Summary
Cellcykel analys med 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) och phospho-histon H3 (pH3) märkning är en flera steg förfarande som kan kräva omfattande optimering. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll som beskriver alla steg för denna procedur inklusive bildanalys och kvantifiering för att skilja celler i olika cellcykelfaser.
Abstract
In vivo cellcykelprogressionsanalys utförs rutinmässigt i studier på gener som reglerar mitos och DNA-replikering. 5-Ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) har använts för att undersöka replikativ/S-fas progression, medan antikroppar mot fosfo-histon H3 har använts för att markera mitotiska atomkärnor och celler. En kombination av båda etiketterna skulle möjliggöra klassificering av G0/G1 (Gap phase), S (replikativ) och M (mitotisk) faser och fungera som ett viktigt verktyg för att utvärdera effekterna av mitotiska gen knockdowns eller null mutanter på cellcykelprogression. De reagenser som används för att märka EdU-märkta celler är dock oförenliga med flera sekundära antikroppslysrör. Detta komplicerar immunstaining, där primära och märkta sekundära antikroppar används för att markera pH3-positiva mitotiska celler. Detta dokument beskriver ett steg-för-steg protokoll för dubbelmärkning av EdU och pH3 i Drosophila larval neurala stamceller, ett system som används i stor utsträckning för att studera mitotiska faktorer. Dessutom tillhandahålls ett protokoll för bildanalys och kvantifiering för att allokera märkta celler i 3 distinkta kategorier, G0/G1, S, S>G2/M (progression från S till G2/M) och M-faser.
Introduction
Celldelningscykeln består av en G1-fas (första gapfasen), en replikativ/S-fas, en G2-fas (andra gapfasen) och en M-fas (mitotisk). Genom dessa faser genomgår cellen dramatiska förändringar i cellulär transkription, översättning och omorganisation av cytoskeletala maskiner1,2. Som svar på utvecklings- och miljösignaler kan celler tillfälligt upphöra att dela sig och bli quiescent (G0) eller differentiera och permanent upphöra att dela3. Andra scenarier, såsom DNA-skador, kan orsaka för tidig differentiering eller apoptos3,4. Svar på sådana signaler förmedlas av cellcykelkontrollpunkter, som fungerar som ett övervakningssystem för att säkerställa integriteten hos väsentliga cellulära processer innan cellen förbinder sig till nästa fas av delningscykeln5. Därför måste studier på gener som reglerar DNA-replikation, kontrollpunkter och mitotiska maskiner analysera möjliga cellcykelprogressionsdefekter som kan uppstå i mutanta celler eller vid siRNA-knockdown av dessa gener. Dessutom kan sådana analyser användas för att testa övergripande cellhälsa samt cellulära svar på läkemedelsbehandling.
5-bromo-2'-deoxyuridin (BrdU) är en tymidinanalog som införlivas i DNA under replikering6. Denna metod användes i stor utsträckning för att identifiera celler i S-fas. Cellerna utsätts dock sedan för hårda DNA-denatureringsförfaranden för att möjliggöra detektion av BrdU genom användning av anti-BrdU-antikroppar6. Denna hårda behandling kan skada cellulära epitoper och förhindra ytterligare karakterisering av provet genom immunstaining. EdU-inkorporering och efterföljande detektion av en kopparkatalyserad klickreaktion med små, cellgenomsläppliga, fluorescerande märkta azidfärger eliminerar behovet av hårda denatureringsförfaranden7. Denna metod framstod därför som ett mer praktiskt alternativ till BrdU-införlivandet.
Dessutom har pH3 beskrivits som en tillförlitlig markör för mitotiska/M-fasceller8. Histon H3 är ett DNA-associerat core histonprotein som blir fosforylerat i runt den sena G2-fasen till tidig M-fasen och avfosforyleras mot slutet av anafas8. Flera kommersiella antikroppar kan användas för att detektera pH3 med hjälp av vanliga immunstainingprotokoll. Dubbelfärgning av EdU och pH3 skulle därför göra det möjligt att upptäcka celler i S-fas samt M-fas. Dessutom skulle celler i G1 och tidig G2-fasen inte färga positivt för någon av markörerna.
Drosophila neurala stamceller eller neuroblaster (NBs) erbjuder en väl karakteriserad stamcellsmodell där celler delar sig asymmetriskt för att producera en identisk självförnyande NB och en ganglion modercell (GMC), som är fett för differentiering9. Dessutom gör flera genetiska verktyg och NB-specifika antikroppar detta system lämpligt för genetisk manipulation och levande cellavbildning. Följaktligen har flera studier använt NBs för att studera gener som reglerar asymmetriska uppdelningar och cell ödesbestämning9. Distinkta populationer av NBs finns i den centrala hjärnan (CB) och den optiska loben (OL) i larvhjärnan9; CB NBs användes för den aktuella studien. Dessa tredje instar larval CB NBs är stora celler som också är lämpliga för att studera faktorer som reglerar mitotisk spindel montering. Ett protokoll för att analysera cellcykelprogressionsdefekter skulle vara ett viktigt verktyg i sådana studier.
