Summary
Celcyclusanalyse met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) en fosfo-histon H3 (pH3) etikettering is een procedure in meerdere stappen die uitgebreide optimalisatie kan vereisen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat alle stappen voor deze procedure beschrijft, inclusief beeldanalyse en kwantificering om cellen in verschillende celcyclusfasen te onderscheiden.
Abstract
In vivo celcyclusprogressieanalyse wordt routinematig uitgevoerd in studies naar genen die mitose en DNA-replicatie reguleren. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) is gebruikt om replicatieve / S-fase progressie te onderzoeken, terwijl antilichamen tegen fosfo-histon H3 zijn gebruikt om mitotische kernen en cellen te markeren. Een combinatie van beide labels zou de classificatie van G0/G1 (Gap-fase), S (replicatief) en M (mitotisch) mogelijk maken en dienen als een belangrijk hulpmiddel om de effecten van mitotische gen-knockdowns of nulmutanten op de progressie van de celcyclus te evalueren. De reagentia die worden gebruikt om EdU-gelabelde cellen te markeren, zijn echter niet compatibel met verschillende secundaire antilichaam-fluorescerende tags. Dit bemoeilijkt immunostaining, waarbij primaire en gelabelde secundaire antilichamen worden gebruikt om pH3-positieve mitotische cellen te markeren. Dit artikel beschrijft een stap-voor-stap protocol voor de dual-labeling van EdU en pH3 in Drosophila larvale neurale stamcellen, een systeem dat uitgebreid wordt gebruikt om mitotische factoren te bestuderen. Daarnaast is er een protocol voor beeldanalyse en kwantificering om gelabelde cellen toe te wijzen in 3 verschillende categorieën, G0/ G1, S, S>G2 / M (progressie van S naar G2 / M) en M-fasen.
Introduction
De celdelingscyclus bestaat uit een G1-fase (eerste gapfase), een replicatieve/S-fase, een G2-fase (tweede gapfase) en een M-fase (mitotische fase). Door deze fasen ondergaat de cel dramatische veranderingen in cellulaire transcriptie, vertaling en reorganisatie van cytoskeletmachines1,2. Als reactie op ontwikkelings- en omgevingssignalen kunnen cellen tijdelijk ophouden te delen en rustig (G0) of differentiëren worden en permanent ophouden te delen3. Andere scenario's, zoals DNA-schade, kunnen voortijdige differentiatie of apoptoseveroorzaken 3,4. Reactie op dergelijke signalen wordt gemedieerd door controlepunten voor de celcyclus, die fungeren als een bewakingssysteem om de integriteit van essentiële cellulaire processen te waarborgen voordat de cel zich verbindt aan de volgende fase van de delingcyclus5. Daarom moeten studies naar genen die DNA-replicatie, checkpoints en mitotische machines reguleren, mogelijke celcyclusprogressiedefecten analyseren die kunnen optreden in mutante cellen of bij siRNA-knockdown van deze genen. Bovendien kunnen dergelijke analyses worden gebruikt om de algehele celgezondheid en cellulaire reacties op medicamenteuze behandeling te testen.
5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) is een thymidine-analoog dat tijdens replicatie in het DNA wordt opgenomen6. Deze methode werd uitgebreid gebruikt om cellen in de S-fase te identificeren. De cellen worden vervolgens echter onderworpen aan strenge DNA-denaturatieprocedures om detectie van BrdU mogelijk te maken door het gebruik van anti-BrdU-antilichamen6. Deze harde behandeling kan cellulaire epitopen beschadigen en verdere karakterisering van het monster door immunostaining voorkomen. EdU-opname en daaropvolgende detectie door een kopergekatalyseerde,'klikreactie' met kleine, celdoorlatende, fluorescerend gelabelde azidekleurstoffen elimineert de noodzaak van agressieve denaturatieprocedures7. Deze methode kwam daarom naar voren als een praktischer alternatief voor BrdU-integratie.
Verder is pH3 beschreven als een betrouwbare marker voor mitotische / M-fasecellen8. Histon H3 is een DNA-geassocieerd kernhitoneiwit dat rond de late G2-fase tot vroege M-fase wordt gefosforyleerd en tegen het einde van anafase8wordt gedefosforyleerd. Verschillende commerciële antilichamen kunnen worden gebruikt om pH3 te detecteren met behulp van standaard immunostainingprotocollen. Dubbele kleuring van EdU en pH3 zou daarom de detectie van cellen in zowel S-fase als M-fase mogelijk maken. Bovendien zouden cellen in de G1- en vroege G2-fase voor geen van de markers positief kleuren.
