Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att erhålla stabila vilotillstånd funktionella magnetisk resonanstomografi (rs-fMRI) data från en råtta som använder låg dos isofluran i kombination med låg dos dexmedetomidine.
Abstract
Vila-tillstånd funktionell magnetisk resonanstomografi (rs-fMRI) har blivit en alltmer populär metod för att studera hjärnans funktion i ett vilande, icke-uppgiftstillstånd. Detta protokoll beskriver en preklinisk överlevnadsmetod för att erhålla rs-fMRI-data. Att kombinera lågdosisfluran med kontinuerlig infusion av α2 anerga receptoragonist dexmedetomidin ger ett robust alternativ för stabilt dataförvärv av hög kvalitet samtidigt som hjärnans nätverksfunktion bevaras. Dessutom möjliggör detta förfarande spontan andning och nästan normal fysiologi hos råttan. Ytterligare avbildningssekvenser kan kombineras med förvärv av vilotillstånd som skapar experimentella protokoll med bedövningsstabilitet på upp till 5 h med den här metoden. Detta protokoll beskriver installation av utrustning, övervakning av råtta fysiologi under fyra distinkta faser av anestesi, förvärv av vilotillstånd skanningar, kvalitetsbedömning av data, återvinning av djuret och en kort diskussion om efterbehandling data analys. Detta protokoll kan användas över en mängd olika prekliniska gnagare modeller för att hjälpa till att avslöja de resulterande hjärnan nätverk förändringar som uppstår i vila.
Introduction
Vilotillstånd funktionell magnetisk resonanstomografi (rs-fMRI) är ett mått på signalen om blod-syre-nivåberoende (BOLD) när hjärnan är i vila och inte engagerad i någon särskild uppgift. Dessa signaler kan användas för att mäta korrelationer mellan hjärnregioner för att bestämma den funktionella anslutningen inom neurala nätverk. rs-fMRI används ofta i kliniska studier på grund av dess icke-invasivitet och den låga ansträngning som krävs av patienter (jämfört med uppgiftsbaserad fMRI) vilket gör det optimalt för olika patientpopulationer1.
Tekniska framsteg har gjort det möjligt att anpassa rs-fMRI för användning i gnagaremodeller för att avslöja mekanismer som ligger till grund för sjukdomsstater (sereferens 2 för granskning). Prekliniska djurmodeller, inklusive sjukdoms- eller knockoutmodeller, tillåter ett brett spektrum av experimentella manipuleringar som inte är tillämpliga hos människor, och studier kan också använda obduktionsprover för att ytterligare förbättraexperimenten 2. På grund av svårigheten att både begränsa rörelse och mildra stress utförs MRI-förvärv hos gnagare traditionellt under anestesi. Bedövningsmedel, beroende på deras farmakokinetik, farmakodynamik och molekylära mål, påverkar hjärnans blodflöde, hjärnans ämnesomsättning och kan potentiellt påverka neurovaskulära kopplingsvägar.
Det har gjorts många ansträngningar för att utveckla bedövningsprotokoll som bevarar neurovaskulär koppling och hjärnansnätverksfunktion 3,4,5,6,7,8. Vi rapporterade tidigare en bedövningsregim som applicerade en låg dos isofluran tillsammans med en låg dos av α2 aterenergiska receptor agonist dexmedetomidine9. Råttor enligt denna anestesimetod uppvisade robusta BOLD-svar på whisker stimulering i regioner som överensstämmer med etablerade projektionsvägar (ventrolateral och ventromedial thalamic atomkärnor, primära och sekundära somatosensory cortex); storskaliga vilotillstånd hjärnnätverk, inklusive standardläge nätverk10,11 och salience nätverk12 har också konsekvent upptäckts. Dessutom tillåter detta bedövningsprotokoll upprepad avbildning på samma djur, vilket är viktigt för att övervaka sjukdomsprogressionen och effekten av experimentella manipuleringar längsgående.
I den aktuella studien beskriver vi de experimentella inrättning, djurberedning och fysiologiska övervakningsförfaranden som är involverade. I synnerhet beskriver vi de specifika bedövningsfaserna och förvärvet av skanningar under varje fas. Datakvaliteten utvärderas efter varje vilotillståndssökning. En kort sammanfattning av analysen efter skanning ingår också i diskussionen. Laboratorier som är intresserade av att avslöja potentialen att använda rs-fMRI hos råttor kommer att finna detta protokoll användbart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes på en 9,4 T MR-skanner och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Dartmouth College. Ytterligare godkännande erhölls för att registrera och visa de djur som användes i videon och siffrorna nedan.