Protokoll publicerade tidigare använda kommersiella kit, såsom Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit, som ger flera reaktionskomponenter och azidfärger taggade med en mängd olika Alexa Fluor-färgämnen för EdU-inkorporering och detektion10. De reagenser som levereras med sådana satser är dock inte kompatibla med vissa fluorescerande taggar som ofta används med sekundära antikroppar. Detta EdU-detekteringskit (Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit som levereras med Alexa Fluor 647-konjugerat azidfärg) testades i Drosophila tredje instar larval NBs, och co-staining försöktes med antikroppar mot pH3 och Miranda, en markör för NBs. Vidare användes Alexa Fluor 568- eller Cy3-märkta sekundära antikroppar för detektion av Miranda-märkning på plasmamembranet i NBs11. Den förväntade signalintensiteten och färgning mönstret (opublicerade resultat) observerades dock inte med dessa sekundära antikroppar när immunostaining utfördes efter EdU påvisande.
För EdU-inkorporering krävde det protokoll som beskrivs av Daul och kollegor utfodring av larverna med Kankel-White medium blandat med EdU och bromofenolblå (BPB)10. Larverna matas på EdU och BPB-spetsad mat, som kunde ses av sin blå färg vid intag i larvens tarm. Även om denna metod användes för EdU-inkorporering i Mms19 förlust av funktion (Mms19P) tredje instar larver, mms19P larverna uppenbarligen inte matar eftersom knappast någon blå färg upptäcktes i larv gut (opublicerade resultat). Mms19P larverna visar drastiska utvecklingsdeformiteter och så småningom arrestera i det tredje instar-stadiet. Detta kan på något sätt påverka utfodringsbeteendet hos de tredje instar larverna och göra EdU-utfodringsprotokollet olämpligt för sådana fall.
Efter att ha studerat tillgänglig litteratur och arbetat mycket med standardisering av väsentliga steg, föreslogs ett alternativt tillvägagångssätt för EdU/pH3 dubbelmärkning i Drosophila NBs, som inte kräver utfodring EdU till larver. En tidigare studie använde dubbel EdU/pH3 färgning för att analysera cellcykeln i NBs, men presenterade inte ett detaljerat protokoll4. Detta innebär ett onödigt hinder för labb som försöker implementera den här metoden. Dessutom kan det vara en tidskrävande process att utvärdera kompatibiliteten hos olika reagenser med EdU-satsen och utföra ytterligare optimering. Detta dokument presenterar ett steg-för-steg protokoll som täcker EdU införlivande i dissekerade larval hjärnor och immunostaining med anti-pH3 antikroppar, följt av confocal mikroskopi och bild analys för att fördela NBs till fyra distinkta kategorier: G0/G1 fas, S fas, S>G2/M (progression från S till G2/M) och M fas. Stegen som behöver optimering beskrivs och tips ges för avbildnings analys av stora data uppsättningar. Dessutom analyseras EdU/pH3-avläsningen i NB av vild typ och jämförs med Mms19P NBs, som nyligen rapporterades visa en cellcykelfördröjning11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av reagenser och lager för Click-it EdU-analys
OBS: Se tabellen över material och tabell 1 för mer information om satsen och reagenserna som medföljer satsen.
- Ta flaskorna till rumstemperatur innan du förbereder lösningarna.
- Förbered 10 mM EdU (komponent A) lagerlösning genom att tillsätta 2 ml dimetyllsulfoxid (DMSO, komponent C). Blanda väl och förvara vid -20 °C.
- Förbered en arbetslösning av Alexa Fluor 647-azid (komponent B) genom att tillsätta 70 μL DMSO (komponent C). Blanda väl och förvara vid -20 °C.
- Förbered en 1x lösning av Click-iT EdU reaktionsbuffert (komponent D) genom att blanda 4 ml av denna lösning med 36 ml avjoniserat vatten. Förvara den återstående lösningen vid 2-6 °C.
- Gör ett 10x lager (200 mg/ml) av Click-iT EdU bufferttillsats (komponent F) genom att tillsätta 2 ml avjoniserat vatten. Blanda väl och förvara vid -20 °C.
- Förvara Hoechst 33342 (komponent G) vid 2-6 °C. Förvara DMSO (komponent C) i en desiccator vid -20 °C.
OBS: Handskar ska användas för att hantera DMSO och Hoechst.
2. Dissekering av tredje instar larvhjärnor och EdU-inkorporering
OBS: Protokollet för hjärn dissekeringar har beskrivits tidigare12. Innan dissektionerna påbörjas, se till att tillräckliga mängder av EdU- och PFA-lösningarna bereds och tinas enligt beskrivningen i 2.6 och 3.1.
- Förbered 10x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) genom att tillsätta 25,6 g Na2HPO4.7H20, 80 g NaCl, 2 g KCl och 2 g KH2PO4 till 1 L avjoniserat vatten. Justera pH-värdet till 7,4 och förbered därefter en 1x lösning i avjoniserat vatten.
- Tillsätt Schneiders dissekeringsmedium (SM) till två på varandra följande fördjupningar av en glas (3 eller 9) depression glas spot tallrik. Lägg till 1x PBS till nästa på varandra följande depression.
- Använd ett par tångar, plocka vandrande tredje instar larver och placera på en vävnad fuktad med PBS för att rengöra flugmatsrester. Placera larven i depressionen med PBS och sedan i den på varandra följande depressionen med SM.
- Använd ett par fina tångar, ta bort 3/4av larvens underkropp.
