5-乙炔基-2'-脱氧尿苷/磷酸化组蛋白 H3 双标记细胞周期进程分析方案 果蝇 神经干细胞

摘要

利用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）和磷酸化组蛋白H3（pH3）标记进行细胞周期分析是一种多步骤实验流程，可能需要进行大量优化。本文提供了一个详细方案，描述了该流程的全部步骤，包括图像分析和定量方法，以区分处于不同细胞周期阶段的细胞。

摘要

体内细胞周期进程分析通常用于研究调控有丝分裂和DNA复制的基因。5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）被用来研究复制期/S期的进程，而抗磷酸化组蛋白H3的抗体则被用来标记有丝分裂期的细胞核和细胞。结合这两种标记方法，可将细胞周期分为G0/G1期（间隙期）、S期（复制期）和M期（有丝分裂期），并作为评估有丝分裂相关基因敲低或无效突变体对细胞周期进程影响的重要工具。然而，用于标记EdU标记细胞的试剂与多种荧光标记的二抗不兼容，这使得使用一抗和标记的二抗来标记pH3阳性有丝分裂细胞的免疫染色变得复杂。本文介绍了一种在果蝇（Drosophila）幼虫神经干细胞中对EdU和pH3进行双重标记的逐步实验方案，该系统被广泛用于研究有丝分裂因子。此外，还提供了一套图像分析与定量方法的流程，用于将标记的细胞划分为三个不同类别：G0/G1期、S期、S>G2/M期（从S期向G2/M期的进程）以及M期。

引言

细胞分裂周期包括G1期（第一间隙期）、复制/S期、G2期（第二间隙期）和M期（有丝分裂期）。在经历这些阶段的过程中，细胞在转录、翻译以及细胞骨架系统的重组方面会发生显著变化^1,2。响应发育和环境信号，细胞可能暂时停止分裂而进入静息状态（G0期），或发生分化并永久停止分裂³。其他情况，如DNA损伤，可能导致细胞过早分化或发生凋亡^3,4。此类信号的响应由细胞周期检查点介导，这些检查点作为监控系统，确保在细胞进入分裂周期下一阶段之前，关键的细胞过程保持完整⁵。因此，针对调控DNA复制、检查点及有丝分裂机制的基因研究，需要分析突变细胞或通过siRNA敲低这些基因时可能出现的细胞周期进程异常。此外，此类分析也可用于评估细胞整体健康状况以及细胞对药物处理的反应。

5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）是一种胸苷类似物，可在DNA复制过程中掺入DNA中⁶。该方法曾被广泛用于鉴定处于S期的细胞。然而，后续需要进行强烈的DNA变性处理，以便利用抗BrdU抗体检测BrdU⁶。这种....

方案

1. Click-it EdU 检测所需试剂与储备液的制备

注意：有关试剂盒及其所含试剂的详细信息，请参见材料表和表1。

1. 在配制溶液前，先将小瓶恢复至室温。
2. 通过加入 2 mL 二甲基亚砜（DMSO，组分 C）配制 10 mM EdU（组分 A）储备液。充分混匀后于 -20 °C 保存。
3. 通过加入 70 μL 二甲基亚砜（DMSO，组分 C）配制 Alexa Fluor 647-叠氮化物（组分 B）工作液。充分混匀后于 -20 °C 保存。
4. 将 4 mL Click-iT EdU 反应缓冲液（组分 D）与 36 mL 去离子水混合，配制成 1x 的溶液。剩余溶液于 2–6 °C 保存。
5. 加入 2 mL 去离子水配制 10x 储备液（200 mg/mL）的 Click-iT EdU 缓冲液添加剂（组分 F）。充分混匀后于 -20 °C 保存。
6. Hoechst 33342（组分 G）于 2–6 °C 保存。DMSO（组分 C）置于干燥器中于 -20 °C 保存。
   ​注意：操作 DMSO 和 Hoechst 时应佩戴手套。