1. Förberedelser före skanning
- Subkutan infusionslinje
- Ta delvis bort en 23 G nål från förpackningen så att nålspetsen förblir steril.
- Håll fast nålens nav ordentligt och använd ett rakblad för att få nålaxeln där den möter navet.
- Kläm fast en nålhållare runt axeln direkt under poängsättningen och bryt försiktigt axeln från navet.
- Sätt in 1/3 av nålaxeln (trubbig ände) i tidigare steriliserad PE50-linje med tillräckligt med linjelängd för att sträcka sig från läkemedelspumpen till djuret inuti magnethålet.
- Utspädning av dexmedetomidin och atipamezole
- Bered en lösning av utspädd dexmedetomidinhydroklorid med 0,5 ml 0,5 mg/ml blandat med 9,5 ml steril saltlösning i en klar, steril glasflaska (utspädd koncentration = 0,025 mg/ml).
- Bered en lösning av utspädd atipamezole med 0,1 ml 5 mg/ml buljong blandat med 9,9 ml steril saltlösning i en klar, steril glasflaska (utspädd koncentration = 0,05 mg/ml).
- Skanningsparametrar
- Använd parametrarna i tabell 1 för att förbereda skanningssekvenser.
2. Fas 1-anestesi: Induktion och beredning av djur
- Installationen
- Se till att all utrustning är på och fungerar som den ska, inklusive syre- och luftblandare, värmedyna och aktivt rensningssystem (se figur 1).
- Ställ in värmesystemets temperaturinställningspunkt på 37,5 °C.
- Induktion av djur
- Placera djuret (90 dagar gammalt, manlig Sprague Dawley-råtta) i induktionskammaren och inducera anestesi med 2,5% isofluran i 30% syreberikad luft.
OBS: Ett brett utbud av djur åldrar och båda könen kan användas. - När djuret har bedövats, ta bort det från kammaren, väg djuret och placera det i näskonen (vid 2,5% isofluran) på värmeplattan i förberedelseutrymmet.
- Placera djuret (90 dagar gammalt, manlig Sprague Dawley-råtta) i induktionskammaren och inducera anestesi med 2,5% isofluran i 30% syreberikad luft.
- Djurberedning
- Applicera oftalmisk smörjsalva på varje öga för att förhindra torkning.
- Bekräfta djupet av anestesi genom brist på tå nyp svar.
- Använd klippare för att raka ett 2" med 2" kvadratiskt område på den nedre ländryggsregionen på djurets rygg (dvs. direkt ovanför svansen).
- Administrera 0, 015 mg/kg av dexmedetomidinlösningen med en intraperitoneal (dvs. injektion) (t.ex. skulle en 300 g råtta få 0, 18 ml) i bukens nedre högra kvadrant med en 25 G-nål.
- Växla isofluranflöde från förberedelseutrymmet till djurvaggan.
- Flytta djuret in i djurets vagga. Placera råttans framtänder säkert över och in i bettstången. Tryck näskonen över näsan för att säkerställa en snäv passform.
OBS: Om munstyckskonen inte täcker underkäken, använd en paraffinfilm för att försiktigt hålla käken stängd samtidigt som du förseglar runt näskonen. - Placera andningsdynan under råttans buk under bröstkorgen och sätt tillbaka den tills andningsvågformen visar ett djupt tråg centrerat på varje andetag (se andningsvågform i figur 2).
- Övervaka djurets andning med hjälp av fysiologiövervakningsprogramvaran. Flytta till nästa fas av anestesi när andningen är mindre än 40 andetag/min (bpm; ca 5 min efter dexmedetomidininjektion).
3. Fas 2 anestesi: Djurinställning
- Sätt in öronstänger i öronkanalen för att stabilisera råttans huvud i djurvaggan. När du är placerad, dra framåt på bettstången och bekräfta att huvudet inte rör sig. Justera näskonen och paraffinfilmen efter behov (se figur 3a).
- Sätt in temperatursonden i ett försmord engångssondskydd. Sätt försiktigt in temperatursonden ungefär 1/2" i ändtarmen och tejpa fast den vid svansens botten med medicinsk tejp.
