Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול לכוונון עדין של אזורי עניין (ROIs) עבור טכנולוגיות Spatial Omics כדי לאפיין טוב יותר את המיקרו-סביבה של הגידול ולזהות אוכלוסיות תאים ספציפיות. עבור מבחני פרוטאומיקה, פרוטוקולים מותאמים אישית אוטומטיים יכולים להנחות את בחירת ההחזר על ההשקעה, בעוד שמבחני תמלול יכולים להיות מכווננים באמצעות ROIs קטנים עד 50 מיקרומטר.
Abstract
ריבוב מאפשר הערכה של מספר סמנים על אותה רקמה תוך מתן הקשר מרחבי. טכנולוגיות Spatial Omics מאפשרות ריבוב חלבונים ורנ"א על ידי מינוף נוגדנים ובדיקות המתויגים על ידי אוליגו הניתנים לביקוע, בהתאמה. אוליגוס נבקעים ומכמתים מאזורים ספציפיים ברחבי הרקמה כדי להבהיר את הביולוגיה הבסיסית. כאן, המחקר מדגים כי ניתן להשתמש בפרוטוקולים אוטומטיים של הדמיית נוגדנים מותאמים אישית כדי להנחות את בחירת ההחזר על ההשקעה בשילוב עם מבחני פרוטאומיקה מרחבית. שיטה ספציפית זו לא הראתה ביצועים מקובלים עם מבחני תעתיק מרחבי. הפרוטוקול מתאר פיתוח של בדיקה אימונופלואורסצנטית (IF) בת 3 פלקסים להדמיית סמנים על פלטפורמה אוטומטית, תוך שימוש בהגברת אות טירמיד (TSA) כדי להגביר את האות הפלואורסצנטי מיעד חלבון נתון ולהגדיל את מאגר הנוגדנים לבחירה. פרוטוקול ההדמיה היה אוטומטי באמצעות בדיקת 3-plex מאומתת ביסודיות כדי להבטיח איכות ויכולת שחזור. בנוסף, הוערכה החלפת DAPI בצבעי SYTO כדי לאפשר הדמיה של מבחני IF מבוססי TSA על פלטפורמת הפרופיל המרחבי. בנוסף, בדקנו את היכולת לבחור ROIs קטנים באמצעות מבחן התמלול המרחבי כדי לאפשר חקירה של תחומי עניין ספציפיים מאוד (למשל, אזורים מועשרים עבור סוג תא נתון). נאספו ROIs בקוטר 50 מיקרומטר ו-300 מיקרומטר, המתאימים לכ-15 תאים ו-100 תאים, בהתאמה. דגימות הוכנסו לספריות ורוצפו כדי לחקור את היכולת לזהות אותות מ-ROIs קטנים ומאזורים ספציפיים לפרופיל של הרקמה. קבענו שטכנולוגיות פרוטאומיקה מרחבית מפיקות תועלת רבה מפרוטוקולים אוטומטיים וסטנדרטיים שינחו את בחירת ההחזר על ההשקעה. בעוד שפרוטוקול ויזואליזציה אוטומטי זה לא היה תואם למבחני תעתיק מרחבי, הצלחנו לבדוק ולאשר שניתן לזהות בהצלחה אוכלוסיות תאים ספציפיות אפילו ב- ROIs קטנים באמצעות פרוטוקול ההדמיה הידני הסטנדרטי.
Introduction
ההתקדמות בטכניקות הריבוב ממשיכה לספק כלי אפיון טובים יותר למטרות הקיימות בגידולים. המיקרו-סביבה של הגידול (TME) היא מערכת מורכבת של תאי גידול, תאים חיסוניים חודרים וסטרומה, שבה מידע מרחבי הוא קריטי כדי להבין טוב יותר ולפרש מנגנונים של אינטראקציה בין סמנים ביולוגיים בעלי עניין1. עם טכניקות מתפתחות כגון GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) ו- 10x Visium, ניתן לזהות ולכמת מטרות מרובות בו זמנית בתוך ההקשר המרחבי שלהן. השימוש בפרוטוקולים אימונופלואורסצנטיים המאפשרים הדמיה של רקמות יכול לשפר עוד יותר את יכולות הפרופיל המרחבי של טכנולוגיות אלה.
טכנולוגיית ה-Spatial Omics בה התמקדנו לפיתוח שיטה זו מורכבת מפרוטאומיקה מרחבית ומבדיקות תעתיק שבהן אוליגונוקלאוטידים מחוברים לנוגדנים או לבדיקות RNA באמצעות מקשר רגיש ל-UV. שקופיות היסטולוגיות מסומנות בנוגדנים מצומדים לאוליגו או בגשושיות אלה, ולאחר מכן מוצגות בפלטפורמת הפרופיל המרחבי. לאחר מכן, ROIs של גדלים וצורות שונות נבחרים לתאורה, ואת oligonucleotides photocleaved שואפים ונאספים בלוח 96 באר. האוליגונוקלאוטידים הפוטוקלאוטידים מוכנים לכימות באמצעות מערכת ה-nCounter של ננו-מיתרים או עם ריצוף הדור הבא (NGS)2,3 (איור 1)4,5.
