Summary
La anotación digital con disección automatizada de tejidos proporciona un enfoque innovador para enriquecer el tumor en casos de bajo contenido tumoral y es adaptable tanto a la parafina como a los tipos de tejido congelado. El flujo de trabajo descrito mejora la precisión, la reproducibilidad y el rendimiento y podría aplicarse tanto a la investigación como a los entornos clínicos.
Abstract
El enriquecimiento tumoral en tejidos de bajo contenido tumoral, aquellos por debajo del 20% de contenido tumoral dependiendo del método, es necesario para generar datos de calidad de manera reproducible con muchos ensayos posteriores, como la secuenciación de próxima generación. La disección automatizada de tejidos es una nueva metodología que automatiza y mejora el enriquecimiento tumoral en estos tejidos comunes y de bajo contenido tumoral al disminuir la imprecisión dependiente del usuario de la macrodisección tradicional y las limitaciones de tiempo, costo y experiencia de la microdisección de captura láser mediante el uso de superposición de anotación de imagen digital en diapositivas no teñidas. Aquí, las anotaciones digitales de hematoxilina y eosina (H&E) se utilizan para dirigirse a áreas tumorales pequeñas utilizando una cuchilla de 250 μm2 de diámetro en parafina fija de formalina no teñida incrustada (FFPE) o secciones frescas congeladas de hasta 20 μm de espesor para el enriquecimiento automatizado del tumor antes de la extracción de ácido nucleico y la secuenciación del exoma completo (WES). La disección automatizada puede cosechar regiones anotadas en tejidos de bajo contenido tumoral de secciones únicas o múltiples para la extracción de ácido nucleico. También permite la captura de extensas métricas de recolección antes y después de la cosecha, al tiempo que mejora la precisión, la reproducibilidad y aumenta el rendimiento con la utilización de menos diapositivas. El protocolo descrito permite la anotación digital con disección automatizada en FFPE animal y /o humano o tejidos frescos congelados con bajo contenido tumoral y también podría usarse para cualquier región de enriquecimiento de interés para aumentar la adecuación de las aplicaciones de secuenciación posterior en flujos de trabajo clínicos o de investigación.
Introduction
La secuenciación de próxima generación (NGS) se utiliza cada vez más tanto para la atención del paciente como en la investigación del cáncer para ayudar a guiar los tratamientos y facilitar el descubrimiento científico. El tejido a menudo es limitado y se usan muestras pequeñas con contenido tumoral variable de forma rutinaria. La adecuación y la integridad del tumor, por lo tanto, siguen siendo una barrera para obtener datos significativos. Las muestras con porcentajes tumorales más bajos pueden causar dificultad para distinguir las variantes verdaderas de los artefactos de secuenciación y, a menudo, no son elegibles para NGS1. Se ha demostrado que el enriquecimiento tumoral de casos de bajo contenido tumoral, aquellos por debajo del 20%, ayuda a producir material suficiente para generar datos de secuenciación reproducibles y garantizar que no se pierdan variantes de baja frecuencia 2,3. Sin embargo, los límites variarán dependiendo de las plataformas utilizadas y el uso planificado de los datos generados.
Tradicionalmente, el enriquecimiento de las regiones tumorales para la extracción se realiza mediante macrodisección manual o microdisección de captura láser (LCM) de portaobjetos incrustados de parafina fija de formalina (FFPE). La macrodisección manual, o raspado de áreas de tejido especificadas de diapositivas, permite extirpar regiones tumorales para su uso en ensayos posteriores con un costo relativamente bajo, pero con baja precisión y baja precisión 2,4. La precisión técnica mínima puede ser muy efectiva con casos de mayor contenido tumoral donde grandes franjas de tumor están presentes y / o la pérdida mínima de tejido no afecta significativamente los resultados, pero los casos de bajo contenido tumoral o los casos con tumores más dispersos requieren una mayor precisión. Por lo tanto, LCM se inventó en la década de 1990 y se convirtió en una forma valiosa de eliminar con precisión regiones pequeñas, definidas y microscópicas de tejido de las diapositivas de parafina fija incrustada en formalina (FFPE) 5,6,7,8. LCM se puede utilizar para recolectar poblaciones de células individuales cuando existe heterogeneidad compleja de la muestra9 que permite la recolección de poblaciones celulares previamente difíciles de separar. Sin embargo, LCM requiere maquinaria costosa que requiere una amplia experiencia técnica y tiempo práctico 10,11,12,13,14.