- Placera pulsoximeterklämman på bakfotens metatarsala område och se till att ljuskällan är på fotens botten (handflatan).
OBS: Rotation av klämman kan påverka signalen; Således leder skapandet av en hållare för att hålla tassen och klämman upprätt till större stabilitet. Observera också att tills råttan är vid normal kroppstemperatur kan syremättnaden vara låg (<95%). - Använd råttans vikt för att beräkna infusionshastigheten för att mata ut 0,015 mg/kg/h dexmedetomidin (en 300 g råtta får 0,18 ml/h).
- Ställ in läkemedelspumpen för att mata ut den beräknade infusionshastigheten.
- Fyll en 3 ml spruta med den sterila, utspädda dexmedetomidinlösningen och för in nålens spets i den öppna änden av den steriliserade infusionslinjen (sträcker sig från läkemedelspumpen till djurdockan med den subkutana nålen tidigare fastsatt). Fyll linjen och fäst sprutan i läkemedelspumpens spruthållare.
- Flytta skjutblocket framåt tills det rör kolven, och läkemedlet utvisas vid nålen, vilket säkerställer att infusionsledningen är helt fylld.
- Använd en alkoholservett, rengör det rakade området för att ta bort eventuellt herrelöst hår.
- Nyp ihop huden ungefär två fingerbredder ovanför svansens botten. Sätt in 1/3 av infusionsledningsnålen i tälthuden.
- Fäst nålen på huden med en 3" bit bred medicinsk tejp. Placera en andra bit bred medicinsk tejp över den första, över råttan och fäst på båda sidor av djurvaggan (se figur 4).
OBS: Det är mycket viktigt att den ferromagnetiska nålen är väl fastsatt för att förhindra rörelse under skanningen. - Påbörja infusionen av subkutan dexmedetomidin.
- Placera en bit gasväv på råttans näsa för att skapa en jämn yta för spolen. Använd papperstejp, som inte stör MR-signalen, för att fästa spolen på råttans huvud och centrera den över hjärnan (se figur 3b, c).
- Säkra alla linjer och kablar i djurvaggan med labbtejp och kontrollera om alla fysiologiska signaler är stabila (se figur 2).
- Placera pappershanddukar över djuret och säkra dem till djurvaggan med laboratorietejp. Om du använder ett luftvärmesystem, linda ett plastark runt hela vaggan för att hålla den varma luften.
- Flytta djuret in i borrhålet och finjustera magneten.
4. Fas 3 anestesi: Anatomisk skanning förvärv
- Minska isofluran till 1,5%, vilket resulterar i en stadig ökning av andningen till cirka 45-50 bpm. Stanna på denna nivå under den anatomiska skanningen.
- Använd FLASH-lokaliserarskanningen för att säkerställa att hjärnan är i linje med magnetisotcentret (Figur 5a). Flytta djuret och upprepa vid behov.
- Kör den högre upplösningen RARE localizer scan och använd denna skanningsutgång för att justera 15 sagittalsegment centrerade över hjärnan (vänster till höger, bild 5b).
- Justera den mellersta axiella sektorn med hjälp av den mellersta sagitalskivan till decussationen av det främre fattningsstället, som visas som en mörk fläck (figur 5c). Observera segmentförskjutningen som ska användas senare i vilotillståndsskanningarna.
- Skaffa 23 segment med både FLASH- och RARE-axiella protokoll för att underlätta registrering till ett gemensamt utrymme under analysen efter skanningen.
- Shim över hela hjärnan med hjälp av PRESS-sekvensen.
5. Fas 4: Förvärv av vilotillståndsskanning
- Efter att ha slutfört anatomiska skanningar, minska isofluran till 0,5% till 0,75%, justera så att djurets andning är 60-65 andetag per minut. Stanna på denna nivå i minst 10 minuter innan du börjar vilotillståndsskanning för att säkerställa stabilitet.
- När fysiologin är stabil (andningsområdet är 60-75 bpm utan flämtning eller oegentligheter, kärnkroppstemperaturen är 37,5 ± 1,0 °C och syremättnaden är 95% eller högre), förvärva en 15-skiva EPI-skanning med samma skiva offset som den anatomiska axiella serien.
- När varje vilotillståndssökning är klar kontrollerar du kvaliteten med hjälp av en oberoende komponentanalys (ICA) för att sönderdela data i rumsliga och temporala komponenter.