2. 三龄幼虫大脑的解剖及EdU掺入

结果

双叶型的Drosophila三龄幼虫脑已被用作研究基本细胞和发育过程的模型系统⁹。本研究的重点是介绍一种用于分析CB区域EdU和pH3标记的神经母细胞（NB）细胞周期进程的实验方案（图1）。CB区域的神经母细胞分为I型和II型，表现出典型的不对称分裂模式⁹。每次I型神经母细胞分裂产生一个具有自我更新能力的神经母细胞和一个注定分化的中间神经前体细胞（GMC）⁹。相比之下，II型神经母细胞产生可进行过渡性扩增的未成熟神经前体细胞（INP），这些细胞能够自我更新并进一步生成2个GMC⁹。尽管在OL区域存在一个独立的神经母细胞群体，但本研究聚焦于CB区域的神经母细胞，因其体积较大且可通过神经母细胞特异性标记物轻松识别。

本研究中，使用Miranda来识别和分析中央脑神经母细胞（CB NBs）（

讨论

EdU 掺入及其随后与细胞通透性叠氮化物发生的“点击”反应，相较于早期使用的 BrdU 方法具有实际优势⁷。然而，该反应由 Cu(I) 离子催化，某些染料在此铜催化剂存在下可能不稳定，这一点已被 Click-it EdU 试剂盒制造商明确警示。当在完成 EdU 检测步骤后进行免疫染色实验时，红光通道染料 Alexa Fluor 568 和 Cy3 未观察到预期的信号强度。然而，若在 EdU 检测步骤之前完成免疫染色反应，则实验结果良好。采用该方案，使用四个通道分别可视化 Hoechst、pH3、Miranda 和 EdU。

本方案中另一个优化的步骤是采用分离的脑组织直接摄取EdU，而不是通过向幼虫喂食添加EdU的果蝇食物。由于完整的黑腹果蝇（Drosophila）神经母细胞周期持续约2–2.5小时¹⁶，因此本方案中脑组织在EdU中孵育2.5小时，可实现对神经母细胞一个完整细胞周期的追踪。对EdU和pH3均无阳性染色的细胞为静息细胞。在三龄幼虫中，由于神经母细胞正处于活跃.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
果蝇品系
P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p)	布卢明顿果蝇资源中心	#15477	Mms19 基因第三外显子中的P元件插入突变品系
+; Mms19::eGFP, Mms19p	本实验室构建		Mms19p 背景下表达eGFP标记的Mms19蛋白
w1118	布卢明顿果蝇资源中心	#3605	野生型品系 (w;+;+)
一抗			稀释比例
大鼠抗Miranda抗体	Abcam	Ab197788	1/250
兔抗pH3抗体	Cell Signaling	9701	1/200
二抗
山羊抗大鼠Cy3抗体	Jackson Immuno	112-165-167	1/150
山羊抗大鼠Alexa Fluor 568抗体	Invitrogen	A11077	1/500
山羊抗兔Alexa Fluor 488抗体	Invitrogen	A27034	1/500
试剂/试剂盒
Aqua Poly/Mount 封片剂	Polysciences Inc	18606-20
Click-it EdU 标记试剂盒，Alexa Fluor 647	Thermo Fischer Scientific	C10340
Schneider’s 果蝇培养基	Thermo Fischer Scientific	21720-024
牛血清白蛋白（BSA）第五组分	Merck	10735078001
Triton X-100	Fischer Scientific	9002-93-1	非离子型去垢剂
软件
Fiji (ImageJ)	https://imagej.net/Fiji
Leica Application Suite (LAS X)	Leica Microsystems
PRISM	GraphPad 软件	版本 5
Microsoft Excel	Microsoft Office	2016
仪器
Leica TCS SP8 激光共聚焦显微镜，配备63倍油镜、1.4 NA 平场复消色差物镜
材料
Aqua Poly/Mount 封片剂			水溶性、无自发荧光的封片介质
Pyrex 3孔或9孔玻璃凹板
Whatman 滤纸