Summary
Этот протокол описывает этапы создания модели кролика с двумя переваренными эластазой аневризмами с различной гемодинамикой (пень и бифуркационное созвездие). Это позволяет тестировать новые эндоваскулярные устройства при аневризмах с различной ангиоархитектурой и гемодинамическими условиями в пределах одного животного.
Abstract
Доклинические модели животных с гемодинамическими, морфологическими и гистологическими характеристиками, близкими к внутричерепным аневризмам человека, играют ключевую роль в понимании патофизиологических процессов, разработке и тестировании новых терапевтических стратегий. Это исследование направлено на описание новой модели аневризмы кролика, которая позволяет создавать две переваренные эластазой мешковидные аневризмы с различными гемодинамическими условиями у одного и того же животного.
Пять самок новозеландских белых кроликов со средним весом 4,0 (± 0,3) кг и средним возрастом 25 (±5) недель подверглись микрохирургическому образованию культи и бифуркации аневризмы. Одна аневризма (культя) была создана воздействием правой общей сонной артерии (CCA) в ее начале в брахиоцефальном стволе. Временный зажим был применен в начале ОАС, а другой - на 2 см выше. Этот сегмент обрабатывали местной инъекцией 100 Ед эластазы в течение 20 мин. Вторая аневризма (бифуркация) была создана путем зашивания обработанного эластазой артериального мешочка в сквозной анастомоз правого CCA к левому CCA. Проходимость контролировалась флуоресцентной ангиографией сразу после создания.
Средняя продолжительность операции составила 221 мин. Создание двух аневризм у одного и того же животного было успешным у всех кроликов без осложнений. Все аневризмы были запатентованы сразу после операции, за исключением одной бифуркационной аневризмы, которая показала экстремальную тканевую реакцию из-за инкубации эластазы и немедленного внутрипросветного тромбоза. Во время операции не наблюдалось никакой смертности и до одного месяца наблюдения. Заболеваемость ограничивалась транзиторным вестибулярным синдромом (один кролик), который выздоравливал спонтанно в течение одного дня.
Здесь впервые продемонстрирована целесообразность создания двуханевризмной модели кролика с гемодинамическими характеристиками культи и бифуркации и сильно дегенерированными условиями стенки. Данная модель позволяет изучать естественное течение и потенциальные стратегии лечения на основе биологии аневризмы в различных условиях течения.
Introduction
Внутричерепная аневризма – тяжелое состояние с летальностью после разрыва, достигающей 50% и длительной инвалидностью у 10-20% больных1. В последнее десятилетие наблюдается быстрое развитие вариантов эндоваскулярного лечения, но в то же время увеличивается частота рецидивов с повторным сканированием до 33% аневризмы после свертывания 2,3. Для лучшего понимания патофизиологии, лежащей в основе окклюзии и реканализации аневризмы, а также для разработки и тестирования новых эндоваскулярных устройств, в настоящее время существует потребность в надежных доклинических моделях, гемодинамические, морфологические и гистологические характеристики которых имитируют характеристики внутричерепных аневризм человека 4,5,6 . На сегодняшний день не существует определенной модели в качестве стандарта для доклинических испытаний, и исследователям доступен большой спектр видов и методов 7,8.
Тем не менее, кролик представляет особый интерес из-за размера и гемодинамического сходства между его шейными артериями и сосудами головного мозга человека, а также его сходных профилей свертывания и тромболиза. Несколько моделей с переваренными эластазой мешковидными аневризмами на общих сонных артериях (CCA) показали качественное и количественное сходство с внутричерепными аневризмами человека с точки зрения условий потока, геометрических особенностей и характеристик стенок 9,10,11,12. Это исследование направлено на описание метода создания новой модели аневризмы кролика как с культей, так и с бифуркационными аневризмами, переваренными эластазой, у одного и того же животного. Хирургические методы вдохновлены методами Hoh et al.13 и Wanderer et al.14 с небольшими изменениями, чтобы обеспечить хорошую стандартизацию и воспроизводимость и обеспечить низкую смертность и заболеваемость.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент был одобрен Местным комитетом по уходу за животными кантона Берн, Швейцария (номер заявки BE108/16), и все процедуры по уходу за животными были выполнены в соответствии с институциональными руководящими принципами и принципами 3R15,16. Данные сообщаются в соответствии с руководящими принципами ARRIVE. Периоперационное лечение проводил сертифицированный ветеринарный анестезиолог. Для исследования самки новозеландских белых кроликов со средним весом 4,0 (± 0,3) кг и средним возрастом 25 (±5) недель были размещены при комнатной температуре 22-24 ° C с 12-часовым циклом света / темноты со свободным доступом к воде, гранулам и сену.
1. Предоперационная фаза и анестезия
- Проведите клиническое обследование в соответствии с рекомендациями Ассоциации ветеринарных анестезиологов и Европейского и Американского колледжа ветеринарной анестезии и обезболивания, чтобы подтвердить, что кролики здоровы, взвесив каждое животное, оценив слизистую оболочку, задокументировав время пополнения капилляров и качество пульса, а также выполнив легочную и сердечную аускультацию, а также пальпацию брюшной полости.
