Summary
تصف هذه المخطوطة كيفية تقييم المناعة في الجسم الحي للحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا السرطانية (EVs) باستخدام قياس التدفق الخلوي. تبدو المركبات الكهربائية المشتقة من الأورام التي تخضع لموت الخلايا المناعية الناجم عن العلاج ذات أهمية خاصة في المراقبة المناعية للورم. يجسد هذا البروتوكول تقييم المركبات الكهربائية للورم المناعي الناجم عن أوكساليبلاتين ولكن يمكن تكييفه مع مختلف الإعدادات.
Abstract
يمكن أن يؤدي موت الخلايا المناعية للأورام ، الناجم عن العلاج الكيميائي أو الإشعاعي ، إلى استجابات الخلايا التائية الخاصة بالورم عن طريق إطلاق أنماط جزيئية مرتبطة بالخطر وتحفيز إنتاج الإنترفيرون من النوع الأول. تعتمد العلاجات المناعية، بما في ذلك تثبيط نقاط التفتيش، في المقام الأول على الخلايا التائية الخاصة بالورم الموجودة مسبقا للكشف عن تأثير علاجي. وبالتالي ، فإن النهج العلاجية التآزرية التي تستغل موت الخلايا المناعية كلقاح جوهري مضاد للسرطان قد تحسن استجابتها. ومع ذلك ، فإن طيف العوامل المناعية التي تطلقها الخلايا تحت الضغط الناجم عن العلاج لا يزال غير مميز تماما ، خاصة فيما يتعلق بالحويصلات خارج الخلية (EVs). تعتبر المركبات الكهربائية ، وهي جزيئات غشائية نانوية الحجم تنبعث من جميع الخلايا تقريبا ، تسهل الاتصال بين الخلايا ، وفي السرطان ، ثبت أنها تتوسط في التحضير المتبادل ضد مستضدات الورم. لتقييم التأثير المناعي للمركبات الكهربائية المشتقة من الأورام في ظل ظروف مختلفة ، يتم البحث عن طرق قابلة للتكيف وقابلة للتطوير وصالحة. لذلك ، يتم تقديم نهج سهل وقوي نسبيا لتقييم مناعة المركبات الكهربائية في الجسم الحي . ويستند البروتوكول إلى تحليل التدفق الخلوي للخلايا التائية الطحالية بعد تحصين الفئران في الجسم الحي بالمركبات الكهربائية، معزولة عن طريق المقايسات القائمة على هطول الأمطار من مزارع الخلايا السرطانية تحت العلاج أو ظروف الحالة الثابتة. على سبيل المثال ، يظهر هذا العمل أن التعرض لأوكساليبلاتين لخلايا الورم الميلانيني الفئران B16-OVA أدى إلى إطلاق EVs المناعية التي يمكن أن تتوسط في تنشيط الخلايا التائية السامة للخلايا التفاعلية للورم. وبالتالي، فإن فحص المركبات الكهربائية عن طريق التحصين في الجسم الحي وقياس التدفق الخلوي يحدد الظروف التي يمكن أن تظهر فيها المركبات الكهربائية المناعية. يوفر تحديد ظروف إطلاق EV المناعي شرطا أساسيا لاختبار الفعالية العلاجية للمركبات الكهربائية ضد السرطان واستكشاف الآليات الجزيئية الأساسية للكشف في نهاية المطاف عن رؤى جديدة حول دور EVs في علم المناعة السرطاني.
