Summary
Här beskriver vi ett optimerat retinal organoid induktionssystem, som är lämpligt för olika mänskliga pluripotenta stamcellslinjer för att generera retinal vävnader med hög reproducerbarhet och effektivitet.
Abstract
Retinal degenerativa sjukdomar är de främsta orsakerna till irreversibel blindhet utan effektiv behandling. Pluripotenta stamceller som har potential att differentiera sig i alla typer av näthinneceller, även mini-retinal vävnader, håller enorma löften för patienter med dessa sjukdomar och många möjligheter i sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening. Induktionsprocessen från hPSCs till näthinneceller är dock komplicerad och tidskrävande. Här beskriver vi ett optimerat retinal induktionsprotokoll för att generera retinal vävnader med hög reproducerbarhet och effektivitet, lämplig för olika mänskliga pluripotenta stamceller. Detta protokoll utförs utan tillsats av retinsyra, vilket gynnar anrikning av konfotoreceptorer. Fördelen med detta protokoll är kvantifieringen av EB:s storlek och pläteringstäthet för att avsevärt öka effektiviteten och repeterbarheten hos näthinneinduktion. Med denna metod visas alla större näthinneceller sekventiellt och rekapitulera de viktigaste stegen för näthinneutveckling. Det kommer att underlätta nedströmsapplikationer, såsom sjukdomsmodellering och cellterapi.
Introduction
Retinala degenerativa sjukdomar (RDs), såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och retinitis pigmentosa (RP), kännetecknas av dysfunktion och död av fotoreceptorceller och leder vanligtvis till irreversibel synförlust utan effektiva sätt att bota1. Mekanismen bakom dessa sjukdomar är till stor del okänd delvis på grund av brist på mänskliga sjukdomar modeller2. Under de senaste decennierna har betydande framsteg gjorts inom regenerativ medicin genom stamcellsteknik. Många forskare, inklusive oss själva, har visat att mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs), inklusive mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), kan differentiera i alla typer av näthinneceller, även mini-retinal vävnader genom olika differentieringsmetoder3,4,5,6,7,8,9,10, 11, vilket ger stor potential i sjukdomsmodellering och cellterapi12,13,14.
Induktionsprocessen från hPSCs till näthinneceller är dock mycket komplicerad och tidskrävande med låg repeterbarhet, vilket kräver forskare med rik erfarenhet och hög kompetens. Under den komplexa och dynamiska induktionsprocessen kommer ett antal faktorer att påverka utbytet av näthinnevävnader15,16,17. Dessutom varierar olika induktionsmetoder ofta avsevärt i timing och robust uttryck för näthinnemarkörer, vilket kan förvirra provinsamlingen och datatolkningen3. Därför skulle ett enkelt protokoll om näthinnediimering från hPSCs med steg-för-steg-vägledning vara efterfrågat.
Här, baserat på våra publicerade studier18,19,20,21, beskrivs ett optimerat retinalinduktionsprotokoll för att generera retinalorganoider (ROs) med rika konfotoreceptorer från hPSCs, vilket inte kräver tillägg av retinsyra (RA). Detta protokoll fokuserar på beskrivningen av metoden i flera steg för att generera neural näthinna och RPE. EB-bildandet är den viktigaste delen av det tidiga induktionsstadiet. Både storleken och pläteringstätheten för EBs är kvantitativt optimerade, vilket vetenskapligt förbättrar utbytet av näthinnevävnader och främjar repeterbarhet. I den andra delen av induktionen organiserar optiska blåsor (OVs) själv i följsamhetskulturen och ROs bildas i suspensionskulturen; Tidskurserna och effektivitetsvinsterna i denna del varierar avsevärt i olika hPSC-linjer. Mognad och specifikation av näthinneceller i ROs förekommer huvudsakligen i mitten och sent skede av induktion. Utan tillägg av RA kan mogna fotoreceptorer med både rika koner och stavar produceras.
Syftet med detta protokoll är att kvantitativt beskriva och beskriva varje steg för oerfarna forskare att upprepa. Olika hPSC linjer har framgångsrikt inducerats till ROs genom detta protokoll med en robust avkastning av kon-rika näthinnan vävnader och hög repeterbarhet. HPSCs-härledda ROs med detta protokoll kan rekapitulera de viktigaste stegen för retinal utveckling in vivo, och överleva långsiktiga, vilket underlättar nedströms applikationer, såsom sjukdom modellering, läkemedelsscreening, och cellterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kultur och utvidgning av hPSCs
- HPSC-kultur
- Täck två brunnar av en 6-brunnsplatta med extracellulär matris (ECM, hESC-kvalificerad matris). Bered 50 ml ECM-lösning som innehåller 8-12 μg/ml ECM i Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM). Tillsätt 1 ml av den tinade ECM-stamlösningen (50x) i 49 ml DMEM. Tillsätt 1 ml ECM-lösning till varje brunn på en 6-brunnsplatta. Inkubera den i 1 timme i en inkubator vid 37 °C och 5 % CO2.
