Summary
Mevcut multielektrot dizisinin veya yama kelepçesi ekipmanının modifikasyonu, ex vivo elektroretinogramı daha yaygın olarak erişilebilir hale getirir. Exvivo ışık yanıtlarını kaydetmek ve sürdürmek için geliştirilmiş yöntemler, sağlıklı retinada, göz hastalıklarının hayvan modellerinde ve insan donör retinalarında fotoreseptör ve ON-bipolar hücre fonksiyonunun incelenmesini kolaylaştırır.
Abstract
Retinal nöronal ışık yanıtlarının ölçümleri, sağlıklı retinanın fizyolojisinin araştırılması, retina hastalıklarında patolojik değişikliklerin belirlenmesi ve terapötik müdahalelerin test edilmesi için kritik öneme sahiptir. Exvivo elektroretinogram (ERG), spesifik farmakolojik ajanların eklenmesi ve sistemik etkilerden bağımsız olarak doku-intrinsik değişikliklerin değerlendirilmesi yoluyla izole retinadaki bireysel hücre tiplerinin katkılarının ölçülmesine olanak tanır. Retinal ışık tepkileri, mevcut yama kelepçesi veya mikroelektrot dizisi ekipmanından modifiye edilmiş özel bir ex vivo ERG numune tutucu ve kayıt kurulumu kullanılarak ölçülebilir. Özellikle, ON-bipolar hücrelerin ve aynı zamanda fotoreseptörlerin incelenmesi, zaman içinde ex vivo ERG'deki ışık tepkilerinin yavaş ama ilerleyici düşüşü ile engellenmiştir. Artan perfüzyon hızı ve perfüzyon sıcaklığının ayarlanması, ex vivo retinal fonksiyonu iyileştirir ve yanıt genliğini ve stabilitesini en üst düzeye çıkarır. Exvivo ERG, bireysel retinal nöronal hücre tiplerinin incelenmesine benzersiz bir şekilde izin verir. Ek olarak, yanıt genliklerini ve stabilitesini en üst düzeye çıkarmaya yönelik iyileştirmeler, büyük hayvanlardan ve insan donör gözlerinden alınan retina örneklerinde ışık yanıtlarının araştırılmasına izin vererek, ex vivo ERG'yi retina fonksiyonunu araştırmak için kullanılan tekniklerin repertuarına değerli bir katkı sağlar.
Introduction
Elektroretinografi, ışığa yanıt olarak retina fonksiyonunu ölçer1. Retina fizyolojisi ve patofizyolojisini incelemek ve retina hastalıkları için tedavilerin başarısını ölçmek için ayrılmaz bir bütündür. İn vivo ERG, bozulmamış organizmalarda retina fonksiyonunu değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır, ancak önemli sınırlamaları vardır 2,3. Bunlar arasında, in vivo ERG'deki bireysel retinal hücre tiplerinin kantitatif analizi, tüm retinal hücrelerden ışık uyaranlarına kadar potansiyel değişikliklerin toplamını ve dolayısıyla üst üste binen tepkileri kaydettiği için engellenmektedir4. Ayrıca, retinaya ilaç eklenmesine kolayca izin vermez, sistemik etkilere karşı savunmasızdır ve nispeten düşük bir sinyal-gürültü oranına sahiptir. Bu dezavantajlar, izole retina 2,3,5,6'nın işlevini araştıran ex vivo ERG'de ortadan kaldırılmıştır. Exvivo ERG, farmakolojik inhibitörlerin eklenmesi ve süperfüzyona eklenebilen terapötik ajanların kolay değerlendirilmesi ile spesifik retinal hücre tiplerinden büyük ve stabil yanıtların kaydedilmesini sağlar. Aynı zamanda, sistemik etkilerin etkilerini ortadan kaldırır ve fizyolojik gürültüyü (örneğin, kalp atışı veya solunum) ortadan kaldırır.
Ex vivo ERG'de, retinalar veya retinal örnekler izole edilir ve numune tutucu 3,5'in kubbesi üzerinde fotoreseptör tarafı yukarı doğru monte edilir. Numune tutucu monte edilir, retinaya ısıtılmış, oksijenli ortam sağlayan bir perfüzyon sistemine bağlanır ve bilgisayar kontrollü ışık uyaranları vermek için modifiye edilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirilir. Işığın ortaya çıkardığı tepkileri kaydetmek için, numune tutucu bir amplifikatöre, sayısallaştırıcıya ve kayıt sistemine bağlanır (Şekil 1). Bu teknik, ışık uyaranlarının parametrelerini değiştirerek ve farmakolojik ajanlar ekleyerek çubuk ve koni fotoreseptörlerinden, ON-bipolar hücrelerden ve Müller glia'dan gelen yanıtların izole edilmesini sağlar.