Drosophila neurale stamcellen of neuroblasten (NBs) bieden een goed gekarakteriseerd stamcelmodel waarbij cellen zich asymmetrisch delen om één identieke zelfvernieuwende NB en een ganglionmoedercel (GMC) te produceren, die is vetgemest voor differentiatie9. Daarnaast maken verschillende genetische hulpmiddelen en NB-specifieke antilichamen dit systeem geschikt voor genetische manipulatie en live-cell imaging. Bijgevolg hebben verschillende studies NBs gebruikt om genen te bestuderen die asymmetrische delingen en bepaling van het lot van cellen reguleren9. Verschillende populaties van NB's bestaan in de centrale hersenen (CB) en de optische kwab (OL) van de larvale hersenen9; Cb-nbb's werden gebruikt voor de huidige studie. Deze derde instar larvale CB NBs zijn grote cellen die ook geschikt zijn voor het bestuderen van factoren die de mitotische spindelassemblage reguleren. Een protocol om progressiedefecten van de celcyclus te analyseren zou een essentieel hulpmiddel zijn in dergelijke studies.
Protocollen die eerder zijn gepubliceerd, gebruikten commerciële kits, zoals Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, die verschillende reactiecomponenten en azidekleurstoffen bieden die zijn getagd met een verscheidenheid aan Alexa Fluor-kleurstoffen voor EdU-opname en -detectie10. De reagentia die bij dergelijke kits worden geleverd, zijn echter niet compatibel met sommige fluorescerende tags die vaak worden gebruikt met secundaire antilichamen. Deze EdU-detectiekit (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit geleverd met Alexa Fluor 647-geconjugeerde azidekleurstof) werd getest in Drosophila derde instar larvale NB's, en co-kleuring werd geprobeerd met antilichamen tegen pH3 en Miranda, een marker voor NBs. Verder werden Alexa Fluor 568- of Cy3-gelabelde secundaire antilichamen gebruikt voor de detectie van Miranda-etikettering op het plasmamembraan van NBs11. De verwachte signaalintensiteit en het kleuringspatroon (niet-gepubliceerde resultaten) werden echter niet waargenomen met deze secundaire antilichamen wanneer immunostaining werd uitgevoerd na EdU-detectie.
Voor EdU-opname vereiste het door Daul en collega's beschreven protocol voeding van de larven met Kankel-White-medium gemengd met EdU en broomfenolblauw (BPB)10. De larven voedden zich met het EdU- en BPB-spiked voedsel, dat te zien was aan de blauwe kleur bij inname in de larvale darm. Hoewel deze methode werd gebruikt voor EdU-opname in Mms19-functieverlies (Mms19P) derde instarlarven, voedden de Mms19P-larven zich blijkbaar niet omdat er nauwelijks een blauwe kleur werd gedetecteerd in de larvale darm (ongepubliceerde resultaten). De Mms19P-larven vertonen drastische ontwikkelingsmisvormingen en stoppen uiteindelijk in het derde instarstadium. Dit kan op de een of andere manier het voedingsgedrag van de derde instarlarven beïnvloeden en het EdU-voedingsprotocol ongeschikt maken voor dergelijke gevallen.
Na bestudering van de beschikbare literatuur en uitgebreid werken aan de standaardisatie van essentiële stappen, werd een alternatieve aanpak voorgesteld voor EdU/pH3 dual-labeling in Drosophila NBs, waarvoor geen EdU aan larven hoeft te worden gevoerd. Een eerdere studie gebruikte dubbele EdU / pH3-kleuring om de celcyclus in OS's te analyseren, maar presenteerde geen gedetailleerd protocol4. Dit vormt een onnodige hindernis voor laboratoria die deze methode proberen te implementeren. Bovendien kan het evalueren van de compatibiliteit van verschillende reagentia met de EdU-kit en het uitvoeren van verdere optimalisatie een tijdrovend proces zijn. Dit artikel presenteert een stapsgewijs protocol dat betrekking heeft op EdU-opname in ontleed larvale hersenen en immunostaining met anti-pH3-antilichamen, gevolgd door confocale microscopie en beeldanalyse om NBs toe te wijzen aan vier verschillende categorieën: G0 / G1-fase, S-fase, S>G2 / M (progressie van S naar G2 / M) en M-fase. De stappen die moeten worden geoptimaliseerd, worden beschreven en tips gegeven voor beeldanalyse van grote datasets. Bovendien wordt de EdU / pH3-uitlezing in wild-type NBs geanalyseerd en vergeleken met Mms19P NBs, waarvan onlangs werd gemeld dat ze een celcyclusvertraging11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van reagentia en voorraden voor click-it EdU-test
OPMERKING: Raadpleeg de tabel met materialen en tabel 1 voor meer informatie over de kit en reagentia die bij de kit zijn geleverd.
- Breng de injectieflacons op kamertemperatuur voordat u de oplossingen bereidt.
- Bereid een voorraadoplossing van 10 mM EdU (component A) door toevoeging van 2 ml dimethylsulfoxide (DMSO, component C). Meng goed en bewaar bij -20 °C.
- Bereid een werkoplossing van Alexa Fluor 647-azide (component B) voor door 70μL DMSO (component C) toe te voegen. Meng goed en bewaar bij -20 °C.
- Bereid een 1x-oplossing van Click-iT EdU-reactiebuffer (component D) door 4 ml van deze oplossing te mengen met 36 ml gedeïoniseerd water. Bewaar de resterende oplossing bij 2-6 °C.
