Summary
既存の多電極アレイまたはパッチクランプ装置の改造により、 ex vivo 網膜電図がより広く利用できるようになります。 生体外 光応答を記録および維持するための改善された方法は、健康な網膜、眼疾患の動物モデル、およびヒトドナー網膜における光受容体およびONバイポーラ細胞機能の研究を容易にします。
Abstract
網膜ニューロン光応答の測定は、健康な網膜の生理機能を調査し、網膜疾患の病理学的変化を決定し、治療的介入をテストするために重要です。 ex vivo 網膜電図(ERG)は、特定の薬理学的物質を添加し、全身の影響とは無関係に組織固有の変化を評価することにより、単離された網膜の個々の細胞タイプからの寄与を定量化することができます。網膜の光応答は、既存のパッチクランプまたは微小電極アレイ装置から変更された特殊な ex vivo ERG試料ホルダーと記録セットアップを使用して測定できます。特に、ONバイポーラ細胞だけでなく光受容体の研究も、時間の経過に伴う ex vivoERG における光応答のゆっくりとした、しかし進行性の低下によって妨げられてきました。灌流速度の向上と灌流液温度の調整により、 ex vivo 網膜機能が改善され、応答振幅と安定性が最大化されます。 ex vivo ERGは、個々の網膜神経細胞タイプの研究を独自に可能にします。さらに、応答振幅と安定性を最大化するための改善により、大型動物やヒトドナーの目からの網膜サンプルの光応答の調査が可能になり、 ex vivo ERGは網膜機能の調査に使用される技術のレパートリーに貴重な追加となります。
Introduction
網膜電図は、光に応答して網膜機能を測定する1.これは、網膜生理学と病態生理学を研究し、網膜疾患の治療の成功を測定するために不可欠です。in vivo ERGは、無傷の生物の網膜機能を評価するために広く使用されていますが、重大な制限があります2,3。これらの中で、in vivo ERGにおける個々の網膜細胞タイプの定量分析は、すべての網膜細胞から光刺激への潜在的な変化の合計を記録し、したがって応答を重ね合わせるため、妨げられています4。さらに、網膜への薬物の添加を容易に許さず、全身の影響に対して脆弱であり、信号対雑音比が比較的低い。これらの欠点は、単離された網膜2、3、5、6の機能を調べるex vivo ERGにおいて排除される。ex vivo ERGは、薬理学的阻害剤の添加およびスーパーフューセートに添加することができる治療薬の容易な評価により、特定の網膜細胞型からの大規模で安定した応答の記録を可能にする。同時に、全身的影響の影響を除去し、生理学的ノイズ(例えば、心拍または呼吸)を排除する。
ex vivo ERGでは、網膜または網膜試料が単離され、標本ホルダー3,5のドーム上に感光体側を上にしてマウントされる。試料ホルダーは組み立てられ、網膜に加熱された酸素化媒体を供給する灌流システムに接続され、コンピューター制御の光刺激を提供するように変更された顕微鏡のステージに配置されます。光によって誘発された応答を記録するために、試料ホルダーはアンプ、デジタイザ、および記録システムに接続されています(図1)。この技術は、光刺激のパラメータを変更し、薬理学的物質を添加することにより、桿体および錐体光受容体、ONバイポーラ細胞、およびミュラーグリアからの応答の単離を可能にする。
既存のパッチクランプまたは多電極アレイ(MEA)セットアップは、市販のex vivo ERGアダプターまたはカスタムポリカーボネートコンピューター数値制御(CNC)機械加工された標本ホルダーと組み合わせて、ex vivo ERGを記録するように変換して、マウスなどの小動物モデルからの網膜の光応答を測定することができます。この変更により、特殊な機器の必要性を最小限に抑えながら、ex vivo ERGのアクセシビリティが向上します。試料ホルダーの設計により、取り付け技術が簡素化され、電極が統合されるため、以前に報告された経網膜ex vivo ERG法と比較して、微小電極の操作が不要になります7。試料ホルダー内の灌流速度と温度は、光受容体とONバイポーラ細胞からの応答特性に影響を与える重要な要素です。これらの条件を調整することにより、ex vivo ERGを単離されたマウス網膜から長期間にわたって確実に記録することができる。最適化された実験条件により、大型動物の目やヒトドナーの目など、より大きな網膜からの網膜パンチでのex vivoERG記録が可能になります8。
