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Biology

डी 11 एससीएफवी-क्षारीय फॉस्फेट फ्यूजन प्रोटीन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके ऊतकों में आइसोलेवुग्लैंडिंस का प्रत्यक्ष पता लगाना

Published: July 5, 2021 doi: 10.3791/62603
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4,6, 4, 5, 3, 4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Department of Biochemistry, Vanderbilt University, 4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine, 6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

यह लेख क्षारीय फॉस्फेट-संयुग्मित एससीएफवी डी 11 एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा ऊतकों में आइसोलेवुग्लैंडिंस के माप के लिए एक विस्तृत पद्धति प्रदान करता है। चूहों और मनुष्यों दोनों में उच्च रक्तचाप मॉडल का उपयोग ऊतक के नमूनों में आइसोलेवुग्लैंडीन माप से जुड़े चरण-दर-चरण प्रक्रियाओं और मौलिक सिद्धांतों को समझाने के लिए किया जाता है।

Abstract

आइसोलेवुग्लैंडिंस (आईएसओएलजी) अत्यधिक प्रतिक्रियाशील गामा केटोएल्डिहाइड हैं जो लिपिड पेरोक्सीडेशन और क्रॉसलिंक प्रोटीन के माध्यम से एच 2-आइसोप्रोस्टेन्स से बनते हैं जो सूजन और उच्च रक्तचाप सहित विभिन्न बीमारियों का कारण बनते हैं। ऊतकों में आईएसओएलजी संचय का पता लगाना रोग प्रक्रियाओं में उनकी भागीदारी पर प्रकाश डालने में महत्वपूर्ण है। हालांकि, ऊतकों में आईएसओएलजी का माप बेहद मुश्किल है, और वर्तमान में उपलब्ध उपकरण, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण सहित, श्रमसाध्य और बेहद महंगे हैं। यहां हम क्षारीय फॉस्फेट-संयुग्मित डी 11 एससीएफवी और इम्यूनोफ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा ई कोलाई में उत्पादित एक पुनः संयोजक फेज-डिस्प्ले एंटीबॉडी का उपयोग करके ऊतकों में आईएसओएलजी का सीटू पता लगाने के लिए एक नई विधि का वर्णन करते हैं। धुंधलापन को मान्य करने के लिए चार नियंत्रणों का उपयोग किया गया था: (1) डी 11 के साथ और उसके बिना धुंधला होना, (2) क्षारीय फॉस्फेट लिंकर के साथ बैक्टीरियल पेरिप्लाज्मिक अर्क के साथ धुंधला होना, (3) अप्रासंगिक एससीएफवी एंटीबॉडी धुंधलाहोना, और (4) धुंधला होने से पहले आईएसओएलजी के साथ प्रतिस्पर्धी नियंत्रण। हम उच्च रक्तचाप के साथ या बिना मानव और माउस दोनों ऊतकों में क्षारीय फॉस्फेट-संयुग्मित डी 11 की प्रभावशीलता का प्रदर्शन करते हैं। यह विधि संभवतः विभिन्न प्रकार की रोग प्रक्रियाओं में आईएसओएलजी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में काम करेगी।

Introduction

आइसोलेवुग्लैंडिंस (आईएसओएलजी), जिसे आइसोकेटल के रूप में भी जाना जाता है, 4-केटोएल्डिहाइड परिवार के आइसोमर हैं, जो लिपिड पेरोक्सीडेशन के उत्पाद हैं, और प्रोटीन 1,2 पर प्राथमिक अमाइन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। आइसोएलजी को कई बीमारियों में फंसाया गया है, जिसमें कार्डियोवैस्कुलर, अल्जाइमर, फेफड़े और यकृत रोग और कई प्रकार के कैंसरशामिल हैं। आईएसओएलजी का कार्डियोवैस्कुलर बीमारी (सीवीडी) में उनके योगदान में सबसे बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, जो संयुक्त राज्य अमेरिका सहित विश्व स्तर पर एक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य और आर्थिक बोझ है। यह अनुमान लगाया गया है कि 92.1 मिलियन अमेरिकी वयस्कों में कम से कम एक प्रकार का सीवीडी है, 2030 के अनुमानित अनुमान अमेरिकी वयस्क आबादी के 43.9% तक पहुंच गएहैं। रक्तचाप, कोलेस्ट्रॉल और धूम्रपान बंद करने को कम करने से सीवीडीघटनाओं के समग्र जोखिम और घटना कम हो जाती है।

उच्च रक्तचाप या उच्च रक्तचाप कार्डियोवैस्कुलर बीमारी के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है औरअमेरिकी आबादी के लगभग आधे हिस्से को प्रभावित करता है। पिछले अध्ययनों में पाया गया है कि सूजन उच्च रक्तचाप का एक अंतर्निहित कारण है और यह कि आईएसओएलजीएक भूमिका निभाते हैं। एंजियोटेंसिन II, कैटेकोलामाइन, एल्डोस्टेरोन और अतिरिक्त आहार नमक सहित उच्च रक्तचाप से ग्रस्त उत्तेजनाएं, डेंड्राइटिक कोशिकाओं (डीसी) सहित एंटीजन पेश करने वाली कोशिकाओं में आईएसओएलजी संचय को प्रेरित करती हैं, जो बदले में टी कोशिकाओं को सक्रिय करती हैं और भड़काऊ साइटोकिन्स का उत्पादन करती हैं जो उच्च रक्तचाप 8,9 में योगदान करती हैं।

इससे पहले, आइसोएलजी को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, मास स्पेक्ट्रोमेट्री, एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख और फ्लो साइटोमेट्री10,11 द्वारा मापा गया है। आईएसओएलजी के माप को सुविधाजनक बनाने के लिए, आईएसओएलजी 12 के खिलाफ एक एकल-श्रृंखला टुकड़ा चर (एससीएफवी) पुनः संयोजक एंटीबॉडी (डी11) विकसित किया गया था। प्रारंभ में, इस डी 11 एंटीबॉडी में 11 एमिनो एसिड ई-टैग था और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्रीका पता लगाने के लिए एक द्वितीयक एंटीबॉडी की आवश्यकता थी। हालांकि, निर्माता द्वारा इसका उत्पादन बंद करने के बाद ई-टैग के खिलाफ एक विश्वसनीय द्वितीयक एंटीबॉडी ढूंढना मुश्किल था। इसलिए, हमने क्षारीय फॉस्फेट (डी 11-एपी) के साथ संयुग्मित डी 11 का उपयोग करके आईएसओएलजी के इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग के लिए एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल विकसित किया है, जिसे हमने उच्च रक्तचाप के साथ और बिना माउस और मानव ऊतकों में प्रदर्शित किया है।