Mevcut bir yama kelepçesi veya çoklu elektrot dizisi (MEA) kurulumu, fareler gibi küçük hayvan modellerinden retinalardaki ışık tepkilerini ölçmek için piyasada satılan bir ex vivo ERG adaptörü veya özel bir polikarbonat bilgisayar sayısal kontrol (CNC) ile işlenmiş numune tutucu ile birlikte ex vivo ERG'yi kaydetmek için dönüştürülebilir. Bu değişiklik, ex vivo ERG'nin erişilebilirliğini artırırken, özel ekipman ihtiyacını en aza indirir. Numune tutucunun tasarımı, montaj tekniğini basitleştirir ve elektrotları entegre ederek, daha önce bildirilen transretinal ex vivo ERG yöntemlerine kıyasla mikroelektrotların manipülasyon ihtiyacını ortadan kaldırır7. Numune tutucunun içindeki perfüzyon hızı ve sıcaklık, fotoreseptörlerden ve ON-bipolar hücrelerden gelen yanıt özelliklerini etkileyen önemli faktörlerdir. Bu koşulları ayarlayarak, ex vivo ERG, izole fare retinasından uzun süre boyunca güvenilir bir şekilde kaydedilebilir. Optimize edilmiş deneysel koşullar, büyük hayvan gözleri ve insan donör gözleri de dahil olmak üzere daha büyük retinalardan retinal yumruklarda ex vivo ERG kayıtlarına izin verir8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fareleri kullanan tüm deneyler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzuna uygun olarak gerçekleştirildi ve Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Çalışmaları Komitesi tarafından onaylandı. Bu videonun gösterimi için domuz gözleri, mezbahadan (Sürdürülebilir Domuz Kaynakları, Johnsonville) ölüm sonrası elde edildi. Gözler, FDA, Organ Satın Alma Kuruluşları Birliği (AOPO) ve Amerika Göz Bankaları Birliği tarafından tamamen akredite edilmiş olan Utah Lions Göz Bankası, San Diego Göz Bankası veya Lifesharing aracılığıyla araştırma kullanımı için rıza ile beyin veya kardiyak ölümden sonra insan bağışçılarından elde edildi. İnsan donör gözlerinin kullanımı Utah Üniversitesi'nde (IRB no. 00106658) ve ScrippsHealth IRB'de (IRB no. 16-6781) muaf statüye sahipti.
1. ex vivo ERG'nin kurulması
- Bir çoklu elektrot dizisi kurulumunu dönüştürmek için, ex vivo ERG numune tutucuyu bir kafa aşaması aracılığıyla , çok elektrot dizi sisteminin arayüz kartının analog girişine takılı olan bir diferansiyel amplifikatöre bağlayın. ex vivo ERG'den giriş verilerini kaydetmek ve depolamak için multielektrot dizisinin kayıt yazılımını kullanın. Diferansiyel amplifikatörün kazancını 100'e ayarlayın ve sayısallaştırıcı özelliklerine bağlı olarak ek bir 10x voltaj amplifikasyonu ekleyin. Alçak geçirgen filtresini 100 Hz'ye ayarlayın.
- Bir yama kelepçesi kurulumunu dönüştürmek için, ex vivo ERG numune tutucuyu bir baş kademe üzerinden, yama kelepçeli amplifikatörün baş aşamasına bağlı bir diferansiyel amplifikatöre bağlayın. ex vivo ERG'den giriş verilerini kaydetmek ve depolamak için yama kelepçe sistemi yazılımını ve sayısallaştırıcıyı kullanın. Diferansiyel amplifikatörün kazancını 100'e ayarlayın ve yama kelepçesi kafa aşaması aracılığıyla ek bir 10x voltaj amplifikasyonu uygulayın. Alçak geçirgen filtresini 100 Hz'ye ayarlayın.
- LED'leri uygun dalga boylarına (örneğin, çubuk fotoreseptör ve ON-bipolar hücre tepkilerini ortaya çıkarmak için yaklaşık 530 nm) mikroskopa bağlayın. Işık uyaranlarının tetiklenmesini sağlayan kayıt yazılımı ile LED'leri kontrol edin. Işık uyaranlarını kontrol etmek için, bir sayısallaştırıcıdan analog çıkışlarla kontrol edilen bir LED sürücü kullanın.