- Få minst tre högkvalitativa vilotillståndsskanningar.
6. Återhämtning efter skanning
- När skanningen är klar, öka isofluran till 2% och stoppa subkutan dexmedetomidininfusion.
- Ta bort djurvaggan från magnethålet, packa upp djuret och ta bort öronstänger, temperatursond, pulsoximeterklämma och dexmedetomidinnålen.
- Injicera 0,015 mg/kg av den utspädda atipamezolelösningen i råttans bakbensmuskel med en 1 ml spruta med en 25 G-nål (dvs. en 300 g råtta skulle få 0,09 ml).
- Placera råttan tillbaka i hemburen ovanpå en värmeplatta och övervaka tills djuret är ambulatoriskt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter varje vilotillståndsskanning bedöms stabiliteten med hjälp av en oberoende komponentanalys (ICA; exempelskript som ingår i tilläggsfiler). Bild 6 visar exempel på komponentutgångar från vilotillståndsskanningar. Bild 6a visar en signalkomponent från en skanning med hög stabilitet. Observera att komponenten rumsligt har hög regionalitet. Inom tidskursen under den rumsliga komponenten är signalen stabil och inte förutsägbar, vilket tyder på sann hjärnaktivitet. Effektspektrumet längst ner visar övervägande låga frekvenser. Bild 6b visar en komponent från samma genomsökning som figur 6a som representerar brus. Notera icke-regionaliteten i den rumsliga komponenten, högfrekvent tidskurs och högfrekvent topp i effektspektrumet. Slutligen visar figur 6c en komponent från en skanning med instabil anestesi. Tidskursen är variabel och oregelbunden. När detta inträffar behövs förbättringar av bedövningsprotokollet, vanligtvis till tätning av noskonen och rensning av rökgaser.
Figur 1:Förberedelseutrymme och MRT-djur vagga. a) Förberedelseutrymme. Vakuumet rensar rökgaser från både induktionskammaren och noskonen vid djurvaggan. Värmedynan hjälper till att bibehålla djurtemperaturen under både fas 1 och återhämtning. b) MR-djur vagga. Toppen anger komponenter i djurinställningen i fas 2. Botten visar en råtta helt inställd och redo för skanning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Fysiologisk skanningsutgång. Syremättnad (PulseOx, 96%), hjärtfrekvens (325 BPM [slag per minut]), andningshastighet (61 andetag/min) och kroppstemperatur (T1, 37,5 °C) övervakas ständigt under hela skanningssessionen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3:Näskon och spoleplacering. a)Närbild på näskonen som förseglats runt djurets näsa och underkäke. b)Överliggande vy över ytspolens inriktning mot hjärnan. c)Sidovy av spolejustering med djurets mittpunkt. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4:Subkutan dexmedetomidininfusionsledning och nålplacering. b)Tejp som fäster nålen på djurets hud. c)Tejpa över djurvaggan för att förhindra att den ferromagnetiska nålen förs förflyttning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 5: Anatomisk skanningsjustering. (a) Localizer scan för att anpassa djurets hjärna till magnetisotcentret, noterat med hårkors. b)Sagittala skivor i linje över hjärnan från vänster till höger. c)Anpassning till avhoppet av det främre kommissarien, angiven med den vita pilen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6:Kvalitetsbedömning med hjälp av oberoende komponentanalys.( a ) Signalkomponent under stadig anestesi. b)Bullerkomponent under stadig anestesi. c)Ostadig anestesi. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Avsöka | Sekvens | Orientering | FOV (mm x mm) | Matris | Skivor | Skivans tjocklek (mm) | TE (ms) | TR (ms) | Medelvärden | Ekoavstånd (ms) | Sällsynt faktor | Upprepningar | Skanningstid |
| Localizer | BLIXT | Alla plan | 50 | 256 | 1/dir | 1 | 2.5 | 100 | 1 | 1 | 12,8 s | ||
| Localizer | SÄLLSYNT | Alla plan | 35 | 192 | 1/dir | 0.75 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min |
| Anat | SÄLLSYNT | Sagittal | 35 | 192 | 15 | 1 | 28 | 2500 | 1 | 7 | 8 | 1 | 1 min |
| Anat | BLIXT | Axial | 35 | 192 | 23 | 1 | 5 | 250 | 2 | 1 | 1 min 36 s | ||
| Anat | SÄLLSYNT | Axial | 35 | 192 | 23 | 1 | 28 | 2500 | 4 | 7 | 8 | 1 | 4 min |
| Shims | TRYCKA | Alla plan | 16.223 | 2500 | 1 | 1 | 2,5 s | ||||||
| Vilotillstånd | EPI | Axial | 35 | 64 | 15 | 1 | 15 | 1200 | 1 | 300 | 6 min vardera |
Tabell 1: Referenstabell med skanningsparametrar. Parametrar för de sekvenser som beskrivs i protokollet. FLASH = Snabb lågvinkelskott, SÄLLSYNT = Snabb förvärv med avslappningsförbättring, TRYCK = Punkt RESolved spektroskopi, EPI = Echo Planar Imaging.