- Maak een 10x bouillon (200 mg/ml) van het Click-iT EdU bufferadditief (component F) door 2 ml gedeïoniseerd water toe te voegen. Meng goed en bewaar bij -20 °C.
- Bewaar Hoechst 33342 (component G) bij 2-6 °C. DMSO (component C) bewaren in een exsiccator bij -20 °C.
OPMERKING: Handschoenen moeten worden gebruikt om DMSO en Hoechst te hanteren.
2. Dissectie van derde instar larvale hersenen en EdU-opname
OPMERKING: Het protocol voor hersendissecties is eerder beschreven12. Voordat u met dissecties begint, moet u ervoor zorgen dat voldoende hoeveelheden van de EdU- en PFA-oplossingen worden bereid en ontdooid zoals beschreven in 2.6 en 3.1.
- Bereid 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door 25,6 g Na2HPO4.7H20, 80 g NaCl, 2 g KCl en 2 g KH2PO4 toe te voegen aan 1 l gedeïoniseerd water. Stel de pH in op 7,4 en bereid vervolgens een 1x-oplossing in gedeïoniseerd water.
- Voeg Schneiders dissectiemedium (SM) toe aan twee opeenvolgende depressies van een glazen (3 of 9) depressieglasvlekplaat. Voeg 1x PBS toe aan de volgende opeenvolgende depressie.
- Pluk met behulp van een tang zwervende derde instarlarven en plaats op een weefsel bevochtigd met PBS om vliegenvoedselresten te verwijderen. Plaats de larve in de depressie met PBS en vervolgens in de opeenvolgende depressie met SM.
- Verwijder met een fijne tang 3/4e van het onderlichaam van de larve.
- Pak voorzichtig de larvale mondhaken vast met een tang en houd de cuticula aan het andere uiteinde vast met de andere tang.
- Keer de kop van de larve binnenstebuiten door de mondhaken naar binnen te duwen en tegelijkertijd het weefsel aan het andere uiteinde af te pellen.
- Observeer de larvale hersenen met bevestigde denkbeeldige schijven. Verwijder andere weefsels die aan de hersenen zijn bevestigd en breng de hersenen over naar de volgende opeenvolgende depressie met SM.
- Ontdooi de 10 mM EdU stockoplossing. Bereid een oplossing van 100 μM door deze voorraad van 10 mM te verdunnen in SM.
- Voeg 100 μL van deze 100 μM EdU+SM oplossing toe in een andere depressie op de Pyrex plaat. Incubateer ~5-10 ontleedde hersenen in 100 μL 100 μM EdU+SM oplossing gedurende 2 uur bij 25 °C.
OPMERKING: Omdat NB's eenmaal in ~ 2 uur delen, heeft dit protocol tot doel één volledige celcyclus te analyseren. Gebruik intacte hersenen alleen voor verdere stappen. Gooi hersenen weg die beschadigd zijn tijdens dissectie.
3. Fixatie en immunostaining
- Bereid 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in een zuurkast.
- Voeg 4 g paraformaldehydepoeder toe aan 80 ml 1x PBS in een bekerglas op een magneetroerder en verwarm tot 60 °C. Om PFA op te lossen, voeg een paar druppels van 1 N NaOH toe. Controleer de pH en pas deze indien nodig aan op 7,0 met een paar druppels van 1 M HCl.
- Stel het volume in op 100 ml met 1x PBS. Vul de PFA-oplossing aan en bewaar tot 1 maand bij 2-6 °C. Voeg 0,3% niet-ionisch wasmiddel (zie de tabel met materialen)toe aan de PFA-oplossing voor een efficiënte fixatie van grote weefsels zoals de larvale hersenen.
- Breng na EdU-opname de hersenen over naar microcentrifugebuizen van 0,6 ml die 4% PFA bevatten. Incubeer bij kamertemperatuur op een nutator gedurende 15 min. Tik op de buis op de laboratoriumbank zodat de hersenen zich op de bodem van de buis nestelen.
- Verwijder de PFA en was 3 keer met PBS + 0,3% niet-ionisch wasmiddel (PBST) bij kamertemperatuur. Zorg ervoor dat elke wasbeurt minstens 10 minuten duurt op een nutator. Verwijder na de laatste wasbeurt PBST, voeg een blokkerende oplossing (PBST + 5% runderserumalbumine) toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verdund anti-Miranda-antilichaam (1:250) en anti-pH3-antilichaam (1:200) in PBST (beide antilichamen in dezelfde buis). Verwijder de blokkerende buffer en voeg de primaire antilichaamoplossing toe. Incubeer een nacht bij 2-6 °C op een nutator.
OPMERKING: Miranda is een membraaneiwit dat aanwezig is op CB NBs. Het dient om deze grote ronde cellen in het CB-gebied te identificeren13. - Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was 3 keer met PBST. Zorg ervoor dat elke wasbeurt 10 minuten duurt op een nutator bij kamertemperatuur.