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Protocol
マウスを用いたすべての実験は、実験動物の世話と使用のためのNIHガイドに従って実施され、ユタ大学の施設内動物研究委員会によって承認されました。このビデオのデモンストレーション用の豚の目は、食肉処理場(持続可能な豚資源、ジョンソンビル)から死後に入手しました。眼は、脳死または心臓死後にヒトドナーから、FDA、臓器調達組織協会(AOPO)、およびアイバンクオブアメリカ協会によって完全に認定されているユタライオンズアイバンク、サンディエゴアイバンク、またはライフシェアリングを通じて研究使用の同意を得て取得されました。人間のドナーの目の使用は、ユタ大学(IRB番号00106658)およびスクリップスヘルスIRB(IRB番号16-6781)で免除ステータスを持っていました。
1. 生体外 ERGのセットアップ
- 多電極アレイのセットアップを変換するには、 ex vivo ERG試料ホルダーをヘッドステージ を介して 差動アンプに接続し、差動アンプは多電極アレイシステムのインターフェースボードのアナログ入力に接続します。多電極アレイ用の記録ソフトウェアを使用して、 ex vivo ERGからの入力データを記録および保存します。差動アンプの ゲイン を 100 に設定し、デジタイザの仕様に応じて10倍の電圧増幅を追加します。ローパスフィルターを100Hzに設定します。
- パッチクランプのセットアップを変換するには、 ex vivo ERG検体ホルダーをヘッドステージ を介して 差動アンプに接続し、差動アンプはパッチクランプアンプのヘッドステージに接続します。パッチクランプシステムソフトウェアとデジタイザーを使用して、 ex vivo ERGからの入力データを記録および保存します。差動アンプの ゲイン を 100 に設定し、パッチクランプヘッド段 を介して さらに10倍の電圧増幅を適用します。ローパスフィルターを100Hzに設定します。
- 適切な波長(例えば、ロッド感光体およびONバイポーラ細胞応答を引き出すために約530nm)のLEDを顕微鏡に接続します。光刺激のトリガーを可能にする記録ソフトウェアでLEDを制御します。光刺激を制御するには、デジタイザからのアナログ出力によって制御されるLEDドライバを使用します。
- フォトダイオードを使用して、試料ホルダー内の網膜の位置にあるLEDの光出力を校正します。必要に応じて、減光フィルターを光路に挿入して、光の強度を暗くします。
- 市販またはカスタムビルド のex vivo ERG検体ホルダーを使用してください。
注:ポリカーボネートからのCNC機械加工の図面は、要求に応じて著者から入手できます。 - 電極を準備するには、Ag/AgClペレット電極をネジ付きルアーコネクタに挿入します。ルアーコネクタの内側をホットグルーで満たし、ねじ山のない側からホットグルーに2mmソケットを挿入します。EP1電極の銀線を2mmソケットにはんだ付けします。完成した電極を、ねじ山にOリングを付けて、 ex vivo ERG試料ホルダーの電極ポートにねじ込みます。
注意: 電極は長期間使用できます。ペレット表面に汚れが蓄積したり、暗くなったりした場合(これにより、高いオフセット電圧や電気的ドリフトが発生する可能性があります)、細かいサンドペーパーを使用して「研磨」できます。 - 実験の少なくとも1日前に、エポキシ接着剤を使用して ex vivoERG 標本ホルダーのドームにろ紙を接着し、接着剤が電極チャネルを塞がないようにします(ビデオについては 3 を参照)。
2.動物の準備
- 暗闇は少なくとも6時間または一晩動物を適応させます。
3. 機器の準備
- ex vivo ERGの灌流ラインに、5%の二酸化炭素と95%の酸素でバブリングしたエイムズ培地を充填します。灌流ラインを試料ホルダー近くのDC電流源または熱コントローラーを備えた発熱体に接続してエイムズ培地を温め、網膜が約35〜38°Cに保たれるようにします。