Introduction
يلعب الجهاز المناعي دورا محوريا في مكافحة السرطان ، سواء عند التحريض عليه عن طريق تثبيط نقاط التفتيش المناعية أو لفعالية علاجات السرطان التقليدية. يمكن للخلايا السرطانية التي تستسلم للعلاجات السامة للجينات مثل عوامل العلاج الكيميائي أوكساليبلاتين ودوكسوروبيسين، أو العلاج الإشعاعي المؤين أن تطلق مستضدات وأنماط جزيئية مرتبطة بالخطر (DAMPs) يحتمل أن تبدأ استجابة مناعية تكيفية مضادة للورم1. وتشمل أبرز DAMPs ، في سياق موت الخلايا المناعية ، إشارات find-me مثل ATP الكيميائي ، وإشارات eat-me مثل التعرض للكاليريتيكولين ، الذي يعزز امتصاص الخلايا السرطانية بواسطة الخلايا التي تقدم المستضدات ، وإطلاق HMGB1 ، الذي ينشط مستقبلات التعرف على الأنماط ، وبالتالي تعزيز العرض المتبادل لمستضدات الورم 2. علاوة على ذلك، يتم استشعار الإنترفيرون من النوع الأول (IFN-I)، المستحث عن طريق الأحماض النووية المناعية المشتقة من الورم أو غيرها من المحفزات، بواسطة الخلايا المتغصنة، مما يمكنها من إطلاق الخلايا التائية السامة للخلايا الخاصة بالورم بشكل فعال3،4. سريريا ، توفر خلايا CD8 + T المنشطة والمنتشرة التي تتسلل إلى الورم عاملا تنبؤيا مستقلا للبقاء على قيد الحياة لفترة طويلة في العديد من مرضى السرطان. يتوسط IFN-γ ، الذي يتم إطلاقه من هذه الخلايا التائية المنشطة ، التأثيرات المباشرة المضادة للتكاثر على الخلايا السرطانية ويدفع استقطاب Th1 وتمايز الخلايا التائية السامة للخلايا ، مما يساهم في المراقبة المناعية الفعالة ضد السرطان5,6. أوكساليبلاتين هو محفز لموت الخلايا المناعية بحسن نية، ويتوسط مثل هذه الاستجابة المناعية التكيفية ضد السرطان7. ومع ذلك ، فإن العدد الكبير من الإشارات المناعية الأولية التي تطلقها الخلايا السرطانية تحت الضغط الناجم عن العلاج لا يزال يتعين الكشف عنها بالكامل. على الرغم من التقدم الكبير في العلاج المناعي للسرطان ، إلا أن توسيع فوائده لتشمل جزءا أكبر من المرضى لا يزال يمثل تحديا. قد يؤدي الفهم الأكثر تفصيلا للإشارات المناعية التي تبدأ تنشيط الخلايا التائية إلى توجيه تطوير علاجات جديدة.
يبدو أن مجموعة غير متجانسة من الهياكل المغلقة بالغشاء ، والمعروفة باسم الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، تعمل كأجهزة اتصال بين الخلايا. تحمل المركبات الكهربائية المنبعثة من جميع أنواع الخلايا تقريبا البروتينات الوظيفية والحمض النووي الريبي والحمض النووي والجزيئات الأخرى إلى الخلية المتلقية أو قد تغير الحالة الوظيفية للخلية فقط عن طريق الارتباط بالمستقبلات الموجودة على سطح الخلية. تختلف حمولتها النشطة بيولوجيا اختلافا كبيرا حسب نوع الخلية المولدة وحالتها الوظيفية8. في علم المناعة السرطاني، اعتبرت المركبات الكهربائية المنبعثة من الخلايا السرطانية في الغالب معادية للعلاج المناعي لأنها تعزز في نهاية المطاف النمو الغازي، وتشكل منافذ النقيلي9، وتثبط الاستجابة المناعية10. في المقابل، أظهرت بعض الدراسات أن المركبات الكهربائية يمكنها نقل مستضدات الورم إلى الخلايا المتغصنة من أجل عرض تقديمي فعال11,12. قد توفر المركبات الكهربائية الأحماض النووية المناعية إذا ظهرت تحت الضغط الناجم عن العلاج، مما يسهل الاستجابة المناعية المضادة للورم13،14. وقد ثبت مؤخرا أن استشعار مثل هذه الروابط المناعية الفطرية للحمض النووي الريبي والحمض النووي في البيئة الدقيقة للورم يعدل الاستجابة لحصار نقاط التفتيش بشكل كبير15،16،17. وبالتالي ، فإن الدور المناعي للمركبات الكهربائية التي تطلقها الخلايا السرطانية تحت ضغط مختلف يسببه العلاج يحتاج إلى مزيد من التوضيح. نظرا لأن المركبات الكهربائية تشكل مجالا بحثيا شابا ولكنه متنام ، فإن توحيد الأساليب لا يزال مستمرا. لذلك ، فإن تبادل المعرفة أمر ضروري لتحسين قابلية تكرار الأبحاث حول التفاعلات بين المركبات الكهربائية وعلم المناعة السرطاني. مع وضع ذلك في الاعتبار، تصف هذه المخطوطة بروتوكولا بسيطا لتقييم التأثير المناعي للمركبات الكهربائية المشتقة من الورم في الجسم الحي.