- Bereid secundaire antilichaamoplossing voor door 1:500 verdunde Alexa Fluor 488 anti-Rabbit en Alexa Fluor 568 anti-Rat toe te voegen aan PBST. Verwijder de PBST en voeg de secundaire antilichaamoplossing toe aan de ontlede hersenen. Incubeer een nacht bij 2-6 °C in het donker, op een nutator, en was 3 keer met PBST (stap 3.5).
4. EdU-detectie, DNA-kleuring en montage
- Om de EdU-detectiecocktail te bereiden, mengt u de componenten (zie tabel 2)in een buis van 1,5 ml.
- Verwijder na de laatste wasbeurt (stap 3.6) PBST en voeg de EdU-detectiecocktail toe aan de ontlede hersenen. Incubeer bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten op een nutator. Was 2 keer met PBST gedurende 10 minuten elk, in het donker.
- Verdun voor DNA-kleuring Hoechst 33342 (component G) 1:2.000 in PBST om een oplossing van 5 μg/ml te bereiden.
- Verwijder PBST na de tweede wasbeurt (stap 4.2) en voeg 500 μL 5 μg/ml Hoechst-oplossing toe aan de ontleedde hersenen. Incubeer in het donker gedurende 10 min. Verwijder Hoechst en was eenmaal met PBST gedurende 10 minuten.
- Tik op de buis op de laboratoriumbank en laat de hersenen tot rust komen. Haal de PBST uit de buis, maar laat slechts 50-100 μL achter.
- Snijd het uiteinde van een micropipettetip van 200 μL en breng de hersenen voorzichtig over op een schone glazen dia. Verwijder overtollige PBST van de dia door te deppen met filtreerpapierstroken. Pas op dat het filterpapier de hersenen niet raakt.
- Plaats een druppel in water oplosbaar, niet-fluorescerend montagemedium op de hersenen en oriënteer de hersenen zodanig dat het ventrale zenuwstreng naar de dia is gericht en de lobben naar boven gericht. Rangschik de hersenen in een enkel bestand, zodat het gemakkelijker is om de hersenen serieel in beeld te brengen.
- Plaats voorzichtig een deklap bovenop de hersenen. Plaats de glijbaan 's nachts op 2-6 °C.
OPMERKING: Het montagemedium hardt uit bij nachtopslag, zodat het niet nodig is om de deklip af te dichten met nagellak.
5. Beeldvorming
OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over de laserscanmicroscoop en het olie-onderdompelingsobjectief dat in dit protocol wordt gebruikt.
- Selecteer in de acquisitiesoftware de doelstelling 63x.
- Doe een druppel dompelolie op de coverslip net boven de gemonteerde hersenen om het weefsel gemakkelijker door het oculair te lokaliseren.
- Gebruik het DAPI/Hoechst 33342-kanaal om de hersenen via het oculair te vinden en schakel vervolgens over naar de acquisitiemodus in de software.
- Stel 4 kanalen in om Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) en Alexa Fluor 647 (EdU) in beeld te brengen. Gebruik de kleurstofassistent, die automatisch de excitatielasers en emissiefilters voor de geselecteerde kleurstoffen instelt.
- Stel het gezichtsveld zo in dat het de hele hersenkwab omvat. Stel je het volledige volume van de hersenkwab voor door z-stacks te verkrijgen die 0,8 μm uit elkaar staan. Sla alle afbeeldingen van een beeldbewerkingssessie op in een *.lif-bibliotheekindeling.
6. Beeldanalyse
OPMERKING: De volgende stappen beschrijven de analyse van verkregen beelden en hoe cellen te sorteren in G0/G1-fase, S-fase, S>G2/M (progressie van S naar G2/M) en M-fase met behulp van de ImageJ-software.
- Download Fiji (Fiji is ImageJ) vanaf de volgende URL: https://fiji.sc/. Open Fiji en sleep de LIF-bestanden naar Fiji.
OPMERKING: Fiji is een versie van ImageJ die vooraf is geïnstalleerd met verschillende plug-ins14. Het overbrengen van .lif-bestanden naar Fiji opent de Plug-in Bio-formats, die nodig is om de .lif-bestanden te verwerken. Bio-formaten plugin is ook vereist om beeldbestanden gegenereerd van sommige andere microscoop merken, bijvoorbeeld nd2 bestanden gegenereerd met een Nikon microscoop te openen. Deze plug-in wordt vooraf geïnstalleerd met Fiji. - Selecteer Gegevensbrowser op het tabblad Stapelweergave en gebruik virtuele stapel op het tabblad Geheugenbeheer in de plug-in bio-indelingen.