Kompletterande filer: Exempelskript för ICA:s kvalitetsbedömning. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Djurets stabilitet, både fysiskt och fysiologiskt, är nyckeln till att få högkvalitativa vilotillståndsdata. Detta protokoll uppnår stabilitet genom att gå igenom fyra distinkta faser av anestesi. Det är absolut nödvändigt att djuret har uppfyllt de fastställda fysiologiska trösklarna innan det går vidare till nästa fas av anestesi; Eftersom denna metod förlitar sig på fysiologiska autoregulatoriska mekanismer kan enskilda djur kräva något olika mängder tid vid varje anestesifas. Det är vår erfarenhet att det är effektivare att ta mer tid i varje fas än att skynda sig genom tidigare stadier utan att ge råttans fysiologi tillräckligt med tid att bosätta sig. De viktigaste komponenterna som möjliggör stabilitet är näskonens passform och korrekt rensning av spillgas.
En ordentligt förseglad noskon och rensning gör att djuret kan förbli stabilt med regelbundet försedd andning och stadig syremättnad. Om flämtande, oregelbundet avstånd, andningsskydd eller minskande syremättnadsnivåer uppstår, bör man arbeta för att förbättra näskontätningen och rensningen. Noskonen ska passa tätt men bör inte trycka in i näsbryggan. En anpassad noskon kan behöva tillverkas. Den ursprungliga noskonen från vår tillverkare hade en luft uttagningsventil som var för liten, så ett falkrör var utrustat med en större förseglad vakuumledning närmare djuret. Detta resulterade i bättre clearance av utgången CO2 och stadig syremättnad. Som nämnts i protokollet kan paraffinfilm lindas runt underkäken och kanten av näskonen, men om den lindas för tätt kan den begränsa andningen och leda till instabilitet. Dessutom påverkar felaktig placering av öronstänger och bettstång inte bara huvudets nödvändiga stabilitet för avbildning utan kan också påverka andningen; fortsatt blinkande eller hörbart ljud från djuret är en sannolik indikation på felaktig placering av öronstången. Framtänderna ska sitta säkert på bettstången och dras framåt efter placeringen av öronstången för att säkerställa en snäv passform. Råttans tunga kan behöva dras framåt om den sitter för långt bak i munnen och begränsar korrekt andning.
Eftersom varje system är unikt krävs finjustering av vakuumnivån för att uppnå optimal rensning. Som praktisk guide bör det vara möjligt att känna en liten mängd sug antingen genom att placera ett finger över vakuumledningsöppningen inuti näskonen eller genom att försegla hela noskonöppningen med handflatan. Matchande flödeshastighet för anestesiinmatning (0,8 L/min användes här) är en bra utgångspunkt. Syremättnaden hos djuret bör förbli över 95% under hela skanningen. Om syremättnaden visar en nedåtgående trend kan detta vara en indikation på att CO2 byggs upp i noskot och rensningen behöver ökas. En annan möjlighet är att trycket från pulsoximeterklämman på foten måste justeras, antingen lossas för att förbättra blodflödet eller dras åt för att säkerställa en stark, stabil signal. Om andningen av djuret är högre än de arösklar som anges, kan detta tyda på att rensningen är för hög och tar bort för mycket isofluran. I sällsynta fall kan det vara nödvändigt att öka dosen av subkutan dexmedetomidin till 0, 02 mg/kg/tim, men vi har funnit att 0, 015 mg/kg har fungerat bra i ett brett spektrum av råtta åldrar och båda könen, och stöds i farmakologiska studier4.