- Основываясь на клинических выводах, припишите классификацию Американского общества анестезиологов (ASA) каждому кролику17. Выполняйте операции только на животных с баллом ASA I.
- Побрить оба наружных уха, а также нанести прилокаин-лидокаиновый крем на ушные артерии и вены. Достигайте глубокой седации с комбинацией кетамина 20 мг/кг, дексмедетомидина 0,1 мг/кг и метадона 0,3 мг/кг, вводимого подкожно (SC). Оставьте животных нетронутыми в течение 15 минут. Дайте дополнительную оксигенацию (3 л / мин) через ослабленную маску для лица и контролируйте с помощью пульсоксиметра.
- Поместите канюлю 22 G в левую ушную центральную артерию, а также в ушную вену. Индуцируют общую анестезию пропофолом 1-2 мг/кг внутривенно (в/в) до эффекта (потеря глотательного рефлекса). Приступайте к эндотрахеальной интубации через силиконовую трубку (внутренний диаметр 3 мм).
- Побрить лоб, чтобы разместить детские электроэнцефалографические (ЭЭГ) датчики. Побрить хирургическое поле и ввести ропивакаина гидрохлорид 0,75 % внутрикожно.
- Поместите кролика на операционный стол в дорсальную кондицию, установите полный мониторинг и подключите эндотрахеальную трубку к системе педиатрического круга с низким сопротивлением. Поддерживать анестезию с введением изофлурана в кислороде, нацеливаясь на максимальную конечную приливную (Et) концентрацию 1,3 %.
- Обеспечивают непрерывную инфузию лактата рингера 5 мл/кг/ч через венозный доступ. Обеспечить клинический и инструментальный мониторинг до экстубации с помощью пульсоксиметрии, допплерографии и инвазивного артериального давления, 3-выводной электрокардиограммы, ЭЭГ, ректальной температуры, а также вдыхаемых и выдыхаемых газов.
- Продезинфицируйте хирургическое поле повидон-йодом от манубриума стерны до углов челюсти и нанесите стерильную драпировку. Во время операции обеспечивают обезболивание лидокаином (постоянная скорость инфузии (CRI) 50 мкг/кг/мин) и фентанилом (CRI 3-10 мкг/кг/ч). Выполняют спонтанную или вспомогательную вентиляцию. Допускают разрешительную гиперкапнию.
- Выполните хотя бы один анализ газов артериальной крови во время операции. При гипотензии (среднее артериальное давление ниже 60 мм рт.ст.) обработайте его норадреналином, титруя до эффекта. Используйте грелку или систему подогрева с принудительным воздухом для предотвращения переохлаждения (цель: ректальная температура 37,5-38,5 °C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку инвазивное артериальное давление измеряется в левой артерии уха, обрезание левого CCA остановит кровоток и подавит кривую. Затем артериальное давление должно быть измерено с помощью метода допплерографии до повторного открытия сосуда.
2. Хирургия
- Подход
- Сделайте срединный разрез кожи от подъязычной кости до точки 1,5 см каудальной до манубриум стерни скальпелем. Подготовьте подкожную и жировую клетчатку из медиального разреза при выполнении тщательного гемостаза.
- Освободите грудино-головную мышцу от прилипшей соединительной ткани и примените лидокаин местно (2-4 мг/кг, предпочитаю лидокаин 1%), чтобы избежать миоклонуса. Обнажите правую CCA medially грудино-цефальной мышцы и держите ее влажной с помощью влажных тампонов.
- Теперь подготовьте боковую и проксимальную части грудино-цефальной мышцы и втягивайте ее медиально с помощью сосудистой петли, чтобы обнажить ОАС. Определите наружную яремную вену и защитите ее влажным микрокроватом.
- Тщательно рассекают соединительную ткань вдоль проксимального КЦА до бифуркации брахиоцефального ствола, чтобы обнажить артерию. При наличии мелких ветвей, идущих от артерии, свертывают их с прижигателем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы избежать повреждения нервов.
- Создание аневризмы культи и сбор тканей для бифуркационной аневризмы
- Прежде чем отсечь правый CCA, измерьте время антисвертываемости (ACT) и введите гепарин натрия (80 EI / кг) системно через ушную вену (выполняется командой анестезиологов), чтобы избежать тромбоэмболических событий.
- Теперь применяют 2 временных клипса: первый в начале КЦА, а второй в 2 см дистальнее от него (рисунок 1А). Поместите резиновую прокладку под сосуд и промойте папаверином HCL (40 мг/мл; 1:1 растворено в 0,9% физиологического раствора) для расширения сосудов.
- Удалите адвентицию осторожно с помощью микросублиц. Выполните артериотомию ниже дистального зажима с помощью 22 G IV-катетера и вставьте катетер каудально до проксимального зажима (рисунок 1A, B).
- Промывайте сегмент внутрипросветно гепаринизированным NaCl (500 ЕД/100 мл в 0,9% физиологического раствора) до тех пор, пока не будет видно крови, и, наконец, зафиксируйте катетер лигатурой (4-0). Теперь через катетер вводят 0,1-0,2 мл эластазы (100 МЕ, ранее растворенных в 5 мл Трис-буфера) в сегмент артерии и инкубируют в течение 20 мин (Рисунок 1В).