- LED'lerin ışık çıkışını numune tutucudaki retina konumunda bir fotodiyot kullanarak kalibre edin. Gerekirse, ışık yoğunluğunu azaltmak için ışık yoluna nötr yoğunluk filtreleri yerleştirin.
- Ticari olarak temin edilebilen veya özel yapım bir ex vivo ERG numune tutucu kullanın.
NOT: Polikarbonattan CNC işleme için çizimler talep üzerine yazarlardan temin edilebilir. - Elektrodu hazırlamak için, dişli bir luer konektörüne bir Ag/AgCl pelet elektrodu yerleştirin. Luer konektörünün içini sıcak tutkalla doldurun ve dişli olmayan taraftan sıcak tutkalın içine 2 mm'lik bir soket takın. EP1 elektrodunun gümüş telini 2 mm sokete lehimleyin. Bitmiş elektrodu, diş üzerinde bir o-ring ile, ex vivo ERG numune tutucusunun elektrot portlarına vidalayın.
NOT: Elektrotlar uzun süre kullanılabilir. Pelet yüzeyi kir biriktirirse ve / veya kararırsa (bu, yüksek ofset voltajına ve / veya elektriksel sürüklenmeye neden olabilir), ince zımpara kağıdı kullanılarak "cilalanabilir". - Deneyden en az 1 gün önce, epoksi yapıştırıcı kullanarak ex vivo ERG numune tutucusunun kubbelerine yapıştırıcı filtre kağıtları yapıştırın ve tutkalın elektrot kanalını engellememesini sağlayın ( video için 3'e bakınız).
2. Hayvan hazırlığı
- Karanlık, hayvanları en az 6 saat veya bir gecede uyarlar.
3. Ekipman hazırlığı
- Ex vivo ERG'nin perfüzyon hattını, Ames'in %5 karbondioksit ve %95 oksijen ile kabarcıklı orta kısmı ile doldurun. Ames'in ortamını ısıtmak için perfüzyon hattını bir DC akım kaynağı veya numune tutucunun yakınındaki bir ısı kontrolörü ile bir ısıtma elemanına bağlayın, böylece retina yaklaşık 35-38 ° C'de tutulur.
- Ex vivo ERG numune tutucunun her iki yarısını da elektrot çözeltisiyle doldurun, perfüzyon hattını luer tıpalarla kapatın, elektrotları bağlayın ve numune tutucuyu dört vidayla monte edin (video için 3'e bakın).
- Multimetrenin problarını elektrotlara yerleştirerek monte edilmiş numune tutucudaki elektrotlar arasındaki direnci ve ofset voltajını kontrol edin.
NOT: Tıkanıklık yoksa ve elektrotlar iyi durumdaysa, direnç 100 kΩ'un altında ve ofset voltajı 5 mV'nin altında olmalıdır. - Birleştirilmiş numune tutucuyu perfüzyon hattına bağlayın ve ışık yanıp sönmeleri sağlamak için kurulmuş bir mikroskop sahnesine yerleştirin. Numune tutucunun ve perfüzyon hattının herhangi bir hava kabarcığı içermediğinden emin olun.
4. Doku hazırlığı
- Hayvanı CO2 ile kurban edin ve hemen gözleri enüklee edin veya büyük hayvan veya insan donör gözleri elde edin.
- Kalan bağ dokusunun ve ekstraoküler kasların küresini temizleyin. Optik siniri kesin.
- Filtre kağıdı üzerine, fare gözündeki limbustan yaklaşık 1 mm uzakta, ora serrata boyunca jilet bıçağı ile küçük bir kesiyi dikkatlice yerleştirin. İnce vannas makaslarını kesiye yerleştirin ve gözün ön kısmını lensle çıkarmak için limbüs boyunca kesin.
- Göz kapağını Ames'in ortamını içeren bir kaba taşıyın. Sklerayı ince forsepslerle kavrayın, retinaya dokunmamaya dikkat edin. Vannas makasını retina ve sklera arasına yerleştirin ve sklerayı periferikten orta kısma doğru kesin. Retinaya dokunmamaya veya zarar vermemeye dikkat edin.
- Vannas makası ile insizyonun bir tarafını diseksiyon kabının dibine doğru tutarak sklerayı hareketsiz hale getirin. Sklerayı insizyonun diğer tarafındaki forseps ile kavrayın. Retinanın dokuya en az zarar vererek izolasyonuna izin vermek için insizyonun her iki tarafındaki sklerayı ayırarak retinaya dokunmadan veya zarar vermeden sklerayı çıkarın.