OPMERKING: Lif-bestanden met z-stacks van 8-10 hersenen zijn vaak 300-400 megabytes groot. Op computers met weinig RAM kan het openen van een paar van dergelijke bestanden het beschikbare RAM-geheugen op ImageJ snel uitputten en verdere beeldverwerking voorkomen. Virtuele stack is 'read-only', heeft geen hoog RAM-geheugen nodig voor verwerking en is een ideale optie om grote datasets op Fiji te laden. - Observeer de meerkanaalsafbeelding die wordt weergegeven in ImageJ. Wijzig de kleur van de kanalen in de menubalk met het gereedschap Afbeelding | kleur | kanalen. Observeer de Miranda-gelabelde NB's als grote ronde cellen in het CB-gebied.
- Teken een interessegebied (ROI) met behulp van de ellipstool over elke NB om te voorkomen dat de NB twee keer wordt geteld.
- Selecteer in de menubalk ImageJde optie | tools analyseren | ROI-manager. Markeer alle NBs in de huidige z-sectie en druk op t nadat u elke cel hebt gemarkeerd.
- Zodra alle NBs in de huidige z-sectie zijn gemarkeerd, wijzigt u de kanalen in pH3 en EdU en telt u handmatig het aantal EdU-positieve NBs, pH3-positieve NBs, NBs die positief kleuren voor zowel EdU als pH3, en NBs die niet kleuren voor beide markers.
- Zoek naar NBs in volgende z-secties, verwijder oude ROI's en voeg nieuwe ROI's toe om KB's in verschillende stacks te tellen.
- Maak een spreadsheet met de volgende kolommen: 1. EdU- pH3-: deze sectie vertegenwoordigt de dubbelnegatieve cellen die zich in de G0/G1-fase van de celcyclus bevinden; 2. EdU+: de cellen in deze categorie hebben EdU opgenomen en ondergaan DNA-replicatie (S-fase); 3. EdU+ pH3+: deze dubbelpositieve cellen hebben de S-fase voltooid en zijn gevorderd tot de G2- of M-fase; 4. pH3+: deze NB's ondergaan mitose.
- Bereken percentages van NBs aanwezig in alle bovenstaande 4 categorieën voor elke lob. Bereid een staafdiagram voor met behulp van de spreadsheetsoftware met de gepoolde gegevens voor percentages VAN KB's in elke categorie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De bi-lobed Drosophila derde instar larvale hersenen is gebruikt als een modelsysteem om fundamentele cellulaire en ontwikkelingsprocessen te bestuderen9. De focus van de huidige studie was om een protocol te presenteren voor analyse van celcyclusprogressie in EdU- en pH3-gelabelde NBs van de CB-regio(figuur 1). De CB NB's zijn onderverdeeld in type I en type II en vertonen het karakteristieke asymmetrische delingpatroon9. Elke type I NB-divisie genereert een NB, die in staat is tot zelfvernieuwing, en een andere GMC die is voorgesperd voor differentiatie9. Daarentegen genereren type II NB's transitversterkende, onrijpe neurale voorlopercellen (INP's) die zichzelf vernieuwen en 2 GMC's genereren9. Hoewel er een aparte NB-populatie bestaat in de OL-regio, richtte deze studie zich op de CB-NBs, die groot en gemakkelijk identificeerbaar zijn met NB-specifieke markers.
Voor deze studie werd Miranda gebruikt om CB NBs te identificeren en te analyseren(figuur 2). Hoewel Miranda ook andere celpopulaties in het OL kleurt, kunnen CB OS's worden geïdentificeerd met Miranda vanwege hun grote omvang en CB-locatie13. Andere meer specifieke markers kunnen ook worden gebruikt om CB-NB's te labelen, zoals Deadpan, een transcriptiefactor die NB-zelfvernieuwing reguleert. Omdat zowel pH3 als EdU echter het chromatine markeren, werd de membraanmarker Miranda gebruikt om het gemakkelijker te maken om NBs gemarkeerd met pH3 en EdU te visualiseren en te analyseren. EdU-integratie, daaropvolgende detectie en verdere karakterisering door immunostaining en beeldanalyse is een complexe procedure. Het is belangrijk om elke stap te standaardiseren om optimale kleurings- en beeldvormingsomstandigheden te bepalen. Hoewel sommige gepubliceerde rapporten EdU / pH3-etiketteringsstrategieën presenteren, gaan deze rapporten niet in op optimalisatie- en beeldanalysestappen. De workflow in figuur 1 geeft een overzicht van de stappen vanaf de opname van EdU tot en met de beeldanalyse.
We hebben onlangs het Mms19-gen gekarakteriseerd, dat door NBs wordt vereist voor normale mitotische progressie11. Door middel van live-cell imaging-analyses bleek dat NP's zonder functionele Mms19 er twee keer zo lang over deden als wild-type NBs om mitose te voltooien. Dit kwam duidelijk tot uiting in de EdU/pH3-analyse, waarbij een significant hoger percentage Mms19P NBs zich in de M-fase bevond in vergelijking met wild-type NBs ( Figuur3A). Expressie van het Mms19::eGFP-fusie-eiwit in de Mms19P-achtergrond was aangetoond dat het fenotypische defectenredt 11,15. Dit correleerde goed met de resultaten van de celcyclusprogressieanalyse waarbij het aandeel cellen in de M-fase werd gered tot wild-type niveaus op Mms19::eGFP-expressie in de Mms19P-achtergrond ( Figuur3A, B).