התפלגות התאים משתנה בתוך הרקמות, והיכולת לאפיין מיקומים ספציפיים של תאים באמצעות סמנים נבחרים וגדלי ROI שונים היא בעלת חשיבות רבה להבנה מלאה של סביבת הרקמה ולזיהוי תכונות ספציפיות. בטכנולוגיית Spatial Omics שהוזכרה כאן, פרוטוקול ההדמיה הסטנדרטי משתמש בנוגדנים מצומדים ישירות והוא פרוטוקול ידני. הסמנים הסטנדרטיים להבחנה בין גידול לסטרומה הם panCytokeratin (panCK) ו- CD45 6,7, אך סמנים נוספים נחוצים כדי להתמקד באוכלוסיות תאים ספציפיות המעניינות. יתר על כן, השימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים מצומדים ישירות חסר הגברה, המגבילה את בחירת הנוגדנים לסמנים בשפע. בנוסף, בדיקות ידניות כפופות לשונות רבה יותר מאשר זרימות עבודה אוטומטיות8. לכן, רצוי שיהיה פרוטוקול ויזואליזציה הניתן להתאמה אישית, אוטומטי ומוגבר לבחירת ROI.
כאן, המחקר מדגים כי עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית, ניתן להשתמש בטכנולוגיית TSA לפרוטוקולי הדמיה בפלטפורמה אוטומטית וכתוצאה מכך לבצע בדיקה ממוקדת וסטנדרטית יותר. בנוסף, בדיקות מבוססות TSA מאפשרות שימוש בסמנים בעלי הבעה נמוכה, מה שמגדיל את טווח המטרות שניתן לבחור להדמיה. מבחן 3-plex עבור panCK, FAP ונוגדן X פותח באמצעות פלטפורמה אוטומטית שבה panCK ו- FAP שימשו להבחנה בין גידול לסטרומה, בהתאמה. נוגדן X הוא חלבון סטרומלי שנתקלים בו לעתים קרובות בגידולים, אך הביולוגיה שלו והשפעתו על חסינות אנטי-סרטנית אינן מובנות במלואן. אפיון ההקשר החיסוני באזורים עשירים בנוגדן X יכול להבהיר את תפקידו בחסינות נגד גידולים ובתגובה טיפולית, כמו גם את הפוטנציאל שלו כיעד תרופתי.
בעוד שלוחות הדמיה אוטומטיים מותאמים אישית של TSA הוכיחו את עצמם כמוצלחים עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית, לא ניתן היה לאשר את היישום של מבחנים אלה עבור מבחני תעתיק מרחבי. הסיבה לכך היא ככל הנראה הריאגנטים והפרוטוקול המשמש לפרוטוקולי ההדמיה האוטומטיים, שנראה כי הם פוגעים בשלמות הרנ"א. ההכרה בכך שניתן להשתמש בפרוטוקול תיוג אוטומטי עבור סמני הדמיה עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית, אך לא עבור מבחני תעתיק מרחבי, מספקת הדרכה חשובה לגבי עיצובי בדיקות בטכנולוגיית Spatial Omics.
בנוסף, המחקר מדגים כי ניתן להשתמש במבחן התמלול המרחבי כדי ליצור פרופיל מטרות באזורים קטנים עד 50 מיקרומטר קוטר, או כ-15 תאים. שני ROIs בגדלים שונים נבחרו כדי לבחון את היכולת של הבדיקה לזהות גם תעתיקים ב- ROIs קטנים. עבור כל אזור עניין, אוליגוס המתאימים ל-1,800 מטרות mRNA נאספו והפכו לספריות על פי פרוטוקול פלטפורמת הפרופיל המרחבי. ספריות אונדקסו בנפרד, לאחר מכן אוחדו ורוצפו. זה איפשר להעריך הן את יעילות האיגום והן את היכולת לזהות אוכלוסיות תאים ספציפיות ב-ROIs קטנים.
מאמר זה מראה כי עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית, ניתן להשתמש בפרוטוקול אוטומטי להנחיית בחירת ROI על סמנים ספציפיים בעלי עניין כדי למקד באופן סלקטיבי את החקירה של אזורי רקמה רלוונטיים ולאפיין את הסביבה המרחבית של הרקמה. יתר על כן, אנו מראים כי ניתן להשתמש ב-ROIs קטנים יותר עבור מבחני תעתיק מרחביים כדי לזהות ולאפיין אוכלוסיות תאים ספציפיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הרקמות האנושיות נרכשו מביו-בנקים מסחריים או מבנקי רקמות מוסמכים תחת אחריות לקבלת אישור מתאים של מועצת הביקורת המוסדית והסכמה מדעת.
הערה: הפרוטוקול מבוצע באמצעות ה-Discovery Ultra וה-GeoMx Digital Spatial Profiler. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות ריאגנטים, ציוד ותוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.
1. פרוטוקול הדמיה אוטומטי למבחני פרוטאומיקה מרחבית
- תכנות autostainer כדי להחיל נוגדנים הדמיה פלואורסצנטית
- בתוכנת הצבייט האוטומטי, לחץ על כפתור הבית ובחר פרוטוקולים. לאחר מכן, לחץ על צור / ערוך פרוטוקולים ובחר RUO DISCOVERY אוניברסלי כהליך.
- לחץ על רצף ראשון > Deparaffinization > Depar v2. עבור טמפרטורה בינונית, בחר 72 מעלות צלזיוס, ואז לחץ על טיפול מקדים ובחר מיזוג תאים ומאגר CC1. עבור טמפרטורה גבוהה מאוד, בחר 100 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן לחץ על CC1 8 דקות והמשך ללחוץ עד לבחירת CC1 64 דקות.
