Summary
Nous décrivons ici un système d’induction organoïde rétinienne optimisé, qui convient à diverses lignées de cellules souches pluripotentes humaines pour générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité et une efficacité élevées.
Abstract
Les maladies dégénératives de la rétine sont les principales causes de cécité irréversible sans traitement efficace. Les cellules souches pluripotentes qui ont le potentiel de se différencier en tous types de cellules rétiniennes, même les mini-tissus rétiniens, sont très prometteuses pour les patients atteints de ces maladies et offrent de nombreuses possibilités dans la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Cependant, le processus d’induction des CSEh aux cellules rétiniennes est compliqué et prend beaucoup de temps. Nous décrivons ici un protocole d’induction rétinienne optimisé pour générer des tissus rétiniens avec une reproductibilité et une efficacité élevées, adaptés à diverses cellules souches pluripotentes humaines. Ce protocole est réalisé sans ajout d’acide rétinoïque, ce qui profite à l’enrichissement des photorécepteurs coniques. L’avantage de ce protocole est la quantification de la taille EB et de la densité de placage pour améliorer considérablement l’efficacité et la répétabilité de l’induction rétinienne. Avec cette méthode, toutes les principales cellules rétiniennes apparaissent séquentiellement et récapitulent les principales étapes du développement rétinien. Il facilitera les applications en aval, telles que la modélisation des maladies et la thérapie cellulaire.
Introduction
Les maladies dégénératives de la rétine (MR), telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) et la rétinite pigmentaire (RP), sont caractérisées par le dysfonctionnement et la mort des cellules photoréceptrices et entraînent généralement une perte de vision irréversible sans moyens efficaces de guérir1. Le mécanisme sous-jacent à ces maladies est largement inconnu en partie en raison de l’absence de modèles de maladies humaines2. Au cours des dernières décennies, des progrès importants ont été réalisés en médecine régénérative grâce à la technologie des cellules souches. De nombreux chercheurs, y compris nous-mêmes, ont montré que les cellules souches pluripotentes humaines (CSEh), y compris les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSH), peuvent se différencier en tous types de cellules rétiniennes, même les mini-tissus rétiniens par diverses approches de différenciation3,4,5,6,7,8,9,10, 11, offrant un énorme potentiel dans la modélisation des maladies et la thérapie cellulaire12,13,14.
Cependant, le processus d’induction des CSEh aux cellules rétiniennes est très compliqué et prend beaucoup de temps avec une faible répétabilité, ce qui nécessite des chercheurs ayant une riche expérience et des compétences élevées. Au cours du processus d’induction complexe et dynamique, un certain nombre de facteurs auront un impact sur le rendement des tissus rétiniens15,16,17. En outre, les différentes méthodes d’induction varient souvent considérablement dans le temps et l’expression robuste des marqueurs rétiniens, ce qui pourrait confondre la collecte d’échantillons et l’interprétation des données3. Par conséquent, un protocole simple de différenciation rétinienne des CSEh avec un guidage étape par étape serait en demande.
Ici, sur la base de nos études publiées18,19,20,21, un protocole d’induction rétinienne optimisé pour générer des organoïdes rétiniens (RO) avec des photorécepteurs coniques riches à partir de CSEh est décrit, ce qui ne nécessite pas le supplément d’acide rétinoïque (RA). Ce protocole se concentre sur la description de la méthode en plusieurs étapes pour générer la rétine neurale et l’EPR. La formation d’EB est la partie essentielle du stade précoce de l’induction. La taille et la densité de placage des CE sont quantitativement optimisées, ce qui améliore scientifiquement le rendement des tissus rétiniens et favorise la répétabilité. Dans la deuxième partie de l’induction, les vésicules optiques (VE) s’auto-organisent dans la culture d’adhérence et les RO se forment dans la culture de suspension; les parcours temporels et les gains d’efficacité de cette partie varient considérablement selon les lignes hPSC. La maturation et la spécification des cellules rétiniennes dans les OR se produisent principalement au stade moyen et tardif de l’induction. Sans l’ajout de PR, des photorécepteurs matures avec des cônes et des bâtonnets riches peuvent être produits.
Le but de ce protocole est de décrire quantitativement et de détailler chaque étape pour les chercheurs inexpérimentés à répéter. Diverses lignées de hPSC ont été induites avec succès dans les RO par ce protocole avec un rendement robuste de tissus rétiniens riches en cônes et une répétabilité élevée. Les RO dérivés des HPSC avec ce protocole peuvent récapituler les principales étapes du développement rétinien in vivoet survivre à long terme, ce qui facilite les applications en aval, telles que la modélisation des maladies, le dépistage des médicaments et la thérapie cellulaire.