Figuur 1: Een vereenvoudigde workflow voor EdU/pH3 dual-labeling. Derde instar larvale hersenen werden ontleed en geïncubeerd met 100 μM EdU gedurende 2 uur. Vervolgens werd het hersenweefsel gefixeerd met PFA en immunos gekleurd met antilichamen tegen Miranda en pH3. Beelden van de gekleurde hersenen werden verkregen op een confocale microscoop en verder verwerkt met ImageJ / Fiji om cellen toe te wijzen aan verschillende celcyclusfasen. Afkortingen: EdU = met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; pH3 = fosfo-histon H3; PFA = paraformaldehyde; SM = Schneiders dissectiemedium; PBS = fosfaat-gebufferde zoutoplossing; PBST = PBS + 0,3% niet-ionisch wasmiddel; BSA = runderserumalbumine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Toewijzing van cellen aan G1/G0; S; S>G2/M en M fasen. Cellen doorlopen de G1-, S-, G2- en M-fasen om een volledige celcyclus te voltooien. CB NB's van zwervende derde instar larvale hersenen werden gemarkeerd met Miranda (rood), EdU (grijs), pH3 (groen) en DNA werd gelabeld met Hoechst 33342 (blauw). Gelabelde NB's werden geanalyseerd in ImageJ en toegewezen aan 4 verschillende fasen op basis van de vraag of ze positief gekleurd waren voor (A) noch EdU noch pH3 (G1 / G0), (B) alleen EdU (S-fase), (C) zowel EdU als pH3 (S>G2 / M), en (D) alleen pH3 (M-fase). Voorbeelden van individuele NB's alleen uit wild-type hersenen worden hier getoond. Schaalbalken = 5 μm. Afkortingen: CB = centraal brein; NBs = neuroblasten; EdU = met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine; pH3 = fosfo-histon H3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Effect van Mms19P op nb celcyclus fase verdeling. (A) Na analyse van wild-type (w;+;+) NBs bleek ~25% NBs zich in de M-fase te bevinden. In Mms19P NBs steeg dit aandeel echter tot bijna 40%. Van Mms19::eGFP-expressie in de Mms19P-achtergrond is bekend dat het Mms19 P-fenotypen redt, en het aandeel M-fase-NBs op deze achtergrond was vergelijkbaar met wildtype. (B) Percentages van NBs in 4 verschillende categorieën die overeenkomen met celcyclusfasen G1/G0, S, S>G2/M en M werden vergeleken tussen wildtypen; Mms19P, en Mms19::eGFP, Mms19P genotypen. Het aandeel van de M-fase en G1/G0-fasen verschilt aanzienlijk in Mms19P NBs in vergelijking met wild-type NBs. Daarentegen is de celcyclusverdeling van NBs in Mms19::eGFP, Mms19P hersenen vergelijkbaar met die in het wildtype. Statistische significantie werd berekend met behulp van de Kruskal-Wallis-test en meerdere kolommen vergeleken met behulp van Dunn's post-test; (P<0,001). Dit cijfer is gewijzigd van 11. Afkortingen: NBs = neuroblasten; eGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; WT = wild-type. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Reagens | Bedrag/volume |
| EdU (component A) | 5 mg |
| Alexa Fluor 647 – azide (component B) | 1 injectieflacon |
| Dimethylsulfoxide (DMSO, component C) | 4 ml |
| Click-iT EdU reactiebuffer (component D) | 4 ml (10x oplossing) |
| Kopersulfaat (CuSO4, component E) | 100m; 1 injectieflacon |
| Click-iT EdU buffer additief (component F) | 400 mg |
| Hoechst 33342 (component G) | 10 mg/ml in water, 35 μL |
Tabel 1: EdU-kitcomponenten. Componenten geleverd met de Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit en de respectievelijke hoeveelheden / volumes. Afkorting: EdU = met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine.
| Reactie componenten | Volume (ml) |
| 1x Click-iT reactiebuffer (voorbereid in stap 1.4) | 430 |
| CuSO4 (component E) | 20 |
| Alexa Fluor 647 – azide (component B, bereid in stap 1.3) | 1.2 |
| Reactiebufferadditief (component F, bereid in stap 1.5) | 50 |
| Totaal volume | ~ 500 |
Tabel 2: Bereiding van EdU-detectiecocktail. EdU-detectiecocktail werd bereid door de aangegeven volumes van de kitcomponenten (bereid in sectie 2) te mengen. Afkorting: EdU = met 5-ethynyl-2'-deoxyuridine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EdU-opname en de daaropvolgende 'klik'-reactie met celdoorlatend azide biedt praktische voordelen van deze techniek ten opzichte van de BrdU-methode die eerder werd gebruikt7. Deze reactie wordt echter gekatalyseerd door Cu(I)-ionen en verschillende kleurstoffen kunnen onstabiel zijn in de aanwezigheid van deze koperkatalysator, zoals duidelijk wordt geadviseerd door de Click-it EdU-kitfabrikant. Wanneer immunostaining-experimenten waren uitgevoerd na het uitvoeren van de EdU-detectiestap, werd de verwachte signaalintensiteit niet waargenomen met de rode kanaalkleurstoffen, Alexa Fluor 568 en Cy3. Het protocol werkte echter wanneer immunostainingreacties werden voltooid vóór de EdU-detectiestap. Met dit protocol werden vier kanalen gebruikt om Hoechst, pH3, Miranda en EdU te visualiseren.