- לחץ על מעכב > מעכב DISCOVERY, ועבור זמן הדגירה, בחר 8 דקות. לאחר מכן, לחץ על נוגדנים > דגירה בטמפ ' גבוהה; עבור טמפרטורה נמוכה, בחר 37 מעלות צלזיוס; עבור Antibody, בחר את מספר הנוגדן מתווית המתקן (נוגדן 6 בדוגמה זו); עבור פלוס זמן דגירה, בחר 32 דקות.
הערה: לפרוטוקול זה יש שלושה מספרי נוגדנים שונים. הנוגדן הראשון הוא FAP, השני הוא Pan-Cytokeratin, והשלישי הוא נוגדן X. - לחץ על Multimer HRP > חוסם HRP Multimer, ולאחר מכן עבור חסימת נוגדנים, בחר בלוק Gt Ig, ועבור זמן הדגירה, בחר 4 דקות. לאחר מכן, ב - Multimer HRP Reagent, בחר OMap anti-Rb HRP, ועבור זמן הדגירה, בחר 16 דקות. לאחר מכן, לחץ על Cy5, ולזמן דגירה ארוך, בחר 0 שעה 8 דקות.
- לחץ על רצף כפול ובחר דנטורציה של נוגדנים, לאחר מכן בחר נוגדנים דנטורציה CC2-1, ועבור טמפרטורה גבוהה מאוד, בחר 100 מעלות צלזיוס. ודא כי זמן הדגירה הוא 8 דקות. לאחר מכן, לחץ על מעכב DS ובחר נטרל.
- לחץ על נוגדן DS, ולטמפרטורה נמוכה מאוד, בחר 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, בנוגדן, בחר את מספר הנוגדן מתווית המתקן (נוגדן 3 בדוגמה זו), ועבור זמן דגירה פלוס, בחר 32 דקות.
- לחץ על תוכנית המענה ההומניטרי של DS Multimer ובחר חוסם משאבי אנוש של DS Multimer. לאחר מכן, עבור חסימת נוגדנים, בחר בלוק Gt Ig, ועבור זמן הדגירה, בחר 4 דקות. לאחר מכן, ב - Multimer HRP Reagent, בחר OMap anti-Ms HRP, ועבור זמן הדגירה, בחר 16 דקות. לאחר מכן, לחץ על DS Rhodamine 6G, ולזמן דגירה ארוך, בחר 0 שעה 8 דקות.
- לחץ על כתם משולש ובחר דנטורציה של נוגדן TS, לאחר מכן בחר נוגדן דנטורציה CC2-2, ועבור טמפרטורה גבוהה מאוד, בחר 100 מעלות צלזיוס. ודא כי זמן הדגירה הוא 8 דקות. לאחר מכן, לחץ על מעכב TS ובחר TS נטרול.
- לחץ על נוגדן TS, ולטמפרטורה נמוכה מאוד, בחר 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, ב - Antibody, בחר את מספר הנוגדן מתווית המתקן (נוגדן 7 בדוגמה זו), ועבור זמן דגירה פלוס, בחר 32 דקות.
- לחץ על HRP Multimer TS ובחר חוסם HRP של TS Multimer. לאחר מכן, עבור חסימת נוגדנים, בחר בלוק Gt Ig, ועבור זמן הדגירה, בחר 4 דקות. לאחר מכן, ב - Multimer HRP Reagent, בחר OMap anti-Rb HRP, ועבור זמן הדגירה, בחר 16 דקות. לאחר מכן, לחץ על TS FAM, ולזמן דגירה ארוך, בחר 0 שעה 8 דקות.
- הוסף כותרת לפרוטוקול. בחר מספר פרוטוקול, הוסף הערה ולחץ על פעיל ואחריו שמור.
- הכנת שקופיות, הדפסת תוויות והתחלת הפעלת הסטיינינג האוטומטי
- ספק האופים רכש מקטעי רקמה אנושית FFPE (פורמלין קבוע, משובץ פרפין) בתנור שנקבע ל-70 מעלות צלזיוס למשך 20-60 דקות. בזמן שהשקופיות נאפות, הדפס תוויות על-ידי לחיצה על צור תווית בתוכנת הצביעה האוטומטית. לאחר מכן, לחץ על פרוטוקולים, בחר את מספר הפרוטוקול ולחץ על סגור / הדפס. הוסף מידע רלוונטי בתווית השקופית ולחץ על הדפס.
- מוציאים את השקופיות מהתנור ומניחים להן להתקרר לטמפרטורת החדר (RT). החל את תוויות הפרוטוקול שהודפסו בעבר על השקופיות המתאימות.
- טען מכשירי נוגדנים למילוי חוזר עם נוגדנים בהתאם למספר תווית הנוגדנים שהוקצה בשלב 1.1. בפרוטוקול זה, השתמש בנוגדן 6 עבור FAP ב- 1 מיקרוגרם / מ"ל, השתמש בנוגדן 3 עבור Pan-Cytokeratin ב- 0.1 מיקרוגרם / מ"ל, והשתמש בנוגדן 7 עבור נוגדן X ב- 2.5 מיקרוגרם / מ"ל. יש לדלל כל נוגדן בדילול שצוין ולהכין את מכשירי הנוגדנים הניתנים למילוי חוזר.
- אסוף מכשירי ריאגנטים ממולאים מראש לחסימה, זיהוי והגברה שהוזכרו לעיל והנח אותם על מגש מגיבים. טען שקופיות במגשי השקופיות (עד 30 שקופיות בכל ריצה) ולחץ על ריצה ואחריה כן. שים לב כי DAPI אינו משמש עבור counterstaining גרעיני.