- Förbered hPSC-underhållsmedium (MM) enligt tillverkarens anvisningar.
- Förvärmd MM vid rumstemperatur (RT) i 30 min.
- Tina upp en kryogen injektionsflaska med hPSC (hiPSC eller hESC) (ca 1 x 106)från en flytande kvävetank genom inkubation i ett vattenbad vid 37 °C i 30 s.
- Ta ut injektionsflaskan och desinficera den försiktigt med en 75% desinfektionsalkoholspray. Lägg den i ett biosäkerhetsskåp.
- Överför cellfjädringen från injektionsflaskan till ett 15 ml-rör, tillsätt 5 ml förvärmd MM-droppe för droppe till röret med en 5 ml pipett. Skaka under tiden försiktigt röret för att blanda hPSCs .
- Centrifugera röret vid 170 x g i 5 min. Ta bort det mesta av supernatanten med en 1 ml pipett försiktigt och lämna kvar ca 50 μL supernatant för att undvika att förlora cellerna.
- Tillsätt 1 ml MM till röret och sätt tillbaka pelleten genom att försiktigt leda upp och ner en eller två gånger med en 1 ml pipett.
OBS: Överlevnaden av enstaka celler i hPSCs är låg. Små cell klumpar med 3-5 celler föredras för att hålla hPSCs växer i kolonier. - Ta bort ECM från de förbelagda brunnarna (steg 1.1.1), tillsätt 1,5 ml MM till varje brunn och fördela sedan 0,5 ml cellfjädring per brunn.
- Skaka försiktigt plattan för att fördela hPSCs jämnt och lägg plattan i en inkubator vid 37 °C och 5% CO2. Flytta inte plattan i minst 24 timmar för att främja cellens vidhäftning.
- Ändra MM varannan dag och passera hPSCs när sammanflödet har nått cirka 80%.
- Passa av hPSCs
OBS: Underhållet av det odifferentierade tillståndet i hPSCs är ganska kritiskt för ytterligare applikationer. Under de vidhäftande förhållandena växer hPSCs i kolonier med en väldefinierad gräns. Cellerna ska passeras när sammanflödet av hPSCs når ca 80%.- Observera cellerna under ett mikroskop. Markera och ta mekaniskt bort de tydligt synliga differentierade cellerna (<5%) före passaging.
- Bered den ECM-belagda plattan enligt beskrivningen i steg 1.1.1.
- Förvärmd MM och 1x fosfatbuffert saltlösning (PBS) utan Ca2+ och Mg2+ vid RT.
- Förvärm 0,5 mM EDTA-lösningen (i 1x PBS) i ett vattenbad vid 37 °C.
- Ta bort mediet från odlingsplattan med hjälp av ett vakuumambitionssystem, tillsätt 1 ml 1x PBS i varje brunn för att tvätta cellerna med en 1 ml pipett och upprepa två gånger.
- Tillsätt 1 ml EDTA-lösning per brunn för att skilja hPSC:erna åt i en cellkulturinkubator vid 37 °C och 5 % CO2 i 5 minuter. Överskrid inte den rekommenderade inkubationstiden för att undvika dissociation till enstaka celler.
- Ta ut plattan och kontrollera om cellerna är avlossade under ett mikroskop. De sammanflöde hPSCs lossnar och varje cellkant kan ses, men cellerna kan inte lätt lossna genom att försiktigt skaka cellplattan.
- Ta bort EDTA-lösningen med en 1 ml pipett och tillsätt 1 ml MM för att stoppa dissociationen. Pipettera försiktigt hPSCs en eller två gånger med en 1 ml pipett för att återanvända cellerna. Det finns ingen anledning att centrifugera för att samla cellerna.
OBS: Om de flesta cellerna lossnar från plattan efter inkubation med EDTA kan celler samlas in med centrifuger. - Ta bort ECM från de förbelagda brunnarna (steg 1.2.2) och tillsätt 1,5 ml MM per brunn.
- Överför 150-200 μL cellklumpar till varje brunn. I allmänhet kan hPSCs passeras med ett förhållande på 1:6. Till exempel kan celler från en brunn på en 6-brunnsplatta distribueras till sex nya brunnar.
- Skaka försiktigt plattan för att fördela hPSCs jämnt och odla hPSCs i inkubatorn vid 37 °C och 5% CO2 i minst 24 timmar utan att röra plattan.