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Protocol
1. Culture et expansion des CSEh
- Culture HPSC
- Recouvrir deux puits d’une plaque de 6 puits avec matrice extracellulaire (ECM, matrice qualifiée hESC). Préparer 50 mL d’une solution ECM contenant 8-12 μg/mL d’ECM dans le milieu d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco. Dans 49 mL de DMEM, ajouter 1 mL de la solution mère ECM décongelée (50x). Ajouter 1 mL de la solution ECM à chaque puits d’une plaque de 6 puits. Incuber pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C et 5% deCO2.
- Préparez le support d’entretien hPSC (MM) conformément aux instructions du fabricant.
- Préchauffer MM à température ambiante (RT) pendant 30 min.
- Décongeler un flacon cryogénique de CSEh (hiPSC ou cSEh) (environ 1 x 106)d’un réservoir d’azote liquide par incubation dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 s.
- Sortez le flacon et désinfectez-le soigneusement à l’aide d’un spray d’alcool de désinfection à 75%. Mettez-le dans une armoire de biosécurité.
- Transférer la suspension de la cellule du flacon dans un tube de 15 mL, ajouter 5 mL de MM préchauffé goutte à goutte au tube à l’aide d’une pipette de 5 mL. Pendant ce temps, secouez doucement le tube pour mélanger les hPSCs .
- Centrifuger le tube à 170 x g pendant 5 min. Retirez soigneusement la majeure partie du surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL et laissez derrière vous environ 50 μL de surnageant pour éviter de perdre les cellules.
- Ajouter 1 mL de MM au tube et resuspendez la pastille en pipetant doucement de haut en bas une ou deux fois avec une pipette de 1 mL.
REMARQUE: La survie des cellules individuelles des CSEh est faible. Les amas de petites cellules avec 3 à 5 cellules sont préférés pour maintenir la croissance des CSEh en colonies. - Retirer l’ECM des puits pré-enduits (étape 1.1.1), ajouter 1,5 mL de MM à chaque puits, puis répartir 0,5 mL de suspension cellulaire par puits.
- Agiter doucement la plaque pour répartir uniformément les cSH, et mettre la plaque dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO2. Ne déplacez pas la plaque pendant au moins 24 h pour favoriser l’adhérence cellulaire.
- Changez MM tous les deux jours et passez les hPSC lorsque la confluence a atteint environ 80%.
- Passage des CSEh
REMARQUE: Le maintien de l’état indifférencié dans les HSPC est assez critique pour d’autres applications. Dans les conditions adhérentes, les CSEh poussent dans des colonies avec une frontière bien définie. Les cellules doivent être passées lorsque la confluence des CSEh atteint environ 80%.- Observez les cellules au microscope. Marquez et retirez mécaniquement les cellules différenciées clairement visibles (<5%) avant le passage.
- Préparez la plaque revêtue d’ECM comme décrit à l’étape 1.1.1.
- MM préchauffé et 1x solution saline tampon phosphate (PBS) sans Ca2+ et Mg2+ à RT.
- Préchauffer la solution d’EDTA de 0,5 mM (dans 1x PBS) au bain-marie à 37 °C.
- Retirer le milieu de la plaque de culture à l’aide d’un système d’aspiration sous vide, ajouter 1 mL de 1x PBS dans chaque puits pour laver les cellules à l’aide d’une pipette de 1 mL et répéter deux fois.
- Ajouter 1 mL de solution d’EDTA par puits pour dissocier les cSEh dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 5 min. Ne pas dépasser le temps d’incubation recommandé afin d’éviter la dissociation en cellules individuelles.
- Sortez la plaque et vérifiez le détachement des cellules au microscope. Les cSEh confluents se desserrent et chaque bordure cellulaire peut être vue, mais les cellules ne peuvent pas facilement se détacher en secouant doucement la plaque cellulaire.
- Retirer la solution d’EDTA à l’éventrion à l’éventrant d’une pipette de 1 mL et ajouter 1 mL de MM pour arrêter la dissociation. Pipettez doucement les hPSC une ou deux fois avec une pipette de 1 mL pour ressuspender les cellules. Il n’est pas nécessaire de centrifuger pour collecter les cellules.