Protocol

वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति ने इस पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रक्रियाओं को मंजूरी दी। प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार चूहों को रखा और देखभाल की जाती है। वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित अध्ययन में दाखिला लेने से पहले सभी विषयों ने लिखित सूचित सहमति दी। हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार सभी प्रक्रियाएं की गईं।

1. डी 11-क्षारीय फॉस्फेट संलयन प्रोटीन और नकारात्मक नियंत्रण वैक्टर को एन्कोडिंग करने वाले प्लास्मिड की तैयारी

  1. pCANTAB5E प्लास्मिड13,14 के एक संशोधित संस्करण का निर्माण करें जिसमें एकल श्रृंखला टुकड़ा चर (scFv) खंड अपने 3 'अंत में बैक्टीरियल क्षारीय फॉस्फेट (एपी) को एन्कोडिंग अनुक्रम से जुड़ा हुआ है।
    नोट: एससीएफवी अनुक्रम की नोटी प्रतिबंध साइट के तुरंत डाउनस्ट्रीम में, संशोधित प्लास्मिड में अब ई-टैग का कोडिंग अनुक्रम नहीं होता है और इसके बजाय लिंकर अनुक्रम जीजीएसजीजीएचएमजीएसजीजी को एन्कोड करता है, इसके बाद एपी (जेनबैंक परिग्रहण संख्या एएक्सवाई 87039.1, टी 16-के 464) 15,16 के लिए अनुक्रम होता है। एपी के डाउनस्ट्रीम में, प्लास्मिड 8xHis और DYKDDDDK टैग को एन्कोड करेगा। टैग के 3 'अंत में, कोडिंग अनुक्रम एम्बर स्टॉप कोडन के साथ समाप्त होता है। संशोधित प्लास्मिड को pCANTAB5-AP कहा जाता है।
  2. SfiI/NotI प्रतिबंध साइटों के साथ pCANTAB5-AP में D11 scFv (GenBank परिग्रहण संख्या AAW28931.1) क्लोन करें।
  3. D20 scFv को SfiI /NotI प्रतिबंध साइटों के साथ pCANTAB5-AP में क्लोन करें।
    नोट: डी 20 एससीएफवी एक अप्रासंगिक एससीएफवी के ऊतक इंटरैक्शन पैटर्न का आकलन करने के लिए डिज़ाइन किया गया एक नकारात्मक नियंत्रण है। इस एससीएफवी को मूल रूप से ए 2 नामक ग्लाइकन समूह के साथ बातचीत करने की क्षमता के लिए फेज डिस्प्ले द्वारा चुना गया था।
  4. प्लास्मिड से एससीएफवी भाग को पूरी तरह से हटाकर और इसे "एपी लिंकर" कोडिंग अनुक्रम के साथ बदलकर एक "खाली" वेक्टर उत्पन्न करें जिसमें अमीनो एसिड जीजीजीजीएसजीआरएजीजीजीजीएस शामिल हैं।
  5. सभी प्लास्मिड को सक्षम टीजी 1 ई कोलाई में बदलें और बैक्टीरिया को 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर विकसित करें, 0.5% अगर प्लेटों पर 2xYT जिसमें 100 μg / mL एम्पीसिलिन और 2% ग्लूकोज (2xYTAG) माध्यम के साथ पूरक है।
    नोट: सूप जीन (जैसे टीजी 1 ई कोलाई) के साथ उपभेद एम्बर स्टॉप कोडन को 100% तक नहीं दबाते हैं। अनुमान 0.8 - 20% समय से होते हैं, इसलिए अभी भी बहुत सारे उत्पाद हैं जो बीएपी के ठीक डाउनस्ट्रीम में समाप्त होते हैं, क्योंकि यहइन प्रयोगों के लिए अभिप्रेत है। कोलाई का उपयोग मुख्य रूप से व्यावहारिक कारणों के लिए किया जाता है, जैसे कि समय और लागत में कमी, पीसीएएनटीएबी प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रणाली के साथ उनकी संगतता, और फेज डिस्प्ले में उनका उपयोग, जो आमतौर पर प्रयोगशाला में आयोजित किया जाता है। बीएपी के बाद एम्बर स्टॉप कोडन के डाउनस्ट्रीम जीन III के लिए एक अनुक्रम है। जीन III संलयन प्रोटीन को फेज प्रदर्शन के लिए शायद ही कभी व्यक्त करने की आवश्यकता होती है क्योंकि scFv-जीन III संलयन प्रोटीन भोले बैक्टीरिया को फिर से संक्रमित करने के लिए उस विशेष जीन III प्रोटीन के साथ हस्तक्षेप करते हैं। इसलिए, संलयन मुक्त जीन III प्रोटीन को कार्यशील फेज की पीढ़ी के लिए विरियन असेंबली के दौरान मौजूद होने की आवश्यकता होती है यानी, एससीएफवी-जीन III प्रोटीन उत्पाद आमतौर पर जीवाणु के अंदर अपेक्षाकृत दुर्लभ होते हैं। डी 11-एपी, डी 20-एपी, खाली वेक्टर, और इस लेख में उपयोग किए जाने वाले सभी निर्माण कभी-कभी जीन III संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति से समान रूप से प्रभावित होते हैं। ये प्रोटीन कैसे व्यवहार करते हैं, इसमें अभी भी अंतर देखा गया है।
  6. एक व्यक्तिगत कॉलोनी चुनें और 2xYTAG संस्कृति के एक ताजा 5 मिलीलीटर को टीका लगाएं। बैक्टीरिया को 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ने दें और 150 आरपीएम पर हिलाएं।
  7. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 3,000 x g पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को गोली दें। सतह पर तैरने वाला पदार्थ छोड़ दें और 85% 2xYTAG और 15% ग्लिसरॉल के 2 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
  8. ग्लिसरॉल स्टॉक को -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में बनाए रखें।

2. प्रोटीन अभिव्यक्ति और पेरिप्लाज्मिक अर्क की पीढ़ी

नोट: पेरिप्लाज्मिक अर्क की पीढ़ी फेज डिस्प्ले में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली विधि है, मुख्य रूप से क्योंकि एससीएफवी और एंटीबॉडी उत्पादन में डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड का गठन महत्वपूर्ण है। विधि लाइसेट उत्पन्न करने की आवश्यकता से बचती है (आमतौर पर समावेश निकाय युक्त) और यह सुनिश्चित करता है कि प्रोटीन ठीक से मुड़े हुए हैं। पीसीएएनटैब में डी 11-बीएपी संलयन प्रोटीन के एससीएफवी भाग के अपस्ट्रीम में एक जीआईआई सिग्नल अनुक्रम है। सिग्नल अनुक्रम यह सुनिश्चित करता है कि प्रोटीन को जीवाणु के पेरिप्लाज्मिक स्पेस में शटल किया जाता है, और फिर सिग्नल अनुक्रम को छोड़ दिया जाता है। पेरिप्लाज्मिक स्पेस एक ऑक्सीकरण वातावरण प्रदान करता है, जो डाइसल्फ़ाइड पुलों के उचित गठन के लिए महत्वपूर्ण है। आसमाटिक सदमे का उपयोग पेरिप्लाज्मिक अर्क प्राप्त करने के लिए किया जाता है क्योंकि यह बाहरी झिल्ली को बाधित करता है ताकि बैक्टीरिया को बरकरार रखते हुए पेरिप्लाज्मिक प्रोटीन को आसपास के माध्यम में छोड़ा जा सके।