يتم إجراء هذا التقييم عن طريق توليد EVs المشتقة من الورم ، وتحصين الفئران المتلقية مع تلك EVs ، وتحليل الخلايا التائية الطحالية عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم إجراء توليد EV بشكل مثالي عن طريق بذر خلايا ورم الفئران في وسط زراعة الخلايا الخالية من EV للحصول على درجة عالية من النقاء. يتم التعامل مع الخلايا بمحفز إجهاد خلوي محدد ، مثل العلاج الكيميائي ، لمقارنة تأثير EVs الناجم عن العلاج مع المناعة الأساسية للمركبات الكهربائية المشتقة من الورم. يمكن إجراء عزل المركبات الكهربائية من خلال تقنيات مختلفة يجب اختيارها وفقا للتطبيق في الجسم الحي والتوافر المحلي. يصف البروتوكول التالي فحصا قائما على هطول الأمطار مع مجموعة تجارية لتنقية EV. يتم تحصين الفئران مرتين مع تلك المركبات الكهربائية. بعد أربعة عشر يوما من الحقن الأول ، يتم استخراج الخلايا التائية من الطحال وتحليلها لإنتاج IFN-γ عن طريق قياس التدفق الخلوي لتقييم الاستجابة المناعية الجهازية. مع هذا، يتم تقييم إمكانات المركبات الكهربائية المشتقة من الورم، والتي تظهر في ظل أنظمة علاجية مختلفة، للحث على استجابات الخلايا التائية المضادة للورم بسهولة نسبية وبسرعة وبصلاحية عالية13. لذلك ، هذه الطريقة مناسبة للفحص المناعي للمركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا السرطانية في ظل ظروف مختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
في بداية التجارب ، كان عمر الفئران 6 أسابيع على الأقل وتم الحفاظ عليها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض. يتوافق هذا البروتوكول مع المعايير الأخلاقية المؤسسية واللوائح المحلية السائدة. تمت الموافقة على الدراسات على الحيوانات من قبل الوكالة التنظيمية المحلية (Regierung von Oberbayern ، ميونيخ ، ألمانيا). لم يتم التحقيق في التحيزات المحتملة المتعلقة بالجنس في هذه الدراسات.
1. توليد وعزل المركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا السرطانية بعد التعرض للعلاج الكيميائي
- خلايا سرطان الجلد الفئران B16 المستنبتة التي تعبر عن البويضبومين (B16-OVA) في DMEM (تحتوي على 4 mM L-glutamine و 4.5 جم / لتر D-glucose) مع FCS (10٪ v / v) ، البنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) عند 37 درجة مئوية ، حتى تنمو الخلايا بشكل مطرد وتكون متقاربة بنسبة 90٪ تقريبا.
ملاحظة: قم بتنفيذ هذا القسم من البروتوكول بالكامل تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء زراعة الخلايا. لتحليل الكيانات السرطانية الأخرى ، يفضل أن تكون خطوط الخلايا التي تعبر عن مستضد قوي لتقييم استجابات الخلايا التائية الخاصة بالمستضدات ، لأنها تسمح بتحفيز مستضد محدد خارج الجسم الحي . - لإعداد وسائط زراعة الخلايا اللازمة لتوليد المركبات الكهربائية، استنفد المركبات الكهربائية البقرية داخل FCS عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 100000 × g لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية، ثم تخلص من الكرية. بدلا من ذلك ، اختر إعدادا تجاريا منخفضا في المركبات الكهربائية الحيوانية مسبقا.
- حصاد خلايا B16-OVA وغسلها مرتين في PBS ، ثم البذور بتركيز 400000 خلية / مل في الوسائط المستنفدة EV.
ملاحظة: قم بتكييف تركيز الخلية مع ديناميكية نمو خط الخلية قيد التحقيق حتى لا تتضخم الخلايا. - عالج خلايا B16-OVA بإضافة 30 ميكروغرام من أوكساليبلاتين لكل مل واحتضنها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. اترك حالات التحكم دون علاج. عند أول استخدام لمادة سامة وراثيا، قم بمعايرة الفعالية السامة للخلايا المطلوبة باستخدام مقايسات قابلية الخلايا للاستمرار مثل استبعاد التربان الأزرق18.
ملاحظة: قد يقوم هذا الفحص أيضا بتقييم المركبات الكهربائية المتولدة في مزارع الخلايا المعالجة بمواد أخرى معدلة للمناعة أو التشعيع المؤين إلى جانب العلاج الكيميائي.