REMARQUE: Si la plupart des cellules se détachent de la plaque après l’incubation avec EDTA, les cellules peuvent être collectées par centrifugeuse. - Retirer l’ECM des puits pré-enduits (étape 1.2.2) et ajouter 1,5 mL de MM par puits.
- Transférer 150 à 200 μL d’amas cellulaires à chaque puits. Généralement, les CSEh peuvent être adoptés dans un rapport de 1:6. Par exemple, les cellules d’un puits d’une plaque de 6 puits peuvent être distribuées à six nouveaux puits.
- Agitez doucement la plaque pour répartir uniformément les hPSC et culturez les hPSC dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant au moins 24 h sans toucher la plaque.
- Changez MM tous les deux jours comme décrit à l’étape 1.1.
2. Différenciation rétinienne des CSEh
REMARQUE: Lorsque les colonies atteignent ~ 80% de confluence(Figure 1B),elles peuvent être guidées pour se différencier en organoïdes rétiniens en suivant le protocole schématisé dans la Figure 1A. Pour vous assurer que les hPSC ont une haute qualité et un bon rendement, évaluez régulièrement la pluripotence avec des marqueurs moléculaires tels que OCT4 ou NANOG en utilisant IFC ou QPCR. Les HPSC doivent être éliminés si les cellules différenciées représentent plus de 5 % du total des cellules. Vérifiez la contamination par les mycoplasmes à l’ide d’un kit de détection des mycoplasmes conformément aux instructions du fabricant. Utilisez uniquement des CSEh sans mycoplasmes, car les mycoplasmes peuvent modifier la capacité de différenciation des CSEh.
- Préparer les supports et les réactifs
- Préparer le milieu d’induction neuronale (NIM) en mélangeant les éléments suivants : 500 mL de mélange modifié Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 mL de supplément de N2 à 1 %, 0,5 mL d’héparine à 0,1 % (2 mg/mL dans 1x PBS) et 5 mL d’acides aminés non essentiels (NEAA) à 1 % de MEM.
- Préparer un milieu de différenciation rétinienne (RDM) contenant 300 mL de DMEM/F-12, 200 mL de DMEM basique, 10 mL de supplément de B27 à 2 %, 5 mL d’antibiotique antimycotique à 1 % et 5 mL de NEAA MEM à 1 %.
REMARQUE: Nim et RDM ne sont pas filtrés, mais un test de stérilité est effectué. Sortir 1 mL de milieu et l’ajouter dans un plat de 35 mm, et mettre en culture pendant 3 à 7 jours dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Le support peut être stocké à 4 °C et doit être utilisé dans les 2 semaines pour assurer l’activité des composants. - Préparez 10 mM de blébbistatine (1 000x) en DMSO. Ajouter 1 710 μL de DMSO pour dissoudre 5 mg de blébbistatine pour obtenir 10 mM de solution mère (1 000x), aliquote à 10 μL/tube, et conserver à -20 °C.
REMARQUE: Tous les supports et réactifs doivent être réchauffés à RT pendant 30 minutes avant utilisation, sauf indication contraire.
- Formation du corps embryoïde (EB)
- Le jour 0 (J0), initiez la différenciation. Retirez un puits de cSEh d’une plaque de 6 puits, qui a atteint environ 80% de confluence. Prélever les cellules avec une solution de dissociation de l’EDTA comme décrit aux étapes 1.2.1 à 1.2.6.
- Retirer la solution d’EDTA, ajouter 1 mL de MM contenant 10 μM de blébbistatine pour arrêter la dissociation cellulaire et prélever les cellules avec une pipette de 1 mL. La taille des amas cellulaires est l’un des facteurs clés ayant un impact sur le rendement des CE. Environ cinq cellules par amas sont préférées pour produire la bonne taille d’ET sur D5 à D7.
REMARQUE: Il s’agit d’une étape clé. Ne pipettez pas les cellules trop souvent, car les agrégats de type EB sont difficiles à former à partir de cellules individuelles de CSEh. - Transférer la suspension cellulaire (environ 2 x 106 cellules) dans une boîte de Petri ultra-basse de 100 mm et ajouter 9 mL de MM contenant 10 μM de blébbistatine à la boîte.
- Agiter doucement le plat deux fois pour répartir uniformément les cellules, et mettre le plat dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2.
- Sur D1, après que les cellules ont été cultivées pendant au moins 24 heures, sortez le plat et observez-le au microscope. Un grand nombre d’agrégats de petites cellules seront formés spontanément à ce moment-là(Figure 1C).