- Ta försiktigt tag i larvmunkrokarna med ett par tångar och håll nagelbandet i den andra änden med det andra paret tång.
- Vänd larvhuvudet ut och in genom att trycka inåt munkrokarna och samtidigt skala av vävnaden i andra änden.
- Observera larvhjärnan med bifogade imaginala skivor. Ta bort andra vävnader som är fästa vid hjärnan och överför hjärnan till nästa efterföljande depression med SM.
- Tina upp 10 mM EdU lagerlösning. Förbered en 100 μM-lösning genom att späda ut detta 10 mM-lager i SM.
- Tillsätt 100 μL av denna 100 μM EdU+SM-lösning i en annan fördjupning på Pyrexplattan. Inkubera ~5-10 dissekerade hjärnor i 100 μL av 100 μM EdU+SM-lösning i 2 h vid 25 °C.
OBS: Eftersom NBs delar en gång i ~ 2 h, syftar detta protokoll till att analysera en fullständig cellcykel. Använd bara intakta hjärnor för ytterligare steg. Kassera hjärnor som skadas under dissekering.
3. Fixering och immunstaining
- Förbered 4% paraformaldehyd (PFA) lösning i en rökhuv.
- Tillsätt 4 g paraformaldehydpulver till 80 ml 1x PBS i en bägare placerad på en magnetomrörare och värm till 60 °C. För att lösa upp PFA, tillsätt några droppar 1 N NaOH. Kontrollera pH:t och justera till 7,0 med några droppar 1 M HCl vid behov.
- Justera volymen till 100 ml med 1x PBS. Aliquot PFA-lösningen och förvara vid 2-6 °C i upp till 1 månad. Tillsätt 0,3% icke-joniskt tvättmedel (se tabellen över material)till PFA-lösningen för effektiv fixering av stora vävnader som larvhjärnan.
- Efter EdU införlivande, överföra hjärnan till 0,6 mL microcentrifuge rör som innehåller 4% PFA. Inkubera vid rumstemperatur på en mutterator i 15 min. Knacka på röret på laboratoriebänken så att hjärnorna sätter sig ner längst ner i röret.
- Ta bort PFA och tvätta 3 gånger med PBS + 0,3% icke-joniskt tvättmedel (PBST) vid rumstemperatur. Se till att varje tvätt varar i minst 10 min på en mutter. Efter den sista tvätten, ta bort PBST, tillsätt blockeringslösning (PBST + 5% bovint serumalbumin) och inkubera i 30 min vid rumstemperatur.
- Späd anti-Miranda antikropp (1:250) och anti pH3 antikropp (1:200) i PBST (båda antikropparna i samma rör). Ta bort blockeringsbufferten och tillsätt den primära antikroppslösningen. Inkubera över natten vid 2-6 °C på en mutterare.
OBS: Miranda är ett membranprotein som finns på CB NBs. Det tjänar till att identifiera dessa stora runda celler i CB-regionen13. - Ta bort den primära antikroppslösningen och tvätta 3 gånger med PBST. Se till att varje tvätt varar i 10 min på en mutterator vid rumstemperatur.
- Förbered sekundär antikroppslösning genom att tillsätta 1:500 utspädd Alexa Fluor 488 anti-Rabbit och Alexa Fluor 568 anti-Rat i PBST. Ta bort PBST och tillsätt den sekundära antikroppslösningen till de dissekerade hjärnorna. Inkubera över natten vid 2-6 °C i mörker, på en mutterare, och tvätta 3 gånger med PBST (steg 3.5).
4. EdU-detektion, DNA-färgning och montering
- För att förbereda EdU-detekteringscocktailen, blanda komponenterna (se tabell 2) i ett 1,5 ml-rör.
- Efter den sista tvätten (steg 3.6), ta bort PBST och tillsätt EdU-detektionscocktailen till de dissekerade hjärnorna. Inkubera vid rumstemperatur i mörker i 30 min på en mutterare. Tvätta 2 gånger med PBST i 10 min vardera, i mörkret.
- För DNA-färgning, späd Hoechst 33342 (komponent G) 1:2,000 i PBST för att förbereda en 5 μg/ml-lösning.
- Ta bort PBST efter den andra tvätten (steg 4.2) och tillsätt 500 μL av 5 μg/ml Hoechst-lösning till de dissekerade hjärnorna. Inkubera i mörker i 10 minuter. Ta bort Hoechst och tvätta en gång med PBST i 10 min.
- Knacka på röret på labbbänken och låt hjärnan lugna ner sig. Ta bort PBST från röret, men lämna bara 50-100 μL.
- Skär änden av en 200 μL mikropipettespets och överför försiktigt hjärnan till en ren glasrutschbana. Ta bort överflödig PBST från bilden genom att blotta med filterpappersremsor. Var försiktig så att filterpapperet inte vidrör hjärnan.
- Sätt en droppe vattenlösligt, icke-fluorescerande monteringsmedium på hjärnan och orientera hjärnorna så att ventrala nervsladden är vänd mot rutschkanan och loberna vända uppåt. Ordna hjärnan i en enda fil så att det är lättare att avbilda hjärnan seriellt.
- Placera försiktigt ett täckdrag ovanpå hjärnan. Placera bilden vid 2-6 °C över natten.
OBS: Monteringsmediet härdar vid förvaring över natten så att täcket inte behöver täta täcket med nagellack.