- Byt MM varannan dag enligt beskrivningen i steg 1.1.
2. Retinal differentiering från hPSCs
OBS: När kolonierna når ~80% sammanflöde (Figur 1B), kan de styras för att differentieras till näthinneorganoider enligt det protokoll som schematiseras i figur 1A. För att säkerställa att hPSCs har hög kvalitet och bra utbyte, utvärdera regelbundet pluripotensen med molekylära markörer som OCT4 eller NANOG med IFC eller QPCR. HPSCs bör kasseras om differentierade celler står för mer än 5% av de totala cellerna. Kontrollera om mykoplasma kontaminering med ett mykoplasma detekteringskit enligt tillverkarens instruktioner. Använd endast mykoplasmafria hPSCs eftersom mykoplasma kan ändra differentieringsförmågan hos hPSCs.
- Förbereda media och reagenser
- Förbered neuralt induktionsmedium (NIM) genom att blanda följande: 500 ml av Dulbeccos modifierade örnmedel/näringsblandning F-12 (DMEM/F-12, 1:1), 5 ml 1% N2 tillägg, 0,5 ml 0,1% heparin (2 mg/ml i 1x PBS) och 5 ml 1% MEM icke-essentiella aminosyror (NEAA).
- Förbered retinal differentiering medium (RDM) som innehåller 300 ml DMEM/F-12, 200 ml DMEM basic, 10 ml 2% B27 tillägg, 5 mL 1% antibiotiska antimykotiska och 5 ml 1% MEM NEAA.
OBS: Både NIM och RDM filtreras inte men ett sterilitetstest utförs. Ta ut 1 ml medium och tillsätt det i en 35 mm skål och kultur i 3-7 dagar i en inkubator vid 37 °C och 5% CO2. Mediet kan förvaras vid 4 °C och bör användas inom 2 veckor för att säkerställa komponenternas aktivitet. - Förbered 10 mM Blebbistatin (1000x) i DMSO. Tillsätt 1 710 μL DMSO för att lösa upp 5 mg Blebbistatin för att erhålla 10 mM stamlösning (1 000x), alikvot vid 10 μL/rör och förvara vid -20 °C.
OBS: Alla media och reagenser ska värmas på RT i 30 minuter före användning, om inget annat anges.
- Embryoidkropp (EB) bildande
- På dag 0 (D0), initiera differentiering. Ta ut en brunn av hPSCs från en 6-brunnsplatta, som har vuxit till ~ 80% sammanflöde. Samla cellerna med EDTA-dissociationslösning enligt beskrivningen i steg 1.2.1 till 1.2.6.
- Ta bort EDTA-lösningen, tillsätt 1 ml MM som innehåller 10 μM Blebbistatin för att stoppa celldisorienteringen och samla cellerna med en 1 ml pipett. Storleken på cellklumpar är en av de viktigaste faktorerna som påverkar avkastningen av EBs. Ungefär fem celler per klump föredras för att producera rätt storlek på EBs på D5 till D7.
Obs: Detta är ett viktigt steg. Pipettera inte cellerna för många gånger eftersom EB-liknande aggregat är svåra att bilda från enstaka celler i hPSCs. - Överför cellfjädringen (ca 2 x 106 celler) till en 100 mm ultralåg petriskål och tillsätt 9 ml MM innehållande 10 μM Blebbistatin till skålen.
- Skaka försiktigt skålen två gånger för att fördela cellerna jämnt och lägg skålen i inkubatorn vid 37 °C och 5 % CO2.
- På D1, efter att cellerna odlats i minst 24 timmar, ta ut skålen och observera den under mikroskopet. Ett stort antal av de små cellaggregaten kommer att bildas spontant vid denna tidpunkt (Figur 1C).
- Förbered 12 ml blandning med MM och NIM med ett 3:1-förhållande (9 ml MM och 3 ml NIM) i ett 15 ml-rör.
- Överför cellkulturerna till ett 15 ml centrifugeringsrör med en 10 ml pipett vinkelrätt och tillsätt 10 ml av den förvärmda blandningen till skålen.
- Centrifugera röret vid 60 x g i 3 minuter för att samla in aggregaten, ta bort supernatanten med en 5 ml pipett och lämna kvar ca 500 μL för att undvika att förlora celler.
- Tillsätt 2 ml av blandningen i röret och överför suspensionen till samma maträtt (steg 2.2.7).
- Skaka försiktigt skålen för att fördela cellaggregaten jämnt och lägg tillbaka skålen i inkubatorn.