Den skanningstid som krävs för fMRI-aktivering är en funktion av effektstorlek, rumsligt signal-till-brusförhållande (SNR) och temporal SNR, vilket tidigare visats av Murphy et al.13. Användningen av en liten ytspole (2 cm) och högt magnetfält (9,4 T) förbättrar avsevärt SNR- och BOLD-känsligheten. Med vår bildinställning har vi funnit att en enda 6 minuters skanning är tillräcklig för att upptäcka ett robust funktionellt anslutningsnätverk för vilotillstånd, i enlighet med vår tidigare rapport10. Ändå upprepar vi vanligtvis skanningen 3 till 4 gånger och genomsnitt resultaten för att härleda funktionella hjärnnätverk för enskilda djur. Alternativt kan man skanna en enda gång med längre varaktighet (10 min eller mer) för att härleda funktionella anslutningsnätverk14.
När du har samlat in högkvalitativ rs-fMRI med det här protokollet förbehandlar du data som tidigare publicerats15,16. Med användning av både öronstänger och en bitstång är rörelseartefakter i fMRI-tidskursen minimala, och användningen av rörelsekorrigering har inte haft någon märkbar effekt på våra data. Enskilda vilotillstånd EPI-skanningar måste vara skallade och registrerade i ett gemensamt utrymme (vi använder en enda representativ råtthjärna)16,17. Ta bort startvolymerna från varje EPI så att alla som ingår förvärvas när magneten är i stabilt tillstånd (vi tar bort 5 tidpunkter). Enskilda denoiseskanningar (se Representativa resultat för exempel på signal- och bruskomponenter). Tillämpa korrigering av segmenttid, samt linjär och kvadratisk trendborttagning, bandpassfiltrering (0,005-0,1 Hz) och rumslig utjämning (0,6 mm FWHM [full bredd vid halv maximal]). Ta dessutom bort den genomsnittliga signaltidskursen från den vita materian och ventriklarna genom linjär regression. Efter dessa standardförbearbetningssteg kan ytterligare analys på gruppnivå utföras inklusive fröbaserad funktionellanslutning 11,15,18,19,20,21,22, oberoende komponentanalyser10,20,22och modularitetsanalyser12,19.
Det finns två huvudfördelar med det nuvarande protokollet: 1) det möjliggör spontan hjärnaktivitet; och 2) det håller djuret i nästan normal fysiologi. Alternativa bedövningsmetoder (såsom propofol21,α-kloralose15och pankuroniumbromid i kombination med en annan bedövning21,23) har också använts för att förvärva vilotillståndsdata. Användning av en kombination av låg dos isofluran med låg dos dexmedetomidine, som beskrivs i detta protokoll, har dock visat sig endast minimalt störa hjärnans nätverksfunktioner samtidigt som den ger den fysiologiska stabilitet som behövs för att erhålla kvalitet vilotillstånd funktionell anslutning data9,10,18,24. Dessutom kan DJÄRVA svar från somatosensory stimulering9 och mekanisk whisker avböjning11 ses vid eller efter en period av 90 min när du använder detta protokoll, vilket tyder på en konsekvent upphetsning nivå. Intressant nog, använda dexmedetomidine i isolering kan framkalla epileptisk aktivitet; Denna verksamhet avskaffades dock med kompletterad isofluran8. En annan fördel med det nuvarande protokollet är att det eliminerar behovet av konstgjord ventilation. Även om mekanisk ventilation kan leda till ett smalare utbud av partiell koldioxid- och syremättnad över djur, i longitudinella studier, upprätthålla fysiologiska parametrar utan behov av intubation kan resultera i färre komplikationer och oönskade biverkningar.
Intresset för vilostats-fMRI har ökat avsevärt under de senaste 10 åren, och med det ett behov av att förvärva högkvalitativa, prekliniska vilotillståndsskanningar från gnagare. Detta överlevnadsprotokoll uppnår stabil anestesi i upp till 5 h med nära-normala fysiologi under vila-state förvärv. Eftersom protokollet är mycket stabilt kan ytterligare sekvenser (strukturella, stimulering, farmakologiska MRI, etc.) enkelt läggas till för att uppnå önskad experimentell design. Kombinationen av lågdosisfluran med dexmedetomidin som används i detta protokoll möjliggör en mängd olika prekliniska studier för prövare som är intresserade av att studera gnagarehjärnan i sitt vilotillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering från National Institute of Health (NIH) National Institute on Drug Abuse (NIDA) [DJW, EDKS, och EMB stöttades av anslag R21DA044501 tilldelat till Alan I. Gräsplan och DJW stöttades av lån T32DA037202 till Alan J. Budney] och Medborgareinstitut på alkoholmissbruk och alcoholism (NIAAA) [Anslag F31AA028413 till Emily D. K. Sullivan]. Ytterligare stöd gavs genom Alan I. Greens begåvade fond som Raymond Sobel Professor of Psychiatry vid Dartmouth.