- Ön segmenti lensle diğer gözden çıkarın ve vizör adaptörünü% 5 karbondioksit ve% 95 oksijen ile kabarcıklanmış Ames çözeltisinde oda sıcaklığında saklayın.
NOT: Bu şekilde saklanan gözlerden fonksiyonel ışık tepkileri birkaç saat boyunca elde edilebilir. - İnsan donör gözleri de dahil olmak üzere büyük gözlerde, kalan bağ dokusunun küresini temizleyin ve fare gözü için açıklanan prosedüre benzer şekilde ön segmenti ve lensi çıkarın. Limbustan yaklaşık 3 mm kesim yapmak için bir neşter kullanın. Kavisli diseksiyon makasını kesiye yerleştirin ve gözün ön kısmını lensle çıkarmak için limbüs boyunca kesin. 3-6 mm tek kullanımlık biyopsi punch ile ex vivo elektroretinografi için retina örnekleri alın.
5. Mendilin numune tutucuya monte edilmesi
- Numune tutucunun alt yarısını büyük bir Petri kabına yerleştirin ve oksijenli Ames ortamı ile doldurun, böylece numune tutucunun kubbesi sadece suya batırılır.
- Retinanın kenarını ince forsepslerle dikkatlice kavrayın ve retinayı ex vivo numune tutucunun kubbesi, fotoreseptör tarafı yukarı bakacak şekilde aktarın.
- Numune tutucuyu Ames çözeltisinden kaldırın ve retinanın yerinde kalmasına dikkat edin.
- Gürültüyü, elektriksel çapraz konuşmayı ve sinyal şöntünü en aza indirmek için numune tutucunun plakasını tamamen kurulayın.
- Numune tutucunun her iki yarısını da dört vidayla birleştirin ve perfüzyon hattını bağlayın. Elektrodu numune tutucunun alt yarısında kurutun ve anot kablosunu iç retinal tarafa ve katot kablosunu fotoreseptör tarafına bağlayın.
- Işık tepkilerinin stabilize olması için zaman tanımak için numune tutucuyu en az 1 mL / dak oksijenli Ames ortamı ile 10-20 dakika boyunca perfüze edin.
6. Retinal nöronal hücre fonksiyonunun kaydedilmesi
- Retinayı artan yoğunluktaki ışık yanıp sönmelerine maruz bırakarak yanıt ailelerini kaydedin. Örneğin, yaklaşık 10 ila 1.000 foton / μm 2 arasında değişen ışık yoğunluklarına sahip fare çubuğu fotoreseptör yanıt ailelerini ve yaklaşık 0.6 ila20 foton / μm2 arasında değişen ışık yoğunluklarına sahip fare ON-bipolar hücrelerinden olanları kaydedin.
- Müller glial hücrelerinde potasyum kanallarını bloke eden 100 μM baryum klorür varlığında fotoreseptör ışık tepkilerini (a-dalga) ve ON-bipolar hücrelere glutamaterjik sinyal iletimini engelleyen 40 μM DL-AP4 varlığında ölçün (Şekil 2B).
- ON-bipolar hücrelerin işlevinden kaynaklanan b-dalgasını izole etmek için, önce hem fotoreseptör hem de ON-bipolar hücrelerden gelen kombine ışık tepkilerini tek başına baryum klorür varlığında kaydedin (Şekil 2A). Daha sonra, Ames'in baryum klorür içeren ortamı ve DL-AP4 ile 5-10 dakika perfüze edin ve daha önce olduğu gibi aynı ışık uyaranlarına fotoreseptör tepkilerini kaydedin (Şekil 2B). Fotoreseptör yanıtlarını kombine fotoreseptör ve ON-bipolar hücre yanıtlarından çıkarın, böylece tek başına ON-bipolar hücre ışık tepkilerini hesaplayın (Şekil 2C).
7. ON-bipolar hücre fonksiyonunu optimize etme
NOT: ON-bipolar hücrelerden kaynaklanan b-dalgası, numune tutucudaki sıcaklığa ve perfüzyon hızına karşı oldukça hassastır.
- B dalgasını elde etmek için en az 0,5 mL / dak'lık bir perfüzyon hızını koruyun.
NOT: ON-bipolar hücrelerden büyük ve kararlı bir yanıt sağlamak için 1-2 mL / dak'lık daha yüksek bir perfüzyon hızı tercih edilir. - Belirli bir perfüzyon hızı için, retinanın yakınındaki numune tutucudaki sıcaklığın vücut sıcaklığına yakın olduğundan emin olun (yani, yaklaşık 35-38 ° C).