- Préparer 12 mL de mélange avec MM et NIM à un rapport de 3:1 (9 mL de MM et 3 mL de NIM) dans un tube de 15 mL.
- Transférer les cultures cellulaires dans un tube centrifuge de 15 mL avec une pipette de 10 mL perpendiculairement, et ajouter 10 mL du mélange préchauffé à la boîte.
- Centrifuger le tube à 60 x g pendant 3 min pour recueillir les agrégats, retirer le surnageant à l’aide d’une pipette de 5 mL et laisser derrière lui environ 500 μL pour éviter de perdre des cellules.
- Ajouter 2 mL du mélange dans le tube et transférer la suspension dans le même plat (étape 2.2.7).
- Secouez doucement le plat pour répartir uniformément les agrégats cellulaires et remettez le plat dans l’incubateur.
- Sur D2, préparer 12 mL d’un nouveau mélange avec MM et NIM à un rapport de 1:1 (6 mL de MM et 6 mL de NIM) dans un tube de 15 mL. Changer le milieu cellulaire avec le mélange fraîchement préparé en répétant les étapes de 2.2.5 à 2.2.10.
- Sur D3, changez le milieu cellulaire avec 15 mL de NIM comme décrit ci-dessus. Culturez les cellules pendant au moins 5 jours dans les conditions de suspension.
REMARQUE: Pendant D1 à D3, le milieu doit être changé chaque jour, fournissant suffisamment de nutrition. Depuis D3, NIM peut être changé tous les deux jours. En outre, les AB peuvent être divisés en plusieurs plats pour fournir une nutrition abondante.
- Ensemencez les ABE
REMARQUE: Sur D5 à D7, choisissez un point de temps approprié pour plaquer les ET sur les plats revêtus d’ECM en fonction de la taille des ABE. Les CE d’un diamètre approximatif de 200 μm conviennent à la différenciation rétinienne. En général, un puits de CSEh dans une plaque de 6 puits peut produire environ 300 à 1 000 OE. La variation du rendement EB est variée par les lignes hPSC.- Sur D4, préparez des plats enrobés d’ECM pour la culture adhérente des ER. Ajouter 5 mL d’ECM à chaque boîte de culture tissulaire de 100 mm (traitée en surface) et les mettre dans l’incubateur pendant la nuit.
- Sur D5, retirez l’ECM des plats pré-enrobés et ajoutez 10 mL de NIM préchauffé à chaque plat.
- Sortez le plat contenant des OE. Vérifiez la qualité des ÉBs au microscope et assurez-vous qu’ils sont assez brillants et de forme ronde. La taille des CE est d’environ 200 μm de diamètre. Collectez tous les CE dans un tube de 15 mL. Transférer les OE des plats dans un tube de 15 mL avec une pipette de 5 mL. Laissez les ABE s’installer pendant 5 min. Retirez la majeure partie du surnageant, en laissant derrière vous environ 2 mL de milieu.
- Répartir les CE dans les plats enduits contenant 10 mL de NIM goutte à goutte avec une pipette de 1 mL. Ensemencez les OE à une densité d’environ 2-3 EBs par cm2. Par exemple, ajoutez environ 120 à 180 OE dans un plat de 100 mm. Pour juger approximativement du nombre EB, placez une goutte de suspension EB sur un couvercle et comptez le nombre d’EB sous le microscope.
REMARQUE: La densité de placage des EBs est l’un des facteurs clés ayant un impact sur l’efficacité de l’induction rétinienne. La densité peut également être ajustée par chaque ligne hPSC. - Secouez doucement la vaisselle pour répartir uniformément les BOULE. Mettez-les dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2.
REMARQUE: Ne déplacez pas les plats pendant au moins 24 heures pour améliorer l’adhérence des CE.
- Induction de vésicules optiques (VE) et d’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dans des conditions adhérentes
REMARQUE: Une fois que les CE sont ensemencés sur la surface revêtue d’ECM, les hPSC peuvent développer des structures de type OV, qui peuvent être observées dès D20 après différenciation. Dans ce protocole, des facteurs de croissance spécifiques ou des molécules de signalisation ne sont pas nécessaires pour guider les CSEh dans le devenir rétinien, à l’exception de l’ajout de suppléments de N2 et de B27 dans le milieu.- Sur D8-D9, retirez les paraboles et observez les ET au microscope. Tous les CE seront fixés et étalés sur les plats(Figure 1D). Ajouter 10 mL de NIM frais à chaque plat de 100 mm contenant 10 mL de vieux milieu. Remettez-les dans l’incubateur.