  1. कोलाई ग्लिसरॉल स्टॉक जिसमें संबंधित प्लास्मिड होते हैं, उन्हें 2xYTAG की 60 एमएल संस्कृति में टीका लगाएं और 150 आरपीएम पर हिलाने के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कल्चर करें।
  2. प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए, 10 मिनट के लिए 3,000 x g पर पेलेट बैक्टीरियल कल्चर करें, 2xYTA माध्यम के 60 mL में फिर से निलंबित करें, और 150 RPM पर झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कल्चर करें।
    नोट: 2xTYAG से 2xYTA माध्यम में स्विच प्रोटीन अभिव्यक्ति18 के पर्याप्त प्रेरण में मदद करता है। जब ग्लूकोज जीवाणु माध्यम में मौजूद होता है, तो लाख प्रमोटर को दबा दिया जाता है क्योंकि बैक्टीरिया अधिमानतः ग्लूकोज का उपभोग करते हैं और लैक्टोज को अनदेखा करते हैं, क्योंकि ग्लूकोज को संसाधित करने में कम ऊर्जा लगती है। जब मध्यम स्विच के बाद ग्लूकोज को हटा दिया जाता है, तो बैक्टीरिया 2xYT माध्यम द्वारा प्रदान किए गए कार्बोहाइड्रेट पर भरोसा करते हैं। खमीर निकालने (2xYT में वाई घटक) में कार्बोहाइड्रेट होते हैं, उनमें लैक्टोज होता है, और इसलिए, लाख प्रमोटर के माध्यम से प्रोटीन अभिव्यक्ति को चलाने में सक्षम होता है। IPTG pCANTAB निर्माण के साथ आवश्यक नहीं है और इसके परिणामस्वरूप अत्यधिक प्रोटीन अभिव्यक्ति हो सकती है, साथ ही समावेश निकायों के परिणामस्वरूप गैर-कार्यात्मक प्रोटीन होता है।
  3. आसमाटिक सदमे के माध्यम से पेरिप्लाज्मिक अर्क उत्पन्न करें।
    1. 10 मिनट के लिए 3,000 x g पर पेलेट बैक्टीरियल कल्चर।
    2. 1xTES (0.2 M Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 0.5 M सुक्रोज) के 20 mL में पुन: सस्पेंड करें और बर्फ पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. 10 मिनट के लिए 3,000 x g पर फिर से गोली लें, और 0.05 M Tris, pH 7.6 के 15 मिलीलीटर में फिर से निलंबित करें।
  4. 1 घंटे के लिए बर्फ पर इस निलंबन को इनक्यूबेट करें, फिर 10 मिनट के लिए 5,000 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा स्पष्ट करें।
  5. सुपरनैटेंट को एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और प्रयोगों में शुद्धिकरण या प्रत्यक्ष उपयोग के लिए आवश्यक होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  6. एलिसा में सक्रिय डी 11-बीएपी की उपस्थिति से सेल लाइसिस का आकलन करें। पीएनपीपी के एक एमएल में पेरिप्लाज्मिक अर्क के 3-5 μL जोड़ें, फिर देखें कि क्या अगले 10 मिनट में रंग परिवर्तन होता है (रंग स्पष्ट-पीले से तीव्र पीले रंग में जाता है)।
    नोट: रंग की तुलना पीएनपीपी की एक ट्यूब से की जा सकती है जिसे कोई लाइसेट या पीएनपीपी की एक ट्यूब नहीं मिली है जिसे भोले टीजी 1 बैक्टीरिया का लाइसेट प्राप्त हुआ है। 405 एनएम पर अवशोषण के साथ मात्रा निर्धारित करें।