NOT: Ex vivo ERG numune tutucusuna ulaşmadan önce ısıtılan perfüzyonun sıcaklığını, retinada optimum sıcaklık aralığında olacak şekilde ayarlamak önemlidir. - Daha sonraki deneyler için göz kapaklarını ışıktan korunmuş olarak saklayın ve birkaç saat boyunca normal a ve b dalgalarını korumak için oda sıcaklığında oksijenli Ames'in ortamında saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ex vivo ERG, örneğin fare retinasından tekrarlanabilir ve kararlı fotoreseptör ve ON-bipolar hücre ışık tepkilerinin kaydedilmesini sağlar (Şekil 2A-C). İnsan donör retinalarından fotoreseptör yanıtlarının kaydedilmesi, enükleasyonun 5 saate kadar postmortem gecikmesi (Şekil 2D) ve <20 dakika enükleasyon gecikmesi ile ON-bipolar hücre yanıtları ile mümkündür (Şekil 2E). Büyük yanıtlar elde etmek için önemli parametreler arasında dikkatli bir diseksiyon tekniği, yüksek perfüzyon hızı ve fizyolojik değerlere yakın perfüzyon sıcaklığı (memeli retinasında 35-38 ° C) bulunur. Bu koşullar altında, her iki hücre tipinde yanıt genlikleri ve kinetiği zamanla nispeten kararlıydı, ancak retinalar örnek tutucuya monte edildikten yaklaşık 40-45 dakika sonra yavaşça azaldı (Şekil 3).
Fotoreseptörlerle karşılaştırıldığında, ON-bipolar hücre fonksiyonu, örneğin diseksiyon ve montaj sırasında retinaya zarar vererek veya sıcaklık ve / veya perfüzyon hızında bir düşüş ile daha kolay bozulur. Numune tutucudaki düşük sıcaklık, hem fotoreseptörlerin hem de ON-bipolar hücrelerin kinetiğini büyük ölçüde yavaşlatırken, b-dalgasının genliğini azalttı, ancak a-dalgasını azaltmadı (Şekil 4A). Tersine, perfüzyon hızını 2.1 mL / dak'dan 0.6 mL / dak'ya düşürmek, hem fotoreseptör hem de ON-bipolar hücre yanıtlarının genliklerini azalttı, ancak a- veya b-dalgasının örtük zamanını (uyaran başlangıcından yanıt zirvesine kadar geçen süre) etkilemedi (Şekil 4B). Perfüzyonun 10 dakika boyunca kesilmesi ve ardından reperfüzyon, korunmuş fotoreseptör yanıtları ile ON-bipolar hücre fonksiyonunun tamamen kaybedilmesine neden olmuştur (Şekil 5).
Şekil 1: Ex vivo elektroretinogram numune tutucu ve kayıt kurulumu . (A,B) Ex vivo ERG numune tutucu, Ames'in ortamını sürekli olarak iletmek için bir perfüzyon hattına bağlanan izole retinayı monte etmek için bir kubbe içerir. Elektrotlar, dar kanallar aracılığıyla retinanın hem fotoreseptör tarafına perfüzyon hattı aracılığıyla hem de kubbeye yapıştırılmış filtre kağıdı aracılığıyla iç retinaya bağlanır. Bu elektrotlar, ışık uyaranlarına yanıt olarak retinadaki potansiyel farklılıkların ölçülmesini sağlayan bir diferansiyel amplifikatöre bağlanır. (C) Örnek tutucu, ışık yanıp sönmeleri vermek için modifiye edilmiş ve ısıtılmış, oksijenli Ames ortamını yerçekimi ile ileten perfüzyon hattına bağlanmış bir mikroskop sahnesine yerleştirilir. Tüm kayıt kurulumu, elektrik gürültüsünü en aza indirmek için bir Faraday kafesi ile korunmaktadır. Bu rakam 9'dan değiştirilmiştir. Kısaltma: ERG = elektroretinogram. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Örnek ex vivo fotoreseptör ve ON-bipolar hücre yanıtlarının izleri. Perfüzyonata farmakolojik ajanların eklenmesi, bireysel retinal hücre tiplerinden ex vivo elektroretinograma katkıların ölçülmesini sağlar. Fotoreseptör (PR) ışık tepkileri, Müller glial hücreler tarafından eksprese edilen K + kanallarının bir blokeri olan 100 μM baryum klorür (BaCl2) ve ayrıca fotoreseptörlerden ON-bipolar hücrelere (B) sinyal iletimini engelleyen bir glutamat reseptör blokeri olan 40 μM DL-AP4 varlığında izole edilir. ON-bipolar hücre (ON-BPC) fonksiyonu (C), fotoreseptör bileşeninin (B) kombine fotoreseptörden çıkarılması ve tek başına baryum klorür varlığında ON-bipolar hücre yanıtı (A) ile belirlenir. Fotoreseptör ışık yanıtları, insan donör retinalarından <5 saat (D) enükleasyon gecikmesi ile elde edilebilirken, ölümden 20 dakika sonra enüklee edilen retinalar sıklıkla ON-bipolar hücre yanıtları (E) verir (daha fazla bilgi için bkz. 8). Şekil 2A-C, 9'dan değiştirilmiştir. Kısaltmalar: PR = fotoreseptör; ON-BPC = ON-bipolar hücre. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fotoreseptör ve ON-bipolar hücre fonksiyonunun zaman içinde ex vivo elektroretinogramdaki stabilitesi . (A) Işık tepkileri, hem 100 μM baryum klorür hem de 40 μM DL-AP4 varlığında yalnızca fotoreseptörlerden her dakika kaydedildi. (B) Tek başına 100 μM baryum klorür varlığında loş ışık yanıp söner, küçük bir fotoreseptör bileşeni içermesine rağmen, ON-bipolar hücre fonksiyonu tarafından ağır bir şekilde domine edilir. İzole retinalardan gelen ışık tepkileri tipik olarak ex vivo numune tutucuyu 15-20 dakika perfüze ettikten sonra stabilize olur ve azalmaya başlamadan önce en az 20-25 dakika boyunca stabil kalır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farklı sıcaklıklarda ve perfüzyon hızlarında kombine fotoreseptör ve ON-bipolar hücre yanıtları. (A) Örnek tutucu içindeki sıcaklığın 37 ° C'den oda sıcaklığına düşürülmesi, fotoreseptör ve ON-bipolar hücre kinetiğini büyük ölçüde yavaşlattı, ancak sadece karışık fotoreseptördeki ON-bipolar hücre genliğini ve ON-bipolar hücre yanıtını azalttı. (B) Perfüzyon hızının 2.1 mL / dak'dan 0.6 mL / dak'ya düşürülmesi, fotoreseptör ve ON-bipolar hücre genliklerinin azalmasına neden oldu, ancak yanıt kinetiğinde hiçbir değişiklik olmadı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: ON-bipolar hücre yanıtları perfüzyonun kesilmesine karşı daha duyarlıdır. (A) Perfüzyonu takiben 20 dakika boyunca 2.1 mL/dk ile büyük fotoreseptör ve ON-bipolar hücre yanıtları kaydedildi. (B) Perfüzyonun 10 dakika kesilmesinden sonra 2.1 mL/dk'da 10 dk reperfüzyon yapıldıktan sonra, fotoreseptör yanıtları mevcuttu, oysa ON-bipolar hücre yanıtları tamamen kayboldu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İlk olarak 1865 yılında Holmgren tarafından amfibi retina10'dan retinal ışık tepkilerini ölçmek için geliştirilen teknik kısıtlamalar başlangıçta ERG'nin yaygın olarak kullanılmasını engelledi. Bununla birlikte, Ragnar Granit ve diğerleri tarafından yapılan seminal çalışmalar, ERG'nin hücresel kökenlerini tanımladı ve fotoreseptör ve ON-bipolar hücre yanıtlarını ex vivo 11,12,13 olarak ölçtü. O zamandan beri, rafine yöntemler ex vivo ERG kayıtlarının14,15'in daha yaygın kullanımına izin verdi, ancak yanıt genlikleri, özellikle ON-bipolar hücrelerden gelenler, nispeten küçük kaldı16. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, retina fonksiyonu, deneysel kısıtlamalara ve kaydedilen dalga formlarının daha karmaşık yorumlanmasına rağmen, günümüzde in vivo ERG ile daha yaygın olarak ölçülmektedir. Her ne kadar ex vivo ERG fizyolojik koşulları mümkün olduğunca yakın bir şekilde çoğaltmaya çalışsa da, yine de yapay bir ortamda ve sistemik faktörlerin ve patolojik değişikliklerin yokluğunda retina fonksiyonunu ölçer. Bununla birlikte, in vivo ERG ile kombine edildiğinde, bu sınırlama, hastalıkta retina fonksiyonundaki değişikliklerin retina hücrelerine özgü olup olmadığı veya sistemik değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığı gibi önemli soruları cevaplamak için kullanılabilir17.