- אשר את תחילת הריצה על ידי בדיקת משך הריצה בתוכנת הסטיינר האוטומטי. הפרוטוקול לוקח ~ 11 שעות להשלמה והוא יכול לרוץ לילה.
- למחרת, ודא שהריצה הושלמה על ידי התבוננות באורות מהבהבים ירוקים על חריצי מגש השקופיות. לאחר מכן, הסר את השקופיות מהמכשיר ושטוף את השקופיות במרץ במאגר תגובה 1x עד שתמיסת הכיסוי הנוזלי תוסר לחלוטין.
- פרוטוקול פלטפורמת פרופיל מרחבית לבדיקת פרוטאומיקה
- עקוב אחר פרוטוקול הפרוטאומיקה המרחבית המצוין בהערה שלהלן. כלול את השינויים הבאים בפרוטוקול כדי לאפשר את הליך ההתוויה האוטומטית של 3-plex.
- בצע את שלבים 1.2.1-1.2.6 יום לפני תחילת פרוטוקול הפרוטאומיקה המרחבית ועבור ישירות לשלב אחזור האנטיגן של פרוטוקול הפרוטאומיקה המרחבית לאחר ביצוע שלב 1.2.6. השמט את הליך ההדמיה המתואר בפרוטוקול פרופיל מרחבי של פרוטאומיקה.
- החלף את SYTO 13 ב-SYTO 64 ב-5000 ננומטר כדי לאפשר שילוב פלואורופור. יש לדלל את SYTO 64 ב-1x TBS ולדגור בתא לחות למשך 15 דקות.
- בעת הגדרת פרמטרי הסריקה בפלטפורמת הפרופיל המרחבי, בחר את המסננים ואת ערוצי המיקוד בהתאם לפלואורופורים המשמשים בלוח ההדמיה כדי לאפשר אינטגרציה של 3 פלקסים. השתמש ב- FITC עבור DISCOVERY FAM והגדר את החשיפה ל- 200 אלפיות השנייה, השתמש ב- Cy3 עבור DISCOVERY Rhodamine 6G והגדר את החשיפה ל- 200 אלפיות השנייה, השתמש ב- Texas Red עבור SYTO 64 והגדר את החשיפה ל- 50 אלפיות השנייה (ציין זאת כערוץ המיקוד), ולבסוף, השתמש ב- Cy5 עבור DISCOVERY Cy5, הגדר את החשיפה ל- 200 אלפיות השנייה, ולשמור שינויים.
הערה: הוראות מפורטות של פרוטוקול הפרופילים המרחביים נמצאות בכרטיסיית התמיכה באתר הרשמי על-ידי בחירה באפשרות תיעוד > מדריכים למשתמש. כאן, חפש את פרוטוקול החלבון עבור nCounter באמצעות Bond RX.
2. בחירת ROI עבור מבחני תעתיק מרחביים
- אופים חלקי כדוריות תא FFPE בתנור שנקבע ל 70 מעלות צלזיוס במשך 20-60 דקות. עקוב אחר פרוטוקול NGS של פלטפורמת הפרופיל המרחבי המצוין בהערה שלהלן וסרוק שקופיות בפלטפורמת הפרופיל המרחבית, ובחר גדלים של 50 מיקרומטר ו- 300 מיקרומטר. ההמלצה הבאה מודגשת למבחן התמלול המרחבי:
- בעת הכנת הספרייה, אם נבחרו גדלים שונים של ROIs, איחד ROIs בגדלים דומים כדי ליצור ספרייה אחת לכל גודל. זאת כדי להבטיח שעומקי ריצוף מספיקים יושגו עבור כל ה-ROIs ללא הטיה מהגודל.
הערה: הוראות מפורטות של פלטפורמת יצירת הפרופילים המרחבית נמצאות בכרטיסיית התמיכה באתר הרשמי על-ידי בחירה באפשרות תיעוד > מדריכים למשתמש. כאן, חפש את פרוטוקול RNA עבור יישומי NGS באמצעות Bond RX.
- בעת הכנת הספרייה, אם נבחרו גדלים שונים של ROIs, איחד ROIs בגדלים דומים כדי ליצור ספרייה אחת לכל גודל. זאת כדי להבטיח שעומקי ריצוף מספיקים יושגו עבור כל ה-ROIs ללא הטיה מהגודל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול תצוגה חזותית אוטומטי להנחיית בחירת ROI
במאמר זה אנו מציגים את השימוש בפרוטוקול IF אוטומטי ומותאם אישית המבוסס על TSA כדי להמחיש את הרקמה ולבחור ROIs ספציפיים. פיתוח פאנל הדמיה באמצעות מלנומה ועור תקין אנושי כרקמות בקרה כלל בדיקת יציבות אפיטופית, כוונון עדין של עוצמות הסמן, והערכת דימום באמצעות השארת אחד הפקדים. כדי לבדוק אם יציבות האפיטופ של הנוגדנים מושפעת משלבי אלוטיון חוזרים ונשנים, אותות FAP ונוגדן X הוערכו איכותית לאחר הסימון בכל מיקום של 3-plex. אות נוגדן X נשאר עקבי בכל המיקומים, בעוד שעוצמת אות FAP ירדה לאחר אלוציה אחת (איור 2). מחקרים פנימיים קודמים הראו כי אפיטופ panCK יציב לאורך כל הבדיקה של 3 פלקס. לכן, FAP נבחר להיות בעמדה1 st ב 3-plex, panCK הוצב ב2, ונוגדן X במצב3 . מאחר שאות ה-FAP היה חלש יותר באופן כללי בהשוואה לנוגדן X ול-panCK, FAP הוצמד לפלואורופור הבהיר יותר, Cy5.
