olika signalvägar. Primordiala ECs härrör från mesodermförfäder och specificeras sedan mot mogna arteriella, venösa, kapillär- och lymfatiska fenotyper4. Dessutom specificeras en liten delmängd av ECs i den extraembryoniska äggula sac och embryonala Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) -regionen för att bli hemogena ECs, vilket ger upphov till hematopoetiska stam- och stamceller (HSPC) som migrerar till fosterlever och fosterbenmärg, där de förblir postnatalt och genererar alla blodcellstyper under hela livet4. Det varierande utbudet av EG-fenotyper är avgörande för all vävnadsutveckling och underhåll.
Således är ECs och deras derivat kritiska komponenter i studier som syftar till att modellera och belysa mekanismer för mänsklig utveckling och / eller sjukdom, liksom regenerativ medicin och vävnadstekniska applikationer 5,6,7,8. Den största begränsningen för dessa typer av studier är dock bristen på tillgång till primära mänskliga ECs i den mängd som krävs. Det har uppskattats att minst 3 x 108 ECs skulle krävas för de flesta terapeutiska tillämpningar6. För att lösa detta problem har användningen av mänskliga embryonala stamceller (hESC) och humaninducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) föreslagits på grund av deras olika härstamningspotential och deras förmåga att generera ett stort antal avkomma 6,9.
Faktum är att användbarheten av celler som härrör från hESC eller hiPSC har visats i flera studier med fokus på sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening10,11,12. Organ-on-a-Chip (OOC) -teknik har använts för att mer troget rekapitulera människokroppens fysiologi genom att integrera celler och vävnader i tredimensionella byggnadsställningar. Dessutom kan anslutning av flera enskilda OOC (ett så kallat body- eller human-on-a-chip, BOC/HOC) åstadkommas via mikrofluidik för att möjliggöra överhörning mellan organenav intresse 13,14,15. Stödjande vävnader, såsom kärlen, är kritiska komponenter i OOC och BOC / HOC; Införlivande av vaskulatur möjliggör transport av näringsämnen, syre och parakrina faktorer genom vävnaderna, vilket främjar den nödvändiga vävnadsspecifika mikromiljön 3,12. Således är metoder för att härleda mogna mänskliga ECs, såsom arteriella, venösa, lymfatiska och hemogena ECs, avgörande för att främja dessa vävnadstekniska tillvägagångssätt.
Flera protokoll har publicerats som beskriver steg för härledning av humana primordiala eller stamfader-ECs från hESC eller hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Många av dessa protokoll förlitar sig på embryoidkroppsbildning (EB) eller samodling av ESC / iPSCs med ett murint matarskikt av stromaceller. Dessa strategier tenderar att vara svåra och tidskrävande, med låga EG-utbyten och/eller kontaminering av mänskliga EC med murina celler. Protokoll som förlitar sig strikt på 2D-odling utan användning av stromaceller kräver ofta långa induktioner, använder komplexa kombinationer av tillväxtfaktorer och / eller hämmare för induktion, har förlängda expansionsperioder efter cellseparation eller en kombination av dessa faktorer. Att öka kunskapen om signalvägar och faktorer som är involverade i härledningen av mogna EC-typer in vivo ger grunden för ett enkelt och robust in vitro-differentieringsprotokoll.
Tidigare identifierades nyckelroller för signalvägar för Notch och Retinoic Acid (RA) i specifikationen av murina arteriella respektive hemogena ECs under utvecklingen. Notch-signalvägen spelar flera roller i specifikationen och underhållet av den arteriella EG-fenotypen. Arbete med hjälp av murin retinal vaskulariseringsmodell identifierade en väg där vätskeskjuvspänning inducerar en Notch-Cx37-p27-signalaxel, vilket främjar G1-cellcykelstopp, vilket möjliggör arteriell EC-specifikation27. Cellcykeltillstånd har antagits spela en roll i cellödesbeslut genom att tillhandahålla distinkta fönster av möjligheter där celler är mottagliga för vissa signaler som kan inducera genuttryck och fenotypiska förändringar28. Denna Notch-medierade G1-arrestering möjliggjorde uttrycket av gener berikade i arteriella EC, inklusive ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 och Notch 4 (granskad i29,30). Det har också visats att hemogen EG-specifikation främjas in vivo via RA-signalering31,32. Ytterligare studier identifierade att, nedströms RA-signalering, uttryck av c-Kit och Notch upregulate p27, vilket möjliggör hemogen specifikation i murin äggula sac och AGM33. Murin hemogena ECs kan identifieras minimalt genom uttryck av både endotelial (dvs CD31, KDR) och hematopoetiska (dvs c-Kit, CD34) markörer4. Slutligen genomgår hemogena ECs en endotel-till-hematopoietisk övergång (EHT) för att bilda HSPC, vilket kan ge upphov till alla blodcellstyper 4,34,35.
Nyligen utfört arbete testat om samma signalhierarki kan främja human hemogen EG-specifikation. För att göra det utvecklades ett serum- och matarfritt 2D-odlingsprotokoll för att härleda hemogena EC från hESC, och dessa hemogena ECs karakteriserades på en enda cellnivå som CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45-. Denna studie utnyttjade också den fluorescerande Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) reporter, som identifierar olika cellcykeltillstånd, med hjälp av H9-hESC som uttrycker FUCCI-reporterkonstruktionen (H9-FUCCI-hESC)36. I studier med dessa celler visades det att RA främjar tidig G1-cellcykelstopp i ECs, och tidigt G1-tillstånd möjliggör hemogen specifikation in vitro37. Häri tillhandahålls ett detaljerat protokoll för differentiering av dessa humana hemogena endotelceller och analyser som bekräftar deras identitet. Denna enkla metod ger ett användbart sätt att generera denna specialiserade delmängd av ECs för framtida studier av mekanismer för utveckling av mänskliga blodkroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagenser och beredning av reagens
OBS: En lista över reagenser finns i materialförteckningen.