تحذير: يسبب أوكسالبلاتين تهيجا شديدا للجلد وقد يسبب رد فعل تحسسي للجلد وتهيج في الجهاز التنفسي. يشتبه في أن أوكساليبلاتين يسبب السرطان. كإجراء احترازي ، استخدم معدات الحماية الشخصية ، بما في ذلك القفازات والنظارات الواقية والأقنعة والملابس الكافية ، التي يتم تنظيفها قبل إعادة الاستخدام. تجنب الاستنشاق واغسل يديك جيدا بعد التعامل. تجنب الإطلاق في البيئة وتخلص من أوكساليبلاتين وفقا للوائح السائدة. الحصول على معلومات مفصلة من ورقة بيانات السلامة. - جمع الخارقة زراعة الخلايا. جهاز طرد مركزي أولا عند 400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم عند 2000 × g لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، في كل مرة يتم التخلص من الكرية. أخيرا ، قم بالتصفية من خلال غشاء PVDF 220 نانومتر. استخدم أنبوبا جديدا لكل خطوة لإزالة أي حطام خلوي.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، قد يتم تخزين supernatant المحتوي على EV عند 4 درجات مئوية لمدة يوم قبل استئناف البروتوكول. ومع ذلك ، يوصى بشدة بالالتزام بالجدول الزمني الموصوف مع تنقية EV الفورية. - امزج 1 مل من السوبرناتانت مع 0.5 مل من كاشف عزل إكسوسوم محدد متاح تجاريا (انظر جدول المواد) في أنبوب 1.5 مل على شكل حرف V. ماصة تماما صعودا وهبوطا أو دوامة لإنشاء حل متجانس. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- جهاز طرد مركزي عند 10000 × جم لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص بعناية من السوبرناتانت. قم بإزالة القطرات المتبقية عن طريق النقر على أنبوب 1.5 مل رأسا على عقب على منشفة ورقية وعن طريق الشفط من خلال ماصة ذات طرف ناعم دون لمس حبيبة EV في الأسفل.
- قم بإزالة جميع السوائل جيدا لمنع التخفيف غير المنضبط للحبيبات الكهربائية. أيضا ، قم بتنفيذ هذه المهام بسرعة لمنع الكريات من الجفاف.
- أعد تعليق المركبات الكهربائية في PBS البارد عن طريق السحب لأعلى ولأسفل دون خدش الكريات من جدار الأنبوب بالطرف. الآن ، انقل التعليق خطوة بخطوة من الأنبوب الأول إلى الأنبوب الأخير لتجميع المركبات الكهربائية.
ملاحظة: استخدم حجم PBS يساوي 5 ميكرولتر مضروبا في عدد الأنابيب. يحتوي 5 ميكرولتر من التعليق النهائي على EVs المعزولة التي تم إطلاقها من 400000 خلية تحت العلاج الكيميائي أو في حالة مستقرة. - يفضل استخدام المركبات الكهربائية مباشرة. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فقم بتخزين معلقات EV عند -80 درجة مئوية في أوعية مصنوعة من السيليكون لمدة تصل إلى 28 يوما حتى التطبيق.
ملاحظة: لا تفقد المركبات الكهربائية الموصوفة هنا وفي العديد من المنشورات الأخرى وظيفتها البيولوجية عند تخزينها عند -80 درجة مئوية لتلك الفترة الزمنية19. - تحديد وتوصيف عزلات السيارات الكهربائية وفقا لإرشادات MISEV201820.
ملاحظة: تشمل الطرق الممكنة للقياس الكمي تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)21 والكشف عن البروتينات المرتبطة بالغشاء في EV22. وتشمل النهج الممكنة لزيادة توصيف المركبات الكهربائية المجهر الإلكتروني23 واللطخة الغربية20.
2. تحصين الفئران بالمركبات الكهربائية
- خطط للتجربة في الجسم الحي مع الفئران C57BL/6 (أو غيرها من الفئران المتجانسة المقابلة لخط الخلايا السرطانية)، بما في ذلك مجموعات العلاج التي تتلقى EVs المشتقة من الخلايا المعالجة، والخلايا غير المعالجة، وPBS (السيارة)، على التوالي.
ملاحظة: يفضل استخدام الفئران في سن 6-8 أسابيع لمنع الشيخوخة الفسيولوجية من تقليل الاستجابة المناعية24. - امزج 5 ميكرولتر من نظام التعليق EV مع 55 ميكرولتر من PBS البارد لكل فأر ضمن مجموعة المعالجة المعنية لتمنيعه بمركبات كهربائية معزولة من خلايا 4.0 × 105 B16-OVA.
ملاحظة: تتوافق هذه الكمية من المركبات الكهربائية مع حوالي 2 × 109 جسيمات تقاس بتحليل تتبع الجسيمات النانوية (البيانات غير معروضة). يمكن تطبيق بروتين OVA الممزوج بمادة مساعدة (على سبيل المثال ، LPS) كعنصر تحكم إيجابي قوي للقاح.- املأ المحاقن (حجم الإبرة 26-30 جم) ب 60 ميكرولتر من EVs المخففة أو PBS ، على التوالي وضعها على الجليد على الفور.
ملاحظة: في البروتوكول ، يتم تطبيع كمية EVs المحقونة إلى عدد الخلايا السرطانية التي تطلق EV للنظر تجريبيا في كل من التأثيرات النوعية والكمية ل oxaliplatin على التكوين الحيوي للخلايا السرطانية EV. بالنسبة لبعض القراء ، قد يتناسب التطبيع مع تركيز معين من المركبات الكهربائية المنتجة بشكل أفضل مع إعدادهم التجريبي اعتمادا على سؤالهم العلمي.