ה-3-plex האוטומטי עבר אופטימיזציה עם פקדי Left One Out, כאשר כל סמן הושמט מפרוטוקול 3-plex פעם אחת כדי לאשר שלא היה גלישה לערוצים שכנים (איור 3).
הפלואורופורים המשמשים בפלטפורמת הצביעה האוטומטית נבדקו על פלטפורמת הפרופיל המרחבי כדי לאשר שהמסננים תואמים לפלואורופורים של TSA בלוח ההדמיה בן 3 הפלקסים. מכיוון שפרוטוקול 3-plex משתמש ב- FITC, Cy3 ו- Cy5, וערוץ DAPI משמש לביקוע UV בפלטפורמת הפרופיל המרחבית, היה צורך להשתמש בכתם נגדי גרעיני בערוץ האדום של טקסס. שני צבעים גרעיניים שונים, SYTO 59 ו-SYTO 64, נבדקו, והצבעים הראו אות גרעיני מובהק ברקמות המעי הגס. עם זאת, SYTO 59 גם הציג אות בליד מסוים בערוץ Cy5 בעוד שערוץ Cy5 היה נקי בעת השימוש ב-SYTO 64 (איור 4). לכן, SYTO 64 היה הבחירה המועדפת לגילוי גרעיני.
בדיקה נוספת של SYTO 64 הראתה כי צבע זה אינו ניתן לצילום ופוטו-לבנת במהירות במהלך ההדמיה. ברגע שהאות מולבן, מערכת ההדמיה מתמקדת ברקע, מה שיכול להתפרש כאות לא ספציפי (איור 5). הגדלת הריכוז של הצבע הגרעיני כדי להגביר את עוצמת האות סייעה למזער בעיה זו.
רקמות המסומנות בפרוטוקול ההדמיה הידנית panCK/CD45, המשתמשת בנוגדנים מצומדים ישירות, הושוו לרקמות המסומנות בפרוטוקול ההדמיה המותאם אישית האוטומטי panCK/FAP/Antibody X. שני הפרוטוקולים חולקים את panCK כסמן משותף, והאות היה דומה בין שני הפרוטוקולים (איור 6).
כדי להבטיח שלפרוטוקול תצוגה חזותית שונה לא תהיה השפעה על בדיקת הפרוטאומיקה המרחבית במעלה הזרם, השווינו את ערכי הספירה שהתקבלו לאחר איסוף פלטפורמת פרופיל מרחבית ועיבוד פלטפורמת הספירה בעת שימוש בפרוטוקול ההדמיה הידני panCK/CD45. זה משתמש בנוגדנים מצומדים ישירות או בפרוטוקול הדמיה מותאם אישית אוטומטי של 3-plex, המשתמש ב- TSA. ארבע רקמות של סרטן המעי הגס (CRC) סומנו בפרוטוקול ההדמיה הידני panCK/CD45 או בפרוטוקול ההדמיה המותאם אישית האוטומטי בן 3 הפלקסים בשילוב עם בדיקת הפרוטאומיקה המרחבית. ROIs דומים נבחרו עבור כל פרוטוקול, ונתוני ספירה של ה- ROIs המתאימים הושוו באמצעות נורמליזציה של משק הבית עבור S6 ו- Histone. מגמות דומות נצפו בין ה-ROIs האלה, כפי שמוצג במפת החום של log2 (איור 7A), עם ערך Spearman R של 0.88 עבור כל הסמנים הכלולים במבחן הפרוטאומיקה המרחבית (איור 7B). מתוך 31 נוגדנים ששימשו במבחנים, 23 נוגדנים היו בעלי ערך ספירמן R גבוה או שווה ל-0.5.
מכיוון שפרוטאומיקה מרחבית ופרוטוקולי תעתיק שונים זה מזה, הערכנו אם ניתן ליישם את פרוטוקול ההדמיה האוטומטי גם על מבחני תעתיק מרחבי. פרוטוקול ההדמיה האוטומטי דורש לבצע את בדיקת IHC לפני זיהוי RNA, בעוד שהפרוטוקול הידני המקורי מזהה RNA תחילה לפני החלת פרוטוקול ההדמיה. פרוטוקול ההדמיה האוטומטי בן 3 הפלקסים נבדק זה לצד זה עם פרוטוקול ההדמיה הידני CK/CD45 בשילוב עם מבחן התמלול המרחבי. נתוני רצף עבור פרוטוקול ההדמיה האוטומטי בן 3 הפלקסים Quartile 3 count (Q3), המנורמל בתוכנת הפרופיל המרחבי, הציגו ערכים נמוכים יותר בהשוואה לפרוטוקול ההדמיה הידנית CK/CD45 (איור 8A), המשתקף גם בערכי Spearman R הנמוכים של 0.15 (איור 8B). כמו כן, נצפה אובדן של טווח דינמי בעת שימוש בפרוטוקול האוטומטי של ויזואליזציה של 3 plex (איור 8C).
