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方法文章

体内 肿瘤来源细胞外囊泡的免疫原性筛选：通过脾脏T细胞流式细胞术分析

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DOI：

10.3791/62811

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2021年9月23日

 ,  , 
1Department of Medicine III, School of Medicine, Technical University of Munich, 2Center for Translational Cancer Research (TranslaTUM), School of Medicine, Technical University of Munich, 3Department of Internal Medicine III, University Hospital Regensburg, 4National Centre for Tumor Diseases WERA

本文内容

摘要

本文描述了如何评估 体内 使用流式细胞术检测肿瘤细胞来源的细胞外囊泡（EVs）的免疫原性。在治疗诱导的免疫原性细胞死亡过程中产生的肿瘤来源EVs似乎在肿瘤免疫监视中具有特别重要的意义。本方案以奥沙利铂诱导的具有免疫刺激作用的肿瘤EVs的评估为例，但可适用于多种不同实验条件。

摘要

由化疗或放疗诱导的肿瘤免疫原性细胞死亡可通过释放损伤相关分子模式并促进Ⅰ型干扰素的产生，从而触发针对肿瘤特异性T细胞的免疫应答。免疫治疗（包括免疫检查点抑制剂）主要依赖于体内已存在的肿瘤特异性T细胞以发挥治疗效应。因此，利用免疫原性细胞死亡作为内源性抗癌疫苗的协同治疗策略，可能提高免疫治疗的应答率。然而，治疗应激条件下肿瘤细胞所释放的免疫原性因子谱仍未能被充分阐明，尤其是关于细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）的研究尚不完善。EVs是几乎所有细胞均可释放的纳米级膜性颗粒，被认为在细胞间通讯中发挥重要作用，并在肿瘤中被证实可介导针对肿瘤抗原的交叉提呈。为了评估不同条件下肿瘤来源EVs的免疫原性效应，亟需建立可适应性强、可扩展且可靠的实验方法。因此，本文介绍了一种相对简便且稳健的方法，用于评估EVs的免疫原性功能。 体内 免疫原性。该方案基于流式细胞术分析脾脏T细胞 体内 使用基于沉淀法从接受治疗或稳态条件下肿瘤细胞培养物中分离出的细胞外囊泡（EVs）对小鼠进行免疫。例如，本研究显示，奥沙利铂处理B16-OVA小鼠黑色素瘤细胞可诱导释放具有免疫原性的EVs，这些EVs能够介导肿瘤反应性细胞毒性T细胞的活化。因此，对EVs进行筛选 通过体内实验 免疫接种与流式细胞术可鉴定出免疫原性细胞外囊泡（EVs）产生的条件。明确免疫原性EV释放的条件，是评估EVs在抗肿瘤治疗中疗效的前提，同时有助于探究其背后的分子机制，从而揭示EVs在肿瘤免疫学中的新作用。

引言

免疫系统在对抗癌症中发挥着关键作用，无论是在免疫检查点抑制剂激发的情况下，还是在传统癌症治疗的疗效中均如此。当肿瘤细胞受到诸如奥沙利铂和多柔比星等化疗药物或电离辐射等基因毒性治疗作用而死亡时，可释放抗原和危险相关分子模式（DAMPs），这些物质有可能启动适应性抗肿瘤免疫反应1在免疫原性细胞死亡的背景下，最主要的损伤相关分子模式（DAMPs）包括趋化性ATP等“找到我”信号、钙网蛋白暴露等“吃掉我”信号（可促进抗原呈递细胞对肿瘤细胞的摄取），以及HMGB1的释放（可激活模式识别受体，从而增强肿瘤抗原的交叉呈递）2此外，I型干扰素（IFN-I）被诱导产生 通过 肿瘤来源的免疫原性核酸或其他刺激物可被树突状细胞感知，从而使其能够有效启动肿瘤特异性的细胞毒性T细胞3,4. 临床上，活化并增殖的 CD8+ 肿瘤浸润性T细胞是多种癌症患者长期生存的独立预后因素。活化的T细胞释放的IFN-γ可直接抑制肿瘤细胞增殖，并促进Th1型极化及细胞毒性T细胞的分化，从而有助于机体对肿瘤的有效免疫监视。5,6奥沙利铂是一种真正的免疫原性细胞死亡诱导剂，可介导针对癌症的适应性免疫反应7然而，肿瘤细胞在治疗诱导的应激条件下释放的大量初始免疫原性信号仍有待全面揭示。尽管癌症免疫治疗已取得显著进展，但将其疗效扩展到更广泛患者群体仍面临挑战。对启动T细胞活化的免疫原性信号进行更深入的理解，可能为新型疗法的开发提供指导。