- På D2, förbered 12 ml av en ny blandning med MM och NIM med ett 1:1-förhållande (6 ml MM och 6 ml NIM) i ett 15 ml-rör. Byt cellmedium med den färska beredda blandningen genom att upprepa stegen från 2.2.5 till 2.2.10.
- På D3, byt cellmedel med 15 ml NIM enligt beskrivningen ovan. Odla cellerna i minst 5 dagar under suspensionsförhållandena.
OBS: Under D1 till D3 bör mediet ändras varje dag, vilket ger tillräckligt med näring. Sedan D3 kan NIM ändras varannan dag. Dessutom kan EBs delas in i flera rätter för att ge riklig näring.
- Sådd av EB
OBS: På D5 till D7 väljer du en lämplig tidpunkt för att plätera de europeiska centralbankerna på ecm-belagda rätter beroende på storleken på EBs. EBs med en ungefärlig diameter på 200 μm är lämplig för retinal differentiering. I allmänhet kan en brunn av hPSCs i en 6-brunnsplatta producera cirka 300 till 1 000 EBs. Variationen av EB-avkastningen varierar beroende på hPSC-linjerna.- På D4, förbered ECM-belagda rätter för EBs vidhäftande kultur. Tillsätt 5 ml ECM till varje 100 mm vävnadskulturrätt (ytbehandlad) och lägg dem i inkubatorn över natten.
- På D5, ta bort ECM från de förbelagda diskarna och tillsätt 10 ml förvärmd NIM till varje maträtt.
- Ta ut skålen som innehåller EBs. Kontrollera kvaliteten på EB under mikroskopet och se till att de är ganska ljusa och runda i form. Storleken på EBs är ungefär 200 μm i diameter. Samla alla EBs i ett 15 ml rör. Överför EBs från disken till ett 15 ml rör med en 5 ml pipett. Låt EBs slå sig ner i 5 minuter. Ta bort det mesta av supernaten och lämna efter sig ca 2 ml medium.
- Fördela EBs i de belagda rätterna som innehåller 10 ml NIM droppe för droppe med en 1 ml pipett. Kärna ur DE EB:erna med en densitet på cirka 2–3 EB per cm2. Lägg till exempel ca 120-180 EBs i en 100 mm skål. För att grovt bedöma EB-numret, placera en droppe EB-suspension på ett täckglas och räkna antalet EB under mikroskopet.
OBS: Pläteringsdensiteten hos EBs är en av de viktigaste faktorerna som påverkar effektiviteten hos näthinneinduktion. Densiteten kan också justeras med varje hPSC-linje. - Skaka försiktigt disken för att fördela EBs jämnt. Lägg dem i inkubatorn vid 37 °C och 5 % CO2.
OBS: Flytta inte disken i minst 24 timmar för att förbättra vidhäftningen av EBs.
- Induktion av optiska blåsor (OVs) och retinal pigment epitel (RPE) i vidhäftande förhållanden
OBS: När EBs har såtts på ECM-belagda ytan kan hPSCs utveckla OV-liknande strukturer, som kan observeras redan D20 efter differentiering. I detta protokoll krävs inte specifika tillväxtfaktorer eller signalmolekyler för att leda hPSCs in i näthinnan öde utom tillägg av N2 och B27 kosttillskott i media.- På D8-D9, ta bort disken och observera EBs under mikroskopet. Alla EBs kommer att fästas och spridas ut på disken(figur 1D). Tillsätt 10 ml färsk NIM till varje 100 mm skål som innehåller 10 ml gammalt medium. Lägg tillbaka dem i inkubatorn.
OBS: Ta inte bort det gamla mediet. - På D12, byt halva mediet med NIM med en 10 ml pipett. Håll kulturen i inkubatorn.
- På D16, ta bort all NIM från disken med hjälp av ett vakuum-aspirationssystem. Tillsätt 20 ml RDM till varje maträtt. Fortsätt att odla i RDM och ändra hälften av mediet varannan dag.
- Under D10-D30, observera cellernas morfologiska förändringar två gånger i veckan under ett mikroskop och utvärdera effektiviteten av retinal differentiering.
OBS: Sedan D10 är EF-domäner (Eye Field) självorganiserade i perifera zoner för vidhäftande EBs. De OV-liknande strukturerna förekommer mellan D20 och D25, sticker gradvis ut från skålen och själv bildar en optisk kopp, som är omgiven av pigmenterad RPE (Figur 1E). OVs kan lätt kännas igen med den ljusa, brytnings- och tjocka NR-ringen.
- På D8-D9, ta bort disken och observera EBs under mikroskopet. Alla EBs kommer att fästas och spridas ut på disken(figur 1D). Tillsätt 10 ml färsk NIM till varje 100 mm skål som innehåller 10 ml gammalt medium. Lägg tillbaka dem i inkubatorn.