- Начните с рассечения с левой стороны, чтобы обнажить левый CCA (см. раздел 2.3). Через 20 мин инкубации с эластазой очистите раствор эластазы и замените шприц, чтобы промыть сегмент артерии примерно 10 раз с 0,9% NaCl.
- Применяют 2 лигатуры (6-0): первая 5 мм дистально проксимального зажима, а вторая просто проксимально, под артериотомию (рисунок 1С). Отрежьте сосуд ~3 мм выше первой лигатуры и еще раз между второй лигатурой и дистальным зажимом. Хранят этот аутологичный трансплантат в гепаринизированном растворе (500 ЕД/100 мл в 0,9% физиологическом растворе) до создания бифуркационной аневризмы (рисунок 1D). Наконец, осторожно откройте первый проксимальный зажим и измерьте аневризму (длину, ширину и глубину).
- Создание бифуркационной аневризмы
- Подготовьте левую сторону, рассекнув грудино-головную мышцу медиально, чтобы обнажить ~ 2 см левого CCA. Наносите лидокаин местно на мышцы, чтобы избежать миоклонуса.
- Подложите сонную артерию марлевым шариком и небольшим тампоном с кусочком перчатки. Нанесите немного папаверина. HCl местно (40 мг/мл; 1:1 растворен в 0,9% физиологического раствора). Продолжайте работу под микроскопическим видом: подготовьте мешочек аневризмы и удалите адвентицию. Измерьте мешочек аневризмы (длина, ширина, глубина).
- Промойте открытую часть правого CCA гепаринизированным NaCl и при необходимости замените зажим на ~1 см, чтобы обеспечить свободные манипуляции для шва. Аккуратно удалите адвентицию и сделайте продольный разрез ~2 мм сбоку в культе правого КЦА.
- Теперь примените два временных зажима на левом CCA, чтобы разграничить сегмент ~ 1 см и удалить адвентицию между ними. Выполните артериотомию иглой 23 Г. Промыть сегмент гепаринизированным NaCl (500 Ед/100 мл в 0,9% физиологическом растворе). Увеличьте артериотомию с помощью микроциссоров до ~4-5 мм, чтобы обеспечить наложение швов на правый CCA и мешочек аневризмы (рисунок 1E). Орошайте сосуды в течение всей процедуры наложения швов и защищайте их влажными микросменами.
- Выполняют анастомоз 9-0 нерассасывающимся швом.
- Зашить проксимальную заднюю стенку правой сонной тупости 5 швами, начиная с проксимального края артериотомии на левом КЦА. Затем зашить заднюю сторону мешочка аневризмы 4-5 швами, начиная с дистального края артериотомии на левом КЦА.
- Продолжить с дистальной тыльной стороны на уровне разреза рта рыбы до шва вертикальной тыльной стороной трансплантата аневризмы с 3 швами. Зашить переднюю сторону рыбьего рта разрезом с помощью 3 швов, начиная вверх и двигаясь вниз.
- Закончите передним швом между левым CCA и передней стороной трансплантата аневризмы и правой CCA с ~6 швами. Перед окончанием анастомоза промыть сосуды гепаринизированным 0,9% физиологическим раствором внутрипросветно.
- Перед снятием зажима измерьте антисвертывающее время (ACT) еще раз и введите адаптированную дозу гепарина системно (цель: 2-3 раза больше исходного ACT).
- Удалите зажим справа CCA, оказывая некоторое давление на анастомоз микрокроватами для гемостаза. Затем продолжите, удалив дистальный зажим из левого CCA. Если нет сильного кровотечения, продолжайте вынимать проксимальный зажим на левом CCA, чтобы обеспечить кровоток. Если есть какое-то кровотечение из анастомоза, приложите некоторое давление марлевым шариком и тампоном; подождите пару минут. Если она сохраняется, замените клипсы и выполните повторные сшивания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кровопотеря более 20-30 мл может поставить под угрозу фазу восстановления.
- Контроль проходимости и документирование
- После вскрытия всех сосудов задокументируйте результаты фотографически и измерьте их (рисунок 1F и рисунок 2A, B).
- Подтверждают восстановление кровотока в дистальной части КЦА через инвазивную кривую артериального давления (измеряется на ушной артерии, прямой ветви наружной сонной артерии), которая также должна прийти в норму.
- Выполняйте флуоресцентную ангиографию, вводя 1 мл флуоресцеина IV, используя 2 полосовых фильтра, видеокамеру и велосипедный прожектор. Описание всей процедуры см. в предыдущих публикациях18,19.
- Замыкание
- Повторно приспособите жировую прокладку к анастомозу и зашить ее рассасывающимся швом 4-0. Наконец нанесите подкожный шов и кожу одиночными швами с помощью 4-0 рассасывающегося шва.