Een andere geoptimaliseerde stap in dit protocol was de opname van EdU door ontleedde hersenen in tegenstelling tot het voeren van EdU-spiked vliegenvoer aan larven. Aangezien de volledige Drosophila NB-celcyclus ongeveer 2-2,5 hduurt 16, maakt EdU-opname door hersenen gedurende 2,5 h mogelijk, zoals in dit protocol, het volgen van één volledige celcyclus van NBs. Cellen die niet positief kleuren voor EdU of pH3 zijn rustende cellen. In het geval van een derde instarlarve waarin de NB's zich actief delen, zouden deze rustende cellen zich hoogstwaarschijnlijk in de G1-fase van de celcyclus bevinden. Echter, van de late embryonale tot de vroege tweede instar stadia, worden de OS's tijdelijk rustig17. In deze vroege ontwikkelingsstadia zou dubbelnegatieve kleuring hoogstwaarschijnlijk een G0 / rustige fase vertegenwoordigen.
NBs die DNA-replicatie ondergaan, moeten positief kleuren voor EdU, terwijl cellen die zijn gevorderd van de S-fase (EdU-integratie) naar de late G2- of M-fase positief moeten kleuren voor zowel EdU als pH3. Karakterisering van de G2-fase zou echter moeilijk zijn met dit protocol, omdat vroege G2-cellen niet positief kleuren voor EdU of pH3. Cellen die EdU hebben opgenomen en zijn gevorderd tot vroege G2 zouden echter ook positief kleuren voor EdU en de analyse van de G2-fase kunnen bemoeilijken. Verschillende geneesmiddelen die DNA-replicatie remmen, veroorzaken celcyclusstilstand in de S-fase18,19,20. Dit protocol zou een handig hulpmiddel kunnen zijn om het effect van dergelijke medicamenteuze behandelingen te analyseren en te identificeren, omdat S-fase-geblokkeerde cellen niet zouden evolueren naar de M-fase en de fractie van EdU, pH3 dubbelpositieve cellen zou in dit geval verminderd of zelfs afwezig zijn.
In een recent gepubliceerde studie evalueerden we het effect van het Mms19-gen op mitotische progressie in NBs11. Door middel van live-cell imaging toonden we een dramatische vertraging van Mms19P NBs in M-fase progressie. Terwijl wild-type NBs de M-fase in ~ 10 minuten voltooien, hadden Mms19P NBs ongeveer twee keer zoveel tijd nodig om de M-fase11te voltooien. Dienovereenkomstig weerspiegelde dit EdU / pH3 dual-labeling protocol ook een mitotische vertraging, aangezien we bijna 1,5x zoveel NBs positief zagen kleuren voor pH3 in Mms19P-hersenen in vergelijking met wild-type hersenen. Gegevens van dit EdU-protocol zijn dus vergelijkbaar met de directe live-cell imaging resultaten. Omdat directe, live-celbenaderingen tijdrovend zijn en uitgebreide optimalisatie vereisen, kan dit protocol worden gebruikt om een snelle eerste screening van dergelijke celcyclusmutanten uit te voeren om defecten in specifieke stadia te begrijpen. Zodra een fase van interesse is geïdentificeerd, kan dit worden gevolgd door directe celvisualisatietests.
De duur van celcyclusfasen kan aanzienlijk variëren tussen verschillende celtypen en ontwikkelingsstadia. Bijvoorbeeld, bij de ontwikkeling van Drosophila-embryo's resulteert downregulatie van mitotische kinasen in een langere duur van de S-fase, terwijl in cellen die zijn voorbestemd voor differentiatie, zoals fret (Mustela putorius furo) hersenneuronale voorlopers, de S-faseduur aanzienlijk kort is21,22. De labelingtijd van de EdU-puls moet dus worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de lengte van de S- en G-fasen in het gegeven celtype. De duur van de EdU-puls zou ook afhangen van de experimentele doelstellingen, bijvoorbeeld, een korte puls is voldoende om de fractie van cellen te meten die zich momenteel in de S-fase bevinden, terwijl een langere puls de analyse van de progressie van cellen door de S-fase mogelijk maakt.