- Erhåll de mänskliga pluripotenta stamcellslinjerna: H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
OBS: Genereringen av hemogena ECs kan vara effektivare i H1-cellinjen. - Förbered matrisproteinlager: Alikvotera matrisproteinet i förkylda 1,5 ml rör (på is) så att varje rör innehåller 1 mg matrisprotein. 1 mg matrisprotein räcker för att belägga alla brunnar i två 6-brunnsplattor (totalt 12 brunnar). Förvara alikvoterna vid -20 °C tills de används.
OBS: Utför alla steg som involverar matrisprotein på is eller vid 4 °C. Tina den frysta injektionsflaskan med matrisprotein på is vid 4 °C över natten. När du har tinat, virvla injektionsflaskan för att säkerställa att innehållet blandas. Prechill 1,5 ml mikrocentrifugrör i minst 1 timme vid -20 °C och överför till is omedelbart före alikvotering. - Förbered matrisproteinbelagda plattor: Tina matrisproteinalikvoter på is vid 4 °C. Tillsätt 12,5 ml iskall DMEM:F12 till ett förkylt koniskt rör på is. Använd förkylda pipettspetsar, överför en alikvot (1 mg) matrisprotein till det koniska röret och blanda väl genom att pipettera upp och ner. Alikvot 1 ml av det utspädda matrisproteinet till varje brunn av förkylda 6-brunnsplattor (på is) med användning av en förkyld serologisk pipett. Virvla och gunga plattorna så att hela brunnen är jämnt belagd. Inkubera plattorna i minst 30 minuter vid rumstemperatur så att matrisproteinet stelnar. Slå in plattorna med parafilm och förvara vid 4 °C tills de används. Använd matrisproteinbelagda plattor inom 2 veckor efter beredningen.
OBS: Använd matrisproteinbelagda 6-brunnsplattor för rutinmässig passering av celler och differentiering till primordiala och hemogena endotelceller. Utför alla steg på is. Förkyl 6-brunnsplattor, pipettspetsar, serologiska pipetter och koniska rör före användning i minst 1 timme vid -20 °C. Överför dessa föremål till is när de är redo att användas. - Förbered basdifferentieringsmediet genom att tillsätta 5 ml PFHM till 100 ml pluripotent stamcellsdifferentieringsmedium. Förvaras vid 4 °C.
- Förbered 0,1% BSA-PBS genom att lösa upp 0,1 g BSA i 100 ml PBS. Filtrera sterilisera BSA-PBS genom att passera genom ett 0,22 μm filter och förvara vid 4 °C.
- Bered 5 mM HCl genom att späda ut stam HCl (12 M) 1:2 400 med vatten. Justera pH-värdet till 3,0 med NaOH. Filtrera lösningen genom att passera genom ett 0,22 μm filter och förvara vid 4 °C.
- Förbered bFGF-, BMP4-, VEGF-A-, retinsyra- (RA) och DLL4-aktier.
- bFGF: Rekonstituera det frystorkade pulvret till 100 μg / ml i 0,1% BSA-PBS. Alikvot och förvaras vid -20 °C. Använd bFGF-aktier inom 3 månader efter beredningen. Tina alikvoterna omedelbart före användning.
- BMP4: Rekonstituera det frystorkade pulvret till 1 mg/ml i 5mM HCl, pH 3,0. Späd ytterligare till 50 μg/ml i 0,1 % BSA-PBS. Alikvot och förvaras vid -20 °C. Använd BMP4-aktierna inom 3 månader efter beredningen. Tina alikvoterna omedelbart före användning.
- VEGF-A: Rekonstituera det frystorkade pulvret till 1 mg/ml i dH2O. Späd ytterligare till 100 μg/ml i 0,1 % BSA-PBS. Alikvot och förvaras vid -20 °C. Använd VEGF-A-bestånden inom 3 månader efter beredningen. Tina alikvoterna omedelbart före användning.
- RA: Rekonstituera det frystorkade pulvret till 100 mM i DMSO. Alikvot och förvaras vid -80 °C. Använd RA-lagren inom 1 månad efter beredningen. Tina alikvoterna omedelbart före användning.
OBS: Skydda RA-aktier från ljus. - DLL4: Rekonstituera det frystorkade pulvret till 1 mg/ml i PBS. Alikvot och förvaras vid -20 °C. Använd DLL4-aktierna inom 12 månader efter beredningen. Tina alikvoterna omedelbart före användning.
- Bered endotelcellsdifferentieringsmediet omedelbart före användning genom att späda VEGF-A och BMP4 i basdifferentieringsmedium (steg 1.4) så att de slutliga koncentrationerna blir 25 ng/ml respektive 50 ng/ml.
- Förbered den fungerande RA omedelbart före användning genom att späda 100 mM lager 1:1 000 i DMSO till 100 μM.
OBS: Skydda fungerande RA från ljus. - Bered det hemogena endotelcellsdifferentieringsmediet omedelbart före användning genom att späda ut VEGF-A, BMP4 och arbeta RA i basdifferentieringsmedium (steg 1.4) så att de slutliga koncentrationerna är 25 ng / ml, 50 ng / ml respektive 0,5 μM.
- Förbered antikroppsfärgningsbufferten genom att göra HBSS innehållande 10% FBS och komplettera med 1:500 utspätt antimikrobiellt reagens. Sterilt filtrera bufferten och använd omedelbart.
