Summary
ここでは、ヒトの多能性幹細胞株が再現性と効率の高い人工組織を生成するのに適した最適化されたレチナルオルガノイド誘導システムについて説明します。
Abstract
レチンバル性疾患は、効果的な治療を伴わない不可逆的失明の主な原因である。多能性幹細胞は、あらゆるタイプのレチナル細胞(ミニレチナル組織)に分化する可能性を秘めており、これらの疾患を有する患者に対して大きな約束をし、疾患モデリングや薬物スクリーニングにおいて多くの機会を得ています。しかし、hPSCからレチナル細胞への誘導プロセスは複雑で時間がかかります。ここでは、多様なヒト多能性幹細胞に適した、高い再現性と効率を持つレチナル組織を生成するための最適化されたレチナル誘導プロトコルについて述べます。このプロトコルは、レチノイン酸を添加することなく実行され、これは錐体の光受容体の濃縮に利益をもたらします。このプロトコルの利点は、レチン誘導の効率と再現性を大幅に向上させるEBサイズとめっき密度の定量化です。この方法では、すべての主要なレチン細胞が順次現れ、レチンの主な段階を再現します。疾患のモデル化や細胞治療などの下流のアプリケーションを容易にします。
Introduction
網膜変性疾患(RD)は、加齢黄斑変性症(AMD)および網膜色素変性症(RP)などの、光受容体細胞の機能不全および死を特徴とし、典型的には、効果的な治療法なしに不可逆的な視力喪失を導く1。これらの疾患の根底にあるメカニズムは、ヒト疾患モデル2の不足のために部分的にはほとんど知られていない。過去数十年にわたり、幹細胞技術を通じて再生医療において大きな進歩が遂げられています。私たち自身を含む多くの研究者は、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を含むヒト多能性幹細胞(hPSC)が、様々な分化アプローチ3、4、5、7、8、9、10を介してあらゆるタイプのレチナル細胞に分化できることを示している。11、疾患のモデリングと細胞療法12、13、14に大きな可能性を提供する。
しかし、hPSCからレチナル細胞への誘導プロセスは非常に複雑で時間がかかり、再現性が低いため、経験豊富で高いスキルを持つ研究者が必要です。複雑で動的な誘導プロセスの間、多くの要因が、15、16、17の組織の収率に影響を与えます。また、異なる誘導方法は、しばしば、サンプル収集とデータ解釈を混乱させる可能性のある、レチンマーカーのタイミングと堅牢な発現でかなり異なる。したがって、ステップバイステップのガイダンスを持つhPSCからのレチナル分化の簡単なプロトコルが必要になります。
ここでは、18,19,20,21の研究に基づき、hPSCから豊富な円錐型感光体を有するレチナルオガノイド(R)を生成するための最適化されたレチナル誘導プロトコルが記載されており、レチノイン酸(RA)のサプリメントを必要としない。このプロトコルは、神経のレティナとRPEを生成するマルチステップ法の記述に焦点を当てています。EB形成は、早期誘導段階の必須部分です。EBsのサイズとめっき密度の両方が定量的に最適化され、これは科学的に、レチン組織の収量を高め、反復性を促進します。誘導の第2部では、光学小胞(OV)は、懸濁液培養におけるアドヒアランス培養およびROV形態において自己組織化する。この部分のタイムコースと効率は、異なるhPSCラインで大きく異なります。Rの細胞の成熟と指定は、主に誘導の中間段階と後期段階で起こります。RAを添加することなく、豊かなコーンとロッドの両方を持つ成熟した感光体を作り出すことができます。
このプロトコルの目的は、経験の浅い研究者が繰り返すために各ステップを定量的に記述し、詳細に記述することです。さまざまなhPSCラインは、このプロトコルにより、錐が豊富なレチナル組織の堅牢な収率と高い再現性を持つROsにうまく誘導されています。このプロトコルを用いたHPSCs由来のROsは 、生体内でのレチナル開発の主なステップを再現し、疾患モデリング、薬物スクリーニング、細胞治療などの下流のアプリケーションを容易にする長期的な生存を可能にします。
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Protocol
1. hPSCの文化と拡大
- HPSC 文化
- 細胞外マトリックス(ECM、hESC修飾マトリックス)で6ウェルプレートの2つのウェルをコーティングします。Dulbeccoの修正イーグル培地(DMEM)に8-12 μg/mLのECMを含むECM溶液50 mLを調製します。DMEMの49 mLに、解凍したECMストック溶液(50x)を1 mL加えます。6ウェルプレートの各ウェルにECM溶液1mLを加えます。37°Cおよび5%CO2でインキュベーターに1時間インキュベートする。