4. एलिसा में डी 11-एपी टिटर का लक्षण वर्णन।

  1. 384-अच्छी तरह से पॉलीस्टाइनिन प्लेट को 25 μL / अच्छी तरह से फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (PBS) (1.8 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na2HPO 4, 2.7 mM KCl,137 mM NaCl) के साथ रात भर4 डिग्री सेल्सियस पर कोट करें, जिसमें माउस सीरम एल्बुमिन (MSA) (नकारात्मक नियंत्रण), या 5 μg / mL ISOLG /
  2. प्लेट खाली करें और टैप सुखाएं। पीबीएस + 0.1% ट्वीन (पीबीएस-टी) के साथ एक बार धो लें। प्लेट खाली करें और टैप सुखाएं।
  3. प्लेट को ब्लॉकिंग बफर (120 μL / well) के रूप में PBS-T के साथ भरें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. प्लेट खाली करें और टैप सुखाएं। डी 11-एपी पेरिप्लाज्मिक अर्क के सीरियल 1: 2 कमजोर पड़ने को 25 μL / अच्छी तरह से लागू करें और पीबीएस-टी में पतला करें। नकारात्मक नियंत्रण के रूप में केवल पीबीएस-टी युक्त एक अच्छी तरह से शामिल करें।
    नोट: पेरिप्लाज्मिक अर्क के लिए विशिष्ट कमजोर पड़ने की सीमा 1: 8 - 1: 4096 है। 25 μL परख मात्रा के लिए, शुरुआती "1: 8" एकाग्रता के 50 μL से शुरू करें: 6.25 μL पेरिप्लाज्मिक अर्क और 43.75 μL PBS-T। फिर, इस घोल के 25 μL को हटाकर और इसे पीबीएस-टी के 25 μL वाले अगले कुएं में जोड़कर 2 गुना कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें और इसे ऊपर और नीचे पिपेट करें। इस कुएं में अब "1:16" कमजोर पड़ने का अर्थ है। वर्णित 1: 2 कमजोर पड़ने की श्रृंखला उत्पन्न करने के लिए 2-गुना कमजोर पड़ने को दोहराते रहें।
  5. कमरे के तापमान पर 1.5 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  6. प्लेट खाली करें और टैप सुखाएं। पीबीएस-टी के साथ 5 बार धोएं। खाली और नल सूख जाए।
  7. 930 एमएम डायथेनॉलमाइन के 1 एल में 1 ग्राम पीएनपीपी को घोलकर पीएनपीपी समाधान तैयार करें (एच 2 ओ में 98% स्टॉक समाधान 1:10 पतला है), 0.5एमएम एमजीसीएल2 के साथ और एचसीएल के साथ पीएच 9.5 में समायोजित किया जाता है।
  8. एपी विकसित करने के लिए 25 μL / अच्छी तरह से PNPP समाधान लागू करें। कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें और एक संगत प्लेट रीडर का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के भीतर 405 एनएम पर अवशोषण निर्धारित करें।
  9. आईएसओएलजी/एमएसए कुओं से उत्पन्न सिग्नल की तुलना एमएसए कुओं से उत्पन्न शोर से करें और कमजोर पड़ने की सीमा ज्ञात करें जिसमें सिग्नल शोर से कम से कम 5 गुना अधिक है।
  10. इस डी 11-एपी सिग्नल कमजोर पड़ने की श्रृंखला को एक ग्राफ पर प्लॉट करें, वक्र की रैखिक सीमा निर्धारित करें, और कमजोर पड़ने की स्थापना करें जहां सिग्नल का 50% देखा जा सकता है।
    नोट: यदि यह कमजोर पड़ना लगभग 1: 1,000 के बराबर है, तो डी 11-एपी समाधान का उपयोग आईएचसी / आईएफ में 1: 10 की एकाग्रता पर किया जा सकता है।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. माउस और मानव पैराफिन-एम्बेडेड ऊतकों (5 μm मोटी) के सीरियल सेक्शन को एक माइक्रोटोम का उपयोग करके काटें और गर्म पानी के स्नान (37 डिग्री सेल्सियस) में रखें। ग्लास स्लाइड पर ऊतक अनुभाग माउंट करें और रात भर सूखने दें।
    नोट: इस अध्ययन के लिए, चूहों से महाधमनी प्राप्त की गई थी। वेंडरबिल्ट सहकारी मानव ऊतक नेटवर्क से नॉर्मोटेन्सिव और उच्च रक्तचाप से ग्रस्त मनुष्यों के बृहदान्त्र खंड प्राप्त किए गए थे।
  2. ऊतकों को डिपैराफिनाइज्ड करने के लिए 5 मिनट के लिए तीन बार जाइलीन में स्लाइड डुबोएं।
  3. एच 2 ओ में 95%, 70% और 50% इथेनॉल में से प्रत्येक में2वॉश में ऊतकों को फिर से हाइड्रेट करें।
  4. ट्रिस-बफर्ड सेलाइन (टीबीएस) में स्लाइड को 0.1% ट्वीन20 (टीबीएसटी) के साथ तीन बार धोएं और स्लाइड धारक को टीबीएसटी से भरकर फिर टीबीएसटी को छोड़ दें।
    नोट: हाइड्रेटेड स्लाइड को एंटीजन पुनर्प्राप्ति से पहले एक सप्ताह से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर टीबीएसटी में संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. स्लाइड्स की गर्मी-प्रेरित एंटीजन पुनर्प्राप्ति करने के लिए, स्लाइड को पूर्व-गर्म (80-95 डिग्री सेल्सियस) सोडियम साइट्रेट बफर (10 एमएम सोडियम साइट्रेट, 0.05% ट्वीन 20, पीएच 6.0) में रखें और 20 मिनट के कुल एंटीजन पुनर्प्राप्ति समय के लिए उच्च दबाव पर 4 मिनट के लिए सेट प्रेशर कुकर में इनक्यूबेट करें।
  6. प्रेशर कुकर से स्लाइड निकालें और उन्हें कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए ठंडा होने दें।
  7. टीबीएसटी में स्लाइड को त्वरित धोने के साथ तीन बार धोएं।
    नोट: धुंधला होने से पहले एक सप्ताह से अधिक समय तक एंटीजन पुनर्प्राप्ति के बाद स्लाइड को टीबीएसटी में संग्रहीत किया जा सकता है।
  8. स्लाइड ्स को ब्लॉक करने के लिए टीबीएसटी में घुलने वाले 2% बीएसए को जोड़ें। पैराफिन फिल्म की एक पट्टी के साथ स्लाइड को कवर करें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
  9. स्लाइड्स से ब्लॉकिंग बफर को हटा दें.
  10. टीबीएसटी में 1:10 डी 11-एपी के 200 μL को स्लाइड्स में जोड़ें और पैराफिन फिल्म की एक पट्टी के साथ कवर करें।
  11. कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए एंटीबॉडी समाधान वाष्पीकरण को कम करने के लिए एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में इनक्यूबेट करें।
  12. TBST में स्लाइड ्स को तीन बार धोएं.
  13. क्रमशः इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री या इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए एक कलरमेट्रिक या फ्लोरोसेंट क्षारीय फॉस्फेट डेवलपर के साथ विकसित करें। अतिरिक्त डेवलपर को हटाने और आगे के रंग विकास को रोकने के लिए टीबीएसटी के साथ स्लाइड ्स को एक बार धोएं।
  14. इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए पीबीएस में 1 μg / mL पर Hoechst परमाणु दाग के साथ काउंटरस्टेन स्लाइड। किसी भी अतिरिक्त काउंटरदाग को हटाने के लिए टीबीएसटी में एक बार स्लाइड धो लें।
  15. बढ़ते माध्यम का उपयोग करके कवरलिप लागू करें।
  16. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप या इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए एक कॉन्फोकल फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड देखें।

6. नकारात्मक नियंत्रण

नोट: आईएसओएलजी के लिए डी 11-एपी धुंधला होने की विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए चार नकारात्मक नियंत्रण प्रयोग किए जा सकते हैं। नकारात्मक नियंत्रण प्रयोगों को समान परिस्थितियों में एक ही धुंधला सेट में किया जाना चाहिए।

  1. पहले नकारात्मक नियंत्रण प्रयोग में, अकेले टीबीएसटी या टीबीएसटी में पतला डी 11-एपी के साथ ऊतकों को इनक्यूबेट करें।
  2. टीबीएसटी में पतला डी 11-एपी के साथ ऊतकों को इनक्यूबेट करें और डी 11-एपी (एपी लिंकर) के बिना बैक्टीरियल पेरिप्लाज्मिक अर्क को टीबीएसटी में पतला करें।
  3. आईएसओएलजी / एमएसए या गैर-जोड़ एमएसए के साथ एक प्रतिस्पर्धी परख करें जैसा कि पहले वर्णित12 है।
    1. माउस सीरम एल्बुमिन (एमएसए) में आईएसओएलजी और आईएसओएलजी को 8 आईएसओएलजी: 1 एमएसए (8: 1 आईएसओएलजी / एमएसए) के दाढ़ अनुपात पर तैयार करें।
    2. टीबीएसटी में डी 11-एपी 1: 10 पतला करें।
    3. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 50 μg / mL IsoLG / MSA या गैर-जोड़ एमएसए के साथ पतला D11-AP इनक्यूबेट करें।
    4. धुंधला होने के लिए ऊतकों में आईएसओएलजी /एमएसए के साथ डी 11-एपी या गैर-जोड़ एमएसए के साथ डी 11-एपी जोड़ें।
  4. अंतिम नकारात्मक नियंत्रण सेट के लिए ऊतकों को दागने के लिए अप्रासंगिक एससीएफवी एंटीबॉडी, डी 20 का उपयोग करें।