- Lösgör och odla OVs och RPE i suspension för att erhålla retinal organoider (ROs)
- På D28-D35 visas de flesta OVs i disken. Använd en Volframnål eller en nål med 1 ml spruta för att mekaniskt lossa de morfologiskt identifierbara OVs tillsammans med intilliggande RPE. Odla dem i suspension.
OBS: Utseendet och utbytet av OVs och RPE varierar kraftigt i olika hPSC-linjer. Således är tidspunkten för att lossa OV och RPE flexibel. Uppenbara OVs med intilliggande RPE kan lossna och sedan flyttas till en låg tillbehörskulturrätt som innehåller RDM. Fortsätt att odla resten av cellerna tills alla OVs och RPG lyfts upp. - Lägg 50-60 OVs i varje 100 mm låg fastsättningskulturform som innehåller 15 ml RDM för ROs-formationen(figur 1F).
- Byt RDM var 2-3: e dag till D42, när ROs är väl rundformade.
- På D28-D35 visas de flesta OVs i disken. Använd en Volframnål eller en nål med 1 ml spruta för att mekaniskt lossa de morfologiskt identifierbara OVs tillsammans med intilliggande RPE. Odla dem i suspension.
3. Näthinneutveckling och mognad
OBS: I detta protokoll krävs serum för att hålla ROs växa och mogna för långsiktig kultur.
-
Näthinne laminering och specifikation i ROs
- Förbered 10 ml 100 mM taurin (1 000 x) i 1x PBS. Väg 125 mg taurin och lös upp i 10 ml 1x PBS. Filtrera lösningen med ett 0,22 μm sprutfilter. Alikvot vid 500 μL/rör och förvaras vid -20 °C.
- Förbered näthinnekulturmediet 1 (RC1). Blanda följande komponenter: 250 ml DMEM/F-12. 175 ml DMEM basic, 50 ml fetala nötkreatur serum, 10 mL 2% B27 tillägg, 5 mL 1% Antimycotic antimycotic, 5 mL 1% MEM NEAA, 0,5 ml 100 μM taurin och 5 ml 2 mM L-alanyl-L-glutamin.
- Bered näthinneodlingsmedium 2 (RC2) innehållande 450 ml DMEM/F-12. 50 ml fetala nötkreatur serum, 5 ml 1% N2 tillägg, 5 ml 1% antimykotisk antimykotisk, 0,5 ml 100 μM taurin, 5 ml 1% MEM NEAA och 5 ml 2 mM L-alnyl-L-glutamin.
OBS: RC1 och RC2 filtreras inte, utan genomgår ett sterilitetstest. Ta ut 1 ml medium, tillsätt det i en 35 mm skål och kultur i 3-7 dagar i inkubatorn vid 37 °C och 5% CO2, för att säkerställa sterilitet före användning. Mediet kan förvaras vid 4 °C och bör användas inom 2 veckor för att säkerställa komponenternas aktivitet. Alla media och reagenser ska förvärmas på RT i 30 minuter före användning. - På D42 byter du kulturmedium från RDM till RC1.
- Luta disken på ca 30° och låt ROs slå sig ner i 30 s. Ta bort den gamla RDM med en 10 ml pipett som lämnar efter sig ca 1 ml medium för att undvika att förlora ROs. Tillsätt 15 ml färsk RC1 till varje maträtt.
- Skaka försiktigt disken för att fördela ROs jämnt. Lägg tillbaka disken i inkubatorn. Byt hela mediet två gånger i veckan därefter.
- Under D50-D90 väljer du ut hög kvalitet på ROs för långsiktig kultur, som är rundformade med en tjock och ljus NR. Placera 30-40 ROs i en 100 mm låg fästform med 20 ml RC1 och byt hela mediet två gånger i veckan.
- För den långsiktiga suspensionskulturen hos ROs, pipett ROs för att undvika RO-RO reattaching med en pipett. Överför ROs till nya kulturrätter en gång i månaden för att undvika att ROs håller sig till ytan av disken.
OBS: Under upphängningskulturförhållandena är ROs rundformade, med en ljus och tjock NR-ring fäst med mer eller mindre RPE på ena sidan. Laminerad neural näthinnan utveckla och retinal cell subtyper sekventiellt visas med retinal ganglion celler först genereras, följt av photoreceptor celler, amacrine celler och bipolära celler.
-
Mänsklig fotoreceptor mognad med anrikning av koner i ROs
- Efter D90, byt medium från RC1 till RC2, som är lämplig för fotoreceptormognad.