REMARQUE: Ne supprimez pas l’ancien support. - Sur D12, changer la moitié du milieu avec NIM à l’aide d’une pipette de 10 mL. Gardez la culture dans l’incubateur.
- Sur D16, retirez tous les NIM des plats à l’aide d’un système d’aspiration sous vide. Ajouter 20 mL de RDM à chaque plat. Continuez à cultiver en RDM et changez la moitié du support tous les deux jours.
- Au cours de D10-D30, observez les changements morphologiques des cellules deux fois par semaine au microscope et évaluez l’efficacité de la différenciation rétinienne.
REMARQUE: Depuis D10, les domaines du champ oculaire (EF) sont auto-organisés dans les zones périphériques des ABE adhérents. Les structures de type OV apparaissent entre D20 et D25, dépassent progressivement de la parabole et s’auto-forment une coupe optique, qui est entourée par le RPE pigmenté(Figure 1E). Les OV peuvent être facilement reconnus avec l’anneau NR lumineux, réfractif et épais.
- Sur D8-D9, retirez les paraboles et observez les ET au microscope. Tous les CE seront fixés et étalés sur les plats(Figure 1D). Ajouter 10 mL de NIM frais à chaque plat de 100 mm contenant 10 mL de vieux milieu. Remettez-les dans l’incubateur.
- Détacher et mettre en culture des OV et des EPR en suspension pour obtenir des organoïdes rétiniens (RO)
- Sur D28-D35, la plupart des OV apparaissent dans les plats. Utilisez une aiguille en tungstène ou une aiguille avec une seringue de 1 mL pour détacher mécaniquement les OV morphologiquement identifiables ainsi que l’EPR adjacent. Culturez-les en suspension.
REMARQUE: L’apparence et le rendement des OV et des EPR varient considérablement selon les lignes hPSC. Ainsi, le point temporel de détachement ov et RPE est flexible. Les OV évidents avec le RPE adjacent peuvent être détachés, puis déplacés vers une boîte de culture à faible attachement contenant du RDM. Continuez à cultiver le reste des cellules jusqu’à ce que tous les OV et EPR soient soulevés. - Placer 50 à 60 AV dans chaque boîte de culture à faible fixation de 100 mm contenant 15 mL de RDM pour la formation des RO (Figure 1F).
- Changez RDM tous les 2-3 jours jusqu’à D42, lorsque les DR sont bien ronds.
- Sur D28-D35, la plupart des OV apparaissent dans les plats. Utilisez une aiguille en tungstène ou une aiguille avec une seringue de 1 mL pour détacher mécaniquement les OV morphologiquement identifiables ainsi que l’EPR adjacent. Culturez-les en suspension.
3. Développement et maturation de la rétine
REMARQUE: Dans ce protocole, le sérum est nécessaire pour maintenir les OR à croître et à mûrir pour une culture à long terme.
-
Lamination rétinienne et spécification dans les RO
- Préparer 10 mL de taurine de 100 mM (1 000x) dans 1x PBS. Peser 125 mg de taurine et dissoudre dans 10 mL de 1x PBS. Filtrer la solution avec un filtre à seringue de 0,22 μm. Aliquote à 500 μL/tube et conserver à -20 °C.
- Préparer le milieu de culture rétinienne 1 (RC1). Mélanger les composants suivants : 250 mL de DMEM/F-12, 175 mL de DMEM basique, 50 mL de sérum bovin fœtal, 10 mL de supplément de B27 à 2 %, 5 mL d’antibiotique antimycotique à 1 %, 5 mL de NEAA MEM à 1 %, 0,5 mL de taurine 100 μM et 5 mL de L-alanyl-L-glutamine de 2 mM.
- Préparer le milieu de culture rétinienne 2 (RC2) contenant 450 mL de DMEM/F-12, 50 mL de sérum bovin fœtal, 5 mL de supplément de N2 à 1 %, 5 mL d’antimycotique antibiotique à 1 %, 0,5 mL de taurine à 100 μM, 5 mL de NEAA MEM à 1 % et 5 mL de L-alnyl-L-glutamine à 2 mM.
REMARQUE: Les RC1 et RC2 ne sont pas filtrés, mais subissent un test de stérilité. Retirer 1 mL de milieu, l’ajouter à un plat de 35 mm et le mettre en culture pendant 3 à 7 jours dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2,pour assurer la stérilité avant utilisation. Le milieu peut être conservé à 4 °C et doit être utilisé dans les 2 semaines pour assurer l’activité des composants. Tous les supports et réactifs doivent être préchauffés à RT pendant 30 minutes avant utilisation. - Sur D42, basculez le milieu de culture de RDM à RC1.