- Förbered cellsorteringsbufferten genom att göra HBSS innehållande 1% FBS och komplettera med 1:500 utspätt antimikrobiellt reagens. Sterilt filtrera bufferten och använd omedelbart.
- Bered 1 mg/ml fibronektinstammar genom att tillsätta 5 ml sterilt vatten till 5 mg frystorkat fibronektin. Alikvot och förvaras vid -20 °C. Använd fibronektinlagren före utgångsdatumet på den frystorkade produktetiketten. Tina alikvoterna omedelbart före användning.
- Förbered de fibronektinbelagda 35 mm-faten. Späd fibronektinstammarna (1 mg/ml) till 4 μg/ml i sterilt vatten. Tillsätt 1 ml av denna fibronektinbeläggningslösning till varje skål och inkubera vid 37 °C i 30 minuter till 1 timme. Använd diskarna omedelbart efter beläggningen.
- Bered 3 eller 4 ml alikvoter av metylcellulosabaserat medium enligt tillverkarens anvisningar. Förvara alikvoterna vid -20 °C tills de används. Använd de metylcellulosabaserade mediumalikvoterna före utgångsdatumet som anges på lagerproduktens etikett. Tina alikvoterna omedelbart före användning.
- Bered DLL4-beläggningslösningen genom att späda ut rekombinant humant DLL4-stam till en slutlig koncentration på 10 μg/ml i PBS.
- Förbered och förvara endotelcelltillväxtmediet enligt tillverkarens instruktioner.
- Förbered flödescytometrianalysbufferten genom att göra PBS innehållande 0,1% BSA. Sterilfiltrera bufferten och förvara vid 4 °C tills den används.
2. Cellodling och passering av hESC
- Låt matrisproteinbelagda plattor, stamcellstillväxtmedium och DMEM: F12 värmas till rumstemperatur.
- Odla hESC-cellinjerna i stamcellstillväxtmedium (2 ml/brunn) på matrisproteinbelagda 6-brunnsplattor i en 37 °C, 5%CO2-inkubator .
- Kontrollera cellerna dagligen och ta bort de differentierade cellerna efter behov genom att försiktigt skrapa dem från plattan med en p200-pipettspets.
OBS: Differentierade celler kommer att visas i periferin av kolonier. Se produkthandboken för stamcellstillväxtmedium för exempel på differentierade celler i odling. - Passera cellerna när de når 70% -80% sammanflöde. Utför följande steg för att passera celler.
OBS: Celler bör delas innan de når 70% -80% sammanflöde om ökad differentiering inträffar.- Ta bort mediet ovanför cellerna och tvätta försiktigt med 1 ml DMEM: F12 per brunn.
- Lägg till 1 ml DMEM: F12 per brunn.
- Tillsätt 160 μl/ml Dispase per brunn och inkubera cellerna vid 37 °C i en 5% CO2-inkubator i 45 minuter.
- Efter Dispase-inkubation, tillsätt ytterligare 1 ml DMEM: F12 per brunn och pipettera försiktigt för att lyfta cellerna.
OBS: Undvik att dissociera cellerna i en encellssuspension. Passera cellerna som små klumpar. - Överför cellerna till ett koniskt rör som innehåller 12 ml DMEM: F12 och låt cellerna sätta sig genom tyngdkraften (~ 5-10 min).
- Ta bort supernatanten och återsuspendera försiktigt pelleten i 0,5 ml stamcellstillväxtmedium per brunn av lyfta celler för att få små klumpar av celler.
OBS: Undvik att dissociera cellerna i en encellssuspension. Passera cellerna som små klumpar. - Aspirera matrisproteinbeläggningslösningen från brunnarna i den beredda matrisproteinbelagda plattan och tillsätt 1,5 ml av stamcellstillväxtmediet per brunn.
- Tillsätt önskad volym återsuspenderade celler (steg 2.4.6) till varje brunn på den beredda matrisproteinbelagda plattan.
- Inkubera plattan i en 37 °C, 5% CO 2-inkubator. Byt medium var 24: e timme till färskt stamcellstillväxtmedium.
3. Differentiering av hESC till primordiala endotelceller
- Dag -1: Odla och passera cellerna enligt beskrivningen ovan i avsnitt 2. Frö cellerna (steg 2.4.6) i små klumpar (~ 50 μm) med en densitet av cirka 2 klumpar per kvadratcentimeter38.
OBS: Utvärdera frödensiteten och förfina empiriskt vid behov. - Dag 0: 24 h efter sådd av cellerna, aspirera mediet från varje brunn och tvätta försiktigt cellerna med 1 ml DMEM: F12 per brunn. Tillsätt 1 ml av basdifferentieringsmediet innehållande 5 μM GSK3i (CHIR99021, tillsatt färskt) till varje brunn och inkubera i 24 timmar (37 °C, 5 %CO2).
OBS: För alla tvättsteg, tillsätt långsamt det angivna tvättmediet på plattan genom att pipettera mot plattans vägg. Virvla försiktigt plattan så att hela ytan på brunnen täcks av tvättmedia. Luta plattan något så att tvättmediet samlas klockan sex och försiktigt aspirera tvättmediet. - Dag 1: Aspirera mediet från varje brunn och tvätta försiktigt cellerna med 1 ml DMEM: F12 per brunn. Tillsätt 1 ml av basdifferentieringsmediet innehållande 50 ng/ml bFGF (tillsatt färskt, 1:2 000 från fryst lager) till varje brunn och inkubera 24 timmar (37 °C, 5 %CO2).