Representative Results

प्रतिनिधि प्रयोगों में, एक क्षारीय फॉस्फेट संयुग्मन (डी 11-एपी) के साथ डी 11 एससीएफवी का उपयोग इम्यूनोफ्लोरेसेंस में सामान्य शाम चूहों और नॉर्मोटेन्सिव मनुष्यों की तुलना में उच्च रक्तचाप वाले मनुष्यों की तुलना में एंजियोटेंसिन II-उपचारित चूहों में मौजूद आइसोएलजी का पता लगाने के लिए किया गया था। चूहों को दो सप्ताह के लिए 490 एनजी / किग्रा / मिनट की खुराक पर एंजियोटेंसिन II के साथ इलाज किया गया था, और शाम चूहों की तुलना में सिस्टोलिक रक्तचाप में वृद्धि के साथ उच्च रक्तचाप की पुष्टिकी गई थी। डी 11-एपी की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए, ऊतकों को डी 11-एपी की उपस्थिति के साथ या उसके बिना दाग दिया गया था। जैसा कि डी 11-एपी स्टेनिंग द्वारा प्रदर्शित किया गया है, एंजियोटेंसिन II-प्रेरित उच्च रक्तचाप वाले चूहों की महाधमनी ने नियंत्रित चूहों की तुलना में आइसोएलजी की उच्च एकाग्रता दिखाई (चित्रा 1)। पृष्ठभूमि धुंधला या ऑटोफ्लोरेसेंस सीमित था, जैसा कि नकारात्मक नियंत्रणों द्वारा दिखाया गया था जो डी 11-एपी से सना नहीं था।

डी 11-एपी का उपयोग उच्च रक्तचाप (एचटीएन) या नॉर्मोटेन्सिव मनुष्यों (एनटीएन) के साथ मानव रोगियों के आंतों के ऊतकों में मौजूद आईएसओएलजी का पता लगाने के लिए किया गया था। उच्च रक्तचाप की स्थिति अस्पताल के रिकॉर्ड से 140 से ऊपर सिस्टोलिक रक्तचाप और 80 मिमीएचजी से ऊपर डायस्टोलिक रक्तचाप के रूप में स्थापित की गई थी। डी 11-एपी के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल विकसित करने वाले शोधकर्ताओं को मानव ऊतकों की उच्च रक्तचाप की स्थिति के लिए अंधा कर दिया गया था। एंटीबॉडी विशिष्टता सुनिश्चित करने और पृष्ठभूमि धुंधला या ऑटोफ्लोरेसेंस दिखाने के लिए डी 11-एपी की उपस्थिति और अनुपस्थिति में वर्गों को दाग दिया गया था। जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, हमने पाया कि एचटीएन के रोगियों के ऊतकों में एनटीएन वाले रोगियों की तुलना में आईएसओएलजी की उच्च सांद्रता थी। डी 11-एपी के बिना धुंधला होना भी न्यूनतम पृष्ठभूमि धुंधला और ऑटोफ्लोरेसेंस दिखाता है। अंतर्जात क्षारीय फॉस्फेट आंतों के उपकला द्वारा व्यक्त किया जाता है, इसलिए डी 11-एपी के बिना दाग वाले ऊतकों की सीमित प्रतिदीप्ति से पता चलता है कि इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली एंटीजन पुनर्प्राप्ति ऊतकों में मौजूद अंतर्जात क्षारीय फॉस्फेट को निष्क्रिय करने में पर्याप्त थी। चूहों में परिणामों के साथ संयोजन में, इन परिणामों से यह भी पता चलता है कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल प्रभावी रूप से उच्च रक्तचाप में ऊंचा आइसोएलजी दिखाता है जब नॉर्मोटेन्सिव स्थिति की तुलना में।

डी 11-एपी को बैक्टीरियल पेरिप्लाज्मिक अर्क में अलग और संग्रहीत किया गया था। माउस और मानव ऊतकों को डी 11-एपी और पेरिप्लाज्मिक अर्क के साथ दाग दिया गया था जिसमें डी 11 के बिना एपी लिंकर होता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पेरिप्लाज्मिक अर्क में मौजूद अन्य कारक, जैसे कि अतिरिक्त या गैर-संयुग्मित क्षारीय फॉस्फेट, डी 11-एपी के साथ इलाज किए गए ऊतकों में देखे गए धुंधलापन में योगदान नहीं करते हैं (चित्रा 3)। डी 11-एपी से सना हुआ ऊतक पेरिप्लाज्मिक अर्क से सना ऊतकों की तुलना में चमकदार धुंधलापन पैदा करता है। ये परिणाम पुष्टि करते हैं कि डी 11-एपी ऊतकों को धुंधला कर रहा है, और धुंधलापन गैर-संयुग्मित जीवाणु क्षारीय फॉस्फेट के कारण नहीं है जो संभावित रूप से पेरिप्लाज्मिक अर्क में मौजूद हो सकता है और इसके परिणामस्वरूप आईएसओएलजी का गलत धुंधलापन हो सकता है या पृष्ठभूमि धुंधला होने में योगदान हो सकता है।