- Inclinez la vaisselle à environ 30° et laissez les GR s’installer pendant 30 s. Retirez l’ancien RDM avec une pipette de 10 mL laissant derrière lui environ 1 mL de milieu pour éviter de perdre des RO. Ajouter 15 mL de RC1 frais à chaque plat.
- Secouez doucement la vaisselle pour répartir uniformément les GR. Remettez la vaisselle dans l’incubateur. Changez l’ensemble du support deux fois par semaine par la suite.
- Pendant D50-D90, sélectionnez des R de haute qualité pour la culture à long terme, qui sont de forme ronde avec un NR épais et lumineux. Placez 30 à 40 RO dans un plat à fixation basse de 100 mm avec 20 mL de RC1 et changez le milieu entier deux fois par semaine.
- Pour la culture de suspension à long terme des RO, pipettez les RO pour éviter le rattachement RO-RO à l’aide d’une pipette. Transférez les RO vers de nouveaux plats de culture une fois par mois pour éviter que les RO ne collent à la surface des plats.
REMARQUE: Dans les conditions de culture en suspension, les RO sont de forme ronde, avec un anneau NR brillant et épais attaché avec plus ou moins de RPE d’un côté. La rétine neurale stratifiée se développe et des sous-types de cellules rétiniennes apparaissent séquentiellement avec des cellules ganglionnaires rétiniennes d’abord générées, suivies de cellules photoréceptrices, de cellules amacrines et de cellules bipolaires.
-
Maturation des photorécepteurs humains avec enrichissement des cônes dans les RO
- Après D90, basculez le milieu de RC1 à RC2, ce qui convient à la maturation des photorécepteurs.
- Modifiez le support comme décrit aux étapes 3.1.7 à 3.1.8.
REMARQUE: Dans cette condition de culture, les RO peuvent croître à long terme(Figure 1G),jusqu’à D300 testé. Les cellules rétiniennes dans les RO deviennent matures et tous les sous-types cellulaires de la rétine neurale, y compris les cellules gliales muller, les bâtonnets et les cônes, sont également acquis. Sans aucun ajout de PR, les photorécepteurs coniques sont également riches en OR.
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Representative Results
Le processus d’induction rétinienne dans ce protocole imite le développement de la rétine fœtale humaine. Pour initier la différenciation rétinienne, les CSEh ont été dissociés en petites touffes et cultivés en suspension pour induire la formation d’EBs. Sur D1, les agrégats cellulaires uniformes ou EBs se sont formés (Figure 1C). Le milieu de culture a été progressivement transféré en NIM. Sur D5, les ÉBs ont été plaqués sur les plats de culture enrobés d’ECM. Les cellules ont progressivement migré hors des CE (Figure 1D). À partir de D10, les champs oculaires s’auto-organisent dans la zone périphérique des É adhérents. Sur D16, le milieu d’induction a été remplacé par RDM. Par la suite, les domaines NR se sont progressivement formés, ont fait saillie de la parabole et ont auto-formé des structures de type OV entourées par les cellules RPE(Figure 1E). Au cours de la D28-D35, les OV ainsi que les EPR adjacents ont été soulevés avec une aiguille tranchante et cultivés en suspension. Dans les conditions de culture en suspension, les RO se sont auto-formés comprenant la rétine neurale (NR) attachée avec plus ou moins de sphère RPE d’un côté(Figure 1F)et pouvaient survivre et mûrir au fil du temps tant que des FBS étaient ajoutés au milieu.
Au fur et à mesure que la différenciation et la spécification rétiniennes progressaient, les CSEh produisaient tous les principaux sous-types de cellules rétiniennes de manière séquentielle. Les sous-types de rétine neurale se sont progressivement alignés en couches, imitant les caractéristiques architecturales de la rétine humaine native (Figure 2A-G). Les cellules ganglionnaires rétiniennes (CRG) ont d’abord été générées à partir de progéniteurs rétiniens et accumulées dans le côté basal des NR. Les cellules photoréceptrices situées dans le côté apical, tandis que les cellules amacrines, les cellules horizontales, les cellules bipolaires et les cellules gliales muller sont toutes situées dans la couche intermédiaire des NR.