- ex vivo ERG検体ホルダーの両方の半分を電極溶液で満たし、ルアーストッパーで灌流ラインをシールし、電極を接続し、4本のネジで検体ホルダーを組み立てます(ビデオの3を参照)。
- マルチメータのプローブを電極に挿入して、組み立てた試料ホルダー内の電極間の抵抗とオフセット電圧を確認します。
注意: 詰まりがなく、電極の状態が良好な場合、抵抗は100kΩ未満、オフセット電圧は5mV未満である必要があります。 - 組み立てた試料ホルダーを灌流ラインに接続し、光のフラッシュを提供するためにセットアップされた顕微鏡のステージに置きます。試料ホルダーと灌流ラインに気泡が含まれていないことを確認してください。
4.ティッシュの準備
- 動物をCO2 で犠牲にし、直ちに眼を摘出するか、または大きな動物またはヒトのドナー眼を得る。
- 残りの結合組織と外眼筋の地球をきれいにします。視神経を切り取ります。
- ろ紙の上に、マウスの目の縁から約1 mmのオラセラタに沿ってかみそりの刃で小さな切開を慎重に置きます。細かいバンナはさみを切開部に挿入し、縁に沿って切断して、レンズで目の前部を取り除きます。
- アイカップをエイムズの培地が入った皿に移します。網膜に触れないように注意しながら、細かい鉗子で強膜をつかみます。網膜と強膜の間にバナハサミを挿入し、強膜を末梢から中央部に向かって切断します。網膜に触れたり損傷したりしないように注意してください。
- 切開片の片側をバナハサミで解剖皿の底に当てて強膜を固定します。切開部の反対側の鉗子で強膜をつかみます。切開部の両側の強膜を引き離すことで網膜に触れたり損傷したりすることなく強膜を取り除き、組織への損傷を最小限に抑えて網膜を分離できるようにします。
- レンズ付きの前部を仲間の目から取り除き、5%の二酸化炭素と95%の酸素で泡立てたエイムズの溶液に室温でアイカップを保管します。
注:この方法で保存された目からの機能的な光応答は、数時間得ることができます。 - ヒトドナーの目を含む大きな目では、マウスの目について説明した手順と同様に、残りの結合組織の地球をきれいにし、前部セグメントと水晶体を取り除きます。メスを使用して、リムバスから約3 mmの切り込みを入れます。湾曲した解剖ハサミを切開部に挿入し、辺縁に沿って切断してレンズで目の前部を取り除きます。3〜6mmの使い捨て生検パンチを使用して、 ex vivo 網膜電図用の網膜標本を入手します。
5.試験片ホルダーへの組織取り付け
- 検体ホルダーの下半分を大きなペトリ皿に入れ、酸素化されたエイムズ培地を充填して、検体ホルダーのドームがちょうど水没するようにします。
- 細かい鉗子で網膜の端を注意深くつかみ、網膜を ex vivo 標本ホルダーのドームに移し、感光体側を上に向けています。
- 標本ホルダーをエイムズの溶液から持ち上げ、網膜が所定の位置に留まるようにします。
- 試料ホルダーのプレートを完全に乾燥させて、ノイズ、電気的クロストーク、信号シャントを最小限に抑えます。
- 試料ホルダーの両半分を4本のネジで組み立て、灌流ラインを接続します。試料ホルダーの下半分の電極を乾燥させ、アノードケーブルを網膜内側に、カソードケーブルを感光体側に接続します。
- 検体ホルダーに少なくとも1 mL/分の酸素化エイムズ培地を10〜20分間灌流して、光応答が安定するまで待ちます。
6. 網膜神経細胞機能の記録
- 網膜を強度が増す光の閃光にさらすことによって、応答ファミリーを記録します。例えば、約10〜1,000光子/μm 2の範囲の光強度を持つマウスロッド光受容体応答ファミリーと、約0.6〜20光子/μm2の範囲の光強度を持つマウスONバイポーラ細胞からの応答ファミリーを記録します。
- ミュラーグリア細胞のカリウムチャネルをブロックする100 μMの塩化バリウムと、ONバイポーラ細胞へのグルタミン酸作動性シグナル伝達をブロックする40 μM DL-AP4の存在下で、光受容体の光応答(a波)を測定します(図2B)。