5. Bildbehandling
OBS: Se materialförteckningen för detaljer om laserskanningsmikroskopet och oljesänkningsmålet som används i detta protokoll.
- Välj 63x-måleti hämtningsprogrammet .
- Lägg en droppe nedsänkningsolja på täckslipet precis ovanför de monterade hjärnorna för att göra det lättare att hitta vävnaden genom okularet.
- Använd DAPI/Hoechst 33342-kanalen, hitta hjärnan genom okularet och byt sedan till förvärvsläget i programvaran.
- Ställ in 4 kanaler för att avbilda Hoechst 33342 (DNA), Alexa Fluor 488 (pH3), Alexa Fluor 568 (Miranda) och Alexa Fluor 647 (EdU). Använd färgassistentverktyget, som automatiskt ställer in excitationslasrarna och emissionsfiltren för de valda färgämnena.
- Ställ in synfältet så att det omfattar hela hjärnloben. Avbilda hela volymen av hjärnloben genom att förvärva z-staplar med 0,8 μm mellanrum. Lagra alla bilder från en bildbehandlingssession i ett *.lif-biblioteksformat.
6. Bildanalys
OBS: Följande steg beskriver analysen av förvärvade bilder och hur man sorterar celler i G0/G1-fas, S-fas, S>G2/M (progression från S till G2/M) och M-fasen med hjälp av ImageJ-programvaran.
- Ladda ner Fiji (Fiji är ImageJ) från följande URL: https://fiji.sc/. Öppna Fiji och dra och släpp sedan LIF-filerna till Fiji.
OBS: Fiji är en version av ImageJ som kommer förinstallerad med flera plugins14. Överföring .lif filer till Fiji kommer att öppna Bio-format plugin, som behövs för att bearbeta .lif filer. Bioformat plugin krävs också för att öppna bildfiler som genereras från några andra mikroskopmärken, t.ex. nd2-filer som genereras från ett Nikon-mikroskop. Detta plugin kommer förinstallerat med Fiji. - Välj Data-webbläsare på fliken stackvisning och använd virtuell stack på fliken minneshantering i plugin-programmet för bioformat.
OBS: Lif-filer med z-staplar från 8-10 hjärnor är ofta 300-400 megabyte i storlek. På datorer med lågt RAM-minne kan öppna några sådana filer snabbt tömma det tillgängliga RAM-minnet på ImageJ och förhindra ytterligare bildbehandling. Virtuell stack är "skrivskyddad", behöver inte högt RAM-minne för bearbetning och är ett idealiskt alternativ för att ladda stora datamängder på Fiji. - Observera flerkanalsbilden som visas i ImageJ. Ändra färgen på kanalerna från menyraden med verktyget Bild | färg | kanaler. Observera de Miranda-märkta NBs som stora runda celler i CB-regionen.
- Rita en region av intresse (ROI) med ellipsverktyget över varje NB för att undvika att räkna NB två gånger.
- Välj analysera | verktyg | i menyraden ImageJ ROI-chef. Markera alla NBs i det aktuella z-avsnittet och tryck på t när du har markerat varje cell.
- När alla NBs i det aktuella z-avsnittet har markerats ändrar du kanalerna till pH3 och EdU och räknar manuellt antalet EdU-positiva NBs, pH3-positiva NBs, NBs färgar positivt för både EdU och pH3 och NBs som inte färgar för båda markörerna.
- Sök efter NBs i efterföljande z-sektioner, ta bort gamla ROM och lägg till nya ROM för att räkna NBs i olika staplar.
- Förbered ett kalkylblad med följande kolumner: 1. EdU- pH3-: det här avsnittet representerar de dubbelnegativa celler som befinner sig i cellcykelns G0/G1-fas. 2. EdU+: cellerna i denna kategori har införlivat EdU och genomgår DNA-replikation (S-fas); 3. EdU+ pH3+: dessa dubbelpositiva celler har slutfört S-fasen och har gått vidare till G2- eller M-fas. 4. pH3+: dessa NBs genomgår mitos.
- Beräkna procentandelar av NBs som finns i alla ovanstående 4 kategorier för varje lob. Förbered ett stapeldiagram med hjälp av kalkylbladsprogrammet som visar poolade data för procentandelar nbs i varje kategori.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den bi-lobed Drosophila tredje instar larval hjärnan har använts som ett modellsystem för att studera grundläggande cellulära och utvecklingsmässiga processer9. Fokus för den aktuella studien var att presentera ett protokoll för analys av cellcykelprogression i EdU- och pH3-märkta NBs i CB-regionen (figur 1). CB NBs är indelade i typ I och typ II, och de visar det karakteristiska asymmetriska delningsmönstret9. Varje typ I NB-division genererar en NB, som kan förnya sig själv, och en annan GMC som är fet för differentiering9. Däremot genererar typ II NBs transitförstärkande, omogna neurala stamceller (INPs) som själv förnyar och genererar 2 GMC9. Även om det finns en distinkt NB-population i OL-regionen, fokuserade denna studie på CB NBs, som är stora och lätt identifierbara med NB-specifika markörer.