- املأ المحاقن (حجم الإبرة 26-30 جم) ب 60 ميكرولتر من EVs المخففة أو PBS ، على التوالي وضعها على الجليد على الفور.
- قم بتلقيح المركبات الكهربائية أو PBS تحت الجلد في الجانب الإنسي من فخذ الفئران وكرر التحصين بعد 7 أيام. بعد أربعة عشر يوما من العلاج الأول ، تضحي الفئران ، على سبيل المثال ، عن طريق خلع عنق الرحم لتحليل الاستجابة المناعية.
ملاحظة: يمكن استخدام طرق حقن بديلة تحت الجلد، وفقا للمعايير المحلية.
3. تحليل التدفق الخلوي للخلايا التائية الطحالية
- تحضير وتبريد RPMI الكامل (cRPMI) ، واستكمال RPMI-1640 مع FCS (10 ٪ v / v) ، والبنسلين (100 وحدة / مل) ، والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) ، L-الجلوتامين (2 mM) ، و β-mercaptoethanol (50 ميكرومتر).
- استئصال الطحال من تجويف البطن المفتوح. اهرسي الطحال بمصفاة خلايا مبللة 100 ميكرومتر ومكبس بلاستيكي لمحقنة واغسلي الخلايا الطحالية في أنبوب سعة 50 مل مع 5-10 مل من cRPMI. جهاز طرد مركزي عند 400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant.
ملاحظة: احتفظ بالخلايا على الجليد كلما أمكن ذلك. لتحليل الاستجابة المناعية المحلية بدلا من الطحالية ، قم باستئصال الغدد الليمفاوية المأبضية والإربية المستنزفة ، باتباع نفس البروتوكول. في هذه الحالة ، تخطي الخطوة التالية لتحلل كريات الدم الحمراء. - لإزالة كريات الدم الحمراء من تعليق الخلية، أعد تعليق الكريات مع 2 مل من مخزن تحلل خلايا الدم الحمراء (انظر جدول المواد) واحتضنها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم قم بإيقاف التفاعل عن طريق إضافة cRPMI. جهاز طرد مركزي عند 400 × g لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من supernatant.
- للبذر ، أعد تعليق حبيبات الخلايا في cRPMI وعد الخلايا لوضع ثلاثة أضعاف من 200000 خلية مع 200 ميكرولتر cRPMI في كل بئر ، باستخدام لوحة 96 بئرا مع قاع على شكل حرف U. احتضان لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: لمعالجة خصوصية المستضد للخلايا التائية المنشطة، أضف 1 ميكروغرام/مل أوفألبومين قابل للذوبان (أو مستضد ورم آخر يتوافق مع خط الخلية قيد التحقيق) أو اتركه بدون حافز إضافي، على التوالي. إضافة الببتيد المهيمن على المناعة SIINFEKL ، بدلا من ovalbumin كامل الطول ، يسمح بفترة حضانة أقصر. إلى جانب قياس التدفق الخلوي ، يمكن تحليل مصل الفئران وثقافة الخلايا الفائقة بعد 48 ساعة من الحضانة لمختلف السيتوكينات. - بعد 48 ساعة ، لتعزيز تلطيخ IFN-γ داخل الخلايا عن طريق ، من بين أمور أخرى ، منع إفراز البروتينات بوساطة غولجي ، أضف Brefeldin A (5 نانوغرام / مل) ، PMA (20 نانوغرام / مل) ، و Ionomycin (1 ميكروغرام / مل) إلى مزرعة الخلايا. حضانة لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية.
- قبل تلطيخ المؤشرات الحيوية السطحية ، انقل خلايا الطحال إلى صفيحة 96 بئرا ذات قاع على شكل حرف V واغسلها مرتين باستخدام PBS. بعد ذلك ، أضف أجساما مضادة فلورية ، متوافقة مع مقياس التدفق الخلوي المتاح محليا ، موجهة ضد المؤشرات الحيوية السطحية ، CD3 ، CD8 ، و CD4 (انظر جدول المواد) ، المخففة 1: 400 ، بالإضافة إلى صبغة قابلة للإصلاح قابلة للإصلاح ، مخففة 1: 1000 في PBS. أعد تعليق الخلايا الطحالية الحبيبية في محلول التلطيخ واحتضنها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء.
- لتثبيت الخلايا الطحالية ونفاذها، اغسلها مرتين في المخزن المؤقت FACS-(PBS بالإضافة إلى 3٪ v/v FCS)، ثم أعد التعليق في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثبيت/النفاذية (انظر جدول المواد) لكل بئر. تحضن لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء.