- ONバイポーラ細胞の機能に由来するb波を単離するには、まず、塩化バリウムのみの存在下で、視細胞とONバイポーラ細胞の両方からの複合光応答を記録します(図2A)。次に、塩化バリウムとDL-AP4を含むエイムズ培地で5〜10分間灌流し、以前と同じ光刺激に対する光受容体応答を記録します(図2B)。光受容体とONバイポーラ細胞の応答の組み合わせから光受容体応答を差し引き、ONバイポーラ細胞の光応答のみを計算します(図2C)。
7. ONバイポーラ細胞機能の最適化
注:ONバイポーラ細胞に由来するb波は、検体ホルダー内の温度と灌流速度に非常に敏感です。
- b波を得るために、少なくとも0.5mL / minの灌流速度を維持します。
注:ONバイポーラ細胞からの大きく安定した応答を維持するためには、1〜2 mL / minのより高い灌流速度が好ましいです。 - 所定の灌流速度に対して、網膜近くの検体ホルダーの温度が体温に近いことを確認してください(つまり、約35〜38°C)。
注:重要です ex vivo ERG検体ホルダーに到達する前に加熱される灌流液の温度を調整して、網膜の最適な温度範囲内に収まるようにします。 - 後の実験のためにアイカップを光から保護し、室温で酸素化されたエイムズ培地に保管して、通常のa波とb波を数時間維持します。
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Representative Results
エクスビボERGは、例えばマウス網膜からの再現性のある安定した光受容体およびONバイポーラ細胞の光応答の記録を可能にします(図2A-C)。ヒトドナー網膜からの光受容体応答の記録は、死後最大5時間の除核遅延(図2D)およびONバイポーラ細胞応答の記録が<20分の除核遅延(図2E)で可能です。大きな応答を得るための重要なパラメータには、慎重な解剖技術、高い灌流速度、および生理学的値に近い灌流温度(哺乳類網膜では35〜38°C)が含まれます。これらの条件下では、両方の細胞タイプの応答振幅と動態は時間の経過とともに比較的安定していましたが、網膜が標本ホルダーに取り付けられてから約40〜45分後にゆっくりと減少しました(図3)。
光受容体と比較して、ONバイポーラ細胞の機能は、例えば、解剖および取り付け中の網膜の損傷、または温度および/または灌流速度の低下によって、より容易に破壊される。試料ホルダーの温度を下げると、視細胞とONバイポーラ細胞の両方の動態が大幅に遅くなりましたが、b波の振幅は減少しましたが、a波の振幅は減少しませんでした(図4A)。逆に、灌流速度を2.1 mL/minから0.6 mL/minに減速すると、視細胞応答とONバイポーラ細胞応答の両方の振幅が減少しましたが、a波またはb波の暗黙の時間(刺激開始から応答ピークまでの時間)には影響しませんでした(図4B)。灌流を10分間停止した後、再灌流すると、光受容体応答が保存されたONバイポーラ細胞機能が完全に失われました(図5)。
図1:生体外網膜電図標本ホルダーと記録セットアップ。 (A、B) ex vivo ERG検体ホルダーは、孤立した網膜を取り付けるためのドームで構成され、灌流ラインに接続されてエイムズ培地を継続的に送達します。電極は、狭いチャネルを介して、灌流線を介して網膜の感光体側と、ドームに接着された濾紙を介して網膜の内側の両方に接続されます。これらの電極は差動増幅器に接続されており、光刺激に応答して網膜の電位差を測定することができます。(C)試料ホルダーは、光の閃光を照射するように改造された顕微鏡のステージに配置され、重力によって加熱され、酸素化されたエイムズ培地を供給する灌流ラインに接続されています。録音セットアップ全体は、電気的ノイズを最小限に抑えるためにファラデーケージによってシールドされています。この数値は 9 から変更されました。略称:ERG =網膜電図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ex vivo光受容体とONバイポーラ細胞応答の痕跡の例。灌流液への薬理学的物質の添加は、ex vivo網膜電図に対する個々の網膜細胞型からの寄与の定量化を可能にする。