- メーカーの指示に従ってhPSCメンテナンス媒体(MM)を準備します。
- 室温(RT)で30分間MMを温める前に。
- 37°Cの水浴中で30sの水浴中でインキュベーションすることによって液体窒素タンクからhPSC(hiPSCまたはhESC)(約1 x 106)の極低温バイアルを解凍します。
- バイアルを取り出し、75%消毒アルコールスプレーを使用して慎重に消毒します。バイオセーフティキャビネットに入れてください。
- バイアルから15mLチューブにセルサスペンションを移し、5mLピペットを使用してチューブにドロップして5mLの事前温めたMMドロップを加えます。一方、チューブを軽く振ってhPSCをブレンドします。
- チューブを170 x g で5分間遠心します。慎重に1 mLピペットを使用して上清のほとんどを除去し、細胞を失うことを避けるために上清の約50 μLを残します。
- チューブにMMの1mLを加え、1mLピペットで1、2回上下に軽くピペットを加え、ペレットを再懸濁します。
注: hPSC の単一細胞の生存率は低い。3〜5個の細胞を有する小細胞塊は、コロニー内でhPSCを増殖させ続けることが好ましい。 - 事前にコーティングされたウェルからECMを取り出し(ステップ1.1.1)、各ウェルに1.5mLのMMを加え、ウェルごとに0.5mLの細胞懸濁液を分配します。
- プレートを軽く振ってhPSCを均一に分配し、37°Cと5%CO2のインキュベーターにプレートを入れます。細胞の付着を促進するために、少なくとも24時間プレートを動かさない。
- 合流が約80%に達したときに1日おきにMMを変更し、hPSCを通過させます。
- hPSCのパッシング
注: hPSC での未分化状態の保守は、それ以降のアプリケーションにとって非常に重要です。接着条件下では、hPSCは明確に定義された境界を持つコロニーで成長する。hPSCの合流が約80%に達すると、細胞は通過する必要があります。- 顕微鏡で細胞を観察します。マークし、機械的に通過する前に、はっきりと見える分化細胞(<5%)を除去します。
- ステップ 1.1.1 で説明したように、ECM コーティングプレートを準備します。
- 前温MMと1xリン酸緩衝剤(PBS)を使用せず、CA2+ およびMg2+ をRTで使用します。
- 37 °Cの水浴で0.5 mM EDTA(1x PBS)溶液を予温してください。
- 真空吸引システムを用いて培養板から培地を取り出し、各ウェルに1mLのPBSを加えて、1mLピペットを用いて細胞を洗浄し、2回繰り返す。
- 37°Cの培養インキュベーターでhPSCを解化するために、1ウェルあたり1 mLのEDTA溶液を加え、5分間5%CO2 を解約します。単一細胞への解離を避けるために推奨インキュベーション時間を超えないでください。
- プレートを取り出し、顕微鏡下で細胞の剥離を確認します。コンフルエントhPSCが緩んで各細胞の境界線が見えますが、細胞板を穏やかに振ると細胞が簡単に外れることができません。
- 1 mL ピペットで EDTA 溶液を取り出し、1 mL の MM を加え、解離を止めます。1 mL ピペットで hPSC を 1 回または 2 回静かにピペットし、細胞を再中断します。細胞を収集するために遠心分離機をする必要はありません。
注:EDTAでインキュベーションした後に大部分の細胞がプレートから外れた場合、遠心分離機で細胞を採取することができます。 - 事前にコーティングされたウェル(ステップ1.2.2)からECMを取り出し、井戸あたり1.5mLのMMを追加します。
- 150~200 μLのセルの塊を各ウェルに移します。一般的に、hPSC は 1:6 の比率で通過できます。例えば、6ウェルプレートの1つのウェルからの細胞を6つの新しい井戸に分配することができる。
- プレートを軽く振ってhPSCを均一に分配し、37°Cで培養器内のhPSCを培養し、プレートに触れることなく、少なくとも24時間培養します。
- ステップ 1.1 で説明したように、1 日おきに MM を変更します。
2. hPSCからのレチナル分化