Hanbing Lu stöds av National Institute on Drug Abuse Intramural Research Program, NIH.
Författarna vill erkänna och tacka den framlidne Alan I. Green. Hans orubbliga engagemang för samuppkomna sjukdomar bidrog till att etablera samarbete mellan författarna. Vi tackar honom för hans mentorskap och vägledning, som kommer att vara mycket saknad.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9.4T MRI | Varian/Bruker | Varian upgraded with Bruker console running Paravision 6.0.1 software | |
| Air-Oxygen Mixer | Sechrist | Model 3500CP-G | |
| Analysis of Functional NeuroImages (AFNI) | NIMH/NIH | Version AFNI_18.3.03 | Freely available at: https://afni.nimh.nih.gov/ |
| Animal Cradle | RAPID Biomedical | LHRXGS-00563 | rat holder with bite bar, nose cone and ear bars |
| Animal Physiology Monitoring & Gating System | SAII | Model 1025 | MR-compatible system including oxygen saturation, temperature, respiration and fiber optic pulse oximetry add-on |
| Antisedan (atipamezole hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-867-7097 | Zoetis, Manufacturer Item #10000449 |
| Ceramic MRI-Safe Scissors | MRIequip.com | MT-6003 | |
| Clippers | Patterson Veterinary | 07-882-1032 | Wahl touch-up trimmer combo kit, Manufacturer Item #09990-1201 |
| Dexmedesed (dexmedetomidine hydrochloride) | Patterson Veterinary | 07-893-1801 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item#17033-005-10 |
| Digital Rectal Thermometer Covers | Medline | MDS9608 | |
| FMRIB Software Library | FMRIB | MELODIC Version 3.15 | Freely available at: https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki |
| Heating Pad | Cara Inc. | Model 50 | |
| Hemostat forceps, straight | Kent Scientific | INS750451-2 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | Patterson Private Label, Manufacturer Item #14043-0704-06 |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip Inc. | 911103 | |
| Lab Tape, 3/4" | VWR International | 89097-990 | |
| Needles, 23 gauge | BD | 305145 | plastic hub removed |
| Parafilm Laboratory Film | Patterson Veterinary | 07-893-0260 | Medline Industries Inc., Manufacturer Item #HSFHS234526A |
| Planar Surface Coil | Bruker | T12609 | 2cm |
| Polyethylene Tubing | Braintree Scientific | PE50 50FT | 0.023" (inner diameter), 0.038" (outer diameter) |
| Puralube Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-2572 | Dechra Veterinary Products, Manufacturer Item #211-38 |
| Sprague Dawley Rats | Charles River | 400 SAS SD | |
| Sterile 0.9% Saline Solution | Patterson Veterinary | 07-892-4348 | Aspen Vet, Manufacturer Item #14208186 |
| Sterile Alcohol Prep Pads | Medline | MDS090735 | |
| Surgical Tape, 1" (3M Durapore) | Medline | MMM15381Z | 3M Healthcare, "wide medical tape" |
| Surgical White Paper Tape, 1/2" (3M Micropore) | Medline | MMM15300 | 3M Healthcare |
| Syringes, 1 mL w/ 25 gauge needle | BD | 309626 | |
| Syringes, 3 mL | BD | 309657 | |
| Vented induction and scavenging system | VetEquip Inc. | 942102 | 2 liter induction chamber with active scavenging |
| 411724 | omega flowmeter | ||
| 931600 | scavenging cube, "vacuum" | ||
| 921616 | nose cone, non-rebreathing |
References
- Smitha, K. A., et al. Resting state fMRI: A review on methods in resting state connectivity analysis and resting state networks. The Neuroradiology Journal. 30 (4), 305-317 (2017).