光受容体(PR)光応答は、ミュラーグリア細胞によって発現されるK+チャネルの遮断薬である100 μM塩化バリウム(BaCl2)と、光受容体からONバイポーラ細胞へのシグナル伝達を阻害するグルタミン酸受容体遮断薬である40 μM DL-AP4の存在下で単離されます(B)。ON双極細胞(ON-BPC)機能(C)は、塩化バリウム単独存在下でのON双極細胞応答と合わせた感光体から感光体成分(B)を差し引くことによって決定される(A)。光受容体光応答は、死から核出までの遅延が<5時間(D)のヒトドナー網膜から得ることができるのに対し、死後20分以内に摘出された網膜は、しばしばONバイポーラ細胞応答(E)も与える(詳細については8を参照)。図 2A-C は 9 から変更されています。略語:PR =光受容体;オン-BPC = オンバイポーラセル。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3: ex vivo 網膜電図における光受容体とONバイポーラ細胞機能の経時的な安定性 。 (A)光応答は、100 μM塩化バリウムと40 μM DL-AP4の両方の存在下で、光受容体のみから毎分記録されました。(B)100 μM塩化バリウム単独存在下での薄暗い光フラッシュは、小さな感光体成分を含んでいますが、ONバイポーラ細胞機能によって大きく支配されています。単離された網膜からの光応答は、通常、 ex vivo 標本ホルダーを15〜20分間灌流した後に安定し、低下し始める前に少なくとも20〜25分間安定していました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:異なる温度と灌流速度での光受容体とONバイポーラ細胞の組み合わせ応答 。 (A)試料ホルダー内の温度を37°Cから室温に下げると、視細胞とONバイポーラ細胞の動態が大幅に遅くなりましたが、混合感光体とONバイポーラ細胞の応答におけるONバイポーラ細胞の振幅は減少しただけでした。(B)灌流速度を2.1 mL/minから0.6 mL/minに低下させたところ、視細胞とONバイポーラ細胞の振幅は減少しましたが、応答速度に変化はありませんでした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ONバイポーラ細胞応答は、灌流の停止に対してより敏感です 。 (A)2.1 mL/minで20分間灌流した後、大きな光受容体およびONバイポーラ細胞応答が記録されました。 (B)灌流を10分間停止した後、2.1 mL/minで10分間再灌流した後、光受容体応答が存在しましたが、ONバイポーラ細胞の応答は完全に失われました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
もともとは両生類の網膜10からの網膜光応答を測定するためにホルムグレンによって1865年に開発されましたが、当初は技術的な制約によりERGは広く使用されていませんでした。それにもかかわらず、Ragnar Granitらによる独創的な研究は、ERGの細胞起源を特定し、ex vivoで光受容体およびONバイポーラ細胞応答を測定した11,12,13。それ以来、洗練された方法により、ex vivo ERG記録のより広範な使用が可能になりました14,15が、応答振幅、特にONバイポーラ細胞からの応答振幅は比較的小さいままでした16。これらの制限を克服するために、網膜機能は、実験上の制約や記録された波形のより複雑な解釈にもかかわらず、今日、in vivo ERGでより一般的に測定されています。ex vivo ERGは生理学的状態を可能な限り忠実に再現しようとしますが、それでも人工環境および全身因子および病理学的変化がない場合に網膜機能を測定します。しかし、in vivo ERGと組み合わせると、この制限は、疾患における網膜機能の変化が網膜細胞に固有のものであるか、全身性変化によって引き起こされるかなどの重要な質問に答えるために使用することができる17。
