Summary
Digital merknad med automatisert vevspredning gir en innovativ tilnærming til berikende svulst i tilfeller med lavt tumorinnhold og kan tilpasses både parafin- og frosne vevstyper. Den beskrevne arbeidsflyten forbedrer nøyaktigheten, reproduserbarheten og gjennomstrømningen og kan brukes på både forsknings- og kliniske innstillinger.
Abstract
Tumorberikelse i vev med lavt tumorinnhold, de under 20% tumorinnhold avhengig av metoden, er nødvendig for å generere kvalitetsdata reprodusert med mange nedstrømsanalyser som neste generasjons sekvensering. Automatisert vevspredning er en ny metodikk som automatiserer og forbedrer tumorberikelse i disse vanlige vevene med lavt tumorinnhold ved å redusere den brukeravhengige upresistensen av tradisjonell makro-disseksjon og tids-, kostnads- og kompetansebegrensninger for laserfangstmikrodisseksjon ved å bruke digital bildemerknadsoverlegg på unstained lysbilder. Her brukes digitale hematoksylin- og eosinmerknader (H&E) til å målrette mot små tumorområder ved hjelp av et blad som er 250 μm2 i diameter i unstained formalin fast paraffin innebygd (FFPE) eller friske frosne seksjoner opp til 20 μm i tykkelse for automatisert tumorberikelse før nukleinsyreutvinning og hele eksomsekvensering (WES). Automatisert disseksjon kan høste kommenterte regioner i vev med lavt tumorinnhold fra enkelt- eller flere seksjoner for nukleinsyreutvinning. Det gjør det også mulig å fange opp omfattende målinger før og etter høsting, samtidig som nøyaktighet, reproduserbarhet og økende gjennomstrømning forbedres med utnyttelse av færre lysbilder. Den beskrevne protokollen muliggjør digital merknad med automatisert disseksjon på dyr og/eller humant FFPE eller ferskt frossent vev med lavt tumorinnhold og kan også brukes til enhver interesseregion for å øke tilstrekkeligheten for nedstrøms sekvenseringsapplikasjoner i kliniske eller forskningsarbeidsflyter.
Introduction
Neste generasjons sekvensering (NGS) brukes i økende grad til både pasientbehandling og i kreftforskning for å veilede behandlinger og legge til rette for vitenskapelig oppdagelse. Vev er ofte begrenset og små prøver med variabelt tumorinnhold brukes rutinemessig. Tumor tilstrekkelighet og integritet er derfor fortsatt en barriere for å skaffe meningsfulle data. Prøver med lavere tumorprosenter kan forårsake vanskeligheter med å skille sanne varianter fra sekvenseringsartefakter og er ofte ikke kvalifisert for NGS1. Tumorberikelse av tilfeller med lavt tumorinnhold, de under 20%, har vist seg å bidra til å gi tilstrekkelig materiale for å generere reproduserbare sekvenseringsdata og sikre at lavfrekvente varianter ikke går glipp av 2,3. Grensene vil imidlertid variere avhengig av plattformene som brukes og planlagt bruk av dataene som genereres.
Tradisjonelt utføres berikelse av tumorregioner for ekstraksjon ved manuell makrodisseksjon eller laserfangstmikrodisseksjon (LCM) av formalinfaste parafin innebygde (FFPE) lysbilder. Manuell makrodisseksjon, eller skraping av spesifiserte vevsområder fra lysbilder, gjør at tumorregioner kan fjernes for bruk i nedstrømsanalyser med relativt lave kostnader, men med lav nøyaktighet og lav presisjon 2,4. Minimal teknisk nøyaktighet kan være svært effektiv med høyere tumorinnhold tilfeller der store svor av svulst er til stede og / eller minimalt vevstap påvirker ikke resultatene betydelig, men lav tumorinnhold tilfeller eller tilfeller med mer dispergert svulst krever økt presisjon. LCM ble derfor oppfunnet på 1990-tallet og ble en verdifull måte å nøyaktig fjerne små, definerte, mikroskopiske vevsregioner fra formalinfast parafin innebygd (FFPE) lysbilder 5,6,7,8. LCM kan brukes til å samle enkeltcellepopulasjoner når komplekse heterogenitet i utvalget eksisterer9, noe som gir mulighet for innsamling av tidligere vanskelige å skille cellepopulasjoner. LCM krever imidlertid kostbare maskiner som krever omfattende teknisk ekspertise og praktisk tid 10,11,12,13,14.