一组由膜包裹的异质性结构，称为细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs），似乎可作为细胞间通讯的媒介。几乎所有类型的细胞均可释放EVs，其可将功能性蛋白质、RNA、DNA及其他分子传递至受体细胞，或仅通过与细胞表面受体结合而改变细胞的功能状态。EVs所携带的生物活性物质因产生细胞的类型及其功能状态的不同而存在显著差异8在肿瘤免疫学中，肿瘤细胞释放的细胞外囊泡（EVs）主要被视为对免疫治疗不利，因为它们最终会促进侵袭性生长并形成转移前微环境9，并抑制免疫反应10相比之下，一些研究显示，细胞外囊泡可将肿瘤抗原转移至树突状细胞，以实现有效的交叉提呈11,12细胞外囊泡（EVs）若在治疗诱导的应激条件下产生，可能携带免疫刺激性核酸，从而促进抗肿瘤免疫反应13,14对这类RNA和DNA的检测 肿瘤微环境中先天免疫配体已被证明可显著调节对检查点阻断的应答性15,16,17因此，不同治疗诱导的应激条件下肿瘤细胞释放的细胞外囊泡（EVs）的免疫原性作用仍需进一步阐明。由于EVs研究是一个新兴且快速发展的领域，相关方法的标准化仍在进行中。因此，共享知识对于提高EVs与肿瘤免疫学相互作用研究的可重复性至关重要。基于此，本文描述了一种评估肿瘤来源EVs免疫原性效应的简易实验方案。 体内.

通过制备肿瘤来源的细胞外囊泡，用这些囊泡免疫受体小鼠，并分析脾脏T细胞来完成该评估 通过 流式细胞术。为了获得高纯度的细胞外囊泡（EV），理想的做法是将小鼠肿瘤细胞接种于无EV的细胞培养基中进行EV的生成。通过给予细胞特定的应激刺激（如化疗药物处理），可比较治疗诱导产生的EV与其对应肿瘤来源EV在基础免疫原性上的差异。EV的分离可通过多种技术实现，应根据具体情况选择合适的方法。 体内 适用性与本地可获得性。以下方案描述了一种基于沉淀法的外泌体（EV）纯化商品试剂盒检测流程。将上述EV免疫小鼠两次。首次注射后14天，从小鼠脾脏中分离T细胞，并检测其IFN-γ的产生情况。 通过 通过流式细胞术评估系统性免疫反应，可相对简便、快速且高可靠性地评价在不同治疗方案下产生的肿瘤来源EVs诱导抗肿瘤T细胞反应的潜力13因此，该方法适用于在不同条件下对源自癌细胞的细胞外囊泡进行免疫学筛选。

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方案

实验开始时，小鼠至少为6周龄，并在特定病原体阴性条件下饲养。本方案符合机构伦理标准及现行当地法规。动物实验已获当地监管机构（德国慕尼黑上巴伐利亚行政区政府）批准。本研究未探讨可能存在的性别相关偏差。