最近、新しく設計されたex vivo ERG検体ホルダーにより、方法論が簡素化され、ex vivo ERGがより広範な研究コミュニティにアクセスできるようになりました2,3,5,18。このプロトコルに記載されている既存のパッチクランプまたは多電極アレイ装置を変更することで、より多くのラボが最小限の財政投資とスペース要件でex vivo ERGを実行できるようになります。特に、ex vivo ERG技術の最近の開発により、哺乳類の単離された網膜の応答性が増幅され、優れたS/N比が得られ、このプロトコルに記載されている追加の増幅ステップにもかかわらず良好なままです。それにもかかわらず、主にONバイポーラ細胞からの光応答の低下19は、おそらくex vivo ERGのより広範な使用を妨げている。エイムズ培地またはロック培地の使用は、より大きな光受容体およびONバイポーラ細胞応答をもたらし、例えば、ex vivo ERG3用のHEPES緩衝リンガー溶液よりも好ましいものになる。他の研究所は、グルタミンまたはグルタミン酸19を補給することによってex vivo ON-バイポーラ細胞機能を安定化させた。この報告は、以前に報告されたように、ヒトドナーの目を含む単離された網膜から大きく安定した光応答を得る方法を示しています8。
重要な実験パラメータには、生理学的範囲内に保たれるべき網膜の温度、および急速な灌流速度が含まれる。 ex vivo ERG検体ホルダーの温度を下げることの最も顕著な効果は、視細胞とONバイポーラ細胞の両方での応答速度論の鈍化と、ONバイポーラ細胞の振幅の減衰です。温度を下げることは、光受容体とONバイポーラ細胞からの複合応答における光受容体振幅にほとんど影響を与えないように見えるが、これは両方の細胞型からの応答速度論の異なる変化によるアーティファクトである可能性がある。
十分な灌流速度は網膜機能にとって特に重要であるように思われ、酸素と栄養素を供給し、老廃物を除去する可能性が最も高いです。視細胞とONバイポーラ細胞の振幅は、灌流速度の適度な低下によっていくらか減少しますが、灌流の短い停止でさえ、ONバイポーラは消失しましたが、光受容体機能は消失しませんでした。これは、光受容体応答がより堅牢であり、ヒトドナーの目8など、大幅な遅延を伴う実験を受ける眼においてより容易に保存され得ることを意味する。これに関連して、ONバイポーラ細胞の機能が、アイカップを酸素化エイムズ培地に数時間保存することによって低下しないことは注目に値する。したがって、ex vivo 検体ホルダーでの灌流が停止した場合のONバイポーラ細胞機能の喪失は、検体ホルダー内の網膜周囲の少量の酸素やその他の栄養素の急速な枯渇による可能性があると仮定します。これは、死から除核までの短い遅延が光受容体、特にヒト網膜からのONバイポーラ細胞応答を記録するために重要であり、死後低酸素症が網膜神経機能への不可逆的損傷の最も可能性の高い候補であるという報告によって裏付けられています8。 ex vivo ERGの実験パラメータはマウス網膜で最適化されましたが、それでも大型動物やヒトドナーの目からの網膜標本の記録条件を改善することに成功しました。
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Disclosures
著者の誰も開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、National Eye Instituteの助成金EY02665およびEY031706、およびInternational Retinal Research FoundationからVinberg博士へのNational Institutes of Health Core Grant(EY014800)、およびニューヨーク州ニューヨークのユタ大学眼科・視覚科学部へのResearch to Prevention Blindnessからの無制限助成金の支援を受けた。フランス・ヴィンバーグ博士は、失明予防研究/H.ジェームズ博士とキャロルフリーキャリア開発賞、およびARVO EyeFind助成金のシルケベッカー博士の受賞者でもあります。図2Eに示す記録に使用されるドナーアイを提供してくれたスクリップス研究所のアン・ハンネケン博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
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