डी 11-एपी की विशिष्टता को आईएसओएलजी में दिखाने के लिए ऊतकों को धुंधला करने से पहले एमएसए या गैर-जोड़ एमएसए के साथ आईएसओएलजी के साथ डी 11-एपी को प्री-इनक्यूबेट करके एक प्रतिस्पर्धी नियंत्रण किया गया था। यदि डी 11-एपी आईएसओएलजी के लिए विशिष्ट है, तो एंटीबॉडी आईएसओएलजी-एमएसए से जुड़ जाएगा, जिसके परिणामस्वरूप ऊतकों को दागने के लिए डी 11-एपी की उपलब्धता कम हो जाएगी, और गैर-जोड़ वाले एमएसए के साथ इनक्यूबेट किए गए डी 11-एपी में सामान्य डी 11-एपी के समान धुंधला होगा। आईएसओएलजी प्रतियोगी के साथ पूर्व-इनक्यूबेट किए गए डी 11-एपी से सना हुआ ऊतकों में, हमने उन ऊतकों की तुलना में कम धुंधलापन पाया जो बिना किसी प्रीइन्क्यूबेशन के डी 11-एपी से सना हुआ था (चित्रा 4)। डी 11-एपी से सना हुआ ऊतकों में, गैर-जोड़ एमएसए के साथ पूर्वनिर्मित ऊतकों में, हमने पाया कि धुंधलापन डी 11-एपी वाले ऊतकों में देखे गए धुंधलापन के समान है। ये परिणाम ऊतकों के कम धुंधलापन के कारण आईएसओएलजी के लिए डी 11-एपी की विशिष्टता दिखाते हैं जब डी 11-एपी को आईएसओएलजी / एमएसए के साथ पूर्व-इनक्यूबेट किया गया था, लेकिन गैर-जोड़ एमएसए नहीं। अंतिम नकारात्मक नियंत्रण में, माउस ऊतक को डी 11-एपी या अप्रासंगिक एससीएफवी एंटीबॉडी, डी 20 के साथ दाग दिया गया था। डी 11-एपी के साथ माउस महाधमनी को धुंधला करने के परिणामस्वरूप डी 20 की तुलना में मजबूत धुंधलापन हुआ, जो उच्च रक्तचाप से ग्रस्त महाधमनी में डी 11-एपी से आईएसओएलजी की विशिष्टता को दर्शाता है (चित्रा 5)।

Figure 1
चित्रा 1: उच्च रक्तचाप से ग्रस्त और नॉर्मोटेंसिव चूहों में महाधमनी की इम्यूनोफ्लोरेसेंस। एंजियोटेंसिन II और शाम संक्रमित चूहों की धमनियों को डी 11-एपी (डी 11) के साथ और बिना आईएसओएलजी की उपस्थिति दिखाने के लिए दाग दिया गया था। (ए) एंजियोटेंसिन II उपचारित माउस से धमनी डी 11-एपी (हरा) और परमाणु काउंटरस्टेन (मैजेंटा) के साथ जांच की जाती है, (बी) डी 11-एपी के साथ जांच किए गए एक नियंत्रण शाम उपचारित माउस से धमनी, (सी) डी 11-एपी के बिना एंजियोटेंसिन II उपचारित माउस से धमनी, (डी) डी 11-एपी (स्केल बार = 100 μm) के बिना एक नियंत्रण शाम उपचारित माउस से धमनी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: उच्च रक्तचाप से ग्रस्त और नॉर्मोटेन्सिव रोगियों से मानव आंतों के ऊतकों की इम्यूनोफ्लोरेसेंस। उच्च रक्तचाप (एचटीएन) और नॉर्मोटेन्सिव मनुष्यों (एनटीएन) के रोगियों के ऊतकों को एचटीएन के रोगियों में आईएसओएलजी की उपस्थिति दिखाने के लिए डी 11-एपी (डी 11) के साथ और बिना दाग दिया गया था। (ए) डी 11-एपी (हरे) और परमाणु काउंटरस्टेन (मैजेंटा) से सना एचटीएन ऊतक, (बी) डी 11-एपी से सना हुआ एनटीएन ऊतक, (सी) डी 11-एपी के बिना सना हुआ एचटीएन ऊतक, (डी) डी 11-एपी के बिना सना हुआ एनटीएन ऊतक (स्केल बार = 100 μm)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डी 11-एपी के साथ और बिना पेरिप्लाज्मिक अर्क के साथ सना हुआ माउस और मानव ऊतक। माउस और मानव ऊतकों को डी 11-एपी के साथ और बिना पेरिप्लाज्मिक अर्क से दाग दिया गया था। चित्र डी 11-एपी के बिना पेरिप्लाज्मिक अर्क के साथ ऊतकों के सीमित धुंधलापन को दिखाते हैं, जो दिखाते हैं कि धुंधलापन ज्यादातर डी 11-एपी बाइंडिंग के कारण होता है, न कि एक अन्य घटक जो पेरिप्लाज्मिक अर्क में मौजूद हो सकता है। (ए) डी 11-एपी (हरे) और परमाणु काउंटरस्टेन (मैजेंटा) से सना हुआ एंग माउस महाधमनी, (बी) पेरीप्लाज्मिक अर्क से सना हुआ एंग माउस महाधमनी, (सी) डी 11-एपी से सना शाम माउस महाधमनी, (डी) पेरीप्लाज्मिक अर्क से सना शाम माउस महाधमनी, (ई) डी 11-एपी से सना हुआ उच्च रक्तचाप से ग्रस्त मानव आंतों का ऊतक, (एफ) पेरिप्लाज्मिक अर्क से सना हुआ उच्च रक्तचाप से ग्रस्त मानव आंतों का ऊतक, (जी) डी 11-एपी से सना हुआ मानव आंतों का ऊतक। (एच) पेरिप्लाज्मिक अर्क (स्केल बार = 100 μm) से सना हुआ नॉर्मोटेन्सिव मानव आंतों का ऊतक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एंग और शाम चूहों के जहाजों में प्रतिस्पर्धी नियंत्रण। इस प्रतिस्पर्धी नियंत्रण में, डी 11-एपी को आईएसओएलजी-जोड़ एमएसए या गैर-जोड़ एमएसए के साथ पूर्व-इनक्यूबेट किया गया था। बिना किसी पूर्व-इनक्यूबेशन के डी 11-एपी को नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। ये परिणाम आईएसओएलजी के लिए डी 11-एपी की विशिष्टता दिखाते हैं क्योंकि डी 11-एपी की तुलना में आईएसओएलजी-एमएसए प्रतियोगी के साथ ऊतकों का धुंधलापन कम हो जाता है। यह कमी आईएसओएलजी के कारण है, न कि एमएसए के कारण क्योंकि गैर-जोड़ एमएसए पूर्व-इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप डी 11-एपी नियंत्रण के समान धुंधला हो गया। एंजियोटेंसिन II (ए) और शाम (बी) माउस महाधमनी डी 11-एपी (हरे) और परमाणु काउंटरस्टेन (मैजेंटा), एंजियोटेंसिन II (सी) और शाम (डी) माउस महाधमनी से सना हुआ है जो आईएसओएलजी-एमएसए, एंजियोटेंसिन II (ई) और शाम (एफ) माउस महाधमनी के साथ डी 11-एपी से सना हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: माउस महाधमनी डी 11 और अप्रासंगिक एससीएफवी, डी 20 के साथ सना हुआ है। माउस ऊतक को डी 11-एपी के साथ दाग दिया गया था और एक अप्रासंगिक नियंत्रण एंटीबॉडी, डी 20 की तुलना में, जो ग्लाइकोप्रोटीन ए 2 के लिए विशिष्ट है। डी 11-एपी (हरा) और परमाणु काउंटरस्टेन (मैजेंटा) (ए) के साथ ऊतक के धुंधला होने के परिणामस्वरूप डी 20 (हरे) और परमाणु काउंटरस्टेन (मैजेंटा) (बी) की तुलना में तीव्र इम्यूनोफ्लोरेसेंस हुआ, जो डी 11-एपी से आईएसओएलजी (स्केल बार = 100 μm) की विशिष्टता को इंगित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