1. 化疗暴露后肿瘤细胞来源的细胞外囊泡的生成与分离

  1. 在含 L-谷氨酰胺（4 mM）和 D-葡萄糖（4.5 g/L）的 DMEM 培养基中培养表达卵清蛋白的 B16 黑色素瘤细胞（B16-OVA），培养基中添加胎牛血清（FCS，10% v/v）、青霉素（100 Units/mL）和链霉素（100 μg/mL），于 37 °C 培养，直至细胞生长稳定且融合度达到约 90%。
    注意：本实验步骤的全部操作均须在细胞培养罩内无菌条件下进行。对于其他癌症类型的分析，优先选用表达强效抗原的细胞系，以评估抗原特异性的T细胞应答，因为此类细胞系可实现特异性 离体 抗原再刺激
  2. 为制备用于细胞外囊泡（EV）生成所需的细胞培养基，需通过超速离心（100,000 × g）去除胎牛血清（FCS）中的牛源EV。 g 4 °C孵育24小时，然后弃去沉淀。或者，可预先选择动物来源EV含量较低的商用试剂。
  3. 收集B16-OVA细胞，用PBS洗涤两次，然后在无细胞外囊泡的培养基中以400,000个细胞/mL的浓度接种。
    注意：根据所研究细胞系的生长动态调整细胞浓度，以防止细胞过度生长。
  4. 用每毫升30 μg的奥沙利铂处理B16-OVA细胞，在37 °C下孵育24小时。对照组不作处理。首次使用基因毒性物质时，应通过台盼蓝排斥等细胞活力检测方法滴定所需的细胞毒效应。18.
    注意：该检测还可用于评估经化疗药物以外的其他免疫调节物质或电离辐射处理的细胞培养物所产生的细胞外囊泡（EVs）。
    警告：奥沙利铂可引起皮肤和严重眼部刺激，可能引发过敏性皮肤反应和呼吸道刺激。奥沙利铂疑似具有致癌性。作为预防措施，操作时应使用个人防护装备，包括合适的手套、护目镜、口罩和防护服，重复使用前须彻底清洗。避免吸入，并在接触后彻底清洗双手。防止该物质释放至环境中，并根据现行法规处置奥沙利铂。详细信息请参阅安全数据说明书。
  5. 收集细胞培养上清液。先以 400 x g 4 °C下离心5分钟，然后在2,000 x g 4 °C下孵育30分钟，每次离心后弃去沉淀。最后经220 nm PVDF膜过滤。每步均使用新离心管，以去除任何细胞碎片。
    注意：在此阶段，含有细胞外囊泡的上清液可在 4 °C 下保存一天后再继续实验步骤。然而，强烈建议遵循所述时间安排，立即进行细胞外囊泡的纯化。
  6. 将1 mL上清液与0.5 mL特定的市售外泌体分离试剂混合（参见 材料表在V型1.5 mL离心管中，充分吹打混匀或涡旋以形成均一溶液。4 °C下孵育过夜。
  7. 在 10,000 x g 条件下离心 g 4 °C下孵育60分钟。小心弃去上清液。将1.5 mL离心管倒置在纸巾上轻轻敲击，并用细尖吸头的移液器吸取残留液滴，注意勿触碰管底的EV沉淀。
    1. 彻底去除所有液体，以防止细胞外囊泡沉淀物发生不可控的稀释。同时，应迅速完成这些操作，以避免沉淀干燥。
  8. 用移液枪反复吹打将细胞外囊泡重悬于预冷的PBS中，注意枪头勿刮擦管壁以避免扰动沉淀。随后，将悬液逐步从第一管转移至最后一管，以汇集细胞外囊泡。
    注意：PBS 体积应为试管数量乘以 5 μL。最终悬浮液中的 5 μL 含有经化疗或稳态条件下 400,000 个细胞释放的分离 EVs。
  9. 最好直接使用细胞外囊泡（EVs）。如果无法做到，则将EV悬液置于硅化容器中，在-80 °C保存，最多可保存28天，之后用于实验。
    注意：本文及其他一些文献中描述的EVs在-80 °C下储存该时间段后，不会丧失其相应的生物学功能19.
  10. 根据MISEV2018指南对EV分离物进行定量和表征20.
    注意：可能的定量方法包括纳米颗粒跟踪分析（NTA）21 以及EV膜结合蛋白的检测22进一步表征细胞外囊泡的可能方法包括电子显微镜23 以及蛋白质印迹法20.

2. 使用细胞外囊泡对小鼠进行免疫

  1. 规划 体内 使用C57BL/6小鼠（或其他与肿瘤细胞系相匹配的同系小鼠）进行实验，分组包括分别接受来自经处理细胞的细胞外囊泡（EVs）、未处理细胞的EVs以及PBS（对照溶剂）的治疗组。
    注意：建议使用6-8周龄的小鼠，以避免生理性衰老削弱免疫反应24.
  2. 将每个处理组内每只小鼠的5 μL EV悬液与55 μL冷PBS混合，以使其免疫接种来自4.0 × 10⁸个EV的分离物5 B16-OVA 细胞
    注意：此量的EVs大约对应于2 x 109 通过纳米颗粒追踪分析测量的颗粒（数据未显示）。含有佐剂（如LPS）的OVA蛋白可作为强效疫苗阳性对照使用。
    1. 将稀释后的EVs或PBS分别装入注射器（针头规格26-30 G），每支注射器装60 μL，立即置于冰上。
      注意：在本实验方案中，所注射的细胞外囊泡（EV）的量是根据释放EV的肿瘤细胞数量进行归一化的，以便在实验上同时考虑奥沙利铂对肿瘤细胞EV生成在定性和定量两方面的影响。对于部分读者而言，根据所产生的EV特定浓度进行归一化可能更符合其具体的实验设计，具体取决于其科学问题。
  3. 将EVs或PBS皮下接种于小鼠大腿内侧 7天后重复免疫。首次处理后14天，通过颈椎脱位等方法处死小鼠，以分析免疫反应。
    ​注意：可根据当地标准采用其他皮下注射途径。