- Dag 2: Aspirera mediet från varje brunn och tvätta försiktigt cellerna med 1 ml DMEM: F12 per brunn. Tillsätt 1 ml av endotelcelldifferentieringsmediet till varje brunn och inkubera 24 timmar (37 °C, 5 %CO2).
- Dag 3: Byt ut mediet ovanför cellerna med 1 ml nyberedt endotelcellsdifferentieringsmedium per brunn och inkubera 24 timmar (37 °C, 5%CO2).
- Dag 4: Byt ut mediet ovanför cellerna med 1 ml nyberedt endotelcellsdifferentieringsmedium per brunn och inkubera 24 timmar (37 °C, 5%CO2).
- Dag 5: FACS renar cellerna för att bedöma EG-fenotyp (avsnitt 4-5) eller hålla i odling och differentiera mot hemogena endotelceller (avsnitt 6).
4. FACS-rening av primordiala endotelceller
- Aspirera mediet ovanför cellerna och tvätta försiktigt en gång med 1 ml DMEM: F12 per brunn.
- Tillsätt 1 ml cellavskiljningslösning per brunn och inkubera cellerna i 12 minuter i en 37 °C, 5 % CO2-inkubator eller tills cellerna har dissocierats.
- Överför de dissocierade cellerna till ett koniskt rör innehållande 12 ml DMEM: F12 och pellets genom centrifugering i 5 minuter, 1 000 x g.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera pelleten i 12 ml DMEM: F12 för att tvätta.
- Pelletera cellerna genom centrifugering i 5 min, 1 000 x g.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelleten i iskall antikroppsfärgningsbuffert och räkna cellerna. Justera koncentrationen med iskall antikroppsfärgningsbuffert till 1 x 105 celler/ml.
- Dela cellerna jämnt i mikrocentrifugrör på is, var och en innehållande minst 600 μL celler vid 1 x 105 celler/ml, för antikroppsfärgning.
OBS: Fyra rör med celler krävs för färgning av primordiala EC: ofärgad kontroll, CD31 enkel antikroppskontroll, CD45 enkel antikroppskontroll och prov som innehåller både CD31- och CD45-antikroppar. Information om antikroppar finns i materialförteckningen. - Tillsätt antikroppar till rören som innehåller celler, beroende på vad som är lämpligt, och inkubera på is och skyddas mot ljus i 30 minuter.
- Kontroll utan omsvep: Lägg inte till någon antikropp.
- CD31 enkel antikroppskontroll: Lägg endast till CD31-antikropp.
- CD45 enkel antikroppskontroll: Lägg endast till CD45-antikropp.
- Exempel: Lägg till både CD31- och CD45-antikroppar.
OBS: Den slutliga antikroppskoncentrationen i provet, liksom de fluorescerande konjugaten, bör optimeras baserat på de specifika antikroppar och cellsorterare som används.
- Pellera cellerna genom centrifugering i en 4 °C bordsmikrocentrifug i 5 minuter vid 1 000 x g.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera cellpelletsen i 600 μl iskall sorteringsbuffert.
- Sila proverna genom nätfilterlocken på 5 ml FACS-rör och förvara cellerna på is, skyddade från ljus, för omedelbar FACS.
- Hämta primordiala endotelceller (CD31 + CD45-), genom att utföra följande steg.
- Identifiera den CD45-negativa cellpopulationen och grinden (CD45-).
- Inom (CD45-), identifiera den CD31-positiva (CD31+) cellpopulationen och sortera celler i 6 ml iskall cellsorteringsbuffert. Använd dessa celler för nedströmsprogram (se avsnitt 5).
5. Analys för att bekräfta primordial endotelcellfenotyp
- Täck tre brunnar i en 6-brunnsplatta med 1 ml/brunn DLL4-beläggningslösning i 30 minuter i en 37 °C, 5% CO2-inkubator. Som en kontroll, mock-coat de andra tre brunnarna på plattan med 1 ml / brunn PBS.
- Aspirera DLL4-beläggningslösningen och PBS och plåta 25 000 sorterade primordiala endotelceller (se steg 4.12) i 2 ml endotelcelltillväxtmedium per brunn.
- Inkubera cellerna i 24 timmar i en 37 °C, 5% CO 2-inkubator.
- Aspirera mediet ovanför cellerna och tvätta en gång med 2 ml / brunn PBS. Analysera cellerna med qPCR eller flödescytometri (för celler som uttrycker FUCCI-konstruktionen).
- Utför följande steg för att analysera cellerna med qPCR.
- Aspirera vätskan ovanför cellerna och isolera RNA i cellerna med hjälp av ett RNA-extraktionssats enligt tillverkarens protokoll.
- Utför omvända transkriptionsreaktioner med en omvänd transkriptionsmastermix enligt tillverkarens protokoll.
- Utför qPCR-reaktioner med en SYBR Green-mastermix enligt tillverkarens protokoll.
OBS: Primers som används (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) listas i tabell 1.
- För att analysera celler som uttrycker FUCCI-konstruktionen genom flödescytometri, utför följande steg.
- Aspirera vätskan ovanför cellerna och tillsätt 500 μL/brunn 0,25% trypsin-EDTA.
- Inkubera cellerna vid 37 °C i en 5% CO 2-inkubator tills de lyfts, ~ 5 min.
- Överför cellerna till ett mikrocentrifugrör och pelletera cellerna i en 4 °C mikrocentrifug i 5 minuter vid 1 000 x g.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i 500 μL av iskall flödescytometrianalysbufferten.
- Sila proverna genom nätfilterlocket på ett 5 ml FACS-rör och förvara cellerna på is, skyddade från ljus, för omedelbar flödescytometrianalys.