Avec ce protocole, les RO se sont développés en photorécepteurs très matures avec des bâtonnets et des cônes(Figure 2G-I). Les photorécepteurs ont augmenté rapidement dans la couche nucléaire en développement(figure 2G)après la semaine 8 et ont progressivement mûri à partir de la semaine 17. À partir de la semaine 21, tous les sous-types de photorécepteurs, y compris les bâtonnets, les cônes rouges/verts et les cônes bleus, peuvent être détectés dans les RO. Des bâtonnets et des cônes riches peuvent être obtenus dans ce protocole d’induction sans aucune addition de PR tout au long du processus de différenciation.
Figure 1: Induction et caractéristiques morphologiques des organoïdes rétiniens à partir de CSEh. (A) Schémas de l’induction rétinienne à partir de CSEh. (B) Une colonie typique de CSH (10x). (C) ABE sur D1 (4x). (D) Sur D7, des EP plaqués ont été fixés et étalés sur les plats (4x). (E) Sur D25, les structures optiques ressemblant à des vésicules (OV) se sont formées et ont fait saillie du plat (indiqué par le cercle rouge), entourées d’EPR pigmentés (4x). (F) Les organoïdes rétiniens se sont auto-formés après que les OV ont été soulevés et cultivés dans des conditions de suspension (les flèches pointées NR et RPE (4x). (G) Organoïde rétinien comprenant NR (flèche rouge) et RPE (flèche noire) sur D180 (4x). Barres d’échelle = 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Des sous-types de cellules rétiniennes ont été détectés séquentiellement dans des tissus rétiniens tridimensionnels. Exemples d’images de principaux types de cellules rétiniennes exprimant des marqueurs spécifiques par coloration immunofluorescente. (A-B) Cellules progéniatrices rétiniennes exprimées Ki67(A)et VSX2(B). (C) Cellules ganglionnaires rétiniennes positives islet1 situées dans la partie basale de la rétine neurale. (D) Cellules amacrines positives pour AP2α. (E) Cellules gliales de Muller positives pour SOX9. (F) Cellules bipolaires PKCα positives. (G) Recoverin cellules photoréceptrices positives. (H) Photorécepteurs de bâtonnets positifs à la rhodopsine. (I) Photorécepteurs coniques positifs L/M-opsine. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans ce protocole d’induction rétinienne en plusieurs étapes, les CSEh ont été guidés étape par étape pour gagner le destin rétinien et auto-organisés en organoïdes rétiniens contenant des NR et des EPR stratifiés. Au cours de la différenciation, les CSEh ont récapitulé toutes les principales étapes du développement rétinien humain in vivo,de l’EF, de l’OV et de l’EPR à la stratification rétinienne, générant tous les sous-types de cellules rétiniennes, y compris les cellules ganglionnaires rétiniennes, les cellules amacrines, les cellules bipolaires, les photorécepteurs en bâtonnets et en cônes et les cellules gliales muller dans un ordre spatial et temporel. La récapitulation du développement rétinien bénéficierait à des applications en aval, telles que la modélisation des maladies rétiniennes.
Quelques protocoles ont été établis pour générer des organoïdes rétiniens à partir de CSH3,4,5,6,7,8,9,10,13,14,15,16,17,18,19,20 . Selon les conditions de culture, les protocoles peuvent être classés en 2D, 3D, et la combinaison de 2D et 3D approche9,13. Les approches 2D6,10,22 signifient que tout le processus d’induction se produit dans les conditions de culture adhérentes, générant des cellules rétiniennes sans architecture à partir de CSEh. En revanche, les approches 3D7,11,23 signifient que tout le processus d’induction est dans les conditions de culture en suspension, produisant des tissus rétiniens organisés. Par exemple, Sasai, Y. et al.7,24 ont rapporté une méthode SFEBq (culture flottante sans sérum d’agrégats de type corps embryoïde avec ré-agrégation rapide) pour guider les CSE à se différencier en coupes optiques en culture en suspension. En utilisant les approches 3D en plusieurs étapes8,11,18,20,25 incluant ce protocole, les CSEh ont été induits vers des destins rétiniens et des organoïdes dans des conditions de culture adhérente et de suspension.