För denna studie användes Miranda för att identifiera och analysera CB NBs (figur 2). Även om Miranda också fläckar andra cellpopulationer i OL, kan CB NBs identifieras med Miranda på grund av deras stora storlek och CB-plats13. Andra mer specifika markörer kan också användas för att märka CB NBs, till exempel Deadpan, som är en transkriptionsfaktor som reglerar NB självförnyelse. Men eftersom både pH3 och EdU markerar kromatin användes membranmarkören Miranda för att göra det lättare att visualisera och analysera NBs märkta med pH3 och EdU. EdU införlivande, efterföljande detektion och ytterligare karakterisering av immunostaining och bild analys är ett komplext förfarande. Det är viktigt att standardisera varje steg för att bestämma optimala färgnings- och bildförhållanden. Även om vissa publicerade rapporter presenterar EdU/pH3-märkningsstrategier, utvecklar dessa rapporter inte optimerings- och bildanalyssteg. Arbetsflödet som beskrivs i figur 1 sammanfattar stegen från EdU-inkorporering till bildanalys.
Vi karakteriserade nyligen Mms19 genen, som krävs av NBs för normal mitotisk progression11. Genom live-cell imaging analyser, NBs saknar funktionella Mms19 visade sig ta dubbelt så lång tid som vilda-typ NBs att avsluta mitos. Detta återspeglades tydligt i EdU/pH3-analysen, där en betydligt högre andel mm19P NBs befanns vara i M-fasen jämfört med NB av vild typ (figur 3A). Uttryck för mms19::eGFP fusion protein i Mms19P bakgrund hade visat sig rädda fenotypiska defekter11,15. Detta korrelerade väl med resultaten från cellcykelprogressionsanalysen där andelen celler i M-fasen räddades till vilda nivåer på Mms19::eGFP-uttrycket i mms19P-bakgrunden (figur 3A, B).
Bild 1: Ett förenklat arbetsflöde för dubbelmärkning av EdU/pH3. Tredje instar larval hjärnor dissekerades och inkuberades med 100 μM EdU för 2 h. Därefter fixerades hjärnvävnaden med PFA och immunstained med antikroppar mot Miranda och pH3. Bilder av de färgade hjärnorna erhölls på ett konfokalt mikroskop och vidare bearbetas med ImageJ/Fiji för att fördela celler till olika cellcykel faser. Förkortningar: EdU = med 5-etynyl-2'-deoxyuridin; pH3 = fospho-histon H3; PFA = paraformaldehyd; SM = Schneiders dissekeringsmedium; PBS = fosfatbuffrad saltlösning; PBST = PBS + 0,3% icke-joniskt tvättmedel; BSA = bovint serumalbumin. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Fördelning av celler till G1/G0. S; S>G2/M- och M-faserna. Cellerna utvecklas genom G1-, S-, G2- och M-faserna för att slutföra en fullständig cellcykel. CB NBs från vandrande tredje instar larval hjärnor var markerade med Miranda (röd), EdU (grå), pH3 (grön) och DNA var märkt med Hoechst 33342 (blå). Märkta NBs analyserades i ImageJ och tilldelades 4 distinkta faser baserat på om de färgade positivt för (A) varken EdU eller pH3 (G1/G0), (B) endast EdU (S-fas), (C) både EdU och pH3 (S>G2/M) och (D) endast pH3 (M-fas). Exempel på enskilda NBs endast från vilda hjärnor visas här. Skalstänger = 5 μm. Förkortningar: CB = central brain; NBs = neuroblaster; EdU = med 5-etynyl-2'-deoxyuridin; pH3 = fosfo-histon H3. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Effekt av Mms19P på fördelningen av NB-cellcykelns fas. (A) Vid analys av vilda (w;+;+) NBs konstaterades ~25% NBs vara i M-fas. I mms19P NBs ökade dock denna andel till nästan 40%. Mms19::eGFP uttryck i Mms19P bakgrund är känd för att rädda Mms19P fenotyper, och andelen M fas NBs i denna bakgrund var jämförbar med vild typ. b)Procentandelar nbs i fyra olika kategorier som motsvarar cellcykelfaserna G1/G0, S, S>G2/M och M jämfördes med vilda typer. Mms19P och Mms19::eGFP, Mms19P genotyper. Andelen M- och G1/G0-faser skiljer sig avsevärt i Mms19P NBs jämfört med NB av vild typ. Däremot är cellcykelfördelningen av NBs i Mms19::eGFP, Mms19P hjärnor jämförbara med den som finns i den vilda typen. Statistisk signifikans beräknades med hjälp av Kruskal-Wallis-testet och flera kolumner jämfört med Dunns eftertest. (P<0.001). Denna siffra har ändrats från 11. Förkortningar: NBs = neuroblaster; eGFP = förbättrat grönt fluorescerande protein; WT = vild typ. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
| Reagens | Belopp/volym |
| EdU (komponent A) | 5 mg |
| Alexa Fluor 647 – azid (komponent B) | 1 flaska |
| Dimetyllsulfoxid (DMSO, komponent C) | 4 ml |
| Click-iT EdU reaktionsbuffert (komponent D) | 4 ml (10x lösning) |
| Kopparsulfat (CuSO4, komponent E) | 100 mM; 1 flaska |
| Click-iT EdU bufferttillsats (komponent F) | 400 mg |
| Hoechst 33342 (komponent G) | 10 mg/ml i vatten, 35 μL |
Tabell 1: EdU-kitkomponenter. Komponenter som medföljer Click-iT EdU Alexa Fluor Cell Proliferation Kit och respektive mängder/volymer. Förkortning: EdU = med 5-etynyl-2'-deoxyuridin.