注: コロニーが約 80% 合流に達すると (図 1B)、図 1Aでスキーマ化されたプロトコルに従って、レチナルオノイドに分化するように導くことができます。hPSCが高品質で良好な収率を持つことを保証するために、IFCまたはQPCRを使用してOCT4またはNANOGなどの分子マーカーを用いて、多能性を定期的に評価します。分化された細胞がセル全体の5%以上を占める場合は、HPSCを廃棄する必要があります。メーカーの指示に従ってマイコプラズマ検出キットでマイコプラズマ汚染がないか確認します。マイコプラズマはhPSCの分化能力を変えることができるので、マイコプラズマを含まないhPSCのみを使用してください。
- メディアおよび試薬の準備
- 以下を混合して神経誘導培地(NIM)を調製:ダルベックコの修飾イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM/ F-12、1:1)の500 mL、1%N2サプリメントの5 mL、0.5 mLの0.1%ヘパリン(1x PBSで2mg/mL)、および5mLの1%MEM-NEA-アミノ酸(アミノ酸)。
- DMEM/F-12の300 mL、DMEM基本の200 mL、2%B27サプリメントの10 mL、1%抗生物質抗抗菌薬の5 mL、および1%MEM NEAAの5 mLを含むレチナル分化培地(RDM)を準備します。
注: NIM と RDM の両方はフィルタリングされませんが、滅菌テストが実行されます。培地1mLを取り出し、35mm皿に加え、37°Cと5%CO2のインキュベーターで3〜7日間培養します。培地は4°Cで保存することができ、コンポーネントの活性を確保するために2週間以内に使用する必要があります。 - DMSOで10mMブレビスタチン(1,000x)を準備します。DMSOを1,710 μL加えてブレビスタチンを5mg溶解し、10 mMストック溶液(1,000x)、10μL/チューブでアリコートを得、-20°Cで保存します。
注:特に記載がない限り、すべてのメディアおよび試薬は、使用前に30分間RTで温める必要があります。
- 胚体(EB)形成
- 0 日目 (D0) で、分化を開始します。6ウェルプレートからhPSCの1つの井戸を取り出し、合流度が80%に成長しました。ステップ 1.2.1 から 1.2.6 に説明されているように、EDTA 解離解液を使用して細胞を収集します。
- EDTA溶液を取り除き、10 μMブレビスタチンを含むMMを1 mL加えて細胞解離を停止し、1 mLピペットで細胞を採取します。セルの束のサイズは、EB の歩留まりに影響を与える重要な要因の 1 つです。およそ、D5〜D7で適切なサイズのEBを生成するために、束当たり5つの細胞が好ましい。
注: これは重要なステップです。EB様凝集体はhPSCの単一細胞から形成されにくいので、細胞を何度もピペットしないでください。 - 細胞懸濁液(約2 x106 細胞)を100mm超低い付着ペトリ皿に移し、10μMブレビスタチンを含む9mLのMMを皿に加えます。
- 皿を2回軽く振って細胞を均一に分配し、37°Cと5%CO2でインキュベーターに入れます。
- D1では、細胞を少なくとも24時間培養した後、皿を取り出し、顕微鏡で観察する。この時間までに多数の小細胞凝集体が自発的に形成される(図1C)。
- 15 mL チューブに 3:1 の比率 (MM の 9 mL と NIM 3 mL) で MM と NIM との混合 12 mL を準備します。
- 細胞培養物を10 mLピペットを垂直に15 mL遠心管に移し、10mLの予温混合物を皿に加えます。
- 凝集体を収集するために3分間60 x g でチューブを遠心分離し、5 mLピペットを使用して上清を除去し、細胞を失うことを避けるために約500 μLを残します。
- 2 mLの混合物をチューブに加え、懸濁液を同じ皿に移します(ステップ2.2.7)。
- 皿を軽く振って細胞の凝集体を均一に分配し、皿をインキュベーターに戻します。
- D2では、15 mLチューブに1:1比(MM 6 mL、NIM6 mL)でMMとNIMを用いた新しい混合物を12 mLで調製します。2.2.5から2.2.10のステップを繰り返して、新鮮な調製混合物で細胞培地を変更する。
- D3では、上述のようにNIMの15mLでセル培地を交換する。細胞を懸濁条件下で少なくとも5日間培養する。
注:D1からD3の間に、十分な栄養を提供し、毎日、媒体を交換する必要があります。D3 以降では、NIM は 1 日おきに変更できます。また、豊富な栄養を提供するために、いくつかの料理に分けることができます。
- エブをシードする