Son zamanlarda, yeni tasarlanan ex vivo ERG numune tutucuları metodolojiyi basitleştirerek ex vivo ERG'yi daha geniş bir araştırma topluluğu için erişilebilir hale getirdi 2,3,5,18. Bu protokolde açıklanan mevcut yama kelepçesi veya multielektrot dizisi ekipmanında yapılan değişiklikler, daha fazla laboratuvarın minimum finansal yatırım ve alan gereksinimi ile ex vivo ERG gerçekleştirmesini sağlayacaktır. Özellikle, ex vivo ERG teknolojisindeki son gelişmeler, memeli izole retinalarının duyarlılığını arttırmış ve bu protokolde açıklanan ek amplifikasyon adımlarına rağmen iyi kalan üstün bir sinyal-gürültü oranı ile sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, esas olarak ON-bipolar hücrelerden19'dan gelen ışık tepkilerinin azalması, belki de ex vivo ERG'nin daha yaygın kullanımını engellemiştir. Ames veya Locke'un ortamının kullanılması, daha büyük fotoreseptör ve ON-bipolar hücre yanıtlarıyla sonuçlanır, bu da onları örneğin ex vivo ERG3 için HEPES-tamponlu Ringer çözeltisine tercih edilir hale getirir. Diğer laboratuvarlar, glutamin veya glutamat19 ile takviye edilerek ex vivo ON-bipolar hücre fonksiyonunu stabilize etti. Bu rapor, daha önce bildirildiği gibi, insan donör gözleri de dahil olmak üzere izole retinalardan büyük ve kararlı ışık tepkilerinin nasıl elde edileceğini göstermektedir8.
Önemli deneysel parametreler arasında fizyolojik aralıkta tutulması gereken retinanın sıcaklığı ve hızlı bir perfüzyon oranı bulunur. Ex vivo ERG numune tutucusundaki sıcaklığın düşürülmesinin en belirgin etkileri, hem fotoreseptörlerde hem de ON-bipolar hücrelerde daha yavaş yanıt kinetiği ve zayıflatılmış bir ON-bipolar hücre genliğidir. Sıcaklığın düşürülmesinin, fotoreseptörlerden ve ON-bipolar hücrelerden gelen kombine yanıtta fotoreseptör genliği üzerinde çok az etkisi olduğu görülse de, bu, her iki hücre tipinden gelen yanıt kinetiğindeki diferansiyel değişiklikler nedeniyle bir eser olabilir.
Yeterli bir perfüzyon oranı, retina fonksiyonu için özellikle kritik öneme sahiptir, büyük olasılıkla oksijen ve besin maddeleri sağlar ve atık ürünleri uzaklaştırır. Hem fotoreseptör hem de ON-bipolar hücre genlikleri, perfüzyon oranındaki ılımlı bir azalma ile bir miktar azalırken, perfüzyonun kısa bir süre kesilmesi bile ON-bipolar fonksiyonunu ortadan kaldırdı, ancak fotoreseptör fonksiyonunu ortadan kaldırmadı. Bu, fotoreseptör yanıtlarının daha sağlam olduğu ve insan donör gözleri 8 gibi önemli bir gecikmeyle deneyyapılan gözlerde daha kolay korunabileceği anlamına gelir. Bu bağlamda, ON-bipolar hücre fonksiyonunun, göz kapaklarının oksijenli Ames ortamında birkaç saat boyunca saklanmasıyla azalmadığı dikkat çekicidir. Bu nedenle, ex vivo numune tutucudaki perfüzyon durdurulduğunda ON-bipolar hücre fonksiyonunun kaybının, numune tutucudaki retinayı çevreleyen küçük hacimdeki oksijen ve diğer besin maddelerinin hızlı tükenmesinden kaynaklanabileceğini varsayıyoruz. Bu, ölümden enükleasyona kısa bir gecikmenin, fotoreseptörün ve özellikle insan retinalarından gelen ON-bipolar hücre yanıtlarının kaydedilmesi için kritik öneme sahip olduğu ve postmortem hipoksinin retinal nöronal fonksiyona geri dönüşümsüz hasar için en olası aday olduğu raporları ile desteklenmektedir8. Fare retinasında ex vivo ERG için deneysel parametreler optimize edilirken, yine de büyük hayvanlardan ve insan donör gözlerinden retina örnekleri için kayıt koşullarını başarıyla iyileştirdiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbirinin açıklayacağı herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Göz Enstitüsü'nün Dr. Vinberg'e EY02665 ve EY031706 ve Uluslararası Retinal Araştırma Vakfı, Ulusal Sağlık Enstitüleri Çekirdek Hibe (EY014800) ve New York, NY'daki Körlüğü Önleme Araştırmalarından Utah Üniversitesi Oftalmoloji ve Görsel Bilimler Bölümü'ne Sınırsız Hibe ile desteklenmiştir. Dr. Frans Vinberg ayrıca Körlüğü Önleme Araştırması / Dr. H. James ve Carole Ücretsiz Kariyer Geliştirme Ödülü ve ARVO EyeFind hibesinden Dr. Silke Becker'in de sahibidir. Scripps Araştırma Enstitüsü'nden Dr. Anne Hanneken'e, Şekil 2E'de gösterilen kayıtlar için kullanılan donör gözünü sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mm socket | WPI | 2026-10 | materials to prepare electrode |