3. Послеоперационная фаза
- В конце операции прекратить прием изофлурана и системной анальгезии без реверсии с целью сохранения обезболивающего эффекта. Убедитесь, что контроль рефлекса глотания вернулся перед выполнением экстубации трахеи.
- Вводят мелоксикам 0,5 мг/кг IV для обеспечения анальгезии, аспирин (ASS) 10 мг/кг IV для предотвращения немедленных тромботических событий, витамин B12 100 мкг SC и кламоксил 20 мг/кг IV в качестве антибиотикотерапии.
- Обеспечьте дополнительную оксигенацию и согревание до тех пор, пока кролик самопроизвольно не восстановит стернальную ложбину. Выполните спасательное обезболивание метадоном, если наблюдаются какие-либо признаки боли. Осуществлять послеоперационное наблюдение и уход 4 раза в день в течение первых 3 предоперационных дней, в соответствии с методическими рекомендациями по оценке и управлению болью у грызунов и кроликов23,24.
- Обеспечьте послеоперационное обезболивание фентаниловым пластырем (12 мкг / ч), нанесенным на наружное ухо, мелоксикамом 1x / SC в течение 3 дней и метадоном в качестве спасательной терапии, а также оценочным листом для оценки боли (дополнительный файл).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Создание культи и бифуркационной аневризмы было успешным у всех 5 новозеландских белых кроликов без интраоперационных осложнений. Во время операции или в течение периода наблюдения 24 ± 2 дня не наблюдалось смертности. Один кролик испытал послеоперационные осложнения с вестибулярным синдромом и слепотой правой стороны. Животное выздоровело полностью и спонтанно через 24 ч. Это осложнение не мешало его нормальной деятельности (свободным движениям, приему воды и пищи, взаимодействию с другими животными) и не требовало какого-либо специфического лечения. Спонтанного разрыва аневризмы не было.
Средняя продолжительность операции составила 221 мин (от 190 до 255 мин). Все аневризмы были запатентованы сразу после операции, за исключением одной бифуркационной аневризмы, которая показала экстремальную реакцию тканей из-за инкубации эластазы и немедленного тромбоза. При последующем наблюдении проходимость аневризмы была подтверждена магнитно-резонансной ангиографией (рисунок 3) и макроскопическим осмотром после извлечения ткани (рисунок 4). За исключением бифуркационной аневризмы, которая уже тромбовалась во время операции, все аневризмы все еще были запатентованы в конечной точке наблюдения. Это привело к проходимости 90% (9 из 10).
Макроскопический осмотр и измерение аневризм после отбора проб показывают рост всех аневризм со средним размером 5,4 мм х 2,4 мм х 2,3 мм ± 1 мм х 0,6 мм х 0,3 мм при создании и 4,5 мм х 3,1 мм х 2,5 мм ± 1,5 мм х 0,9 мм х 0 мм при сборе аневризмы пня; и 3,4 мм x 2 мм x 2,1 мм ± 0,6 мм x 1 мм x 0,4 мм при создании и 3,8 мм x 2,8 мм x 2,6 мм ± 1,2 мм x 0,3 мм x 0,6 мм при сборе для бифуркационных аневризм. Интересно, что бифуркационные аневризмы выросли больше, чем аневризмы культи со средним объемом 14,4 мм3 ± 3,5мм3 при создании и 28,6 мм3 ± 16,4мм3 при экстракции (соотношение 1,9) против объема при создании 30,8 мм3 ± 15 мм3 и 34,9 мм3 ± 24,1 мм3 при экстракции (соотношение 1,1) для пневого варианта.
Рисунок 1: Этапы операции. (А) Нанесение 2 временных зажимов на правый КЦА: первый по своему происхождению от брахиоцефального ствола и второй ~2 см дистальнее первого. Звездочка указывает на локализацию артериотомии с помощью 22 г внутривенного катетера (IV-катетера). (B) После введения и фиксации IV-катетера с лигатурой 4-0 промыть сегмент гепаринизированным NaCl (500 ЕД/100 мл 0,9% физиологического раствора) и ввести 0,1-0,2 мл эластазы (100 ЕД, ранее растворенных в 5 мл буфера TRIS). Инкубировать в течение 20 мин. (С) Применяют 2 нерезорбируемые лигатуры (6-0): первую 5 мм дистальнее к проксимальному зажиму, а вторую просто проксимально под артериотомию. (D) Разрезать сосуд ~ 3 мм над лигатурами, чтобы создать аневризму культи и аутологичный трансплантат для аневризмы бифуркации. (E) Анастомоз правого CCA и аутологичного трансплантата на левом CCA для создания бифуркационной аневризмы. (F) Конечный результат с аневризмой культи с правой стороны и бифуркационной аневризмой с левой стороны. Сокращения: CCA = общая сонная артерия; IV = внутривенно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Интраоперационная фотодокументация результатов. Желтая пунктирная линия представляет среднюю линию с указанием черепного и каудального направлений. (А) Вид аневризмы культи с правой стороны шеи. SCEM втягивается медиально с помощью петли сосуда (синего цвета). (B) Вид бифуркационной аневризмы на левой стороне шеи. Сокращения: SCEM = Грудиноцефальная мышца; SA = аневризма культи; СП = яремная вена; rCCA: правая общая сонная артерия; lCCA= левая общая сонная артерия; Tr = трахея; * = Рецидивирующая или гортанная ветвь; BA = Бифуркационная аневризма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Результаты магнитно-резонансной ангиографии при последующем наблюдении. Изображения из трехмерных последовательностей TOF, полученных с помощью МРТ 3 Тесла, сфокусированы на артериях шеи. (А) Аневризма культи (желтая стрелка) на правой подключичной артерии. (B) Бифуркационная