אובדן ספירות זה עם פרוטוקול ההדמיה האוטומטי מצביע על כך שפרוטוקול זה פוגע בשלמות הרנ"א, וכי זיהוי הרנ"א לפני ביצוע בדיקת ההדמיה נחוץ כדי לשמר את איכות הרנ"א. מאחר שפאנל הדמיה אוטומטי זה דורש שהחלק החלקי של החלבון יבוצע לפני גילוי הרנ"א, פרוטוקול זה אינו מתאים למבחני RNA.
גודל בחירת ההחזר על ההשקעה במבחני תעתיק מרחביים
כדי להבין טוב יותר את ההשפעה של גודל החזר ההשקעה על פלט נתוני RNA, הושוו ספירות RNA של ROIs בגדלים שונים. בדיקת התמלול המרחבי בוצעה על קווי התאים SUDHL1 ו-JURKAT כדי למזער את ההבדלים הטבועים ברקמות. ROIs מעגליים בקוטר 50 מיקרומטר ו-300 מיקרומטר נבחרו והושוו זה לזה באמצעות נורמליזציה Q3 בתוכנת הפרופיל המרחבי. ספירות הרנ"א עבור מטרות נבחרות בקווי תאים שונים היו דומות בין שני גדלי ההחזר על ההשקעה לאחר הנורמליזציה (איור 9A,B).
איור 1: זרימת עבודה של יצירת פרופילים מרחביים דיגיטליים. (A) שקופיות מסומנות בנוגדנים (בדיקת פרוטאומיקה מרחבית) או בבדיקות (בדיקת תעתיק מרחבי) וכן בסמני הדמיה. (B) השקופיות ממוקמות על פלטפורמת יצירת הפרופילים המרחבית כדי לדמות ולבחור ROIs. (C) אוליגוס נבקעים על ידי אור UV ונאספים בצלחת של 96 בארות. תהליך זה חוזר על עצמו עבור כל ROI שנבחר. (D) הדגימות מעובדות, והנתונים נוצרים באמצעות פלטפורמת הספירה או הרצף. נתון זה שונה מאתר טכנולוגיות Nanostring 4,5. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: יציבות אפיטופ. (א-ג) נוגדנים X ו-(D-F) FAP נבדקו על עור רגיל אנושי ומלנומה, בהתאמה. כל סמן במיקום(A,D) 1st, (B,E) 2 nd ו-(C,F) 3 של 3-plex. נוגדן X יציב בכל המיקומים, בעוד ש-(D) FAP מראה ירידה בעוצמת האיתות לאחר (E-F) אחת ושתיים, בהתאמה. נוגדן X בירוק, FAP באדום, DAPI באפור. סרגלי קנה המידה הם ב 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: השאירו אחד מחוץ לבקרה עבור פרוטוקול הדמיה מותאם אישית אוטומטי בן 3 פלקסים על רקמות לבלב אנושיות. עבור כל התמונות, נוגדן X מתואר בירוק, panCK בציאן ו- FAP באדום. השורה הראשונה מציגה את (A) 3-plex ואת הערוצים הבודדים עבור (B) נוגדן X ב- FITC, (C) panCK ב- Cy3 ו- (D) FAP ב- Cy5. השורה השנייה מציגה את ה-3-plex של השארת שליטה אחת עבור (E) נוגדן X ו-(F-H) את הערוצים היחידים עבור כל סמן. השורה השלישית מציגה את 3 הערוצים הבודדים עבור (I) panCK ו- (J-L) את הערוצים הבודדים עבור כל סמן. השורה הרביעית מציגה את 3 הערוצים הבודדים עבור (M) FAP ואת (N-P) את הערוצים הבודדים עבור כל סמן. לא נצפתה בליד-דרך באף אחת מהבקרות של השארת אחד החוצה כפי שצוין על ידי חוסר אות בערוצים המתאימים בעת הבדיקה (F) ללא FAP, (K) ללא panCK, ו- (P) ללא נוגדן X. סרגלי קנה המידה הם ב- 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: בדיקת צבע SYTO. הערוץ האדום של טקסס מציג את האות הגרעיני בקולון עבור (A) SYTO 59 עם גלישה לתוך (B) ערוץ Cy5 (אדום). הערוץ האדום של טקסס מציג את האות הגרעיני בקולון עבור (D) SYTO 64 ללא גלישה לערוץ (E) Cy5. ערוצי טקסס אדום ו- Cy5 בקולון מוצגים יחד כדי להראות (C) bleedthrough של SYTO 59 ו- (F) ללא גלישה עבור SYTO 64. סרגלי קנה המידה הם ב 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: יציבות תמונה של SYTO 64. דגימות המעי הגס המסומנות ב-SYTO 64 (A) לפני ו-(B) לאחר הלבנת תמונות. תמונה B מציגה את האות הלא ספציפי שהופך גלוי יותר לאחר אובדן אות גרעיני. סרגלי קנה המידה הם ב 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: השוואה בין תיוג panCK. אות panCK על דגימות סרטן המעי הגס (CRC) עם (A) פרוטוקול הדמיה ידני panCK/CD45 ו-(B) פרוטוקול הדמיה אוטומטי של panCK/FAP/Antibody X. לא נצפו הבדלים באות panCK בין שני הפרוטוקולים. סרגלי קנה המידה הם ב 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: השוואה של ערכי ספירה עבור בדיקת פרוטאומיקה מרחבית באמצעות שני פרוטוקולי הדמיה שונים על ROIs דומים של ארבע רקמות CRC. (A) Log 2 Heatmap של כל הסמנים הכלולים בבדיקת הפרוטאומיקה המרחבית המשווה את פרוטוקול panCK/CD45 הידני (שחור) לפרוטוקול 3-plex האוטומטי (אפור). (B) מתאם לוג 2 ספירמן עבור כל הסמנים מציג ערך R של 0.88. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות תוכנת GraphPad Prism 7 או באמצעות שפת התכנות Python. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: השוואה של ערכי ספירה עבור בדיקת התמלול המרחבי באמצעות שני פרוטוקולי ויזואליזציה שונים. (A) Log 2 Heatmap של יעדים נבחרים הכלולים במבחן התמלול המרחבי המשווה את פרוטוקול panCK/CD45 הידני (שחור) לפרוטוקול האוטומטי בן 3 הפלקסים (אפור). (B) מתאם לוג 2 ספירמן עבור כל הסמנים מציג ערך R של 0.15. (C) הממוצע (כחול) וסטיית התקן שבהם הטווח הדינמי הולך לאיבוד בפרוטוקול האוטומטי של 3 plex. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות תוכנת GraphPad Prism 7 או באמצעות שפת התכנות Python. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 9: השוואה של ערכי ספירת רנ"א עבור בדיקת התעתיק המרחבי על כדורי תאים. תוצאות דומות נצפו עבור ROIs בקוטר 50 מיקרומטר (שחור) ו-300 מיקרומטר (אפור) עבור מטרות נבחרות בקווי התאים (A) SUDHL1 ו-(B) JURKAT. לא נצפה הבדל משמעותי באמצעות t-test. ממוצע וסטיית תקן המוצגים עבור n = 3 ROIs לכל גודל. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות תוכנת GraphPad Prism 7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נכון להיום, נוגדנים פלואורסצנטיים מצומדים ישירות בפרוטוקול ידני משמשים לרוב כלוחות הדמיה עבור פרוטאומיקה מרחבית או מבחני תעתיק מרחבי 9,10. עם זאת, השימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים מצומדים ישירות יכול להיות מאתגר עבור סמנים פחות בשפע, ולהגביל את בחירת הנוגדנים המתאימים. פרוטוקול זה מראה כי תיוג של סמני הדמיה יכול להיות אוטומטי על פלטפורמת צביעה אוטומטית באמצעות טכנולוגיות TSA כדי לתמוך במבחני פרוטאומיקה מרחבית. זה מאפשר גמישות רבה יותר בהתאמה אישית של לוחות ויזואליזציה, המאפשרת בחירת ROI ממוקדת יותר ורכישת נתונים ביולוגיים רלוונטיים מאזורים ספציפיים ברקמה. טכנולוגיית TSA מאפשרת גם הדמיה של סמני שפע נמוך, ובכך מגדילה את מספר הנוגדנים המתאימים הפוטנציאליים. בנוסף, אוטומציה של פרוטוקול ההדמיה מבטיחה שכפול ואיכות של הליך ההתוויה.
פיתוח בדיקת IF בת 3 פלקסים דורשת הערכה זהירה של עוצמות אות הסמן/פלואורופור ברקמות בקרה מתאימות. מומלץ לטיטרט את ריכוזי הנוגדנים כדי להשיג את יחס האות לרעש הטוב ביותר, אשר יסייע למזער את הדימום לערוצים סמוכים. יתר על כן, יש לבדוק את יציבות האפיטופ עבור כל סמן בעל עניין כדי להבטיח שהאפיטופ אינו מושפע משלבי אלוציה חוזרים ונשנים. לאחר אישור סדר הנוגדנים בפאנל, יש לכוונן את הבדיקה באמצעות בקרות Leave One. כאן, סמן מסוים מושמט בלוח, והערוץ המתאים בתמונה שנרכשה נבדק עבור bleedthrough ו cross-talk.
כאן הוכח כי ניתן לדמות מבחנים מבוססי TSA על פלטפורמת הפרופיל המרחבי, וכי יש להשתמש בחלופות DAPI להכתמה גרעינית. בדקנו את צבעי SYTO וקבענו שכאשר מחליטים באיזה צבע SYTO להשתמש, יש להעריך בזהירות את האות כדי למנוע גלישה לערוצים סמוכים. מגבלה נוספת של השימוש בצבעי SYTO היא שחלק מצבעי SYTO צובעים פוטו-אקונומיקה מהר יותר, כגון SYTO 64 ו- SYTO 83 (נתונים פנימיים), מה שעלול להשפיע על כימות גרעיני. לכן, יש להימנע ככל האפשר מחשיפה לאור של השקופיות המוכתמות. קבוצות אחרות הראו את השימוש ב- SYTO 1311,12, שהוא יותר פוטו-טבל (נתונים פנימיים) וניתן להשתמש בו בלוח כל עוד סמני העניין מוקצים לפלואורופורים התואמים את הצבע הגרעיני המועדף.
בעוד שמבחני פלואורסצנט אוטומטיים מבוססי TSA עבדו היטב עבור הדמיה בשילוב עם מבחני פרוטאומיקה מרחבית, נקבע כאן כי שילוב של פרוטוקול ויזואליזציה אוטומטי בן 3 פלקסים עם פרוטוקול תעתיק מרחבי הביא לאובדן הטווח הדינמי, אשר יכול להיות בגלל תנאי הפרוטוקול הקשים יותר של הוספת שלבי אחזור / אלוטיזציה נוספים של אנטיגן שעשויים להשפיע על שלמות ה- RNA. לכן, יש להתאים את פרוטוקול ההדמיה האוטומטי בן 3 הפלקסים רק למבחני פרוטאומיקה, דבר המהווה מגבלה ודורש גישות הדמיה חלופיות עבור מבחנים מבוססי RNA. כחלופה להדמיה של אותה שקופית, ניתן היה לכסות מקטעים סדרתיים מוכתמים בסמנים מעניינים כדי להקל על בחירת ROI13. בנוסף, הספרות מתארת את השימוש בהכלאה in situ בשקופיות סמוכות כדי להנחות את בחירת ROI14. עם זאת, גישות אלה עשויות להיות מוגבלות על ידי זמינות רקמות, השתנות ממקטע למקטע ורישומי תא לתא.