- لتلطيخ IFN-γ داخل الخلايا ، اغسل خلايا الطحال في مخزن مؤقت للتثبيت / التخلل وأعد تعليقها بأجسام مضادة فلورية ضد IFN-γ ، مخففة 1:200 في المخزن المؤقت. احتضن لمدة 1 ساعة على الأقل (بحد أقصى 12 ساعة) عند 4 درجات مئوية ، محمية من الضوء.
- قبل قياس العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي ، اغسل الخلايا الطحالية مرتين في مخزن مؤقت للتثبيت / النفاذية وأعد تعليقها في المخزن المؤقت FACS. تحليل تنشيط الخلايا التائية السامة للخلايا وفقا لاستراتيجية البوابة المعروضة في الشكل 2.
- أولا ، للكشف عن الخلايا المفردة ، قم بمسح FSC-H ضد FSC-A. ثم ، للكشف عن الخلايا اللمفاوية ، لطخة SSC ضد FSC-A. بعد ذلك ، حدد خلايا CD3 + و CD4 و CD8 + الحية وحدد مجموعتها الفرعية المنتجة γ IFN لتحديد تنشيط الخلايا التائية السامة للخلايا في الطحال.
ملاحظة: قم بتضمين بقعة التألق ناقص واحد (FMO) مع جميع الفلوروكروم باستثناء الفلوروكروم المستهدف ضد IFN-γ كعنصر تحكم تقني سلبي.
- أولا ، للكشف عن الخلايا المفردة ، قم بمسح FSC-H ضد FSC-A. ثم ، للكشف عن الخلايا اللمفاوية ، لطخة SSC ضد FSC-A. بعد ذلك ، حدد خلايا CD3 + و CD4 و CD8 + الحية وحدد مجموعتها الفرعية المنتجة γ IFN لتحديد تنشيط الخلايا التائية السامة للخلايا في الطحال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يهدف هذا البروتوكول إلى تسهيل التقييم المباشر والقابل للتكرار بسهولة للمناعة للمركبات الكهربائية المشتقة من الورم. بموجب هذا ، يتم تلقيح الفئران بمركبات كهربائية مشتقة من مزارع الخلايا السرطانية في المختبر التي تعبر عن نموذج مستضد الدجاج ovalbumin (OVA). يتم تحليل الاستجابة المناعية اللاحقة في الخلايا التائية الطحالية عن طريق قياس التدفق الخلوي.
ويقدم الشكل 1 لمحة عامة عن الخطوات العملية للبروتوكول برمته. نظرا لأن العمل يركز على موت الخلايا المناعية ، والعرض المتبادل ، والمناعة المضادة للورم الناجم عن EV ، فإن هذا البروتوكول يقتصر على وظيفة الخلايا التائية السامة للخلايا CD8 +. كما هو موضح في الشكل 2 ، كانت الخلايا مسورة كخلايا مفردة ، ومجموعة فرعية من الخلايا الليمفاوية (حسب الحجم والدقة) ، وخلايا قابلة للحياة (باستثناء علامة الحياة / الموت) ، وخلايا CD3 + CD4- CD8 + T السامة للخلايا. تم تقييم التراكم داخل الخلايا ل IFN-γ كعلامة بديلة للتنشيط. وتناقش أدناه العلامات الإضافية المحتملة المتعلقة بتمايز الخلايا التائية واستنفادها.
باستخدام الطريقة الموضحة هنا ، تم تحصين الفئران بالمركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا السرطانية المعبرة عن OVA المستزرعة إما في ظل حالة ثابتة (غير معالجة) أو حالات إجهاد سامة وراثيا (معالجة أوكساليبلاتين). فقط الفئران التي تم حقنها بالمركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا السرطانية في ظل ظروف الإجهاد الوراثي تسببت في تنشيط قوي للخلايا التائية السامة للخلايا الطحالية في الحيوانات المتلقية (الشكل 3A). أدى حقن المركبات الكهربائية المشتقة من الأورام في ظل ظروف الحالة الثابتة إلى تنشيط بعض الخلايا التائية ، ولكن هذا لم يكن مختلفا اختلافا كبيرا عن تنشيط الخلايا التائية في الفئران التي تم حقنها باستخدام مركبة PBS. تظهر هذه البيانات أنه تحت الضغط السام للوراثة ، يمكن للخلايا السرطانية إطلاق EVs مناعية قوية. وازداد إنتاج γ IFN- بشكل خاص عندما تم إعادة تحفيز الخلايا الطحالية للحيوانات المعالجة بالخلايا الكهرومغناطيسية خارج الجسم الحي باستخدام مستضد الورم النموذجي OVA قبل التحليل (الشكل 3B). تشير هذه البيانات إلى أن المركبات الكهربائية المشتقة من الورم يمكن أن تحفز الاستجابات المناعية الخاصة بمستضدات الورم. ومن المثير للاهتمام أن إنتاج IFN-γ - على الرغم من أنه بدرجة أقل بكثير - يتم اكتشافه أيضا في غياب التحفيز الخاص بالمستضد. من المحتمل أن تكون المستضدات الأخرى المرتبطة بسرطان الجلد ، مثل مستضد التمايز TRP225 ، مستهدفة من قبل جزء من استجابة الخلايا التائية التي يسببها EV.