- Ändra mediet enligt beskrivningen i steg 3.1.7-3.1.8.
OBS: Under detta odlingsförhållanden kan foU växa långsiktigt (Figur 1G), upp till D300 testat. Näthinneceller i ROs blir mogna, och alla cellundertyper av neural näthinnan, inklusive muller gliaceller, stavar och koner förvärvas också. Utan något tillägg av RA är konfotoreceptorer också rika på ROs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Retinal induktionsprocessen i detta protokoll efterliknar utvecklingen av mänskliga fetala näthinnan. För att initiera retinal differentiering, hPSCs var dissociated i små klumpar och odlas i suspension för att inducera bildandet av EBs. På D1 bildades de uniformerade cellaggregaten eller EB:erna (figur 1C). Kulturmediet övergick gradvis till NIM. På D5 pläterades EBs på ecm-belagda kulturrätter. Celler migrerade gradvis ut ur de europeiska centralbankerna (figur 1D). Från D10 är ögonfält självorganiserade i periferizonen för vidhäftande EBs. På D16 ersattes induktionsmediet av RDM. Efteråt bildades NR-domänerna gradvis, utskjutna från skålen och självformade OV-liknande strukturer omgivna av RPE-cellerna (Figur 1E). Under D28-D35 lyftes OVs tillsammans med intilliggande RPE upp med en vass nål och odlades i suspension. Under suspensionskulturförhållandena, ROs självbildade bestående av neurala näthinnan (NR) fäst med mer eller mindre RPE sfär på ena sidan (Figur 1F) och kunde överleva och mogen övertid så länge FBS lades till mediet.
När retinal differentiering och specifikation fortskrider, hPSCs producerade alla större retinal cell undertyper sekventiellt. Subtyperna av neural näthinnan radade gradvis upp i lager och efterliknar arkitekturfunktionerna hos inhemsk mänsklig näthinna (Figur 2A-G). Retinal ganglion celler (RGCs) genererades först från retinal stamceller och ackumuleras i basal sidan av NRs. Photoreceptor celler ligger i den apokala sidan, medan amacrine celler, horisontella celler, bipolära celler och muller gliaceller alla ligger i mellanliggande lager av NRs.
Med detta protokoll utvecklades ROs till de mycket mogna fotoreceptorerna med både stavar och koner(figur 2G-I). Fotoreceptorerna ökade snabbt i utvecklingen av kärnskiktet (Figur 2G) efter vecka 8 och mognade gradvis från vecka 17 och framåt. Från vecka 21 kan alla undertyper av fotoreceptorer inklusive stavar, röda /gröna koner och blå koner detekteras i ROs. Både rika stavar och koner kan erhållas i detta induktionsprotokoll utan tillägg av RA under hela differentieringsprocessen.
Figur 1: Induktions- och morfologiska egenskaper hos näthinneorganoider från hPSC. (A) Scheman för retinal induktion från hPSCs. B)En typisk koloni av hPSC (10x). C)EB på D1 (4x). D)På D7 fästes pläterade EBs och spreds ut på disken (4x). (E) På D25 bildades och stack den optiska blåsglassen som strukturer (OVs) ut från skålen (indikerad av den röda cirkeln), omgiven av pigmenterad RPE (4x). F)Näthinneorganoider som självbildats efter att OVs lyfts upp och odlats under suspensionsförhållanden (pilarna pekade NR och RPE (4x). g)En näthinneorganoid bestående av NR (röd pil) och RPE (svart pil) på D180 (4x). Skalstänger = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:Subtyper av näthinneceller upptäcktes sekventiellt i tredimensionella näthinnevävnader. Exempel bilder av stora näthinneceller typer uttrycker specifika markörer genom immunofluorescent färgning. A-B) Retinal stamceller uttryckt Ki67 (A) och VSX2 (B). (C) Holme1 positiva näthinnan ganglion celler ligger i den basala sidan av neurala näthinnan. (D) Amacrine celler positiva för AP2α. (E) Muller gliaceller positiva för SOX9. F)PKCα positiva bipolära celler. (G) Återställ i positiva fotoreceptorceller. (H)Rhodopsin positiva stav fotoreceptorer. L/M-opsin positiva konfotoreceptorer. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta flerstegs retinal induktion protokoll, hPSCs guidades steg för steg för att få näthinnan ödet och självorganiserade i retinal organoider som innehåller laminerade NR och RPE. Under differentiering, hPSCs recapitulated alla större steg av mänskliga retinal utveckling in vivo, från EF, OV och RPE, till retinal laminering, generera alla subtyper av retinal celler, inklusive retinal ganglion celler, amacrine celler, bipolära celler, stav och kon fotoreceptorer och muller gliaceller i en rumslig och tidsmässiga ordning. Rekapitulering av näthinneutveckling skulle gynna nedströms tillämpningar, såsom retinal sjukdom modellering.