注:D5からD7では、ECMコーティングされた料理のEBをEBのサイズに応じてプレートする適切なタイムポイントを選択します。およその直径200 μmのEBは、レチナリの分化に適しています。一般に、6ウェルプレートの1つのウェルのhPSCは、約300〜1,000のEBを生成することができます。EB収量の変動はhPSCラインによって変化する。- D4では、ECMコーティングされた料理をEBの付着文化のために準備します。100mmの各組織培養皿に5mLのECMを加え(表面処理)し、一晩インキュベーターに入れます。
- D5では、事前にコーティングされた料理からECMを取り出し、各料理に10mLの事前温められたNIMを加えます。
- EBを含む料理を取り出します。顕微鏡下でのエブの品質を確認し、非常に明るく、形が丸いものであることを確認します。EBのサイズは直径約200μmです。15 mLチューブ内のすべてのEBを収集します。5 mL ピペットを使用して、皿から 15 mL チューブに EB を移します。EBを5分間落ち着かせてください。上清の大部分を取り除き、約2mLの培地を残します。
- 10 mLのNIMドロップを含むコーティングされた皿に、1 mLピペットで滴下して、そのエブを配ります。密度 2 ~ 3 の密度で、2 ~ cm2の密度で EB をシードします。たとえば、100 mm の皿に約 120 ~ 180 個の EB を追加します。EB数を大まかに判断するには、EB懸濁液をカバースリップに1滴置き、顕微鏡下でEBの数を数えます。
注: エブのめっき密度は、レチン誘導の効率に影響を与える重要な要因の 1 つです。密度は、各hPSCラインによっても調整することができます。 - 皿を軽く振って、エブを均一に分配します。37°Cと5%CO2のインキュベーターに入れてください。
注:EBsの付着性を高めるために、少なくとも24時間は食器を動かしないでください。
- 接着条件下での光学小胞(OV)および網膜色素上皮(RPE)の誘導
注: ECM コーティングされた表面に EB をシードした後、hPSC は OV のような構造を開発でき、これは分化後の D20 で早くも観察できます。このプロトコルでは、特定の成長因子またはシグナル伝達分子は、メディアにN2およびB27サプリメントを添加する以外に、hPSCをレチナル運命に導くために必要とされない。- D8-D9では、食器を取り出し、顕微鏡下でのエブを観察します。すべての EB が取り付けられ、皿に広がります (図 1D)。10mLの古い培地を含む100mmの皿に新鮮なNIMの10mLを加えます。インキュベーターに戻します。
メモ:古いメディアを削除しないでください。 - D12では、10 mLピペットを使用して、NIMで培地の半分を交換します。培養器に培養物を保管してください。
- D16では、真空吸引システムを使用して、すべてのNIMを皿から取り外します。各皿に20mLのRDMを加えます。RDMで培養を続け、1日おきに培地の半分を交換してください。
- D10-D30の間、顕微鏡で細胞の形態変化を週2回観察し、レチナル分化の効率を評価する。
注: D10 以降、アイ フィールド (EF) ドメインは、付着型の EB の周辺ゾーンで自己組織化されています。OV様構造はD20からD25の間に現れ、皿から徐々に突き出て、そして色素化したRPEに囲まれた光学カップを自己形成する(図1E)。OVは明るく、屈折し、厚いNRリングと容易に認識することができる。
- D8-D9では、食器を取り出し、顕微鏡下でのエブを観察します。すべての EB が取り付けられ、皿に広がります (図 1D)。10mLの古い培地を含む100mmの皿に新鮮なNIMの10mLを加えます。インキュベーターに戻します。
- 脱離し、分離でOVとRPEを培養し、網膜オルガノイド(ROV)を得る
- D28-D35 では、ほとんどの OV が皿に現れます。タングステン針または1 mLシリンジ付きの針を使用して、隣接するRPEと共に形態学的に識別可能なOVを機械的に取り外します。サスペンションでそれらを培養します。
注: OV と RPE の外観と歩留まりは、hPSC ラインによって大きく異なります。これによりOVとRPEを取り外す時点は柔軟です。隣接する RPE を備えた明らかな OV を取り外して、RDM を含む低い添付ファイルカルチャディッシュに移動できます。すべてのOVとRPEが持ち上げられるまで、残りの細胞を培養し続けます。 - R形成用のRDMの15 mLを含む各100 mm低い取り付け培養皿に50-60 OVを入れてください(図1F)。