Instrumentet som brukes til automatisert vevs disseksjon har presisjon mellom LCM (~ 10 μm) og makrodesisseksjoner (~ 1 mm) 15. I tillegg viser den både kostnads- og tekniske kompetansekrav mellom makrodeseksjon og LCM og er designet for å utføre rask vevsberikelse fra sekvensielle FFPE-lysbilder for å lindre ulempene ved tidligere metoder15. Automatisert disseksjon på denne måten benytter digitale merknader eller lysbildereferansebildeoverlegg på seriell seksjonerte, ubeskårne vevslysbilder for dissekering og berikelse av interesseområder. Instrumentet bruker plastspinningsbladfresespisser, 1,5 ml oppsamlingsrør og kan brukes med en rekke forskjellige væsker for disseksjon for å samle interesseområder for nedstrømsanalyser inkludert nukleisk ekstraksjon og sekvensering. Den roterende plastfresespissen benytter indre og ytre sprøytefatreservoarer og et stempel for å samle buffer, deretter møller og samler vev16. Den variable fresespissens størrelsesdiameter (250 μm, 525 μm, 725 μm) kan tillate disseksjon av separate vevsområder for sammenligning, multifokale regioner som kan samles eller individuelle små områder fra enkle eller flere FFPE-lysbilder. Seksjonstykkelser som brukes til høsting kan justeres basert på individuelle eksperimentbehov, og brukere kan sikre at interesseområder ikke har blitt utarmet ved å utføre en ekstra H&E på en seriell seksjon umiddelbart etter den siste delen som brukes til høsting.
Automatisert disseksjon ble identifisert som en måte å berike tumorinnhold i tilfeller med lavt tumorinnhold, og vi testet og utvidet den tiltenkte funksjonaliteten til et automatisert vevs disseksjonsinstrument, som for tiden markedsføres for bruk på FFPE kliniske prøver opp til 10 μm i tykkelse. Arbeidet viser at automatisert disseksjon kan brukes på både FFPE og ferske frosne menneske- eller dyrevevsseksjoner opp til 20 μm i tykkelse for forskningsformål. Protokollen viser også en tilnærming til digitalt kommentering og automatiser disseksjon for tumorberikelse i vev med lavt tumorinnhold og/eller tilfeller med nestet, spredt svulst der meningsfull makrodisseksjon er utfordrende eller ikke mulig og viser både kvalitet og utbytte av nukleinsyre som er tilstrekkelig for NGS. Automatisert disseksjon kan derfor gi presisjon på mellomnivå og økt gjennomstrømning for tumorberikelse og kan også brukes til å berike andre interesseregioner eller kombinert med andre plattformer for å svare på forskning eller kliniske spørsmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Før oppstart, få passende vevsprøver i henhold til Institutional Review Board (IRB) protokoller. Alle metoder beskrevet her er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i Genentech, Inc.
1. Vev og glideforberedelse
- Velg FFPE eller ferske frosne vevsblokker og bruk den tilsvarende behandlingsmetoden nedenfor.
- Klipp vev blokk seksjoner på positivt ladet glass lysbilder på ønsket tykkelse. Del FFPE-vevet i bånd med den første referansedelen kuttet med en tykkelse som passer for H&E-farging (dvs. 4 μm) etterfulgt av 1-4 seksjoner med en tykkelse fra 4-20 μm basert på behov og vevstilgjengelighet. Samle vevsdelene på positivt ladede glassmikroskopsklier.