Ett par protokoll har upprättats för att generera retinala organoider från hPSCs3,4,5,6,7,8,9,10,13,14,15,16,17,18,19,20 . Enligt kulturförhållandena kan protokollen klassificeras i 2D, 3D och kombinationen av 2D- och 3D-metoder9,13. 2D-metoderna6,10,22 innebär att all induktionsprocess sker under de vidhäftande odlingsförhållandena, vilket genererar näthinneceller utan arkitektur från hPSCs. Däremot innebär 3D-metoderna7,11,23 att all induktionsprocess är under suspensionskulturförhållandena, vilket ger organiserade näthinnevävnader. Till exempel rapporterade Sasai, Y. et al.7,24 en SFEBq-metod (serumfri flytande kultur av embryoidkroppsliknande aggregat med snabb omaggregering) för att vägleda EIC att differentiera till optiska koppar i suspensionskulturen. Med hjälp av flerstegs 3D-metoderna8,11,18,20,25 inklusivedetta protokoll har hPSCs inducerats mot näthinneöden och organoider under både vidhäftande och suspensionskulturförhållanden.
För att inducera hPSCs till neurala retinal öde, en serie exogena faktorer har lagts till media i många protokoll. Till exempel lade Lamba, et al.26 till en kombination av noggin (en hämmare av BMP-vägen) och Dickkopf-1 (dkk1, en antagonist till Wnt/ β-catenin-signalvägen) och insulinliknande tillväxtfaktor-1 (IGF-1) för att rikta EIC till ett främre neuralt öde. Osakada et al.6 tillsatte DAPT (en hacksignalvägshämmare) och vänster-höger bestämningsfaktor A (en WNT-signalvägshämmare) för att erhålla stav- och konfotoreceptorprekursorer. Kuwahara et al.27 och Capowski et al.3 lade till BMP4 för kort, tidig exponering av hPSCs kultur för att förbättra OV-produktionen. Däremot är detta optimerade retinalinduktionsprotokoll enkelt och lågt utan att kräva extrinsiska signalmodulatorer förutom det grundläggande tillägget av N2 och B27.
Retinsyra (RA) spelar en viktig roll i näthinneutveckling och fotoreceptorbestämning28,29,30. De flesta av protokollen utvecklades med tillägget AV RA (0,5-1 μM) under vissa perioder. Våra studier har visat att för hög koncentration av RA eller för lång period av RA-behandling resulterar i stavrika fotoreceptorer men hämmar kondire differentiering8,18. Men i detta optimerade protokoll läggs RA inte till kulturmedierna under hela differentieringsprocessen18, vilket främjar produktionen av konfotoreceptorer, som ansvarar för människans dagtidsseende och färgseende och krävs för cellbyte av RD-behandling. Även om vissa studier avslöjar sköldkörtelhormon signalering leder kon subtyper hos möss och mänskliga näthinnan31,32, regulatorn för kon engagemang är fortfarande oklart33. I dessa studier från Kim et al.34 och Lowe et al.35, den långsiktiga kulturen också utan någon exogen retinsyra genererade konrika retinal organoider, vilket överensstämmer med detta optimerade protokoll.
De viktigaste punkterna i detta protokoll är att göra EB av hög kvalitet och att så EB på lämpligt sätt. Celler växer snabbt under tidig EB-suspensionskultur. Mediet bör ändras varje dag och vara tillräckligt för att ge riklig näring. Storleken på EBs, ca 200 μm i diameter, är lämplig för retinal differentiering. Pläteringstätheten för EBs vid 2-3 EBs per cm2 är lämplig för de flesta hPSC-linjer. Den bästa fördelen med detta optimerade protokoll är kvantifieringen av EB:s storlek och pläteringstäthet för att avsevärt öka effektiviteten och repeterbarheten hos retinal induktion. Vi har tydligt beskrivit alla steg i detalj, vilket till stor del hjälper de oerfarna forskarna att lära sig och upprepa näthinneinduktionen.
Dessutom beror retinal induktionseffektivitet till stor del på kvaliteten och differentieringskraften hos hPSCs36,37. Olika hPSCs har olika effektivitet. Vissa hPSC-linjer har verkligen dålig effektivitet, vilket kan bero på omprogrammeringsmetoder, somatiska celler och så vidare. Detta protokoll har bekräftats vara lämpligt för olika hPSCs att erhålla 3D retinal organoider och RPE, inklusive olika hESCs och hiPSCs omprogrammerade från fibroblaster, blod och urinceller18,20,21. I allmänhet, med detta protokoll beskrivet ovan, kan en brunn av hPSCs (ca 80% sammanflöde) i en 6-brunnsplatta generera cirka 1 000 EBs, vilket ger ungefär 200 ROs. Därför är detta protokoll med hög effektivitet lämpligt för storskalig produktion av näthinneorganoider och fördelar nedströms applikationer inklusive grundläggande och translationell studie.