El instrumento utilizado para la disección automatizada de tejidos tiene una precisión entre la de LCM (~10 μm) y las macrodiseecciones (~1 mm)15. Además, exhibe requisitos de costo y experiencia técnica entre el de macrodisección y LCM y está diseñado para realizar un enriquecimiento rápido de tejidos a partir de diapositivas FFPE secuenciales para aliviar las desventajas de los métodos anteriores15. La disección automatizada de esta manera utiliza anotaciones digitales o superposiciones de imágenes de referencia de diapositivas en el escenario en diapositivas de tejido no teñidas en serie para diseccionar y enriquecer las regiones de interés. El instrumento utiliza puntas de fresado de cuchillas giratorias de plástico, tubos de recolección de 1,5 ml y se puede utilizar con una serie de fluidos diferentes para la disección para recolectar regiones de interés para ensayos aguas abajo, incluida la extracción y secuenciación nucleica. La punta de fresado de plástico giratorio utiliza depósitos de barril de jeringa internos y externos y un émbolo para recolectar tampón, luego muele y recolecta tejido16. El diámetro variable del tamaño de la punta de fresado (250 μm, 525 μm, 725 μm) puede permitir la disección de áreas de tejido separadas para la comparación, regiones multifocales que se pueden agrupar o áreas pequeñas individuales de portaobjetos FFPE individuales o múltiples. Los espesores de sección utilizados para la cosecha se pueden ajustar en función de las necesidades individuales del experimento y los usuarios pueden asegurarse de que las regiones de interés no se hayan agotado realizando un H&E adicional en una sección en serie inmediatamente después de la última sección utilizada para la cosecha.
La disección automatizada se identificó como una forma de enriquecer el contenido tumoral en casos de bajo contenido tumoral y probamos y ampliamos la funcionalidad prevista de un instrumento automatizado de disección de tejidos, que actualmente se comercializa para su uso en muestras clínicas FFPE de hasta 10 μm de espesor. El trabajo muestra que la disección automatizada se puede aplicar tanto a FFPE como a secciones de tejido humano o animal fresco congelado de hasta 20 μm de espesor con fines de investigación. El protocolo también demuestra un enfoque para anotar digitalmente y automatizar la disección para el enriquecimiento tumoral en tejidos con bajo contenido tumoral y / o casos con tumor anidado y disperso donde la macrodisección significativa es desafiante o no factible y muestra tanto la calidad como el rendimiento del ácido nucleico suficiente para NGS. Por lo tanto, la disección automatizada puede proporcionar precisión de nivel medio y un mayor rendimiento para el enriquecimiento tumoral y también podría aplicarse para enriquecer otras regiones de interés o combinarse con otras plataformas para responder preguntas clínicas o de investigación.
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Protocol
Antes del inicio, obtenga muestras de tejido apropiadas de acuerdo con los protocolos de la Junta de Revisión Institucional (IRB). Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Genentech, Inc.
1. Preparación de tejidos y diapositivas
- Seleccione FFPE o bloques de tejido fresco congelado y utilice el método de procesamiento correspondiente a continuación.
- Corte secciones de bloques de tejido en portaobjetos de vidrio cargados positivamente en el grosor deseado. Secciona en serie el tejido FFPE en cintas con la primera sección de referencia cortada a un grosor apropiado para la tinción H&E (es decir, 4 μm) seguido de 1-4 secciones a un grosor que oscila entre 4-20 μm según la necesidad y la disponibilidad del tejido. Recoja las secciones de tejido en portaobjetos de microscopio de vidrio cargados positivamente.