| Ag/AgCl Electrode | World Precision Instruments | EP1 | materials to prepare electrode |
| Ames' medium | Sigma Aldrich | A1420 | perfusion media |
| barium chloride | Sigma Aldrich | B0750 | potassium channel blocker |
| DL-AP4 | Tocris | 0101 | broad spectrum glutamatergic antagonist |
| OcuScience Ex Vivo ERG Adapter | OcuScience | n/a | ex vivo ERG specimen holder |
| Threaded luer connector | McMaster-Carr | 51525K222 or 51525K223 | materials to prepare electrode |
References
- Kolb, H., Fernandez, E., Nelson, R. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , (1995).
- Bonezzi, P. J., Tarchick, M. J., Renna, J. M. Ex vivo electroretinograms made easy: performing ERGs using 3D printed components. Journal of Physiology. 598 (21), 4821-4842 (2020).
- Vinberg, F., Kefalov, V. Simultaneous ex vivo functional testing of two retinas by in vivo electroretinogram system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52855 (2015).
- Heckenlively, J. R., Arden, G. B. Principles and Practice of Clinical Electrophysiology of Vision. , MIT Press. (2006).
- Vinberg, F., Kolesnikov, A. V., Kefalov, V. J. Ex vivo ERG analysis of photoreceptors using an in vivo ERG system. Vision Research. 101, 108-117 (2014).
- Winkler, B. S. Calcium and the fast and slow components of P3 of the electroretinogram of the isolated rat retina. Vision Research. 14 (1), 9-15 (1974).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. A dissection of the electroretinogram from the isolated rat retina with microelectrodes and drugs. Visual Neuroscience. 16 (4), 727-741 (1999).
- Abbas, F., et al. Revival of light signalling in the postmortem mouse and human retina. Nature. , (2022).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Diabetic photoreceptors: Mechanisms underlying changes in structure and function. Visual Neuroscience. 37, (2020).
- Kantola, L., Piccolino, M., Wade, N. J. The action of light on the retina: Translation and commentary of Holmgren (1866). Journal of the History of the Neurosciences. 28 (4), 399-415 (2019).
- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161 (3840), 487-489 (1968).
- Hamasaki, D. I. The effect of sodium ion concentration on the electroretinogram of the isolated retina of the frog. Journal of Physiology. 167 (1), 156-168 (1963).
- Granit, R. The components of the retinal action potential in mammals and their relation to the discharge in the optic nerve. Journal of Physiology. 77 (3), 207-239 (1933).
- Donner, K., Hemila, S., Koskelainen, A. Temperature-dependence of rod photoresponses from the aspartate-treated retina of the frog (Rana temporaria). Acta Physiologica Scandinavica. 134 (4), 535-541 (1988).
- Green, D. G., Kapousta-Bruneau, N. V. Electrophysiological properties of a new isolated rat retina preparation. Vision Research. 39 (13), 2165-2177 (1999).
- Luke, M., et al. The isolated perfused bovine retina--a sensitive tool for pharmacological research on retinal function. Brain Research Protocols. 16 (1-3), 27-36 (2005).
- Becker, S., Carroll, L. S., Vinberg, F. Rod phototransduction and light signal transmission during type 2 diabetes. BMJ Open Diabetes Research and Care. 8 (1), 001571 (2020).
- Nymark, S., Haldin, C., Tenhu, H., Koskelainen, A. A new method for measuring free drug concentration: retinal tissue as a biosensor. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (6), 2583-2588 (2006).
- Winkler, B. S., Kapousta-Bruneau, N., Arnold, M. J., Green, D. G. Effects of inhibiting glutamine synthetase and blocking glutamate uptake on b-wave generation in the isolated rat retina. Visual Neuroscience. 16 (2), 345-353 (1999).