3. 脾脏T细胞的流式细胞术分析

  1. 配制并冷却完全 RPMI 培养基（cRPMI），在 RPMI-1640 中添加 FCS（10% v/v）、青霉素（100 单位/mL）、链霉素（100 μg/mL）、L-谷氨酰胺（2 mM）和 β-巯基乙醇（50 μM）。
  2. 从打开的腹腔中切除脾脏。用湿润的 100 μm 细胞筛和注射器的塑料推杆研磨脾脏，并用 5–10 mL cRPMI 将脾细胞冲洗至 50 mL 离心管中。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
    注意：尽可能将细胞置于冰上。若需分析局部免疫反应而非脾脏免疫反应，则按照相同方案切除引流的腘窝和腹股沟淋巴结。此时，跳过下一步的红细胞裂解步骤。
  3. 为从细胞悬液中去除红细胞，将沉淀重悬于 2 mL 红细胞裂解缓冲液（见材料表），室温孵育 5 分钟。随后加入 cRPMI 终止反应。在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
  4. 接种时，将细胞沉淀重悬于 cRPMI 中，计数后将 200,000 个细胞（溶于 200 μL cRPMI）以每孔三复孔的形式加入 U 型底 96 孔板中。在 37 °C 孵育 48 小时。
    注意：为评估活化 T 细胞的抗原特异性，可分别加入 1 μg/mL 可溶性卵清蛋白（或与所研究细胞系相对应的其他肿瘤抗原），或不添加额外刺激物。使用免疫优势肽表位 SIINFEKL 代替全长卵清蛋白，可缩短孵育时间。除流式细胞术外，还可检测孵育 48 小时后小鼠血清及细胞培养上清液 中的多种细胞因子。
  5. 孵育 48 小时后，为增强细胞内 IFN-γ 染色效果（例如阻断高尔基体介导的蛋白分泌），向细胞培养物中加入布雷菲德菌素 A（5 ng/mL）、PMA（20 ng/mL）和离子霉素（1 µg/mL）。在 37 °C 孵育 4 小时。
  6. 在染色表面生物标志物前，将脾细胞转移至 V 型底 96 孔板，用 PBS 洗涤两次。然后加入适用于本地流式细胞仪的荧光标记抗体，靶向表面生物标志物 CD3、CD8 和 CD4（见材料表），按 1:400 稀释，并加入可固定的活率染料，按 1:1,000 稀释于 PBS 中。将沉淀的脾细胞重悬于染色液中，在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
  7. 对脾细胞进行固定和通透处理：用 FACS 缓冲液（PBS 加 3% v/v FCS）洗涤两次，然后每孔加入 100 µL 固定/通透缓冲液（见材料表）。在 4 °C 避光孵育 30 分钟。
  8. 染色细胞内 IFN-γ 时，用固定/通透缓冲液洗涤脾细胞，然后在缓冲液中加入抗 IFN-γ 荧光抗体，按 1:200 稀释。在 4 °C 避光孵育至少 1 小时（最长不超过 12 小时）。
  9. 在通过流式细胞术检测样本前，用固定/通透缓冲液洗涤脾细胞两次，然后重悬于 FACS 缓冲液中。根据图 2所示的设门策略分析细胞毒性 T 细胞的活化情况。
    1. 首先，通过 FSC-H 对 FSC-A 作图以识别单个细胞。然后，通过 SSC 对 FSC-A 作图以识别淋巴细胞。随后，选择活的 CD3+、CD4-、CD8+ 细胞，并确定其产生 IFN-γ 的亚群，以定量脾脏中细胞毒性 T 细胞的活化水平。
      注意：应包含除针对 IFN-γ 的荧光染料外所有荧光染料的荧光减一（FMO）染色样本，作为阴性技术对照。

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结果

本方案旨在促进对肿瘤来源的细胞外囊泡（EVs）免疫原性的简便且可重复评估。在此过程中，小鼠被接种来自 体外 表达模型抗原鸡卵清蛋白（OVA）的肿瘤细胞培养物。随后在脾脏T细胞中分析其免疫应答 通过 流式细胞术

图1 概述了整个实验方案的实际操作步骤。由于本研究聚焦于免疫原性细胞死亡、交叉呈递以及细胞外囊泡（EV）诱导的抗肿瘤免疫，该实验方案仅限于CD8+细胞毒性T细胞的功能分析。如图2所示，细胞通过单细胞门控、淋巴细胞亚群（依据大小和颗粒度）、活细胞（排除死/活标记物阳性细胞）以及CD3+ CD4- CD8+细胞毒性T细胞进行设门分析。细胞内IFN-γ的积累被用作T细胞活化的替代标志物。有关T细胞分化与耗竭的其他潜在标志物将在下文讨论。

采用此处所述方法，将来源于表达OVA的肿瘤细胞的细胞外囊泡（EVs）免疫...