Uitgebreide optimalisatie van de EdU-puls kan ook een schatting van de S-fase mogelijk maken, zoals elegant werd gedemonstreerd door Pereira en collega's23. Deze onderzoekers demonstreerden een nieuwe, op flowcytometrie gebaseerde methode waarbij HCT116-cellen gedurende incrementele tijdsperioden werden gepulseerd met EdU. De auteurs toonden aan dat de maximale fluorescerende intensiteit van EdU wordt verkregen wanneer de pulserende tijd overeenkomt met de lengte van de S fase23. Bovendien maakte analyse van de temporele progressie van EdU-gelabelde cellen ook de kwantificering van de G1- en G2/M-fasen mogelijk. Hoewel het huidige protocol voor EdU/pH3 dual-labeling de analyse van S- en M-fasedefecten mogelijk maakt, is het niet mogelijk om de precieze duur van fasen met dit protocol te meten. Het protocol beschreven door Pereira en collega's zou een geschikt alternatief kunnen zijn voor assays die de bepaling van celcyclusfaselengten vereisen. Het aanpassen van dit protocol met een extra pH3-etikettering kan ook resulteren in een hogere gevoeligheid bij het detecteren van M-fasecellen.
Afgezien van de EdU / pH3-benadering, is de fluorescent ubiquitin-gebaseerde celcyclusindicator (FUCCI) -methode ook gebruikt om de progressie van de celcyclus in zoogdiercellen en in Drosophila-weefsels te bestuderen24,25. Dit systeem maakt gebruik van twee fluorescerend gelabelde eiwitten, geminin en Cdt1, die motieven bevatten voor specifieke ubiquitinatie en proteasomale afbraak door respectievelijk APC / C en SCFSkp2. Aangezien APC/C alleen actief is vanaf het einde van mitose tot en met G1 en SCFSkp2 actief is in de S- en G2-fasen, maakt de celcyclus-fase-specifieke afbraak van fluorescerend gelabeld geminin en Cdt1 de bepaling van de celcyclus fase24mogelijk . Een licht aangepaste 'Fly-FUCCI'-methode voor Drosophila-weefsels vertrouwt in plaats daarvan op fluorescerend getagd Cyclin B en E2F1, die worden afgebroken door APC / C (tijdens mitose) en CRL4Cdt2 (tijdens het begin van de S-fase), respectievelijk25. Een eerdere studie die prediculaire differentiatie van Drosophila larvale NBs karakteriseerde in reactie op aneuploïdie analyseerde celcyclusdefecten met zowel Fly-FUCCI- als EdU / pH3-methoden4. Aneuploïdie induceert voortijdige differentiatie van NBs, en daarom verlaat een groot deel van de NBs de celcyclus.
Dit werd nauwkeurig weerspiegeld in zowel Fly-FUCCI- als EdU / pH3-gegevens4. Gegevens verkregen uit de EdU/pH3-methode zijn daarom ook vergelijkbaar met andere celcyclusvolgmethoden zoals de Fly-FUCCI. Fly-FUCCI is een krachtig hulpmiddel en alle vliegvoorraden met alomtegenwoordig aangedreven fluorescerende markers of markers gefuseerd met weefselspecifieke promotors zijn verkrijgbaar bij voorraadcentra. Het gebruik van deze constructies om celcyclusdefecten in nulmutanten of met siRNA-knockdown te analyseren, zou echter genetische recombinatie met zich meebrengen om een vliegenbestand te creëren dat de FUCCI-elementen, weefselspecifieke stuurprogramma's, een specifieke mutatie of een siRNA van belang draagt. Dit proces zou het eigenlijke experiment enkele weken vertragen, terwijl de EdU / pH3-methode gemakkelijk kan worden toegepast op vlieglijnen met een genetische nulachtergrond. Als alternatief kan voor siRNA-knockdowns een kruising in één stap tussen een drivervoorraad en een siRNA-voorraad worden gebruikt voor EdU / pH3-analyse.
Een nadeel van deze aanpak is de beeldvormings- en beeldanalysepijplijn, waarbij handmatig een groot aantal cellen uit verschillende hersenmonsters wordt gekwantificeerd. Onlangs is een flowcytometriebenadering gepresenteerd als een high-throughput alternatief voor een conventionele op microscopie gebaseerde test voor celcyclusanalyse26. De snelle analyse van duizenden cellen tegelijkertijd met deze aanpak is voordelig en de mogelijkheid om meerdere markers te detecteren maakt de kwantificering van specifieke celtypen mogelijk. Hoewel het gemakkelijk bruikbaar is met gekweekte cellijnen, kan dit protocol moeilijk worden toegepast op grote weefselmonsters zoals de larvale hersenen van Drosophila. Er zijn echter enkele protocollen gepubliceerd die hersenweefseldissociatie en analyse van geïsoleerde larvale NBs beschrijven door flowcytometrie27,28. Verdere innovatieve benaderingen in deze richting kunnen nieuwe mogelijkheden bieden voor high-throughput celcyclusanalyse in Drosophila-weefsels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van de Swiss National Science Foundation (projectsubsidie 31003A_173188; www.snf.ch) en de Universiteit van Bern (www.unibe.ch) aan BS. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
- Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
- Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
- Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
- Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
- Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
- Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
- Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
- Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
- Duronio, R. J.
- Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
- Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
- Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