- ROが十分に丸い形になっているD42まで、RDMを2〜3日ごとに変更します。
- D28-D35 では、ほとんどの OV が皿に現れます。タングステン針または1 mLシリンジ付きの針を使用して、隣接するRPEと共に形態学的に識別可能なOVを機械的に取り外します。サスペンションでそれらを培養します。
3. レティナルの発達と成熟
注: このプロトコルでは、血清は、長期的な文化のために、ROsの成長と成熟を維持するために必要とされます。
-
Rにおけるレチナルラミネートと仕様
- 1x PBSで100mMタウリン(1,000x)の10mLを調製します。125mgのタウリンを秤量し、10mLの1xPBSに溶解する。0.22 μmのシリンジフィルターで溶液をフィルターします。アリコートは500μL/チューブで、-20°Cで保管してください。
- レチン培養培地1(RC1)を調製する。次のコンポーネントを混ぜます:250 mLのDMEM/F-12、 DMEM基本の175 mL、ウシ胎児血清50mL、2%B27サプリメントの10mL、1%抗生物質抗ミキティック薬の5mL、1%MEM NEAAの5 mL、100 μMタウリンの0.5mL、2 mM L-アラニル-Lグルタミンの5 mL。
- 450 mLのDMEM/F-12、50 mLのウシ血清、5 mLの1%N2サプリメント、5 mLの1%抗生物質抗菌薬、0.5 mLの100 μMタウリン、5 mL 1%MEM NEAA、および5 mL Lm-L-L-M-L-m.l.グルトを含むレチナル培地2(RC2)を調製する。
注意: RC1とRC2はフィルタリングされませんが、滅菌試験を受けます。培地を1mL取り出し、35mm皿に加え、37°Cと5%CO2でインキュベーターで3〜7日間培養し、使用前に無菌性を確保します。培地は4°Cで保存することができ、コンポーネントの活性を確保するために2週間以内に使用する必要があります。すべての媒体および試薬は、使用前に30分間RTで予熱する必要があります。 - D42 で、培養培地を RDM から RC1 に切り替えます。
- 約30°で皿を傾け、ロは30 sのために落ち着きます。10 mL ピペットで古い RDM を取り外し、約 1 mL の培地を残して、ROs を失わないようにします。新鮮なRC1を15mLずつ加えます。
- 皿を軽く振って、一様にロを配ります。皿をインキュベーターに戻します。その後、週に2回、培地全体を変更します。
- D50-D90の間に、厚くて明るいNRで丸い形をした長期培養のためのRの高品質を選択します。RC1の20 mLで100mmの低い取り付け皿に30-40のロを入れ、週に2回、培地全体を交換してください。
- ROの長期懸濁液培養では、ピペットを使用したRO-RO再アタッチを回避するために、ROをピペット化します。新しい文化料理に新しい文化料理にロを移すので、料理の表面に付着しないようにします。
注意:サスペンション培養条件下では、ROは丸型で、明るく厚いNRリングが一方の側に多かれ少なかれRPEを取り付けています。ラミネート神経幹細胞は、最初に生成された神経節細胞を初めて発生させた後、感光体細胞、アマリン細胞、および双極細胞と共に、次いで連続して発現する。
-
Rのコーンの富を有するヒト感光体成熟
- D90の後、光受容体成熟に適したRC1からRC2に媒体を切り替えます。
- 手順 3.1.7~3.1.8 の説明に従って、メディアを変更します。
注: このカルチャ条件下では、ROs は、テストされた D300 まで、長期的に成長できます (図 1G)。Rのレチナル細胞は成熟し、ミュラーグリア細胞、ロッド、コーンを含む神経性レチナのすべての細胞サブタイプも取得されます。RAを添加することなく、錐体の感光体もROに富む。
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Representative Results
このプロトコルのレチナル誘導プロセスは、ヒト胎児の胎児の発育を模倣する。レチナリの分化を開始するために、hPSCを小さな塊に解き分け、懸濁液中で培養して、EBの形成を誘導した。D1では、均一な細胞凝集体またはEBが形成される(図1C)。培養培地は徐々にNIMに移行した。D5では、ECMコーティングされた文化料理にEBをメッキしました。細胞は徐々にエブから移行します(図1D)。D10から、眼球は付着性のEBsの周辺ゾーンで自己組織化した。D16では、誘導媒体をRDMに置き換えた。その後、NRドメインが徐々に形成され、皿から突き出て、RPE細胞に囲まれた自己形成OV様構造が形成された(図1E)。D28-D35の間に、隣接するRPEと共にOVは鋭い針で持ち上げられ、懸濁液で培養された。懸濁培養条件下では、一方の側に多かれ少なかれRPE球を付けた神経性レチナ(NR)を含むR(NR)を含む自己形成し、FBSが培地に添加されている限り、生き残り、成熟した残業をすることができた。