аневризма (желтая стрелка) на бифуркации, создаваемой анастомозированием правого CCA на левом. Сокращения: TOF = время полета; МРТ = магнитно-резонансная томография; CCA = общая сонная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Макроскопическая фотодокументация после извлечения ткани. Крупные бороздки (2 деления) на клипе указывают на 1 мм, а незначительные бороздки между ними (одно деление) указывают на 0,5 мм. (А) Аневризма культи на брахиоцефальном стволе и правой подключичной артерии. (B) Бифуркационная аневризма на бифуркации, созданная анастомозированием правого ОАС на левом. Сокращения: SA = аневризма культи; BCT = брахиоцефальный ствол; rSC = правая подключичная артерия; БА = бифуркационная аневризма; CCA = общая сонная артерия; rCCA = правый CCA; lCCA = левый CCA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Гистологические данные аневризм культи и бифуркации. Образец окрашен гематоксилин-эозин (2-кратное увеличение). (A) Микроскопический обзор аневризмы культи (a) с брахиоцефальным стволом (b) и правой подключичной артерией (c). (*) указывает направление кровотока. (B) Микроскопический обзор бифуркационной аневризмы (a) с проксимальным левым CCA (b), дистальным левым CCA (c) и дистальным правым CCA (d). (*) указывает направление кровотока. В вставках в (A) и (B), I) представляет собой оболочку intima стенки аневризмы, II) оболочку среды и III) тунику externa (20-кратное увеличение). Сокращения: CCA = общая сонная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее распространенная методика создания аневризмы предполагает создание аневризмы культи в начале правого ОАС, либо открытым, либо эндоваскулярным методом. Модель была подтверждена как стабильная нерастущая аневризма, которая остается открытой со временем20,21. Вторая возможная методика предполагает микрохирургическое создание аневризмы артериальной бифуркации путем анастомозирования правого ОАС на левом и наложения швов мешочку аневризмы на бифуркацию 14,22,23. Хотя оба метода показали пригодность для тестирования эндоваскулярных устройств и изучения патофизиологии, морфологии аневризмы и, следовательно, гемодинамические силы и характеристики потока существенно различаются. Учитывая, что существующие модели позволяют создавать только один тип аневризмы на животное, прямое сравнение естественного течения аневризм от типа бифуркации с аневризмами от типа пня в настоящее время затруднено.
Действительно, физиологические различия между животными (такие как кровяное давление или точное содержание коллагена в стенке сосуда) не всегда могут быть полностью контролированы в экспериментальных условиях и могут влиять на биологию аневризмы и естественное течение. Это исследование демонстрирует целесообразность создания модели кролика как с гемодинамическими, так и с бифуркационными условиями гемодинамических и дегенерированных стен у одного и того же животного (или у одного животного). Этот метод дал воспроизводимые аневризмы с низкой заболеваемостью и смертностью и высокой проходимостью (90%). Основным недостатком этого метода остается то же, что и для создания классического пня или самих бифуркационных моделей – необходимость в сложном лабораторном оборудовании и специфических микрохирургических навыках.
Особенно были определены два этапа, которые являются критическими во время этой операции: первый - рассечение и воздействие правого CCA до его возникновения в брахиоцефальном стволе. Следующие жизненно важные структуры могут быть особенно подвержены риску во время этого подхода: трахея, яремная вена и гортанный нерв. Поскольку манипуляции с трахеей могут ухудшить дыхание, предыдущая интубация обеспечивает проходимость дыхательных путей. Кроме того, поскольку операция длительная и находится в непосредственной близости от жизненно важных структур, полный мониторинг полезен для быстрого распознавания любых физиологических отклонений. Хирург также должен обратить внимание, чтобы избежать прямого давления или экстремального вытяжения на саму трахею. Яремная вена проходит непосредственно рядом с сонной артерией и, в некоторых случаях, прилипает к ней. Необходима чрезвычайная осторожность, чтобы избежать любого поражения. Мы рекомендуем защищать вену и держать ее влажной путем нанесения влажного тампона.
Наконец, предыдущие исследования уже описывали важность сохранения гортанных нервов. Любое поражение этих нервов послеоперационно приведет к появлению стридора с последовательно нарушенным дыханием и высокой вероятностью смерти животного. Чтобы предотвратить ятрогенное поражение нервов, рассечение КЦА должно избегать вытяжения тканей, округляющих артерию. Мы рекомендуем использовать ножницы, чтобы разрезать прилипшие ткани, а не отвлекать их. Нервы также должны быть идентифицированы как можно скорее после втягивания мускулатуры, чтобы держать их под визуальным контролем во время операции. Вторым критическим этапом является создание бесснатяжного микроанастомоза с переваренной эластазой аневризмой. Эта аневризма представляет собой высокую дегенерацию структуры ее стенки, затрудняя манипуляции с тканями. Это требует хороших микрохирургических навыков, и следует ожидать кривой обучения.