الشكل 1: نظرة عامة تصويرية للبروتوكول . (أ) إجراء عزل المركبات الكهربائية المتولدة في مزارع الخلايا السرطانية التي تشبه العلاج الكيميائي. (ب) الجدول الزمني لتحصين الفئران بالمركبات الكهربائية. (ج) بروتوكول تلطيخ لتحليل التدفق الخلوي للخلايا التائية السامة للخلايا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: استراتيجية بوابة قياس التدفق الخلوي لتحليل تنشيط الخلايا التائية السامة للخلايا في الطحال. وتمثل الأرقام النسبة المئوية للسكان الأصليين لكل منهما. FSC-A: منطقة تشتت أمامية ؛ FSC-H: ارتفاع التشتت الأمامي ؛ SSC: مبعثر جانبي. حي / ميت: علامة موت الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: يمكن للمركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا السرطانية تحت الضغط السام الوراثي أن تحفز استجابات الخلايا التائية الخاصة بالمستضدات في الحيوانات المتلقية. (أ) تم تحصين الفئران بالمركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا السرطانية المستزرعة إما في حالة ثابتة (غير معالجة) أو حالات الإجهاد السامة وراثيا (المعالجة بالأوكساليبلاتين). تم استخدام حقن المركبات (PBS) كعنصر تحكم سلبي. تم تحديد إنتاج IFN-γ بواسطة الخلايا التائية السامة للخلايا في الطحال عند التمنيع EV. مع هذا ، تم إعادة تنشيط معلقات الخلايا الطحالية مع ovalbumin خارج الجسم الحي قبل التحليل. (ب) عولجت الفئران بالمركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا السرطانية في ظل ظروف الإجهاد السام للوراثة على النحو المبين أعلاه. تم تحديد تنشيط الخلايا التائية الطحالية بعد إعادة التحفيز خارج الجسم الحي إما في وجود أو عدم وجود البويضات. تصور القضبان الوسط الحسابي لكل مجموعة وتوضح خطأها القياسي. تم استخدام التحليل أحادي الاتجاه لاختبار التباين (ANOVA) مع اختبار بونفيروني اللاحق لإجراء مقارنات إحصائية متعددة لمجموعة بيانات. تم تعيين مستوى الدلالة عند P < 0.05 و P < 0.01 و P < 0.001 ويشار إليه هنا بالعلامات النجمية (*، **، و ***). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر هذا البروتوكول تقييما مناعيا في الجسم الحي للمركبات الكهربائية المشتقة من خلايا سرطان الجلد تحت الضغط الناجم عن العلاج الكيميائي أثناء التكيف مع المركبات الكهربائية المنبعثة من أنواع السرطان المختلفة تحت علاجات مختلفة. على سبيل المثال، يؤدي تحصين الفئران بالمركبات الكهربائية المشتقة من خلايا B16-OVA المعالجة بالأوكساليبلاتين، إلى توسيع الخلايا التائية CD8+ المنتجة ل IFN-γ في الطحال، والتي يتم تحفيزها بشكل أكبر عن طريق الحضانة خارج الجسم الحي باستخدام البويضات، مما يشير إلى استجابة مناعية خاصة بالورم. وبالتالي ، فإن الكشف عن المركبات الكهربائية المناعية عن طريق الفحص من خلال هذا البروتوكول يسهل فهما أكثر شمولا لعلاجات السرطان التقليدية ويمكن من إجراء تحقيق مركز في دور المركبات الكهربائية في علم المناعة السرطاني.
تجدر الإشارة إلى أن التجارب مع المركبات الكهربائية تتطلب بعض الاعتبارات الخاصة. في هذا البروتوكول ، يتم تطبيع EVs بشكل شبه كمي مع عدد الخلايا السرطانية التي يتم إطلاقها في غضون 24 ساعة. ويعكس هذا النهج الهدف المتمثل في تحديد المناعة المعززة، بغض النظر عما إذا كانت ناشئة عن تغيرات في نوعية أو كمية المركبات الكهربائية الصادرة. لذلك ، تعتمد النتائج القابلة للتكرار في الجسم الحي على فعالية العزل المستمرة للمركبات الكهربائية. وتحقيقا لهذه الغاية، فإن ضمان إعادة تعليق كريات المركبات الكهربائية بالكامل وعلى الفور لتجنب الجفاف هو خطوة حاسمة.