レチナル分化と仕様が進むに連れ、hPSCは主要なレチナル・サブタイプをすべて順次生産した。神経性のサブタイプは徐々に層に並び、ネイティブのヒトのレティナのアーキテクチャの特徴を模倣する(図2A-G)。レチナルガングリオン細胞(RGC)は、まず、腎前駆細胞から生成され、心房側に位置する光受容体細胞、アマセリン細胞、水平細胞、双極性細胞、およびミュラーグリア細胞の中間層に位置する。
このプロトコルにより、ロッドとコーンの両方を備えた高度に成熟した感光体に発展しました(図2G-I)。感光体は第8週以降に核層(図2G)の開発において急速に増加し、第17週以降に徐々に成熟した。第21週から、ロッド、赤/緑のコーン、青いコーンを含む感光体のすべてのサブタイプを、ROsで検出することができます。豊富なロッドとコーンの両方は、全分化プロセス全体にわたってRAを添加することなく、この誘導プロトコルで得ることができます。
図1: hPSCからのレチナルオガノイドの誘導と形態学的特徴. (B) hPSCの典型的なコロニー(10x)。(C) D1 (4x) の EJB(D) D7では、メッキされたEBが取り付けられ、皿に広がりました(4倍)。(E)D25では、光学小胞のような構造(AV)が形成され、(赤い円で示される)皿から突き出て、色素RPE(4x)に囲まれた。(F) EVを持ち上げて懸濁状態で培養した後に自己形成したレチナルオルガノイド(矢印はNRとRPE(4x)を指す。(G) D180(4x)上のNR(赤矢印)とRPE(黒矢印)を含むレチナルオルガノイド。スケールバー= 200 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:3次元のレチン組織で連続的に検出されたレチン細胞のサブタイプ。免疫蛍光染色法により特異的マーカーを発現する主要なレチン細胞型の画像例。(A-B)レチナル前駆細胞はKi67(A)およびVSX2(B)を発現した。(C)Islet1陽性の腎細胞は、神経性の腎の基底側に位置する。(D)AP2αに対して陽性のアマセリン細胞。(E) SOX9に陽性のミュラーグリア細胞。(F)PKCα陽性双極細胞。(G) 陽性感光体細胞を回復する。(H)ロドプシン陽性ロッド感光体(L/M-オプシン陽性コーン感光体型)スケールバー= 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この多段階のレチナル誘導プロトコルでは、hPSCを、レチナル運命を得るためにステップバイステップで導かれ、かつ、積層NRおよびRPEを含むレチナルオルガノイドに自己組織化した。分化の間、hPSCは、EF、OV、RPEから、レチナルラミネート、レチナル細胞、アマクライン細胞、双極細胞、ロッド、円錐光受容体、および円膜のグリア細胞および時間的空間細胞および時間的空間細胞におけるヒトの腎細胞の発達のすべての主要なステップを要約した。 レチンの発達の再現は、疾患のモデル化などの下流のアプリケーションに利益をもたらすだろう。
hPSC3,4,5,6,7,8,9, 10,13,14,15,16,17,18,19,20からレチナルオルガノイドを生成するプロトコルがいくつか確立されています。.培養条件に従って、プロトコルは2D、3D、および2Dと3Dアプローチ9、13の組み合わせに分類することができます。2Dアプローチ6、10、22は、すべての誘導プロセスが付着培養条件で起こり、hPSCからアーキテクチャーなしでレチナル細胞を生成することを意味する。対照的に、3Dアプローチ7、11、23は、すべての誘導プロセスが懸濁培養条件下にあり、組織化されたレチン組織を生み出す。例えば、Sasai, Y. ら7,24は、SFEBq法(迅速な再凝集を伴う胚体様凝集体の無血清浮遊培養)を報告し、ESCを懸濁培養中の光学カップに分化する。このプロトコルを含む多段階3Dアプローチ8、11、18、20、25を用いて、hPSCは、付着性および懸濁培養条件の両方の下で、レチナル運命およびオルガノイドに誘導されてきた。