Кроме того, мы рекомендуем выбирать кроликов весом не менее 4,0 кг (средний возраст 25 (±5) недель), чтобы гарантировать правильный размер сосудов шеи. В классической модели аневризмы одной культи основным зарегистрированным осложнением в литературе был некроз трахеи после применения эластазы из-за трахеэзофагеальных артерий, возникающих из правого ОАС. Уже было предложено несколько модификаций методов, чтобы избежать проблемы 13,24,25,26. Такой подход позволяет легко идентифицировать эти ветви и их коагуляцию до применения эластазы, чтобы избежать любого оттока раствора эластазы и подобных осложнений.
Антикоагулянтный режим, применяемый во время операции, состоит из применения гепарина до первого применения клипса в правом CCA и перед удалением клипсы, а также восстановления циркуляции к левому CCA. Это может эффективно предотвратить образование тромба из-за временного прерывания потока и манипуляций с сосудами. Кроме того, уникальная доза аспирина (10 мг/кг в/в) вводится сразу после окончания операции для предотвращения образования тромба из-за тромбогенного действия шовного материала и эластазы. Этот протокол позволяет контролировать тромбогенные явления и обеспечивать проходимость аневризмы без увеличения осложнений кровотечения.
Модель культи является наиболее распространенной моделью мешковидной аневризмы кролика и уже несколько раз использовалась для трансляционных исследований эндоваскулярной терапии. Модель бифуркации также хорошо описана в литературе и подходит для изучения патофизиологии аневризмы и тестирования новых терапевтических стратегий. Однако обе модели показывают различные морфологии, что указывает на различные гемодинамические характеристики. Известно, что аневризмы преимущественно появляются при бифуркации и что рост зависит от напряжения сдвига стенки27,28. Предыдущие публикации также показали более высокий спонтанный тромбоз при хирургически созданных аневризмах боковых стенок по сравнению с бифуркационными29 и более высокую скорость окклюзии аневризмы культи после отклонения потока по сравнению с другими более сложными моделями8; однако сравнение всегда проводилось между двумя разными животными.
В настоящем исследовании были созданы стандартные аневризмы диаметром 2-4 мм, как описано ранее 14,22,29,30,31,32,33,34,35,36. Мы стремились создать аневризму культи с такими же размерами, как бифуркационные аневризмы для сравнения. Таким образом, текущий объем несколько меньше, так как было сообщено 5,8,10,11,13,21. Обе аневризмы, однако, показали тенденцию к росту через 1 месяц наблюдения. Таким образом, более длительный период наблюдения может вызвать образование аневризмы с большими объемами, что позволит лучше проводить долгосрочное сравнение с аневризмами у людей. Кроме того, эти гистологические данные, основанные на окрашивании гематоксилин-эозином, показывают клеточную стенку аневризмы и наличие гладкомышечных клеток в линейном или дезорганизованном рисунке, а также дезорганизацию эластических волокон (рисунок 5). Эти результаты коррелируют с текущими результатами, показывающими гистологическое сходство между аневризмами, индуцированными эластазой кролика, и внутричерепными аневризмами у людей11,32,37,38,39,40,41.
Результаты показывают техническую возможность создания как аневризм культи, так и бифуркации с использованием одного и того же хирургического подхода. Ограничением данного исследования является небольшой размер выборки, который не позволяет провести статистический анализ или реальное сравнение гистологических различий между аневризмами культи и бифуркации. Тем не менее, эта модель дает возможность исследовать различия между обеими аневризмами с точки зрения роста, разрыва, спонтанной окклюзии и гистологических изменений в будущих экспериментах с увеличенными размерами выборки и различным временем наблюдения, чтобы точно определить преимущества и характеристики обоих типов аневризм. Кроме того, эта новая хирургическая модель позволяет применять эндоваскулярные устройства в двух различных конфигурациях и условиях потока у одного животного, а также во время уникальной процедуры. Это уменьшает количество необходимых животных и потенциально повышает эффективность доклинических испытаний.