בדקנו גם את השימושיות של גדלים שונים של ROI עבור מבחני תמלול מרחביים. שימוש ב- ROIs קטנים של 50 מיקרומטר מאפשר לחוקר להשיג נתונים של אזורים ספציפיים המאפשרים קריאה מפורטת יותר של תאים נבחרים או תחומי עניין. המגבלות של בחירת ROIs קטנים הן שמספר התאים הקיימים עשוי שלא להיות מספיק בשפע כדי לקבל ערכי ספירה שניתן להבחין בהם מהרקע. אפשרות אחת היא לבחור אוכלוסיות תאים טהורות כדי ללכוד פחות מטרות בשפע. עם זאת, בחירת החזר ההשקעה עבור תאים בודדים מוגבלת על ידי יחס אות לרעש גבוה15. יתר על כן, חשוב לשקול גדלי ROI להכנת ספרייה אם ROIs בגדלים שונים נאספים בניסוי אחד. אם גדלי ההחזר על ההשקעה שונים באופן משמעותי, זה עשוי להיות מועיל לאגד ROIs בהתאם לגדלים שלהם ולבנות ספריות נפרדות כדי למנוע ייצוג יתר של ROIs גדולים בספריה אחת. זה גם יבטיח שכל החזר השקעה יקבל כיסוי רצף מספיק בהתאם לגודלו.
גורמים נוספים שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע ניסויי Spatial Omics הם שהנתונים יכולים להראות וריאציות עקב השתנות משקופית לשקופית, וביטוי נמוך יותר של מטרות מסוימות יכול להעלות רקע והבדלים בערכי המתאם. יש לקחת בחשבון בקרות נאותות וגישות נורמליזציה בעת תכנון ניסויים והערכת נתונים. עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית ב- nCounter, נרמול ליעדי משק בית או לבקרה שלילית IgGs הן השיטות המועדפות על פי ניסיון פנימי והמלצות ספקים שבהן יש להעריך את המתאם בין יעדי משק הבית או לבקרה השלילית IgGs16. עם זאת, בהתאם לרקמות המשמשות, הנורמליזציה הטובה ביותר צריכה להיות מוגדרת עבור כל מחקר17,18. לדוגמה, הספרות קובעת כי עבור סרטן השד מחקרי אומיקה מרחבית, GAPDH, המשמש בדרך כלל לנרמול ליעדי משק בית, היה פחות קונקורדנטי מאשר S6 והיסטון19. לכן, S6 ו- Histone היו יעדי משק הבית המומלצים לנורמליזציה ברקמות סרטן השד19.
עבור מבחני תעתיק מרחבי, יש להגדיר אסטרטגיות נורמליזציה בהתאם לתכנון המחקר (למשל, סוגי רקמות ובחירת ROI). אסטרטגיות מסוימות המשמשות ב- RNA-Seq, כגון ממוצע עליון או חתך של נורמליזציה של ערכי M (TMM), יכולות להיות מיושמות כדי לנרמל נתונים ברצף19,20.
מבחני תעתיק מרחביים מספקים מידע על אלפי מטרות והופכים נפוצים יותר כדי לחקור את התמלול כולו, שבו תאי TME ספציפיים נבחרים ומנותחים בשילוב עם RNA-seq20 בעל גרעין יחיד או ריצוף RNA חד-תאי21. הראינו שפרוטוקולי ויזואליזציה שינחו את בחירת ההחזר על ההשקעה כדי להעריך את ההתפלגות המרחבית של המטרות יכולים להיות אוטומטיים עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית, אך לא עבור מבחני תעתיק מרחבי. בנוסף, אנו מציגים כי ניתן לבחור ROIs קטנים עד 50 מיקרומטר כדי לאפשר חקירה מעמיקה יותר של אזור רקמה מסוים. יישומים עתידיים של טכנולוגיה זו ישפרו את ההבנה של המיקרו-סביבה של הגידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ורוניקה איבארה-לופז, סנג'יטה ג'איאקר, יצ'ינג אנג'לה יאנג, זורה מודרוסאן וסנדרה רוסט הן עובדות ומחזיקות מניות של ג'ננטק, חברה בקבוצת רוש. חברות אחרות שהן חלק מרוש מייצרות ריאגנטים ומכשירים המשמשים בכתב יד זה. סיארה מרטין היא עובדת במשרה מלאה בחברת NanoString Technologies Inc, המייצרת ריאגנטים ומכשירים המשמשים בכתב יד זה.
Acknowledgments
המחברים מודים לתומס וו על עיבוד קבצי NGS. אנו מודים לג'יימס זיאי על דיוני התוצאות וסקירת כתבי היד ולמרדית' טריפלט ורייצ'ל טיילור על התיקון הפנימי של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user's review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022).
- NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022).
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user's perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring. , Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