- Analysera procentandelen celler pläterade på DLL4 jämfört med PBS-kontroll i tidig G1 (ingen färg), sen G1 (mCherry+/mVenus-), G1/S (mCherry+/mVenus+) och S/G2/M (mCherry-/mVenus+).
- Utför följande steg för att analysera cellerna med qPCR.
6. Differentiering av hESC till hemogena endotelceller
OBS: Differentiera cellerna till dag 4 primordiala ECs, som beskrivs ovan i avsnitt 3.1-3.6.
- Dag 5: Aspirera mediet ovanför cellerna och tvätta försiktigt cellerna med 1 ml DMEM: F12 per brunn. Tillsätt 1 ml nyberedt hemogent endotelcellsdifferentieringsmedium per brunn och inkubera 24 timmar (37 °C, 5%CO2).
- Dag 6: Byt ut mediet ovanför cellerna med 1 ml nyberedt hemogent endotelcellsdifferentieringsmedium per brunn och inkubera 24 timmar (37 °C, 5%CO2).
- Dag 7: Byt ut mediet ovanför cellerna med 1 ml nyberedt hemogent endotelcellsdifferentieringsmedium per brunn och inkubera 24 timmar (37 °C, 5%CO2).
- Dag 8: FACS isolerar hemogena endotelceller (se avsnitt 7).
7. FACS-isolering av hemogena endotelceller
- Lyft och tvätta cellerna enligt beskrivningen ovan i punkterna 4.1-4.6.
- Dela cellerna jämnt i mikrocentrifugrör på is, var och en innehållande minst 600 μL celler vid 1 x 105 celler/ml, för antikroppsfärgning.
OBS: Åtta rör av celler krävs för antikroppsfärgning av hemogena ECs: ofärgad kontroll, CD31 enkel antikroppskontroll, CD45 enda antikroppskontroll, KDR enda antikroppskontroll, c-Kit enkel antikroppskontroll, CD34 enkel antikroppskontroll, VE-cadherin enda antikroppskontroll och prov som innehåller alla sex antikropparna.
OBS: Antikroppsinformation finns i materialförteckningen. - Tillsätt antikroppar till rören som innehåller celler, beroende på vad som är lämpligt, och inkubera på is och skyddas mot ljus i 30 minuter.
- Kontroll utan omsvep: Lägg inte till antikropp.
- CD31 enkel antikroppskontroll: Lägg endast till CD31-antikropp.
- CD45 enkel antikroppskontroll: Lägg endast till CD45-antikropp.
- KDR enkel antikroppskontroll: Lägg endast till KDR-antikropp.
- c-Kit enkel antikroppskontroll: Lägg endast till c-Kit-antikropp.
- CD34 enkel antikroppskontroll: Lägg endast till CD34-antikropp.
- VE-cadherin enda antikroppskontroll: Lägg endast till VE-cadherinantikropp.
- Exempel: Lägg till CD31-, CD45-, KDR-, c-Kit-, CD34- och VE-cadherin-antikroppar.
OBS: Den slutliga antikroppskoncentrationen i provet, liksom de fluorescerande konjugaten, bör optimeras baserat på de specifika antikroppar och cellsorterare som används.
- Pellera cellerna genom centrifugering i en 4 °C mikrocentrifug i 5 minuter vid 1 000 x g.
- Ta bort supernatanten och återsuspendera pelletsen i 600 μl iskall sorteringsbuffert.
- Sila proverna genom nätfilterlocket på 5 ml FACS-rör och förvara cellerna på is, skyddade från ljus, för omedelbar FACS.
- För att erhålla hemogena endotelceller (CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45-), utför följande steg.
- Identifiera CD45-cellpopulationen och grinden (CD45-).
- Inom (CD45-), identifiera CD31+ cellpopulationen och grinden (CD31+).
- Inom (CD31+), identifiera VE-Cadherin-cellpopulationen och grinden (CDH5-).
- Inom (CDH5-), identifiera c-Kit+ cellpopulationen och grinden (KIT+).
- Inom (KIT+), identifiera CD34+ cellpopulationen och grinden (CD34+).
- Inom (CD34+), identifiera och sortera KDR+-cellerna i 6 ml iskall cellsorteringsbuffert. Använd dessa celler i underordnade program (se avsnitt 8).
8. Analys av kolonibildande enhet
- Tina alikvoterna av metylcellulosabaserat medium enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: En alikvot på 3 ml räcker för två prover och en alikvot på 4 ml räcker för tre prover. - Räkna de sorterade hemogena endotelcellerna som erhållits i steg 7.7.
- Följ tillverkarens instruktioner beräkna volymen sorterade celler som ska tillsättas till varje metylcellulosabaserad medium alikvot så att varje prov innehåller minst 1 000 hemogena endotelceller.
OBS: Antalet celler kan justeras efter behov. - Tillsätt den beräknade volymen celler till den metylcellulosabaserade mediumaliciteten alikvot och virvel noggrant. Låt de metylcellulosabaserade mediumkulturerna sitta i rumstemperatur i 10 minuter, eller tills bubblorna försvinner.
- Aspirera fibronektinbeläggningslösningen från de beredda 35 mm skålarna. Efter tillverkarens instruktioner, dispensera 1 ml metylcellulosabaserad mediumkultur per 35 mm skål. Rotera försiktigt skålen för att jämnt fördela kulturen.
- Placera dessa 35 mm skålar, samt ytterligare två 35 mm diskar fyllda med sterilt vatten, i en 15 cm vävnadsodlingsskål.
- Inkubera kulturerna i en 37 °C, 5% CO 2-inkubator och observera kulturerna dag 8 och 14.
- På dag 8, räkna CFU-E och BFU-E kolonier.