- Gorges, M., et al. Functional connectivity mapping in the animal model: Principles and applications of resting-state fMRI. Frontiers in Neurology. 8, (2017).
- Paasonen, J., Stenroos, P., Salo, R. A., Kiviniemi, V., Gröhn, O. Functional connectivity under six anesthesia protocols and the awake condition in rat brain. NeuroImage. 172, 9-20 (2018).
- Pawela, C. P., et al. A protocol for use of medetomidine anesthesia in rats for extended studies using task-induced BOLD contrast and resting-state functional connectivity. NeuroImage. 46 (4), 1137-1147 (2009).
- Jonckers, E., et al. Different anesthesia regimes modulate the functional connectivity outcome in mice. Magnetic Resonance in Medicine. 72 (4), 1103-1112 (2014).
- Williams, K. A., et al. Comparison of alpha-chloralose, medetomidine and isoflurane anesthesia for functional connectivity mapping in the rat. Magnetic Resonance Imaging. 28 (7), 995-1003 (2010).
- Zhurakovskaya, E., et al. Global functional connectivity differences between sleep-like states in urethane anesthetized rats measured by fMRI. PloS One. 11 (5), 0155343 (2016).
- Fukuda, M., Vazquez, A. L., Zong, X., Kim, S. -G. Effects of the α2-adrenergic receptor agonist dexmedetomidine on neural, vascular and BOLD fMRI responses in the somatosensory cortex. The European Journal of Neuroscience. 37 (1), 80-95 (2013).
- Brynildsen, J. K., et al. Physiological characterization of a robust survival rodent fMRI method. Magnetic Resonance Imaging. 35, 54-60 (2017).
- Lu, H., et al. Rat brains also have a default mode network. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (10), 3979-3984 (2012).
- Lu, H., et al. Low- but not high-frequency LFP correlates with spontaneous BOLD fluctuations in rat whisker barrel cortex. Cerebral Cortex. 26 (2), 683-694 (2016).
- Tsai, P. -J., et al. Converging structural and functional evidence for a rat salience network. Biological Psychiatry. 88 (11), 867-878 (2020).
- Murphy, K., Bodurka, J., Bandettini, P. A. How long to scan? The relationship between fMRI temporal signal to noise ratio and necessary scan duration. NeuroImage. 34 (2), 565-574 (2007).
- Birn, R. M., et al. The effect of scan length on the reliability of resting-state fMRI connectivity estimates. NeuroImage. 83, 550-558 (2013).
- Lu, H., et al. Synchronized delta oscillations correlate with the resting-state functional MRI signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (46), 18265-18269 (2007).
- Lu, H., et al. Registering and analyzing rat fMRI data in the stereotaxic framework by exploiting intrinsic anatomical features. Magnetic Resonance Imaging. 28 (1), 146-152 (2010).
- Cox, R. W. AFNI: software for analysis and visualization of functional magnetic resonance neuroimages. Computers and Biomedical Research. 29 (3), 162-173 (1996).
- Ash, J. A., et al. Functional connectivity with the retrosplenial cortex predicts cognitive aging in rats. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (43), 12286-12291 (2016).
- Hsu, L. -M., et al. Intrinsic insular-frontal networks predict future nicotine dependence severity. The Journal of Neuroscience. 39 (25), 5028-5037 (2019).
- Li, Q., et al. Resting-state functional MRI reveals altered brain connectivity and its correlation with motor dysfunction in a mouse model of Huntington's disease. Scientific Reports. 7, (2017).
- Lu, H., et al. Abstinence from cocaine and sucrose self-administration reveals altered mesocorticolimbic circuit connectivity by resting state MRI. Brain Connectivity. 4 (7), 499-510 (2014).
- Seewoo, B. J., Joos, A. C., Feindel, K. W. An analytical workflow for seed-based correlation and independent component analysis in interventional resting-state fMRI studies. Neuroscience Research. 165, 26-37 (2021).
- Broadwater, M. A., et al. Adolescent alcohol exposure decreases frontostriatal resting-state functional connectivity in adulthood. Addiction Biology. 23 (2), 810-823 (2018).
- Jaime, S., Cavazos, J. E., Yang, Y., Lu, H. Longitudinal observations using simultaneous fMRI, multiple channel electrophysiology recording, and chemical microiontophoresis in the rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 306, 68-76 (2018).