| Reaktionskomponenter | Volym (mL) |
| 1x Click-iT reaktionsbuffert (beredd i steg 1.4) | 430 |
| CuSO4 (komponent E) | 20 |
| Alexa Fluor 647 – azid (komponent B, beredd i steg 1.3) | 1.2 |
| Tillsats av reaktionsbuffert (komponent F, beredd i steg 1.5) | 50 |
| Total volym | ~500 |
Tabell 2: Beredning av EdU-detektionscocktail. EdU-detektionscocktailen framställdes genom att blanda de angivna volymerna av kitkomponenterna (beredda i avsnitt 2). Förkortning: EdU = med 5-etynyl-2'-deoxyuridin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
EdU-inkorporering och dess efterföljande "klickreaktion" med cellgenomsläpplig azid ger praktiska fördelar med denna teknik jämfört med BrdU-metoden som användes tidigare7. Denna reaktion katalyseras dock av Cu(I) joner, och flera färgämnen kan vara instabila i närvaro av denna kopparkatalysator, vilket tydligt rekommenderas av Click-it EdU-kittillverkaren. När immunostaining experiment hade utförts efter att ha utfört EdU detektionssteget observerades inte den förväntade signalintensiteten med de röda kanalfärgerna, Alexa Fluor 568 och Cy3. Protokollet fungerade dock när immunstaining reaktioner var klar före EdU detektionssteget. Med detta protokoll användes fyra kanaler för att visualisera Hoechst, pH3, Miranda och EdU.
Ett annat optimerat steg i detta protokoll var upptaget av EdU av dissekerade hjärnor i motsats till att mata EdU-spikad flugmat till larver. Eftersom den fullständiga Drosophila NB-cellcykeln varar i cirka 2-2,5 h16, EdU-upptag av hjärnor i 2,5 h som i detta protokoll, möjliggör spårning av en hel cellcykel av NBs. Celler som inte färgar positivt för antingen EdU eller pH3 är viloceller. När det gäller en tredje instar larva där NBs aktivt delar sig, skulle dessa viloceller sannolikt vara i G1-fasen av cellcykeln. Men från det sena embryonala till det tidiga andra instar-stadierna blir de NBs tillfälligt quiescent17. I dessa tidiga utvecklingsstadier skulle dubbelnegativ färgning sannolikt representera en G0/quiescent fas.
NBs som genomgår DNA-replikation bör färga positivt för EdU, medan celler som har utvecklats från S-fasen (EdU-inkorporering) till den sena G2- eller M-fasen bör färga positivt för både EdU och pH3. Karakterisering av G2-fasen skulle dock vara svårt med detta protokoll eftersom tidiga G2-celler inte färgar positivt för EdU eller pH3. Celler som har införlivat EdU och har utvecklats till tidig G2 skulle dock också fläcka positivt för EdU och kan komplicera analysen av G2-fasen. Flera läkemedel som hämmar DNA-replikation orsakar cellcykelstillestånd vid S-fas18,19,20. Detta protokoll kan vara ett bekvämt verktyg för att analysera och identifiera effekten av sådana läkemedelsbehandlingar som S-fas-blockerade celler skulle inte utvecklas till M-fasen och fraktionen av EdU, pH3 dubbelpositiva celler skulle minskas eller ens frånvarande i detta fall.
I en nyligen publicerad studie utvärderade vi effekten av Mms19-genen på mitotisk progression i NBs11. Genom live-cell imaging, visade vi en dramatisk försening av Mms19P NBs i M-fas progression. Medan vilda NBs slutför M-fasen på ~ 10 min, tog Mms19P NBs ungefär dubbelt så mycket tid att slutföra M-fas11. Följaktligen återspeglade detta EdU/pH3 dual-labeling protokoll också en mitotisk fördröjning som vi observerade nästan 1,5x så många NBs färgning positivt för pH3 i Mms19P hjärnor jämfört med vilda hjärnor. Data från detta EdU-protokoll är därmed jämförbara med de direkta live-cellavbildningsresultaten. Som sådan direkt, live-cell metoder är tidskrävande och behöver omfattande optimering, detta protokoll kan användas för att utföra en snabb inledande screening av sådana cell cykel mutanter för att förstå defekter i specifika stadier. När en fas av intresse har identifierats kan detta sedan följas upp av direkta cellvisualiseringsanalyser.
Varaktigheten av cellcykelfaser kan variera avsevärt mellan olika celltyper och utvecklingsstadier. Till exempel, vid utveckling av Drosophila embryon, downregulation av mitotiska kinaser resulterar i en längre varaktighet av S-fasen, medan i celler som är fett för differentiering, såsom iller (Mustela putorius furo) hjärnan neurala stamceller, S fas varaktighet är markant kort21,22. EdU-pulsmärkningstiden bör därför optimeras beroende på längden på S- och G-faserna i den givna celltypen. Varaktigheten av EdU-pulsen skulle också bero på de experimentella målen, t.ex. en kort puls är tillräcklig för att mäta den del av cellerna som för närvarande befinner sig i S-fasen, medan en längre puls möjliggör analys av cellernas progression genom S-fasen.