NOTA: Las secciones de tejido de referencia frescas congeladas deben teñirse inmediatamente con hematoxilina y eosina (H&E) utilizando protocolos de rutina para las secciones congeladas y las secciones congeladas no teñidas mantenidas a -20 ° C hasta que sean necesarias para la cosecha. - Deje que todas las secciones de FFPE se sequen a temperatura ambiente durante la noche.
- Hornea las diapositivas de referencia FFPE a 60 °C durante 30 min y luego tiñe con H&E utilizando protocolos de rutina.
- Escanee las diapositivas teñidas de H&E en un generador de imágenes de diapositivas completo con un aumento de 20x o más.
- Anote las imágenes de diapositivas escaneadas para las regiones tumorales de interés utilizando una plataforma de visualización proporcionada por el proveedor o un visor de código abierto. Exporte estas anotaciones como una captura de pantalla de bajo aumento o guárdelas como un archivo de metadatos que contenga coordenadas de píxeles X-Y correspondientes a vértices poligonales.
NOTA: El primero es menos difícil de trabajar técnicamente, pero el segundo ofrece ventajas en la automatización de procesos. - Cree máscaras digitales de las regiones anotadas de interés de acuerdo con el enfoque utilizado y exporte las anotaciones manuales.
NOTA: Si se utiliza una captura de pantalla / imagen de las anotaciones, se puede utilizar un software de procesamiento de imágenes simple para seleccionar una región y completar toda la selección. El uso de coordenadas X-Y para cada ROI requiere el uso de un lenguaje de programación para leer tanto los datos de la imagen como las coordenadas poligonales para crear una imagen de baja magnética con regiones de interés rellenadas. El usuario debe trabajar con el proveedor de instrumentos de disección automatizada para establecer un proceso basado en su disponibilidad y necesidades de software individuales. Si el escaneo, la anotación digital de diapositivas y/o la creación de máscaras digitales no están disponibles, se puede realizar una anotación cuidadosa en la diapositiva utilizando un marcador y usarla en lugar de una máscara digital como imagen de referencia. El pseudocódigo para la creación de máscaras digitales se ha proporcionado en el archivo complementario 1.
2. Disección automatizada de tejidos
- Coloque los portaobjetos de tejido de muestra no teñidos en el escenario en las posiciones de la primera a la cuarta diapositiva cuando utilice la referencia de diapositiva digital. Cuando utilice la anotación en la diapositiva en lugar de una opción digital, coloque las diapositivas de tejido de muestra no teñidas en el escenario en las posiciones de la segunda a la cuarta diapositiva con una diapositiva de referencia en la primera posición.
- Crear un trabajo de fresado utilizando el software automatizado de disección de tejidos: Selección de > Crear nuevo trabajo > ID de caso > Nombre del trabajo de fresado; vaya a Grosor > Grosor de sección con la pestaña de flecha hacia arriba o hacia abajo; luego vaya a Preparación de tejidos > Parafinado o Desparafinado, Imagen de referencia > Desde archivo > Importar imagen > Archivo para importar desde el menú desplegable como referencia digital, si corresponde. Seleccione Desde escenario para la referencia de diapositiva en el escenario. Cuando se completen los campos, escanee la etapa seleccionando el botón Etapa de exploración en la esquina inferior derecha para capturar cada diapositiva de tejido de muestra en la primera a la cuarta posición.
- Seleccione el área de tejido para la captura de imágenes.
- Si utiliza una referencia en el escenario, arrastre el cuadro de una esquina a la opuesta para crear un área rectangular sobre el tejido. Seleccione la burbuja circular debajo del área rectangular para capturar la imagen de referencia del escenario. Si utiliza una imagen de referencia digital, superponga la imagen en el área rectangular seleccionada. Cambie el tamaño y alinee la referencia digital de forma gruesa en el zoom del curso para que coincida mejor con el tamaño y la posición sobre el tejido de la muestra.
- Copie este campo rectangular en las diapositivas de tejido de muestra restantes en las posiciones de diapositiva segunda a cuarta seleccionando la opción de copia en la esquina superior derecha de la imagen de referencia. Alinee y cambie el tamaño según sea necesario.