MERK: Ferske frosne referansevevsseksjoner bør farges umiddelbart med Hematoxylin og Eosin (H&E) ved hjelp av rutinemessige protokoller for frosne seksjoner og de uoppdagede frosne seksjonene som holdes ved -20 °C til de er nødvendige for høsting. - La alle FFPE-seksjonene tørke ved romtemperatur over natten.
- Stek FFPE-referanseskliene ved 60 °C i 30 minutter og flekk deretter med H&E ved hjelp av rutinemessige protokoller.
- Skann H&E-fargede lysbilder på en hel lysbildebilde ved 20x forstørrelse eller høyere.
- Kommenter de skannede lysbildebildene for tumorområder av interesse ved hjelp av en leverandør som leveres som visningsplattform eller visningsprogram med åpen kildekode. Eksporter disse merknadene som enten et skjermbilde med lav forstørrelse, eller lagre dem som en metadatafil som inneholder X-Y-pikselkoordinater som tilsvarer polygontoppunkt.
MERK: Førstnevnte er mindre teknisk utfordrende å jobbe med, men sistnevnte gir fordeler i prosessautomatisering. - Lag digitale masker av de kommenterte områdene av interesse i tråd med tilnærmingen som brukes, og eksporter de manuelle merknadene.
MERK: Hvis et skjermbilde / bilde av merknadene brukes, kan enkel bildebehandlingsprogramvare brukes til å velge en region og til å fylle ut hele utvalget. Bruk av X-Y-koordinater for hver avkastning krever bruk av et programmeringsspråk for å lese både bildedata og polygonkoordinater for å lage et bilde med lav mag med fylte områder av interesse. Brukeren bør samarbeide med leverandøren av det automatiserte disseksjonsinstrumentet for å etablere en prosess basert på deres individuelle programvaretilgjengelighet og behov. Hvis skanning, digital lysbildemerknad og/eller oppretting av digital maske ikke er tilgjengelig, kan forsiktig merknad på lysbildet ved hjelp av en markør utføres og brukes i stedet for en digital maske som referansebilde. Pseudokode for oppretting av digital maske er angitt i tilleggsfil 1.
2. Automatisert vev disseksjon
- Plasser de uoppdagede prøvevevslysbildene på scenen i første til fjerde lysbildeplassering når du bruker digital lysbildereferanse. Når du bruker merknader på lysbildet i stedet for et digitalt alternativ, plasserer du de ubeskytte prøvevevslysbildene på scenen i den andre til fjerde lysbildeplasseringen med et referanselysbilde i første posisjon.
- Opprett en fresejobb ved hjelp av den automatiserte vevsreditorprogramvaren: Jobbvalg > Opprett ny jobb > saks-ID > Navngi fresejobben. gå til Tykkelse > inndelingstykkelse ved hjelp av pil opp eller pil ned. Gå deretter til Tissue Preparation > Paraffinized eller Deparaffinized, Reference Image > From File > Import Image > File for å importere fra rullegardinmenyen som den digitale referansen, hvis aktuelt. Velg Fra stadium for referanse til scenelysbilde. Når feltene er fullført, skanner du fasen ved å velge Skann trinn-knappen nederst til høyre for å fange hvert prøvevevslysbilde i første til fjerde posisjon.
- Velg vevsområdet for bildeopptak.
- Hvis du bruker en referanse på scenen, drar du boksen fra ett hjørne til det motsatte for å opprette et rektangulært område over vev. Velg den sirkulære boblen under det rektangulære området for å ta opp scenereferansebildet. Hvis du bruker et digitalt referansebilde, legger du bildet over det merkede rektangulære området. Endre størrelse på og juster den digitale referansen grovt i kurszoom for best å samsvare med størrelsen og plasseringen over prøvevevet.