- På dag 14, räkna CFU-GM och CFU-GEMM kolonier.
OBS: Se manualen för metylcellulosabaserat medium för morfologisk identifiering av kolonityper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett schema som beskriver specifikationen för primordiala EC och hemogena EC från hESC, och en representativ bild av celler 24 timmar efter plätering visas i figur 1. Efter specifikation är primordiala ECs och hemogena ECs FACS-renade på dag 5 respektive 8. Primordial ECs definieras som CD31 + CD45- och hemogena ECs definieras som CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45-. En representativ flödescytometrisk grindstrategi för primordial EC och hemogen EG-rening visas i figur 2. Celler är initialt gated baserat på det negativa uttrycket av CD45 och positivt uttryck av CD31 för att erhålla renade primordiala ECs (Figur 2A). För att erhålla renade hemogena ECs är cellerna initialt gated som i figur 2A och renas sedan ytterligare baserat på positivt eller negativt uttryck av (i ordning) VE-Cadherin (CDH5), c-Kit (KIT), CD34 och KDR (Figur 2B).
För att bedöma potentialen hos H9-Fucci-hES-härledda primordiala CD31 + CD45-endotelceller, isolerade via FACS vid dag 5 av differentiering (protokollavsnitt 4), för att ge upphov till endotelsubtyper, sådds de renade cellerna på plattor belagda med antingen Notch-liganden DLL4 för att inducera arteriell specifikation, eller PBS (kontroll) och inkuberas i 24 timmar i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Cellerna lyseras sedan med RNA-lysbuffert, RNA extraheras och omvänd transkriberas till cDNA, och qPCR utförs för att jämföra genuttrycksnivåer i DLL4-behandlade kontra kontrollceller. Som förväntat har endotelceller som odlas på DLL4 ökat uttrycket av den Notch-responsiva genen HEY2, liksom de arteriellt associerade generna EFNB2, GJA5 och GJA4. Dessutom har dessa celler också minskat uttryck av den venösa transkriptionsfaktorn NR2F2 (figur 3A). Alternativt, för att bestämma effekten av DLL4-behandling på cellcykeltillstånd, inkuberas de FACS-renade CD31 + CD45-cellerna på plattor belagda med antingen DLL4 eller PBS i 24 timmar, lyfts och analyseras baserat på uttrycket av hCdt1 (30/120) -mCherry (sent G1) och hGem (1/110) -mVenus (S / G2 / M). I överensstämmelse med resultaten att Notch-signalering främjar sen G1-cellcykelstopp27, arresteras en större andel av primordiala ECs i slutet av G1 efter tillväxt i närvaro av DLL4, jämfört med kontrollceller (Figur 3B, C).
För att verifiera den hematopoetiska potentialen hos hemogena endotelceller frös CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45- endotelceller isolerade genom FACS (metoder i avsnitt 7) i ett metylcellulosabaserat medium formulerat för tillväxt av hematopoetiska stamceller i kolonibildande enhetsanalyser (CFU) och får växa i 14 dagar. CFU-E erytroidkolonier och blastbildande enhet (BFU)-E erytroidkolonier räknas på dag 8 (figur 4A,B), och CFU-GM granulocyt/makrofag och GFU-GEMM (granulocyt, erytroid, makrofag och megakaryocyt) multipotenta hematopoetiska stamkolonier räknas på dag 14 (figur 4C och D). Per 1 000 hemogena ECs pläterade genereras cirka 20 CFU (figur 4F). Celler med endotelcellmorfologi kan också ses i kulturerna (figur 4E); Dessa är de hemogena endotelcellerna som ger upphov till hematopoetiska stamfäder med flera linjer på en enda cellnivå37.
Figur 1: Protokoll för specifikation av primordiala och hemogena ECs . (A) Schematiskt diagram över differentieringsprotokollet. Embryonala stamceller pläteras dag -1 på matrisproteinbelagda plattor och får fästa över natten. Cellerna behandlas sedan på dag 0 och 1 med GSK3i-hämmare (CHIR99021) respektive bFGF för att inducera primitiv strimma respektive mesodermspecifikation. Från och med dag 2 behandlas cellerna med en kombination av BMP4 och VEGF-A för att främja primordial EC-utveckling. Primordial ECs (röd cirkel) är FACS-renade på dag 5. Alternativt, för att generera hemogena ECs, byts mediet ovanför de ursprungliga EC: erna på dag 5 till färskt hemogent differentieringsmedium innehållande BMP4, VEGF-A och RA. Detta medium ersätts dagligen fram till dag 8, då hemogena ECs (röd stjärna) är FACS-renade. (B) Kolonier på dag 0 av differentiering, skala bar = 100 μm. Panel A har modifierats från Qiu et al.37 med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: FACS-analys av hemogena ECs härledda från hESC. Representativ flödescytometrisk grindstrategi för rening av (A) primordiala ECs och (B) hemogena ECs. Observera att eftersom hemogena ECs härleds från primordiala ECs, är flödescytometri-gatingstrategin för CD45 och CD31 identisk för båda cellpopulationerna. På den översta raden i varje panel (prov) visas celler som differentierats till hemogena ECs enligt beskrivningen i protokollavsnitt 6 och färgats med antikroppar enligt beskrivningen i protokollavsnitt 7.3.8. I den nedre raden på varje panel (kontroll) visas ofärgade celler som differentierades i 8 dagar utan RA-behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: DLL4-induktion av H9-Fucci CD31 + CD45- primordiala endotelceller resulterar i