NOTA: Cuando utilice una imagen de referencia en la diapositiva en lugar de una máscara digital, seleccione qué diapositiva del escenario debe utilizarse como referencia.
- Alinear las diapositivas de referencia y de muestra
- Cuando la imagen de referencia esté alineada de forma grosera en las diapositivas de muestra de tejido en todas las posiciones de la diapositiva, seleccione el botón Scan Stage en la esquina inferior derecha de la pantalla para pasar al paso de ajuste fino. Seleccione la posición de la primera etapa y el icono de la herramienta Transformar (el tercer icono hacia abajo en la barra de herramientas de la derecha) para realizar ajustes finos de alineación y zoom de la referencia para que coincida mejor con la superposición de diapositivas de muestra. Utilice la barra deslizante Referencia a muestra en la parte inferior de la pantalla alternando entre la imagen de referencia y la imagen de muestra junto con la función Acercar y alejar para ajustar y lograr la alineación de cada posición de diapositiva. Replique este proceso en las posiciones de diapositivas de la segunda a la cuarta muestra.
- Seleccione el área de molienda de la región de interés
- Una vez que se logre la superposición de muestra óptima de cada una de las cuatro posiciones de diapositiva, dibuje las designaciones de trazado de fresado utilizando el icono de la herramienta Selector de color (el décimo icono en la barra de herramientas de la derecha) en la parte coloreada de la imagen de referencia enmascarada. Seleccione el cuadro Extender a similar si se anotan varias diapositivas o áreas para la disección y, a continuación, seleccione el botón Obtener anotaciones en la parte inferior derecha para dibujar trazados de fresado en diapositivas de muestra.
- Seleccione la trayectoria de fresado en la primera posición de la diapositiva.
NOTA: Cuando se selecciona la ruta de fresado en la primera posición de la diapositiva, se copiará en las posiciones de la diapositiva restantes y se calculará el uso de la punta de fresado. El uso de la punta de fresado en la esquina superior izquierda se calcula en función del área cubierta y el tamaño de la punta seleccionada. Si se calculan más de cuatro puntas, se puede seleccionar un tamaño de punta más grande para capturar el ROI anotado. El tamaño de la punta se puede seleccionar o cambiar en el lado izquierdo de la pantalla debajo de la flecha Punta de fresado y se volverá a calcular el uso de la punta. - Cuando se calcule la ruta de fresado, recoja el ROI anotado con cuatro o menos puntas de fresado. Seleccione el botón Etapa de configuración en la parte inferior derecha de la pantalla para solicitar la carga de las puntas de fresado de los tubos de recolección colocados en su designación adecuada en el escenario.
- Llene el depósito con 3,0 ml del tampón de disección más apropiado para el tipo de tejido (FFPE o fresco congelado) y las necesidades del kit de extracción de ácido nucleico aguas abajo y seleccione el botón Diseccionar en la esquina inferior derecha de la pantalla. Utilice aceite mineral de grado molecular o un tampón apropiado de los kits de extracción de ácidos nucleicos disponibles comercialmente.
NOTA: La disección automatizada de diapositivas y regiones seleccionadas de interés comienza y el instrumento recoge muestras. El cabezal de la unidad recogerá las puntas de fresado de la parte posterior del escenario y se llenará con líquido de disección del depósito. Las puntas luego giran a lo largo de la trayectoria de fresado aspirando el tejido de la muestra desde las diapositivas hasta que esté completo o lleno. La muestra recolectada con líquido de disección se dispensa en tubos de recolección ubicados en la parte posterior del escenario. - Cuando se complete la disección automatizada, retire los tubos de recolección y los portaobjetos de muestras diseccionados del escenario y colóquelos en un bastidor de tubos y un bastidor deslizante, respectivamente.
NOTA: Las cosechas frescas congeladas deben tomarse directamente en la extracción de ácidos nucleicos según las instrucciones del fabricante y las secciones congeladas frescas posteriores a la disección deben teñirse inmediatamente utilizando protocolos de rutina para secciones congeladas. - Hornea los portaobjetos de tejido postdisecados a 60 °C durante 30 min y luego tiñe con H&E utilizando protocolos de rutina.