- Kopier dette rektangelfeltet til gjenstående prøvevevslysbilder fra andre til fjerde lysbilde ved å velge kopieringsalternativet øverst til høyre i referansebildet. Juster og endre størrelse grovt etter behov.
MERK: Når du bruker et referansebilde på lysbildet i stedet for en digital maske, velger du hvilket lysbilde på scenen som skal brukes som referanse.
- Justere referansen og eksempellysbildene
- Når referansebildet er grovt justert på vevsprøvelysbilder i alle lysbildeposisjoner, velger du Skann trinn-knappen nederst til høyre på skjermen for å gå inn i finjusteringstrinnet. Velg første faseplassering og transformeringsverktøyikon (det tredje ikonet nede på verktøylinjen til høyre) for å finjustere og zoome justeringer av referansen slik at de passer best til prøvelysbildeoverlegget. Bruk glidelinjen Referanse til eksempel nederst på skjermen til å veksle mellom referansebilde og eksempelbilde sammen med funksjonen Zoom inn og Zoom ut til å justere og oppnå justering av hver lysbildeplassering. Repliker denne prosessen i den andre til fjerde eksempellysbildeplasseringen.
- Velg freseområdet av interesseområde
- Når optimalt prøveoverlegg for hver av de fire lysbildeplasseringene er oppnådd, tegner du fresebanebetegnelser ved hjelp av fargevelgerverktøyikonet (det tiende ikonet nede på verktøylinjen til høyre) på den fargede delen av det maskerte referansebildet. Merk av for Utvid til lignende hvis flere lysbilder eller områder er kommentert for disseksjon, og velg deretter Hent merknad(er) -knappen nederst til høyre for å tegne fresebaner på eksempellysbilder.
- Velg fresebanen i den første lysbildeplasseringen.
MERK: Når fresebanen er valgt i første lysbildeposisjon, kopieres den til de gjenværende lysbildeposisjonene, og bruken av fresespissen beregnes. Fresespissens bruk i øvre venstre hjørne beregnes basert på området som dekkes og den valgte spissstørrelsen. Hvis mer enn fire tips beregnes, kan du velge en større tipsstørrelse for å fange opp den kommenterte avkastningen. Tipsstørrelsen kan velges eller endres på venstre side av skjermen under fresespisspilen , og tipsbruken beregnes på nytt. - Når fresebanen beregnes, samler du den kommenterte avkastningen med fire eller færre fresespisser. Velg Setup Stage-knappen nederst til høyre på skjermen for å be om lasting av fresetips fra plasserte oppsamlingsrør i riktig betegnelse på scenen.
- Fyll reservoaret med 3,0 ml av disseksjonsbufferen som passer best for vevstypen (FFPE eller ferskfrossen) og nedstrøms nukleinsyreutvinningssettbehov og velg Dissect-knappen nederst til høyre på skjermen. Bruk mineralolje av molekylær kvalitet eller en passende buffer fra kommersielt tilgjengelige nukleinsyreutvinningssett.
MERK: Automatisert disseksjon av lysbilder og utvalgte interesseområder begynner deretter, og prøver samles inn av instrumentet. Enhetshodet vil plukke opp fresespisser fra baksiden av scenen og fylle med disseksjonsvæske fra reservoaret. Tipsene snurrer deretter langs fresebanen og aspirerer prøvevev fra lysbilder til det er fullført eller fullt. Den innsamlede prøven med disseksjonsvæske dispenseres deretter i oppsamlingsrør som ligger på baksiden av scenen. - Når automatisert disseksjon er fullført, fjerner du oppsamlingsrørene og de dissekerte prøvelysene fra scenen og plasserer dem i henholdsvis et rørstativ og glidestativ.
MERK: Ferske frosne høstinger bør tas direkte inn i nukleinsyreutvinning i henhold til produsentens instruksjoner, og etter disseksjonen skal ferske frosne seksjoner tas umiddelbart ved hjelp av rutinemessige protokoller for frosne seksjoner. - Stek den post dissekerte vevssklier ved 60 °C i 30 minutter og flekk deretter med H&E ved hjelp av rutinemessige protokoller.