sent G1-stopp och ökat arteriellt genuttryck. (A) DLL4-behandling av CD31 + CD45- H9-hESC- härledda primordiala endotelceller som uttrycker Fucci-konstruktionen renad vid dag 5 av differentiering resulterar i ökat uttryck av arteriella gener (i-iii) och Notch-responsiva genen Hey2 (v), som åtföljs av en samtidig minskning av uttrycket av den venösa genen NR2F2 (iv). (B) Representativa FACS-diagram som visar cellcykeltillståndsfördelningen för 5 000 H9-Fucci-härledda CD31 + CD45- odlade på PBS (kontroll) eller DLL4 i 24 timmar. (C) DLL4-induktion resulterar i en 15% ökning av celler i den sena G1-fasen jämfört med kontroll. Data är medelvärdet av tredubbla prover från samma experiment som visas i panel (B). Felstaplar indikerar standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Analys av hematopoetisk potential hos hemogena EC härledda från hESC. Representativa bilder som visar morfologi av H1-hESC-härledd (A) CFU-E erytroidkoloni (skalstång = 35 μm), (B) BFU-E erytroidkoloni (skalfält = 75 μm), (C) CFU-GM granulocyt / makrofagkoloni, (D) CFU-GEMM multipotent hematopoetisk stamkoloni och (E) CFU-GM granulocyt / makrofagkoloni med underliggande endotelceller (EC) (röda pilar). (F) Antal och fördelning av CFUs bildade per 1,000 pläterade hemogena endotelceller. Skalstreck = 100 μm in (C-E). Ytterligare bilder av CFU: er differentierade med hjälp av detta protokoll finns i Qiu et al.37. Panel F har modifierats från Qiu et al.37 med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Framåt | Omvända |
| EFNB2 | TATGCAGAACTGCGATTTCCAA | TGGGTATAGTACCAGTCCTTGTC |
| Ephb4 | CGCACCTACGAAGTGTGTGA | GTCCGCATCGCTCTCATAGTA |
| GJA5 | CCGTGGTAGGCAAGGTCTG | ATCACACCGGAAATCAGCCTG |
| GJA4 | ACACCCACCCTGGTCTAC | CACTGGCGACATAGGTGCC |
| HEJ2 | GCCCGCCCTTGTCAGTATC | CCAGGGTCGGTAAGGTTTATTG |
| NR2F2 | GGACCACATACGGATCTTCCAA | ACATCAGACAGACCACAGGCAT |
Tabell 1: information om qPCR-primer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Häri beskrivs stegen för att producera hemogena endotelceller från mänskliga embryonala stamceller på cirka 1 vecka med hjälp av ett murinmatar- och serumfritt 2D-odlingssystem (figur 1). Detta protokoll utökar en metod som beskrivs av Sriram et al. (2015) för att erhålla primordiala ECs38. Den ursprungliga karaktären och specifikationspotentialen hos CD31 + CD45-ECs demonstreras genom att odla dessa celler på DLL4-belagda plattor och observera genuttrycksförändringar som överensstämmer med arteriell specifikation (figur 3). Dessutom är förstärkningen av arteriell identitet associerad med sen G1-cellcykelstopp (figur 3), vilket överensstämmer med tidigare studier27. Efter odling av primordiala ECs i ytterligare 3 dagar i närvaro av 0,5 μM RA, 25 ng / ml BMP4 och 50 ng / mL VEGF-A, var det möjligt att generera och FACS-isolera hemogena ECs (Figur 2) som kan ge upphov till CFU-erytroid, BFU-erytroid, CFU-granulocyt / makrofag och CFU-granulocyt-, erytrocyt-, makrofag- och megakaryocytkolonier (Figur 4 ). Med hjälp av denna metod i en nyligen publicerad studie förändras genuttryck under en 8-dagars tidsperiod som överensstämmer med förlust av pluripotens, primitiv strimma och mesoderminduktion, förvärv av endotelcellidentitet och slutligen hematopoietisk identitet observerades37. Dessutom inducerade RA-behandling tidigt G1-cellcykelstopp för att möjliggöra hemogen EG-specifikation37.
(2019) beskrev nyligen ett protokoll för differentiering av hemogena ECs från hPSCs39. Protokollet som beskrivs ovan erbjuder emellertid betydande fördelar: 1) denna metod kräver inte bildning av sfäroider; 2) detta protokoll använder en standard 37 ° C, 5% CO 2-inkubator snarare än en hypoxisk inkubator, vilket eliminerar behovet av dedikerad specialutrustning; och 3) detta protokoll använder endast ett medium (pluripotent stamcellsdifferentieringsmedium kompletterat med PFHM), en kostnadsbesparande fördel, medan Ohta-protokollet kräver två medier för induktion. (2017) beskrev ett protokoll där CHIR99021-induktion användes för att generera en population av CD34+ hemogena endotelceller40. Dessa celler uttryckte också CD31 och kunde ge upphov till endotelceller när de odlades under monolagerförhållanden eller celler som uttrycker myeloida och lymfoida markörer efter samodling med OP9- respektive OP9-DLL4-celler i närvaro av ytterligare cytokiner. Kravet på ytterligare samodling kan leda till potentiell kontaminering av önskade cellpopulationer med murina celler. och Galat et al. använde en hemogen induktionsperiod som var kortare än den som beskrivs här (4 dagar respektive 5 dagar jämfört med 8 dagar), definierade båda hemogena ECs som CD34 +, medan detta protokoll använde en strängare definition: CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45- . Medan CD34 erkänns som en markör för hematopoetiska celler, uttrycks den också av andra icke-hematopoetiska celltyper, såsom mesenkymala stromaceller och endotelceller41. Definitionen av hemogena EC i detta protokoll (CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45-) är därför strängare och representerar en mer definierad population.