- Escanee las diapositivas teñidas de H&E diseccionadas en una imagen de diapositiva completa con un aumento de 20x y / o archivo para obtener una referencia de qué tejido no se recolectó y permanece en la diapositiva.
NOTA: Consulte el paso 1.5 anterior para ver las opciones de escaneo alternativas.
3. Extracción de ácidos nucleicos
- Agrupar y peletizar el tejido. Realice la extracción de ácido nucleico utilizando un kit disponible comercialmente y siguiendo las instrucciones del fabricante.
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Representative Results
Se seleccionaron las secciones hepáticas de ratón FFPE y FF que contenían cáncer colorrectal metastásico en xenoinjertos. Las secciones fueron teñidas de H&E (Figura 1A, E, I) y escaneadas en un generador de imágenes de diapositivas completa con un aumento de 20x. Un patólogo anotó digitalmente las regiones tumorales de interés y se generó una máscara utilizando software comercial y se formateó como una imagen de referencia png digital (Figura 1B, F, J). Se colocaron en el escenario portaobjetos de muestra no teñidos de 10 μm y 20 μm de espesor en serie y se realizó la disección automatizada como se describió anteriormente. Los tejidos frescos congelados se recogieron en un tampón de lisis de un kit disponible comercialmente y se llevaron directamente a la extracción de ácidos nucleicos siguiendo las instrucciones del fabricante. Las muestras de FFPE se recogieron utilizando aceite mineral de grado molecular y las muestras disecadas se agruparon y centrifugaron a 25.000 x g durante 20 min a 4 °C. Se eliminó el sobrenadante y se utilizó el aceite mineral mínimo requerido para resuspendir, transferir y recolectar el tejido diseccionado en un solo tubo de recolección para cada muestra de manera adecuada. Las muestras se enviaron a temperatura ambiente a un proveedor para la extracción de ácidos nucleicos, el tamaño del ARN y el ADN, la cantidad, la integridad y la determinación de la pureza siguiendo las instrucciones del fabricante. Las bibliotecas de secuenciación se crearon y utilizaron para la hibridación y la captura con opciones comerciales siguiendo las instrucciones del fabricante. Las diapositivas de muestra postsecadas se tiñeron de H&E utilizando protocolos de tinción de rutina para confirmar las áreas de disección en diapositivas de 10 μm (Figura 1C, G, K) y 20 μm (Figura 1D, H, L) y se capturaron métricas de disección (Tabla suplementaria 1). La secuenciación del exoma generó aproximadamente 75 millones de lecturas de extremo pareado de 100 pb, lo que produjo una profundidad promedio de cobertura (antes de eliminar lecturas duplicadas) de 150x por muestra, con un 99,9% de lecturas alineadas y una tasa de 78% en el objetivo. Las métricas de secuenciación de ARN demostraron poco más de 55 millones de lecturas de extremo pareado de pb, una tasa de alineación del 98% y una tasa de duplicación del 19,4% con lecturas concordantes del 77%.