- Skann de postsedømte H&E-fargede lysbildene på en hel lysbildebilde ved 20x forstørrelse og/eller arkiv for å få en referanse til hvilket vev som ikke ble samlet inn og forblir på lysbildet.
MERK: Se trinn 1.5 ovenfor for alternative skannealternativer.
3. Nukleinsyre ekstraksjon
- Basseng og pellet vevet. Utfør nukleinsyreutvinningen ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett og følg produsentens instruksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FFPE og FF mus lever seksjoner som inneholder metastatisk kolorektal kreft i xenografts ble valgt. Seksjonene var H&E-farget (figur 1A, E, I) og skannet på en hel lysbildebilde ved 20x forstørrelse. En patolog digitalt kommenterte tumorregioner av interesse og en maske ble generert ved hjelp av kommersiell programvare og formatert som et digitalt png-referansebilde (Figur 1B, F, J). Serielle 10 μm og 20 μm tykke unstained prøve lysbilder ble plassert på scenen og automatisert disseksjon ble utført som beskrevet ovenfor. Ferskt frossent vev ble samlet inn i en lysisbuffer fra et kommersielt tilgjengelig sett og båret direkte inn i nukleinsyreutvinning i henhold til produsentens instruksjoner. FFPE-prøver ble samlet inn ved hjelp av mineralolje av molekylær klasse og dissekerte prøver ble samlet sammen og sentrifugert ved 25 000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Supernatanten ble fjernet og den minimale mineraloljen som kreves ble brukt til å resuspendere, overføre og samle det dissekerte vevet i et enkelt oppsamlingsrør for hver prøve på riktig måte. Prøver ble sendt ved romtemperatur til en leverandør for nukleinsyreutvinning, RNA og DNA-størrelse, mengde, integritet og renhetsbestemmelse i henhold til produsentens instruksjoner. Sekvenseringsbiblioteker ble opprettet og brukt til hybridisering og opptak med kommersielle alternativer i henhold til produsentens instruksjoner. Post dissekerte prøvelysbilder ble H&E farget ved hjelp av rutinemessige fargeprotokoller for å bekrefte disseksjonsområder på 10 μm (figur 1C, G, K) og 20 μm (figur 1D, H, L) lysbilder og disseksjonsmålinger ble fanget opp (supplerende tabell 1). Exome-sekvensering genererte omtrent 75 millioner 100 bp pardelte lesinger, noe som gir en gjennomsnittlig dybde på dekning (før du fjerner dupliserte lesninger) på 150x per prøve, med 99,9% lesing justert og en 78% on-target rate. RNA-sekvenseringsmålinger viste litt over 55 millioner bp-parkoblede avlesninger, en justeringshastighet på 98 % og en dupliseringsrate på 19,4 % med 77 % konkordanselesing.