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讨论

本方案提供了一种免疫学方法 体内 评估化疗诱导应激下黑色素瘤细胞来源的细胞外囊泡（EVs），同时适应不同治疗条件下多种癌症所释放的EVs。例如，用奥沙利铂处理的B16-OVA细胞来源的EVs免疫小鼠，可扩增产生干扰素-γ（IFN-γ）的CD8⁺ T细胞。+ 脾脏中的T细胞，其进一步受到刺激 离体 与卵清蛋白孵育后显示出肿瘤特异性免疫反应。因此，通过该方案筛选检测具有免疫原性的细胞外囊泡，有助于更全面地理解传统癌症疗法，并推动针对细胞外囊泡在肿瘤免疫学中作用的深入研究。

值得注意的是，外泌体（EVs）实验需要考虑一些特殊因素。在本方案中，EVs 的归一化处理采用半定量方式，依据为 24 小时内释放的肿瘤细胞数量。该方法反映了研究目标，即识别免疫原性的增强效应，而不论这种增强是源于释放的 EVs 在质量还是数量上的改变。因此，可重复的 in vivo 实验结果依赖于 EVs 分离效率的稳定性。为此，确保 EV 沉淀物被完全且及时地重悬，以避免干燥，是关键步骤。

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本研究由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，DFG）资助——项目编号 360372040 - SFB 1335 和项目编号 395357507 - SFB 1371（资助对象：H.P.），DKMS 生命捐赠基金会的 Mechthild Harf 研究基金（资助对象：H.P.），黑色素瘤研究联盟青年研究者奖（资助对象：S.H.），Else-Kröner-Fresenius 基金会奖学金（资助对象：F.S.），慕尼黑工业大学种子基金（资助对象：S.H.），以及 Wilhelm Sander 基金会研究基金（2021.041.1，资助对象：S.H.）。H. P. 还获得欧洲分子生物学组织（EMBO）青年研究员项目的支持。

作者贡献：

F.S.、H.P. 和 S.H. 设计了研究方案，分析并解读了结果。F.S. 和 S.H. 撰写了论文。H.P. 和 S.H. 对研究进行了指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗 CD3 FITCBiolegend100204克隆株 17A2
抗 CD4 PacBlueBiolegend100428克隆株 GK1.5
抗 CD8 APCBiolegend100712克隆株 53-6.7
抗 IFNγ PEeBioscienceRM90022克隆株 XMG1.2
布雷菲德菌素 ABiolegend420601布雷菲德菌素 A 溶液 (1,000 倍浓缩液)
细胞滤筛，100 µmGreiner542000EASYstrainer 100 µm
DMEMSigma-AldrichD6429含 D-葡萄糖（4.5 g/L）和 L-谷氨酰胺（4 mM）的杜氏改良伊格尔培养基
FBS Good FortePAN BIOTECHP40-47500胎牛血清（FCS）
可固定活力染料 eFluor 506eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific65-0866-14
固定/透化浓缩液eBioscience00-5123-43固定/透化浓缩液 (10x)
固定/透化稀释液eBioscience00-5223-56
离子霉素Sigma-Aldrich407952来源于链球菌 Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1，≥ 97% (HPLC)
L-谷氨酰胺Gibco25030-032L-谷氨酰胺 (200 mM)
卵清蛋白InvivoGenvac-pova内毒素含量 < 1 EU/mg 的卵清蛋白 - CAS 9006-59-1
奥沙利铂MRI 医院药房
PBSSigma-AldrichD8537不含氯化钙和氯化镁的磷酸盐缓冲液
青霉素-链霉素Gibco1514-122青霉素（10,000 U/mL）和链霉素（10,000 µg/mL）混合液
PMASigma-AldrichP1585佛波醇 12-十四烷酸酯 13-乙酸酯，≥ 99% (HPLC)
PVDF 滤膜，0.22 µm，用于注射器Merck MilliporeSLGV033RSMillex-GV 滤器单元 0.22 µm Durapore PVDF 膜
红细胞裂解缓冲液Invitrogen00-4333-57
RPMI 1640Thermo Fischer Scientific11875含 D-葡萄糖（2.00 g/L）和 L-谷氨酰胺（300 mg/L）、不含 HEPES 的 Roswell Park Memorial Institute 1640 培养基
注射器，26 GBD Biosciences3055011 mL 皮下注射器带针头（0.45 mm × 12.7 mm）
总外泌体分离试剂Invitrogen4478359用于从细胞培养基中分离外泌体
β-巯基乙醇Thermo Fischer Scientific31350β-巯基乙醇 (50 mM)

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