डी 11 का उपयोग कोशिकाओं या ऊतकों में आईएसओएलजी-जोड़ प्रोटीन का पता लगाने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है जो बीमारी 8,9,20 में सूजन या ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए मार्कर के रूप में है। इससे पहले, डी 11 में एक ई टैग था और आईएचसी विकास के लिए एचआरपी10,20,21 के साथ संयुग्मित द्वितीयक एंटी-ई टैग एंटीबॉडी के उपयोग की आवश्यकता थी। यहां, हमने ई-टैग के स्थान पर क्षारीय फॉस्फेट के साथ संयुग्मित डी 11 एंटीबॉडी का उपयोग करके आईएसओएलजी-जोड़ प्रोटीन का पता लगाने के लिए प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित किया है, जो द्वितीयक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन की आवश्यकता को समाप्त करता है।

डी 11-एपी की विशिष्टता निर्धारित करने के लिए, चार नकारात्मक नियंत्रण प्रयोग किए गए थे। हमने डी 11 की उपस्थिति के बिना प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया और न्यूनतम विकास किया। इन परिणामों में दो गुना संकेत हैं: अंतर्जात क्षारीय फॉस्फेट विकास में योगदान नहीं दे रहा है, और देखा गया धुंधलापन डी 11 के कारण है और एक अन्य योगदान कारक नहीं है। इसके बाद, हमने डी 11 के बिना एपी लिंकर के साथ स्लाइड को दाग दिया। इस प्रयोग के परिणामस्वरूप थोड़ा धुंधलापन हुआ, जो इंगित करता है कि पेरिप्लाज्मिक अर्क में मुक्त एपी या अन्य कारक डी 11 की उपस्थिति में हमारे द्वारा देखे जाने वाले दाग का कारण नहीं बन रहे हैं। डी 11 से आईएसओएलजी की विशिष्टता सुनिश्चित करने के लिए, हमने स्लाइड को धुंधला करने से पहले शुद्ध आईएसओएलजी के साथ डी 11-एपी को प्रीक्यूबेट किया। हमने विकास में कमी देखी जो इंगित करता है कि डी 11-एपी आईएसओएलजी प्रोटीन से बंधा था, इस प्रकार ऊतक में मौजूद आईएसओएलजी को बांधने के लिए मुक्त डी 11-एपी की मात्रा समाप्त हो गई। अंत में, यह सुनिश्चित करने के लिए कि डी 11-एपी आईएसओएलजी के लिए बाध्यकारी था और एमएसए प्रोटीन आईएसओएलजी से बाध्य नहीं था, हमने डी 11-एपी को केवल एमएसए के साथ प्रीक्यूबेट किया। विकास में कोई बदलाव नहीं हुआ, यह दर्शाता है कि डी 11-एपी एमएसए के लिए बाध्यकारी नहीं था, बल्कि आईएसओएलजी प्रोटीन था। अंत में, धुंधला प्रोटोकॉल विकसित करने वाले शोधकर्ता मानव आंतों के ऊतकों की उच्च रक्तचाप से ग्रस्त स्थिति के लिए अंधे थे। उच्च रक्तचाप वाले रोगियों और नॉर्मोटेंशन वाले रोगियों के बीच देखे गए धुंधलापन में अंतर पूर्वाग्रह के कारण नहीं था और पहले22,23 वर्णित किया गया है।

हालांकि ई-टैग के स्थान पर क्षारीय फॉस्फेट के साथ संयुग्मित डी 11 एंटीबॉडी का उपयोग करके आईएसओएलजी-जोड़ प्रोटीन का पता लगाने के लिए हमारा प्रोटोकॉल कठोर और मजबूत है और द्वितीयक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन की आवश्यकता को समाप्त करता है, इसकी कुछ सीमाएं हैं। एक सीमा यह है कि हमने पेरिप्लाज्मिक अर्क में क्षारीय फॉस्फेट के साथ संयुग्मित डी 11 का उपयोग किया, और पेरिप्लाज्मिक अर्क या कुछ ऊतकों जैसे आंत24 में अंतर्जात क्षारीय फॉस्फेट का झूठा धुंधलापन हो सकता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल को विकसित करने के पहले कदम में अंतर्जात क्षारीय फॉस्फेट को अक्षम करना शामिल था जो ऊतकों में मौजूद हो सकताहै25. प्रारंभ में, कोल्ड एसिटिक एसिड, बीएमई और लेवामिसोल26 को दक्षता के लिए परीक्षण किया गया था। इनमें से किसी ने भी सक्रिय अंतर्जात क्षारीय फॉस्फेट की उपस्थिति को पूरी तरह से कम नहीं किया। क्षारीय फॉस्फेट27 को निष्क्रिय करने के लिए गर्मी का उपयोग किया गया है, इसलिए हमने विभिन्न बफर में क्षारीय फॉस्फेट की गर्मी निष्क्रियता का परीक्षण किया। हमने पाया कि साइट्रेट बफर में हीटिंग माउंटेड और हाइड्रेटेड स्लाइड्स ने अधिकांश अंतर्जात क्षारीय फॉस्फेट को समाप्त कर दिया। फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट का उपयोग करके शुरू में स्लाइड विकसित किए गए थे, लेकिन जब इस सब्सट्रेट के बिना छवि बनाई गई, तो ऑटोफ्लोरेसेंस की उच्च मात्रा थी। वेक्टररेड एक सब्सट्रेट है जो एक क्रोमोजेन का उत्पादन करने के लिए क्षारीय फॉस्फेट की उपस्थिति में विकसित होता है जिसे टेक्सास रेड / टीआरआईटीसी चैनल रेंज में देखा जा सकता है। इस सब्सट्रेट का उपयोग करके, हम पृष्ठभूमि ऑटोफ्लोरेसेंस के ऊपर सिग्नल का अधिक आसानी से निरीक्षण करने में सक्षम थे। कृत्रिम धुंधलापन को कम करने के लिए धुंधला होने की प्रक्रिया के दौरान सावधानी बरतनी चाहिए। इमेजिंग तक हाइड्रेशन के बाद स्लाइड पर ऊतकों के सूखने के परिणामस्वरूप विकास में वृद्धि हुई है। डी 11-एपी को -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट और संग्रहीत किया जाना चाहिए। डी 11-एपी के साथ काम करते समय कई फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचना चाहिए। फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) क्षारीय फॉस्फेट की एंजाइमेटिक गतिविधि को भी प्रभावित कर सकता है और इसका उपयोग वॉश बफर28 के रूप में नहीं किया जाना चाहिए। किसी भी एंटीबॉडी-आधारित दृष्टिकोण के साथ, यह सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से परीक्षण और अनुकूलन किया जाना चाहिए कि धुंधलापन विशिष्ट है, और यह संकेत खत्म या कम नहीं है।