En begränsning för användningen av hESC eller hiPSC i terapeutiska tillämpningar är det stora antalet celler som krävs, och standard 2D-härledningsmetoder är främst begränsade till småskaliga differentieringar. (2018) demonstrerade möjligheten att skala upp produktionen av funktionella CD31 + ECs som uttryckte både arteriella (DLL4) och venösa (EPHB4) cellmarkörer som använde antingen suspensionskultur eller en omrörd tankbioreaktor6. Viktigt var att de visade att de kunde erhålla 1,18 x 107 CD31+ ECs som samuttrycker CD34 och KDR från en enda kolv som innehåller 20 ml suspensionskultur. För att erhålla de nödvändiga 3 x 108 ECs som krävs för de flesta terapeutiska tillämpningar skulle drygt två 500 ml kolvar krävas6. Framtida experiment bör utforska tillämpningen av skalningstekniker på det protokoll som presenteras här för storskalig produktion av hemogena ECs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författaren har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av NIH-bidragen HL128064 och U2EB017103. Ytterligare stöd gavs av CT Innovations 15-RMB-YALE-04-bidrag.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 cm dishes | Corning | 430599 | tissue culture treated |
| 35 mm dishes | Corning | 430165 | tissue culture treated |
| 6-well plates | Corning | 3516 | tissue culture treated |
| Antimicrobial reagent Brand Name: Normocin |
Invitrogen | ant-nr-1 | |
| bFGF | R&D systems | 233-FB-025 | use at 50 ng/mL |
| BMP4 | BioLegend | 595202 | use at 25 ng/mL |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-1 | |
| Cell Detatchment Solution Brand Name: Accutase |
Stemcell Technologies | 7920 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7913 | |
| DLL4 | R&D systems | 1506-D4/CF | recombinant human; use at 10 μg/mL |
| DMEM:F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Endothelial cell growth medium Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2) |
Lonza | CC-3162 | |
| FACS tubes | Corning | 352235 | polystyrene round bottom with filter cap |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33016015 | use at 4 μg/cm2 |
| GSK3i/CHIR99021 | Stemgent | 04-0004-02 | 10 mM stock; use at 5 μM |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175-095 | |
| Hydrochloric Acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Matrix protein Brand Name: Matrigel |
Corning | 356230 | Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein. |
| Methylcellulose-based medium Brand Name: MethoCult H4435 Enriched |
Stemcell Technologies | 4435 | |
| Pluripotent stem cell differentiation medium Brand Name: STEMdiff APEL 2 |
Stemcell Technologies | 5270 | |
| Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI | WiCell | WA09 (H9), WA01 (H1) | human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier's lab at Cambridge Stem Cell Institute |
| Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH) | Gibco | 12040077 | |
| Retinoic Acid | Sigma Aldrich | R2625-50mg | use at 0.5 μM |
| Reverse transcription master mix Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix |
BioRad | 1708840 | |
| RNA extraction kit Brand Name: RNeasy Mini Kit |
Qiagen | 74104 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | SS255-1 | |
| Stem cell growth medium Brand Name: mTeSR1 |
Stemcell Technologies | 85850 | |
| SYBR Green master mix Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix |
BioRad | 1725121 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25299956 | 0.25% |
| VEGF165 (VEGF-A) | PeproTech | 100-20 | use at 50 ng/mL |
| α-CD31-FITC | BioLegend | 303104 | 2 μg/mL* |
| α-CD34-Pacific Blue | BioLegend | 343512 | 2 μg/mL* |
| α-CD45-APC/Cy7 | BioLegend | 304014 | 2 μg/mL* |
| α-c-Kit-APC | BioLegend | 313206 | 2 μg/mL* |
| α-Flk-1-PE/Cy7 | BioLegend | 359911 | 2 μg/mL* |
| α-VE-Cadherin-PE | BioLegend | 348506 | 2 μg/mL* |
| * Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study. |
References
- Giacomelli, E., et al. Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells. Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).
- Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering. RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).
- Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems. MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).
- Gritz, E., Hirschi, K. K. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).
- Williams, I. M., Wu, J. C. Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).
- Olmer, R., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture. Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).
- Cossu, G., et al. Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine. The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
- Fox, I. J., et al. Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease. Science. 345 (6199), 1247391 (2014).
- Mahla, R. S. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).
- Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
- Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).
- Ramme, A. P., et al. Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip. Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).
- Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development. Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).
- Kane, N. M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).
- Costa, M., et al. Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization. Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).
- Nguyen, M. T. X., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).
- Ikuno, T., et al. Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP. PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).
- Aoki, H., et al. Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B. Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).
- Lian, X., et al. Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling. Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).
- Orlova, V. V., et al. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
- Kusuma, S., Gerecht, S. Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells. Human Embryonic Stem Cell Protocols. Turksen, K. , Humana Press. New York, NY. 213-222 (2014).
- Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions. Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).
- Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 10 (1), 200 (2019).
- Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -C. Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).
- Dalton, S. Linking the cell cycle to cell fate decisions. Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).
- Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics. Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).
- Rocha, S. F., Adams, R. H. Molecular differentiation and specialization of vascular beds. Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).
- Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis. Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).
- Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development. Cell. 155 (1), 215-227 (2013).
- Marcelo, K. L., et al. Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control. Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).
- Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. The molecular basis of endothelial cell plasticity. Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).
- Ottersbach, K. Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood. Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).
- Pauklin, S., Vallier, L. The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity. Cell. 155 (1), 135-147 (2013).
- Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification. Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).
- Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 261 (2015).
- Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).
- Galat, Y., et al. Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 67 (2017).
- Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors. Stem Cells. 32 (6), Dayton, Ohio. 1380-1389 (2014).