hPSCを神経性の残性に誘導するために、多くのプロトコルで一連の外因性因子がメディアに追加された。例えば、ランバ、他26 は、ノギン(BMP経路の阻害剤)とDickkopf-1(Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路のアンタゴニストであるdkk1)とインスリン様成長因子-1(IGF-1)の組み合わせを加えて、ESCを前神経運命に導いた。大阪da et al.6 は、ロッドおよび錐錐体の前駆体を得るためにDAPT(ノッチシグナル伝達経路阻害剤)および左右決定因子A(WNTシグナル伝達経路阻害剤)を添加した。桑原ら27 と カポフスキら3 は、OV 生産を改善するために hPSC 培養の短時間の早期暴露のために BMP4 を追加しました。対照的に、この最適化されたレチナル誘導プロトコルは、N2およびB27の基本的なサプリメントを除いて外因性シグナル伝達モジュレーターを必要とせずに、シンプルで低コストです。
レチノイン酸(RA)は、レチノインの発達と感光体の決定28、29、30において重要な役割を果たす。プロトコルのほとんどは、特定の期間にRA(0.5-1 μM)を補足して開発されました。我々の研究は、RAの濃度が高すぎるか、またはRA治療のあまりにも長い期間が、ロッドリッチな感光体で生じるが、コーン分化8、18を阻害することを実証した。しかし、この最適化されたプロトコルでは、RAは全分化プロセス18を通して培養培地に添加されず、ヒトの昼間の視力および色覚を担い、RD治療の細胞置換に必要な錐体光受容体の産生を促進する。いくつかの研究は、甲状腺ホルモンシグナル伝達がマウスおよびヒトのretina31,32におけるコーンサブタイプを指示することを明らかにしているが、コーンコミットメントの調節因子は依然として不明である33。Kim et34およびLoweら.35からのこれらの研究では、長期培養はまた、この最適化されたプロトコルと一致するコーンリッチなレチナルオルガノイドを生成した外因性のレチノイン酸を伴わない。
このプロトコルの重要なポイントは、高品質のEBを作り、適切にシードする必要があります。細胞は初期のEB懸濁液培養中に速く成長する。培地は毎日変更し、豊富な栄養を提供するのに十分である必要があります。直径約200μmの大きさのEBは、レチナル分化に適しています。2~3 EB/cm2のメッキ密度は、ほとんどのhPSCラインに適しています。この最適化されたプロトコルの最大の利点は、レチン誘導の効率と再現性を大幅に向上させる EB サイズとめっき密度の定量化です。私たちは、経験の浅い研究者が学習し、再発誘発を繰り返すのに大いに役立つ、すべてのステップを詳細に明確に説明しました。
さらに、レチナル誘導効率は、hPSC36、37の品質と分化効力に大きく依存する。hPSC が異なって、効率は異なります。一部の hPSC ラインは、実際には、リプログラミング方法、体細胞などが原因である可能性があり、効率が悪い場合があります。このプロトコルは、線維芽細胞、血液、および尿細胞18、20、21から再プログラムされた様々なhESCおよびhiPSCを含む、3DレチナルオルガノイドおよびRPEを得るために様々なhPSCに適することが確認された。一般に、上記のプロトコルでは、6ウェルプレート内の1つのウェルhPSC(約80%合流)が約1,000のEBを生成し、約200のROを生み出すことができます。したがって、このプロトコルは、高効率で、レチナルオガノイドの大規模な生産に適しており、基礎的および翻訳的研究を含む下流の用途に利益をもたらします。
要約すると、最適化されたレチン誘導プロトコルは、高い再現性と効率を持つシンプルで低コストであり、有筋疾患の有望なパーソナライズされたモデルを提供し、細胞治療、薬物スクリーニング、および遺伝子治療テストのための豊富な細胞源を提供します。
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Disclosures
Xiufeng Zhongは、ヒト多能性幹細胞からのレチナル細胞の生成に関連する特許発明者である。
Acknowledgments
この研究は、中国の国家キーR&Dプログラム(2016YFC1101103、 2017YFA0104101)、広州科学技術プロジェクト基金(201803010078)、広東省科学技術プロジェクト(2017B020230003)、中国自然科学財団(81570874、81970842)、孫文大学(PT1001010)の100人の人材プログラム、および主要研究所の基礎研究基金
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
| 1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
| 10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
| 100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
| 100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
| 15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
| 35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
| 5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
| 50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
| 6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
| Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
| ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
| Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
| Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
| Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
| Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
| Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
| Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
| Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
| Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
| Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
| B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
| Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
| DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
| Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
| DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
| DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
| FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
| Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
| GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
| Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
| Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
| mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
| Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
| Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |
References
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