Figura 1; Disección exitosa de nidos tumorales de tejido fresco congelado y FFPE. H&E tiñó tejido hepático de ratón fresco congelado (A-D) y FFPE (E-L) con metástasis de cáncer colorrectal. Las diapositivas de referencia de 4 μm utilizadas para la anotación digital (A, E, I) muestran ejemplos con un bajo porcentaje de tumores para el área total de tejido (I) y nidos tumorales distribuidos (E) que clásicamente presentan desafíos para el enriquecimiento tumoral. Se generaron diapositivas de referencia de H&E anotadas y enmascaradas digitalmente (B, F, J) y las diapositivas teñidas de H&E posteriores a la disección de 10 μm (C, G, K) y 20 μm (D, H, L) demuestran la cosecha exitosa de áreas seleccionadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: Pseudocódigo utilizado para crear máscaras digitales a partir de anotaciones para usar en disección automatizada. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla suplementaria 1: Ejemplo de métricas capturadas de disección automatizada y extracción de ácido nucleico. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Aquí se presenta un protocolo para la aplicación de anotación digital y disección automatizada para diseccionar regiones tumorales de FFPE de bajo contenido tumoral o tejidos frescos congelados para el enriquecimiento tumoral y su uso en WES. La combinación de anotación digital y creación de máscaras con disección automatizada reduce significativamente el tiempo práctico y la experiencia requeridos comunes a los métodos clásicos de enriquecimiento tumoral, incluida la macrodisección manual y la LCM. El protocolo demuestra una opción de enriquecimiento tumoral de rango medio potencialmente importante que permite no solo el enriquecimiento de bajo contenido tumoral, sino también el enriquecimiento en los casos en que es difícil diseccionar nidos tumorales distribuidos lejos del tejido normal adyacente al tumor para un enriquecimiento tumoral significativo con un alto rendimiento y un nivel moderado de precisión. Si bien el uso de nuestro flujo de trabajo para tejidos de xenoinjerto de bajo contenido tumoral se demuestra aquí, también se encontró que este protocolo funciona en todos los tipos de tejidos, incluidos los tejidos humanos, murinos y de xenoinjerto para una variedad de tejidos normales e indicaciones de cáncer.
Por lo tanto, también podría aplicarse a una amplia gama de aplicaciones en las que el enriquecimiento para regiones específicas de interés sin una contaminación significativa del tejido de fondo sería beneficioso (es decir, para enriquecer para una región específica del cerebro) o incluso para la eliminación de áreas de tejido antes de la extracción de ácido nucleico utilizando la macrodisección clásica.
Existen muchas plataformas en el mercado para el escaneo de diapositivas y la anotación digital. Por lo tanto, es importante ser consciente de que la compatibilidad de la plataforma puede presentar limitaciones y las plataformas especificadas dentro de cualquier protocolo pueden no estar ampliamente disponibles en todos los laboratorios. Por lo tanto, se hicieron esfuerzos significativos para proporcionar opciones alternativas dentro del protocolo descrito que guiarán a los usuarios a realizar las modificaciones necesarias en función de sus recursos disponibles. También se ha observado una opción para eliminar el componente de anotación digital para permitir una cuidadosa anotación manual en la diapositiva. Las opciones proporcionadas para las modificaciones maximizarán la capacidad de los usuarios para encontrar una opción que funcione con su plataforma actual y la disponibilidad de software.
Si bien se ha demostrado que la anotación digital y la disección automatizada se aplican ampliamente tanto a FFPE como a tejido fresco congelado, es importante tener en cuenta que los límites del instrumento automatizado de disección de tejidos se han ido más allá de su uso previsto con muestras de FFPE y el protocolo está destinado solo para uso de investigación. Aquí, se demostró un enriquecimiento tumoral exitoso a través de la disección tumoral automatizada de FFPE de bajo contenido tumoral, así como tejidos frescos congelados para la extracción de ácido nucleico, WES y secuenciación de ARN. El protocolo muestra que el xenoinjerto y las regiones de tejido humano de interés podrían enriquecerse antes de la secuenciación de WES y ARN en entornos de investigación básica y traslacional y también señalar que otras aplicaciones moleculares posteriores, incluida la PCR, de ambos tipos de tejidos serían posibles. El protocolo amplía las opciones de disección automatizada ffPE y sienta las bases para la disección automatizada de tejido fresco congelado que podría desarrollarse y validarse aún más para su uso en entornos clínicos.
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Disclosures
Charles A Havnar, Oliver Zill, Jeff Eastham, Jeffrey Hung, Jennifer Giltnane, Nicolas Lounsbury, Daniel Oreper, Sarajane Saturnio y Amy A Lo son empleados y accionistas de Genentech y Roche y Mana Javey y Emmanuel Naouri son empleados y accionistas de Roche.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Carmina Espiritu y Robin E. Taylor por su apoyo en el desarrollo de la disección automatizada, así como al personal del Genentech Pathology Core Laboratory que apoyó este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
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