Pour induire les CSEh au destin rétinien neural, une série de facteurs exogènes ont été ajoutés au milieu dans de nombreux protocoles. Par exemple, Lamba et al.26 ont ajouté une combinaison de noggin (un inhibiteur de la voie BMP) et de Dickkopf-1 (dkk1, un antagoniste de la voie de signalisation Wnt/β-caténine) et de facteur de croissance analogue à l’insuline-1 (IGF-1) pour diriger les CSE vers un destin neuronal antérieur. Osakada et al.6 ont ajouté dapt (un inhibiteur des voies de signalisation Notch) et le facteur de détermination gauche-droite A (un inhibiteur des voies de signalisation WNT) pour obtenir des précurseurs de photorécepteurs de bâtonnets et de cônes. Kuwahara et al.27 et Capowski et al.3 ont ajouté BMP4 pour une exposition brève et précoce de la culture de CSEh afin d’améliorer la production d’OV. En revanche, ce protocole d’induction rétinienne optimisé est simple et peu coûteux sans nécessiter de modulateurs de signalisation extrinsèques, à l’exception du supplément de base de N2 et B27.
L’acide rétinoïque (PR) joue un rôle important dans le développement de la rétine et la détermination des photorécepteurs28,29,30. La plupart des protocoles ont été développés avec le supplément de PR (0,5-1 μM) à certaines périodes. Nos études ont démontré qu’une concentration trop élevée de PR ou une trop longue période de traitement de la PR entraînent des photorécepteurs riches en bâtonnets mais inhibent la différenciation des cônes8,18. Cependant, dans ce protocole optimisé, la PR n’est pas ajoutée aux milieux de culture tout au long du processus de différenciation18, favorisant la production de photorécepteurs coniques, qui sont responsables de la vision quotidienne humaine et de la vision des couleurs et nécessaires au remplacement cellulaire du traitement RD. Bien que certaines études révèlent que la signalisation des hormones thyroïdiennes dirige les sous-types de cônes chez la souris et la rétine humaine31,32, le régulateur de l’engagement conique n’est toujours pas clair33. Dans ces études de Kim et al.34 et Lowe et al.35, la culture à long terme également sans acide rétinoïque exogène a généré des organoïdes rétiniens riches en cônes, ce qui est cohérent avec ce protocole optimisé.
Les points clés de ce protocole à saisir sont de fabriquer des CE de haute qualité et d’ensemencer les CE de manière appropriée. Les cellules se développent rapidement au début de la culture en suspension d’EB. Le milieu doit être changé tous les jours et être suffisant pour fournir une nutrition abondante. La taille des CE, d’environ 200 μm de diamètre, est appropriée pour la différenciation rétinienne. La densité de placage des EBs à 2-3 EBs par cm2 convient à la plupart des lignes hPSC. Le meilleur avantage de ce protocole optimisé est la quantification de la taille eb et de la densité de placage pour améliorer considérablement l’efficacité et la répétabilité de l’induction rétinienne. Nous avons clairement décrit toutes les étapes en détail, ce qui aide en grande partie les chercheurs inexpérimentés à apprendre et à répéter l’induction rétinienne.
En outre, l’efficacité de l’induction rétinienne dépend en grande partie de la qualité et de la puissance de différenciation des hPSC36,37. Différents hPSC ont des efficacités différentes. Certaines lignées hPSC ont en effet une faible efficacité, ce qui pourrait être dû aux méthodes de reprogrammation, aux cellules somatiques, etc. Il a été confirmé que ce protocole convient à divers hPSC pour obtenir des organoïdes rétiniens 3D et l’EPR, y compris divers CSEh et hiPSC reprogrammés à partir de fibroblastes, de sang et de cellules urinaires18,20,21. En général, avec ce protocole décrit ci-dessus, un puits de HPC (confluence d’environ 80%) dans une plaque de 6 puits peut générer environ 1 000 OE, ce qui donne environ 200 EO. Par conséquent, ce protocole à haute efficacité convient à la production à grande échelle d’organoïdes rétiniens et profite aux applications en aval, y compris l’étude de base et translationnelle.
En résumé, le protocole d’induction rétinienne optimisé est simple et peu coûteux avec une répétabilité et une efficacité élevées, offre des modèles personnalisés prometteurs de maladies de la rétine et fournit une source cellulaire abondante pour la thérapie cellulaire, le dépistage de médicaments et les tests de thérapie génique.
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Disclosures
Xiufeng Zhong est l’inventeur du brevet lié à la génération de cellules rétiniennes à partir de cellules souches pluripotentes humaines.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), le Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), le Science & Technology Project of Guangdong Province (2017B020230003), la Natural Science Foundation (NSF) de Chine (81570874, 81970842), le programme Cent talents de l’Université Sun Yat-sen (PT1001010) et les Fonds de recherche fondamentale du State Key Laboratory of Ophthalmology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
References
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