В заключение, это исследование описывает воспроизводимый метод создания 2 аневризм с различными условиями потока и сильно дегенерированными стенками в пределах одного животного. Предложенная модель позволяет проводить прямое сравнение естественного течения и эффектов эндоваскулярной терапии мешковых аневризм с учетом роли гемодинамики. Наконец, он обеспечивает эффективную модель, которая способствует сокращению используемых животных и общих затрат на эксперименты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят профессора Ханса Рудольфа Видмера, доктора Луку Ремонду и профессора Хавьера Фандино за их научную поддержку и технический вклад в эту работу. Отдельное спасибо Ольгице Беслак за ее советы во время процедур и Кей Неттельбек за его помощь. Кроме того, мы благодарим Даниэлу Касони DVM, доктора философии и ветеринара. Луизана Гарсия, д-р Алессандра Бергадано и д-р Карлотта Детто за их специализированную ветеринарную поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP292ZH | |
| 4-0 resorbable suture | Ethicon Inc., USA | VCP304H | |
| 6-0 non absorbable suture | B. Braun, Germany | C0766070 | |
| 9-0 non absorbable suture | B. Braun, Germany | G1111140 | |
| Adrenaline | Amino AG | 1445419 | any generic |
| Amiodarone | Helvepharm AG | 5078567 | any generic |
| Anesthesia machine | Dräger | any other | |
| Aspirin | Sanofi-Aventis (Suisse) SA | 622693 | any generic |
| Atropine | Labatec Pharma SA | 6577083 | any generic |
| Bandpass filter blue | Thorlabs | FD1B | any other |
| Bandpass filter green | Thorlabs | FGV9 | any other |
| Biemer vessel clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FD560R | any other |
| Bipolar forceps | any other | ||
| Bispectral index (neonatal) | any other | ||
| Blood pressure cuff (neonatal) | any other | ||
| Bycilces spotlight | any other | ||
| Clamoxyl | GlaxoSmithKline AG | 758808 | any generic |
| Dexmedetomidine | Ever Pharma | 136740-1 | any generic |
| Elastase | Sigma Aldrich | E7885 | |
| Electrocardiogram electrodes | |||
| Ephedrine | Amino AG | 1435734 | |
| Esmolol | OrPha Swiss GmbH | 3284044 | |
| Fentanyl (intravenous use) | Janssen-Cilag AG | 98683 | |
| Fentanyl (transdermal) | Mepha Pharma AG | 4008286 | |
| Fluoresceine | Curatis AG | 5030376 | |
| Fragmin | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 1906725 | |
| Heating pad or heating forced-air warming system | |||
| Isotonic sodium chloride solution (0.9%) | Fresenius KABI | 336769 | |
| Ketamine | Pfizer PFE Switzerland GmbH | 342261 | |
| lid retractor | Approach | ||
| Lidocaine | Streuli Pharma AG | 747466 | |
| Longuettes | |||
| Metacam | Boehringer Ingelheim | P7626406 | Medication |
| Methadone | Streuli Pharma AG | 1084546 | Sedaton |
| Micro-forceps curved | Ulrich Swiss, Switzerland | U52-015-15 | |
| Micro-forceps straight 2x | Ulrich Swiss, Switzerland | U52-010-15 | |
| Microscissors | Ulrich Swiss , Switzerland | U52-327-15 | |
| Midazolam | Accord Healthcare AG | 7752484 | |
| Needle 23 G | arteriotomy | ||
| Needle holder | |||
| O2-Face mask | |||
| Operation microscope | Wild Heerbrugg | ||
| Papaverin | Bichsel | topical application | |
| Povidone iodine | Mundipharma Medical Company | any generic | |
| Prilocaine-lidocaine creme | Emla | ||
| Propofol | B. Braun Medical AG, Switzerland | General anesthesia | |
| Pulse oxymeter | |||
| Rectal temperature probe (neonatal) | |||
| Ringer Lactate | Bioren Sintetica SA | Infusion | |
| Ropivacain | Aspen Pharma Schweiz GmbH | 1882249 | Local anesthesia |
| Scalpell | Swann-Morton | 210 | |
| Small animal shaver | |||
| Soft tissue forceps | |||
| Soft tissue spreader | |||
| Stainless steel sponge bowls | |||
| Sterile micro swabs | |||
| Stethoscope | |||
| Surgery drape | |||
| Surgical scissors | |||
| Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mL | |||
| Tris-Buffer | Sigma Aldrich | 93302 | Elastase solution |
| Vascular clip applicator | B. Braun, Germany | FT495T | |
| Vein and arterial catheter 22 G | |||
| vessel loop | Approach | ||
| video camera or smartphone | |||
| Vitarubin | Streuli Pharma AG | 6847559 | |
| Yasargil titan standard clip (2x) | B. Braun Medical AG, Aesculap, Switzerland | FT242T |
References
- Grasso, G., Alafaci, C., Macdonald, R. L. Management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: State of the art and future perspectives. Surgical Neurology International. 8, 11 (2017).
- Raymond, J., et al. Long-term angiographic recurrences after selective endovascular treatment of aneurysms with detachable coils. Stroke. 34 (6), 1398-1403 (2003).
- Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
- Thompson, J. W., et al. In vivo cerebral aneurysm models. Neurosurgical Focus. 47 (1), 20 (2019).
- Bouzeghrane, F., et al. In vivo experimental intracranial aneurysm models: a systematic review. American Journal of Neuroradiology. 31 (3), 418-423 (2010).
- Strange, F., Gruter, B. E., Fandino, J., Marbacher, S. Preclinical intracranial aneurysm models: a systematic review. Brain Sciences. 10 (3), 134 (2020).
- Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
- Fahed, R., et al. Testing flow diversion in animal models: a systematic review. Neuroradiology. 58 (4), 375-382 (2016).