Figur 1; Vellykket disseksjon av tumorreir fra fersk frossent og FFPE vev. H&E farget mus frisk frossen (A-D) og FFPE (E-L) levervev med kolorektal kreftmetastase. 4 μm referanselysbilder som brukes til digital merknad (A, E, I) demonstrerer eksempler med lav tumorprosent for det totale vevsområdet (I) og distribuerte tumorreir (E) som klassisk byr på utfordringer for tumorberikelse. Kommenterte og digitalt maskerte H&E-referanselysbilder (B, F, J) ble generert og post-disseksjon 10 μm (C, G, K) og 20 μm (D, H,L) H&E fargede lysbilder viser vellykket høsting av utvalgte områder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Pseudokode brukes til å lage digitale masker fra merknader som skal brukes i automatisert disseksjon. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell 1: Eksempel på registrerte beregninger fra automatisert disseksjon og nukleinsyreutvinning. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Presentert her er en protokoll for anvendelse av digital merknad og automatisert disseksjon for å dissekere tumorregioner fra lavt tumorinnhold FFPE eller ferskt frossent vev for tumorberikelse og bruk i WES. Ved å kombinere digital merknad og maskeoppretting med automatisert disseksjon reduserer den nødvendige praktiske tiden og ekspertisen som er felles for klassiske metoder for tumorberikelse, inkludert manuell makrodisseksjon og LCM, betydelig. Protokollen demonstrerer et potensielt viktig mellomtone tumorberikelsesalternativ som tillater ikke bare lav tumorinnholdsberikelse, men også berikelse i tilfeller der det er utfordrende å dissekere distribuerte tumorreir vekk fra svulsten ved siden av normalt vev for meningsfull tumorberikelse med høy gjennomstrømning og et moderat presisjonsnivå. Mens bruken av arbeidsflyten vår for lavt tumorinnhold xenograftvev er demonstrert her, ble det også funnet at denne protokollen fungerer på tvers av vevstyper, inkludert humant, murin og xenograft vev for en rekke normale vev og kreftindikasjoner.
Derfor kan det også gjelde et bredt spekter av applikasjoner der berikelse for bestemte interesseområder uten betydelig forurensning av bakgrunnsvev ville være gunstig (dvs. å berike for en bestemt hjerneregion) eller til og med for fjerning av vevsområder før nukleinsyreutvinning ved hjelp av klassisk makrodisseksjon.
Mange plattformer finnes på markedet for lysbildeskanning og digital merknad. Det er derfor viktig å være klar over at plattformkompatibilitet kan presentere begrensninger, og spesifiserte plattformer innenfor enhver protokoll er kanskje ikke allment tilgjengelig i alle laboratorier. Derfor ble det gjort betydelige anstrengelser for å gi alternative alternativer innenfor den beskrevne protokollen som vil veilede brukerne i å gjøre nødvendige endringer basert på deres tilgjengelige ressurser. Et alternativ for fjerning av den digitale merknadskomponenten er også notert for å tillate nøye manuell merknad på lysbildet. Alternativene for modifikasjoner vil maksimere brukernes evne til å finne et alternativ som fungerer med deres nåværende plattform og programvaretilgjengelighet.
Mens digital merknad og automatisert disseksjon har vist seg å være bredt anvendt på både FFPE og ferskt frossent vev, er det viktig å merke seg at grensene for det automatiserte vevs disseksjonsinstrumentet har blitt presset utover den tiltenkte bruken med FFPE-prøver, og protokollen er kun ment for forskningsbruk. Her ble vellykket tumorberikelse demonstrert gjennom automatisert tumor disseksjon av lavt tumorinnhold FFPE samt ferskt frossent vev for nukleinsyreutvinning, WES og RNA-sekvensering. Protokollen viser at xenograft og menneskelige vevsregioner av interesse kan berikes før WES- og RNA-sekvensering i grunnleggende og translasjonelle forskningsmiljøer, og bemerker også at andre nedstrøms molekylære applikasjoner, inkludert PCR, fra begge vevstyper ville være mulig. Protokollen utvider FFPE automatiserte disseksjonsalternativer og legger grunnlaget for fersk frossen vev automatisert disseksjon som kan utvikles og valideres videre for bruk i kliniske omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Charles A Havnar, Oliver Zill, Jeff Eastham, Jeffrey Hung, Jennifer Giltnane, Nicolas Lounsbury, Daniel Oreper, Sarajane Saturnio og Amy A Lo er ansatte og aksjonærer i Genentech og Roche og Mana Javey og Emmanuel Naouri er ansatte og aksjonærer i Roche.
Acknowledgments
Forfatterne vil takke Carmina Espiritu og Robin E. Taylor for deres støtte til automatisert disseksjonsutvikling samt Genentech Pathology Core Laboratory-ansatte som støttet dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al.
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al.
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).