Omfattande optimering av EdU-puls kan också möjliggöra uppskattning av S-fasen, vilket elegant demonstrerades av Pereira och kollegor23. Dessa forskare visade en ny, flöde cytometri-baserad metod där HCT116 celler var pulsmärkta med EdU för inkrementella tidsperioder. Författarna visade att den maximala fluorescerande intensiteten hos EdU erhålls när den pulserande tiden matchar längden på S fas23. Dessutom möjliggjorde analys av den tidsmässiga progressionen av EdU-märkta celler kvantifieringen av G1- och G2/M-faserna. Även om det nuvarande protokollet för dubbelmärkning av EdU/pH3 möjliggör analys av S- och M-fasfel, är det inte möjligt att mäta den exakta varaktigheten av faser med detta protokoll. Protokollet som beskrivs av Pereira och kollegor kan vara ett lämpligt alternativ för analyser som kräver bestämning av cellcykelfaslängder. Anpassning av detta protokoll med ytterligare pH3-märkning kan också resultera i högre känslighet vid identifiering av M-fasceller.
Förutom EdU/pH3-metoden har metoden fluorescent ubiquitin-based cell cycle indicator (FUCCI) också använts för att studera cellcykelprogression i däggdjursceller samt i Drosophila vävnader24,25. Detta system använder två fluorescerande märkta proteiner, geminin och Cdt1, som innehåller motiv för specifik allestädes närvarande och proteasomal nedbrytning av APC/C respektive SCFSkp2. Eftersom APC/C endast är aktivt från slutet av mitos till G1 och SCFSkp2 är aktiv i S- och G2-faserna, möjliggör den cellcykel-stegspecifika nedbrytningen av fluorescerande taggad geminin och Cdt1 bestämning av cellcykelfas24. En något modifierad "Fly-FUCCI"-metod för Drosophila-vävnader förlitar sig i stället på fluorescerande cyclin B och E2F1, som bryts ned av APC/C (under mitos) respektive CRL4Cdt2 (under S-fas debut), respektive25. En tidigare studie som karakteriserar för tidig differentiering av Drosophila larval NBs som svar på aneuploidy analyserade cellcykel defekter med både Fly-FUCCI och EdU/pH3 metoder4. Aneuploidy inducerar för tidig differentiering av NBs, och därför lämnar en hög del av NBs cellcykeln.
Detta återspeglades korrekt i både Fly-FUCCI och EdU/pH3 data4. Data som erhålls från EdU/pH3-metoden är därför också jämförbara med andra metoder för cellcykelspårning, såsom Fly-FUCCI. Fly-FUCCI är ett kraftfullt verktyg, och alla fluglager med allestädes närvarande drivna fluorescerande markörer eller markörer smälta till vävnadsspecifika promotorer finns tillgängliga från lagercentra. Att använda dessa konstruktioner för att analysera cellcykeldefekter i null mutanter eller med siRNA knockdown skulle dock innebära genetisk rekombination för att skapa ett fluglager som bär FUCCI-elementen, vävnadsspecifika drivrutiner, en specifik mutation eller en siRNA av intresse. Denna process skulle försena det faktiska experimentet i flera veckor, medan EdU/pH3-metoden lätt kan tillämpas på flyglinjer med en genetisk nollbakgrund. Alternativt, för siRNA knockdowns, kan en ettstegskorsning mellan ett förarlager och ett siRNA-lager användas för EdU / pH3-analys.
En nackdel med detta tillvägagångssätt är avbildnings- och bildanalyspipelinen, som innebär manuell kvantifiering av ett stort antal celler från flera hjärnprover. Nyligen har en flödescytometrimetod presenterats som ett alternativ med hög genomströmning till en konventionell mikroskopibaserad analys för cellcykelanalys26. Den snabba analysen av tusentals celler samtidigt med detta tillvägagångssätt är fördelaktig, och förmågan att upptäcka flera markörer möjliggör kvantifiering av specifika celltyper. Även om lätt kan användas med odlade cellinjer, detta protokoll kan vara svårt att tillämpa på stora vävnad prover såsom Drosophila larval hjärnan. Några protokoll har dock publicerats som beskriver hjärnvävnadssociation och analys av isolerade larv-NBs med flödescytometri27,28. Ytterligare innovativa metoder i denna riktning kan presentera nya möjligheter för hög genomströmning cell cykel analys i Drosophila vävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har förklarat att det inte finns några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av finansiering från Swiss National Science Foundation (projektbidrag 31003A_173188; www.snf.ch) och Universitetet i Bern (www.unibe.ch) till BS. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förbereda manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| fly stocks | |||
| P{EPgy2}Mms19EY00797/TM3, Sb1 Ser1 (Mms19p) | Bloomington stock center | #15477 | P-element insertion in the third exon of Mms19 |
| +; Mms19::eGFP, Mms19p | Generated in house | eGFP-tagged Mms19 protein expressed in Mms19p background | |
| w1118 | Bloomington stock center | #3605 | wild-type stock (w;+;+) |
| Primary antibodies | Dilution | ||
| Rat anti-Miranda | Abcam | Ab197788 | 1/250 |
| Rabbit anti-pH3 | Cell Signaling | 9701 | 1/200 |
| Secondary antibodies | |||
| Goat anti-Rat Cy3 | Jackson Immuno | 112-165-167 | 1/150 |
| Goat anti-Rat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11077 | 1/500 |
| Goat anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A27034 | 1/500 |
| Reagent/Kit | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | Polysciences Inc | 18606-20 | |
| Click-it EdU incorporation kit, Alexa Flour 647 | Thermo Fischer Scientific | C10340 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Thermo Fischer Scientific | 21720-024 | |
| Bovine serum albumin (BSA) fraction V | Merck | 10735078001 | |
| Triton X-100 | Fischer Scientific | 9002-93-1 | non-ionic detergent |
| Software | |||
| Fiji (Imagej) | https://imagej.net/Fiji | ||
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica microsystems | ||
| PRISM | Graph pad software | Version 5 | |
| Microsoft Excel | Microsoft office | 2016 | |
| Equipment | |||
| Leica TCS SP8 laser scanning confocal microscope with 63x oil-immersion, 1.4 NA Plan-apochromat objective | |||
| Materials | |||
| Aqua Poly/Mount mounting medium | water-soluble, non-fluorescing mounting medium | ||
| Pyrex 3 or 9 depression glass spot plate | |||
| Whatman filter paper |
References
- Harashima, H., Dissmeyer, N., Schnittger, A. Cell cycle control across the eukaryotic kingdom. Trends in Cell Biology. 23 (7), 345-356 (2013).
- Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., Berneman, Z. N. The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation. 36 (3), 131-149 (2003).
- Pardee, A. B. A restriction point for control of normal animal cell proliferation. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 71 (4), 1286-1290 (1974).
- Gogendeau, D., et al. Aneuploidy causes premature differentiation of neural and intestinal stem cells. Nature Communications. 6, 8894 (2015).
- Barnum, K. J., O'Connell, M. J. Cell cycle regulation by checkpoints. Methods in Molecular Biology. 1170, 29-40 (2014).
- Gratzner, H. G. Monoclonal antibody to 5-bromo- and 5-iododeoxyuridine: A new reagent for detection of DNA replication. Science. 218 (4571), 474-475 (1982).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Kim, J. Y., et al. The value of phosphohistone H3 as a proliferation marker for evaluating invasive breast cancers: A comparative study with Ki67. Oncotarget. 8 (39), 65064-65076 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) labeling of Drosophila mitotic neuroblasts. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), 5461 (2010).
- Chippalkatti, R., Egger, B., Suter, B. Mms19 promotes spindle microtubule assembly in Drosophila neural stem cells. PLoS Genetics. 16, 1008913 (2020).
- Daul, A. L., Komori, H., Lee, C. Y. Immunofluorescent staining of Drosophila larval brain tissue. Cold Spring Harbor Protocols. (7), (2010).
- Mollinari, C., Lange, B., Gonzalez, C. Miranda, a protein involved in neuroblast asymmetric division, is associated with embryonic centrosomes of Drosophila melanogaster. Biology of the Cell. 94 (1), 1-13 (2002).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Nag, R. N., Niggli, S., Sousa-Guimaraes, S., Vazquez-Pianzola, P., Suter, B. Mms19 is a mitotic gene that permits Cdk7 to be fully active as a Cdk-activating kinase. Development. 145 (2), (2018).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Hartenstein, V., Spindler, S., Pereanu, W., Fung, S. The development of the Drosophila larval brain. Advances in Experimental Medicine and Biology. 628, 1-31 (2008).
- Hebar, A., Rutgen, B. C., Selzer, E. NVX-412, a new oncology drug candidate, induces S-phase arrest and DNA damage in cancer cells in a p53-independent manner. PLoS One. 7, 45015 (2012).
- Wyllie, F. S., et al. S phase cell-cycle arrest following DNA damage is independent of the p53/p21(WAF1) signalling pathway. Oncogene. 12 (5), 1077-1082 (1996).
- Xu, X., et al. Inhibition of DNA replication and induction of S phase cell cycle arrest by G-rich oligonucleotides. Journal of Biological Chemistry. 276 (46), 43221-43230 (2001).
- Duronio, R. J.
- Turrero Garcia, M., Chang, Y., Arai, Y., Huttner, W. B. S-phase duration is the main target of cell cycle regulation in neural progenitors of developing ferret neocortex. Journal of Comparative Neurology. 524 (3), 456-470 (2016).
- Pereira, P. D., et al. Quantification of cell cycle kinetics by EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)-coupled-fluorescence-intensity analysis. Oncotarget. 8 (25), 40514-40532 (2017).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
- Zielke, N., et al. Fly-FUCCI: A versatile tool for studying cell proliferation in complex tissues. Cell Reports. 7 (2), 588-598 (2014).
- Shen, Y., Vignali, P., Wang, R. Rapid profiling cell cycle by flow cytometry using concurrent staining of DNA and mitotic markers. Bio-protocol. 7 (16), 2517 (2017).
- Berger, C., et al. FACS purification and transcriptome analysis of drosophila neural stem cells reveals a role for Klumpfuss in self-renewal. Cell Reports. 2 (2), 407-418 (2012).
- Harzer, H., Berger, C., Conder, R., Schmauss, G., Knoblich, J. A. FACS purification of Drosophila larval neuroblasts for next-generation sequencing. Nature Protocols. 8 (6), 1088-1099 (2013).