अंत में, हमने ई-टैग के स्थान पर क्षारीय फॉस्फेट के साथ संयुग्मित डी 11 एंटीबॉडी का उपयोग करके आईएसओएलजी-जोड़ प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली, कठोर और मजबूत अनुकूलित प्रोटोकॉल विकसित किया है। यह प्रोटोकॉल कई फायदे प्रस्तुत करता है: सबसे पहले, एक क्षारीय फॉस्फेट संलयन प्रोटीन के रूप में डी 11 का उपयोग करना सस्ता है। डी 11 मूल रूप से एक फेज एंटीबॉडी लाइब्रेरी से लिया गया था जिसे व्यावसायीकरण नहीं किया जा सकता था और शुद्ध करना महंगा था। हालांकि ई कोलाई पेरिप्लाज्मिक अर्क में डी 11 एक सस्ता विकल्प प्रदान कर सकता है, यह अधिकांश परखों में अप्रभावी था। दूसरा, क्षारीय फॉस्फेट संलयन दृष्टिकोण डी 11 एससीएफवी को एक उपयोगी रिपोर्टर15 (क्षारीय फॉस्फेट) को इसमें शामिल करने की अनुमति देता है और इसे इम्यूनोएसे में उपयोग के लिए शुद्ध करने की आवश्यकता नहीं होगी क्योंकि सब्सट्रेट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। तीसरा, ई कोलाई क्षारीय फॉस्फेट डिमर29 बनाता है। इसलिए डी 11, जब क्षारीय फॉस्फेट से जुड़ा होता है, तो डिमर भी बनता है और इससे एंटीबॉडी की उग्रता और बाध्यकारी गतिविधिबढ़ जाती है। अंत में, पेरिप्लाज्मिक अर्क में क्षारीय फॉस्फेट के साथ संयुग्मित डी 11 को आसानी से सिबाक्रॉन ब्लू सेफ्राइस का उपयोग करके साफ किया जा सकता है। डी 11 में एक उच्च आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु (~ 9.2 पीएच) है। जैसे, यह सकारात्मक रूप से चार्ज किया जाता है और पाई-केशन इंटरैक्शन के माध्यम से सिबाक्रॉन ब्लू से जुड़ सकता है। ई कोलाई पेरिप्लाज्मिक अर्क में अधिकांश अशुद्धियों को राल से हटाया जा सकता है। क्षारीय फॉस्फेट के साथ संयुग्मित डी 11 को तब पानी में उच्च नमक (~ 1.5 एम एनएसीएल) का उपयोग करके संश्लेषित किया जा सकता है। क्षारीय फॉस्फेट के साथ संयुग्मित डी 11 उच्च नमक समाधान में 4-8 डिग्री सेल्सियस पर काफी स्थिर है। इस प्रकार, हमने एक प्रोटोकॉल विकसित किया है जो न केवल डी 11 एंटीबॉडी को कम लागत पर उपलब्ध कराता है, बल्कि द्वितीयक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन के लिए अतिरिक्त चरणों और आवश्यकता को भी समाप्त करता है। यह प्रोटोकॉल आईएसओएलजी के प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप की सुविधा प्रदान करता है, जो कई बीमारियों में ऊतकों में जमा होता है जहां ऑक्सीडेटिव तनाव में वृद्धि एक भूमिका निभाती है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941, और R03HL155041 द्वारा ए.के. हम विज़ुअलाइज़ेशन और स्लाइड स्कैनिंग के लिए डिजिटल हिस्टोलॉजी साझा संसाधन - वेंडरबिल्ट हेल्थ नैशविले, टीएन https://www.vumc.org/dhsr/46298 को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) Cytiva 28953766
200 Proof Ethanol Pharmco 111000200
2xYT powder MP Biomedicals 3012-032
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates ThermoFisher (NUNC) 242757
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) Carbosynth EN08508
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) Carbosynth EB09335
Ampicillin, sodium salt Research Products International (RPI) A40040
Bovine Serum Albumin RPI A30075
Chemically competent TG1 E. coli Amid Biosciences TG1-201
Diethanolamine, >98% Sigma-Aldrich D8885
EDTA Sigma-Aldrich ED
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 Mouting medium
Glucose Research Products International (RPI) G32045
Glycerol Sigma-Aldrich G7893
Histoclear National Diagnostics HS-200 Xylene alternative
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570 stock solution = 10 mg/mL
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals ThermoFisher MK-2624-212
Imidazole Research Products International (RPI) I52000
MgCl2 (anhydrous) Sigma-Aldrich M8266
Mouse Serum Albumin (MSA) Sigma-Aldrich/Calbiochem 126674
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) Carbosynth EN13587
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662
Pressure Cooker Cuisinart CPC-600
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml ThermoFisher 66380
Sodium chloride (NaCl) Research Products International (RPI) S23020
Sodium Citrate Sigma-Aldrich 1064461000
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Research Products International (RPI) S23100
Sucrose Research Products International (RPI) S24065
Tris base Research Products International (RPI) T60040
Tris-buffered Saline Boston Bio-Products 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4
Tris-HCl Research Products International (RPI) T60050
Tween20 Sigma-Aldrich P9416
Vector Red Vector Labs SK-5105

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References

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जीव विज्ञान अंक 173 आइसोलेवुग्लैंडिंस इम्यूनोफ्लोरेसेंस क्षारीय फॉस्फेट संयुग्मित एससीएफवी डी 11 एंटीबॉडी और उच्च रक्तचाप।

Erratum

Formal Correction: Erratum: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence
Posted by JoVE Editors on 04/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. The Authors section was updated from:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

to:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Ashley Pitzer4,6
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

डी 11 एससीएफवी-क्षारीय फॉस्फेट फ्यूजन प्रोटीन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके ऊतकों में आइसोलेवुग्लैंडिंस का प्रत्यक्ष पता लगाना
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Warden, C., Simmons, A. J., Pasic,… More

Warden, C., Simmons, A. J., Pasic, L., Pitzer, A., Davies, S. S., Layer, J. H., Mernaugh, R. L., Kirabo, A. Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (173), e62603, doi:10.3791/62603 (2021).

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