Sammanfattningsvis är det optimerade retinalinduktionsprotokollet enkelt och lågt med hög repeterbarhet och effektivitet, erbjuder lovande personliga modeller av näthinnesjukdomar och ger riklig cellkälla för cellterapi, läkemedelsscreening och genterapitest.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Xiufeng Zhong är patentuppfinnaren relaterad till generering av näthinneceller från mänskliga pluripotenta stamceller.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), Science & Technology Project of Guangdong Province (2017B020230003), Natural Science Foundation (NSF) i Kina (81570874, 81970842), Hundra talangprogram av Sun Yat-sen University (PT1001010) och fundamentala forskningsfonderna för statens nyckellaboratorium för oftalmologi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
References
- Flaxman, S. R., et al. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis. The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine. Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Brooks, M. J., et al. Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo. Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).
- Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
- Osakada, F., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 26 (2), 215-224 (2008).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Development. 145 (5), (2018).
- Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Maeda, A., Mandai, M., Takahashi, M. Gene and Induced Pluripotent Stem Cell Therapy for Retinal Diseases. Annual Review Genomics and Human Genetics. 20, 201-216 (2019).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- O'Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
- Eckert, P., Knickmeyer, M. D., Schutz, L., Wittbrodt, J., Heermann, S. Morphogenesis and axis specification occur in parallel during optic cup and optic fissure formation, differentially modulated by BMP and Wnt. Open Biology. 9 (2), 180179 (2019).
- Patel, A., Sowden, J. C. Genes and pathways in optic fissure closure. Seminals in Cell and Development Biology. 91, 55-65 (2019).
- Chan, B. H. C., Moosajee, M., Rainger, J. Closing the Ggap: Mechanisms of epithelial fusion during optic fissure closure. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, (2021).
- Li, G., et al. Generation of retinal organoids with mature rods and cones from urine-derived human induced pluripotent stem cells. Stem Cells International. 2018, 4968658 (2018).
- Liu, S., et al. Self-formation of RPE spheroids facilitates enrichment and expansion of hiPSC-derived RPE generated on retinal organoid induction platform. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (13), 5659-5669 (2018).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Li, G., et al. Generation and characterization of induced pluripotent stem cells and retinal organoids from a leber's congenital amaurosis patient with novel RPE65 mutations. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 212 (2019).
- Matsa, E., Ahrens, J. H., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cells as a platform for personalized and precision cardiovascular medicine. Physiology Reviews. 96 (3), 1093-1126 (2016).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3d retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
- Lamba, D. A., Karl, M. O., Ware, C. B., Reh, T. A. Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 103 (34), 12769-12774 (2006).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communication. 6, 6286 (2015).
- da Silva, S., Cepko, C. L. Fgf8 expression and degradation of retinoic acid are required for patterning a high-acuity area in the retina. Developmental Cell. 42 (1), 68-81 (2017).
- Mitchell, D. M., et al. Retinoic acid signaling regulates differential expression of the tandemly-duplicated long wavelength-sensitive cone opsin genes in zebrafish. PLoS Genetics. 11 (8), 1005483 (2015).
- Stevens, C. B., Cameron, D. A., Stenkamp, D. L. Plasticity of photoreceptor-generating retinal progenitors revealed by prolonged retinoic acid exposure. BMC Developmental Biology. 11 (1), (2011).
- Eldred, K. C., et al. Thyroid hormone signaling specifies cone subtypes in human retinal organoids. Science. 362 (6411), (2018).
- Yang, F., Ma, H., Ding, X. Q. Thyroid hormone signaling in retinal development, survival, and disease. Vitamins and Hormones. 106, 333-349 (2018).
- Brzezinski, J. A., Reh, T. A. Photoreceptor cell fate specification in vertebrates. Development. 142 (19), 3263-3273 (2015).
- Kim, S., et al. Generation, transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and ROCK-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Carcamo-Orive, I., et al. Analysis of transcriptional variability in a large human ipsc library reveals genetic and non-genetic determinants of heterogeneity. Cell Stem Cell. 20 (4), 518-532 (2017).
- DeBoever, C., et al. Large-scale profiling reveals the influence of genetic variation on gene expression in human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 20 (4), 533-546 (2017).