- Zeng, Z., et al. Hemodynamics and anatomy of elastase-induced rabbit aneurysm models: similarity to human cerebral aneurysms. American Journal of Neuroradiology. 32 (3), 595-601 (2011).
- Ding, Y. H., et al. Long-term patency of elastase-induced aneurysm model in rabbits. American Journal of Neuroradiology. 27 (1), 139-141 (2006).
- Short, J. G., et al. Elastase-induced saccular aneurysms in rabbits: comparison of geometric features with those of human aneurysms. American Journal of Neuroradiology. 22 (10), 1833-1837 (2001).
- Andereggen, L., et al. Three-dimensional visualization of aneurysm wall calcification by cerebral angiography: Technical case report. Journal of Clinical Neuroscience. 73, 290-293 (2020).
- Hoh, B. L., Rabinov, J. D., Pryor, J. C., Ogilvy, C. S. A modified technique for using elastase to create saccular aneurysms in animals that histologically and hemodynamically resemble aneurysms in human. Acta Neurochirurgica. 146 (7), 705-711 (2004).
- Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157 (2020).
- Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biology. 18 (7), 3000411 (2020).
- Prescott, M. J., Lidster, K. Improving quality of science through better animal welfare: the NC3Rs strategy. Lab Animal. 46 (4), 152-156 (2017).
- Portier, K., Ida, K. K. The ASA Physical Status Classification: What is the evidence for recommending its use in veterinary anesthesia?-A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 5, 204 (2018).
- Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
- Strange, F., et al. Fluorescence angiography for evaluation of aneurysm perfusion and parent artery patency in rat and rabbit aneurysm models. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), e59782 (2019).
- Altes, T. A., et al. 1999 ARRS Executive Council Award. Creation of saccular aneurysms in the rabbit: a model suitable for testing endovascular devices. American Journal of Roentgenology. 174 (2), 349-354 (2000).
- Brinjikji, W., Ding, Y. H., Kallmes, D. F., Kadirvel, R. From bench to bedside: utility of the rabbit elastase aneurysm model in preclinical studies of intracranial aneurysm treatment. Journal of NeuroInterventional Surgery. 8 (5), 521-525 (2016).
- Sherif, C., Marbacher, S., Erhardt, S., Fandino, J. Improved microsurgical creation of venous pouch arterial bifurcation aneurysms in rabbits. American Journal of Neuroradiology. 32 (1), 165-169 (2011).
- Bavinzski, G., et al. Experimental bifurcation aneurysm: a model for in vivo evaluation of endovascular techniques. Minimally Invasive Neurosurgery. 41 (3), 129-132 (1998).
- Lewis, D. A., et al. Morbidity and mortality associated with creation of elastase-induced saccular aneurysms in a rabbit model. American Journal of Neuroradiology. 30 (1), 91-94 (2009).
- Wang, K., et al. Neck injury is critical to elastase-induced aneurysm model. American Journal of Neuroradiology. 30 (9), 1685-1687 (2009).
- Cesar, L., et al. Neurological deficits associated with the elastase-induced aneurysm model in rabbits. Neurological Research. 31 (4), 414-419 (2009).
- Aoki, T., Nishimura, M. The development and the use of experimental animal models to study the underlying mechanisms of CA formation. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 535921 (2011).
- Frosen, J., Cebral, J., Robertson, A. M., Aoki, T. Flow-induced, inflammation-mediated arterial wall remodeling in the formation and progression of intracranial aneurysms. Neurosurgical Focus. 47 (1), 21 (2019).
- Gruter, B. E., et al. Comparison of aneurysm patency and mural inflammation in an arterial rabbit sidewall and bifurcation aneurysm model under consideration of different wall conditions. Brain Sciences. 10 (4), 197 (2020).
- Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071 (2014).
- Marbacher, S., et al. Complex bilobular, bisaccular, and broad-neck microsurgical aneurysm formation in the rabbit bifurcation model for the study of upcoming endovascular techniques. American Journal of Neuroradiology. 32 (4), 772-777 (2011).
- Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
- Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
- Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rat model - Introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359 (2017).
- Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
- Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of NeuroInterventional Surgery. , (2021).
- Lyu, Y., et al. An effective and simple way to establish eastase-induced middle carotid artery fusiform aneurysms in rabbits. Biomed Research International. 2020 (10), 1-12 (2020).
- Wang, S., et al. Rabbit aneurysm models mimic histologic wall types identified in human intracranial aneurysms. Journal of NeuroInterventional Surgery. 10 (4), 411-415 (2018).
- Kang, W., et al. A modified technique improved histology similarity to human intracranial aneurysm in rabbit aneurysm model. Neuroradiology Journal. 23 (5), 616-621 (2010).
- Frosen, J., et al. Remodeling of saccular cerebral artery aneurysm wall is associated with rupture: histological analysis of 24 unruptured and 42 ruptured cases. Stroke. 35 (10), 2287-2293 (2004).
- Frosen, J., et al. Growth factor receptor expression and remodeling of saccular cerebral artery aneurysm walls: implications for biological therapy preventing rupture. Neurosurgery. 58 (3), 534-541 (2006).