بالإضافة إلى ذلك، يجب تحديد المركبات الكهربائية كميا وتوصيفها، على سبيل المثال، عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية واللطخة الغربية للغشاء الكنسي، واللمعان، وعلامة EV-marker سلبية واحدة على الأقل20. تحديد وتوصيف ضوابط المركبات الكهربائية للعزل غير المستمر ومعالجة الاختلافات الكمية في المركبات الكهربائية أو المجموعات الفرعية للمركبات الكهربائية. يشكل هذا النوع من توصيف EV جزءا من الحد الأدنى من المعلومات التي يجب الإبلاغ عنها في الدراسات حول الحويصلات خارج الخلية ، وفقا لإرشادات الجمعية الدولية للحويصلات خارج الخلية (ISEV). ومع ذلك ، فإن طرق التوصيف المختلفة مشروعة بنفس القدر ويجب اختيارها فيما يتعلق بالتوافر المحلي ومسألة البحث الفردية. ومن الجدير بالذكر أن تحديد جرعة مادة ذات أهمية أو تشعيع مؤين يشكل خطوة حاسمة أخرى من خطوات البروتوكول، والتي قد تتطلب التحقق التجريبي لتحقيق مستوى كاف من موت الخلايا.
بشكل عام ، يجب النظر في التلوث المحتمل للمركبات الكهربائية المعزولة بمادة المعالجة والبروتينات القابلة للذوبان والبروتينات الدهنية. وتتمثل إحدى الاستراتيجيات في هذا الصدد في إعادة إنتاج التجربة باستخدام تقنيات تكميلية لعزل المركبات الكهربائية قد لا يتنازل عنها نفس النوع من التلوث(20 ). فالتقارب المناعي، على سبيل المثال، يعزل المركبات الكهربائية ذات الغلة الأقل ولكن بخصوصية أعلى من الطرق القائمة على هطول الأمطار البحتة، وقد يوفر تحكما مناسبا في هذا الصدد26. وهناك نهج بديل يتمثل في مقارنة المركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا البرية مع العزلات من الخلايا المهندسة وراثيا مع حذف محدد للجينات المشاركة في التكوين الحيوي للمركبات الكهربائية أو نشر المواد التي تقلل من انبعاثات المركبات الكهربائية20.
وينبغي استكمال النتائج التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول بتوصيف أكثر شمولا للاستجابة المناعية بوساطة المركبات الكهربائية. خاصة تصنيف خلايا CD8 + T إلى خلايا ذاكرة مستجيبة ومستجيبة ، من خلال CD4427 ، وكذلك خلايا الذاكرة الساذجة والمركزية المستضدية ، من خلال CD62L28 ، قد ينقل رؤية أعمق. علاوة على ذلك ، قد يكون تحليل الخلايا التائية المساعدة والخلايا التائية التنظيمية وخلايا NK موضع اهتمام. لاختبار فعالية المركبات الكهربائية المضادة للورم، قد تواجه الفئران تحديا مع الخلايا السرطانية المقابلة بعد تلقي التحصين EV أو معالجتها بالمركبات الكهربائية ضد سرطان محدد مسبقا، وبالتالي تكييف المبادئ التوجيهية للكشف عن موت الخلايا المناعية2,29 مع هذا الورم الخالي من الخلايا. ومع ذلك، فإن الاستنتاجات من جميع هذه الإعدادات التجريبية محدودة بحقيقة أن الخلايا السرطانية في طبق بتري يمكن أن تولد مركبات كهربائية مختلفة وظيفيا عن الخلايا السرطانية المضمنة في بيئة دقيقة ديناميكية للورم30 والتي غالبا ما تقمع المناعة المضادة للسرطان. وبالتالي ، فإن تقييم EVs المشتقة من الزراعات المشتركة للورم / الخلايا الليفية أو أنسجة الورم خارج الجسم الحي قد يعكس الوضع الفعلي بشكل أفضل. في خطوة انتقالية تالية نحو الواقع السريري ، يمكن تحليل المركبات الكهربائية من مواد المريض بحثا عن المناعة قبل وأثناء العلاج لتقييم قابليتها للاستخدام كمؤشرات حيوية.
نظرا لأن المركبات الكهربائية المشتقة من السرطان قد وجدت مؤخرا - في ظل ظروف معينة - تعدل الجهاز المناعي ، فإن رحلة استكشاف إمكاناتها السريرية قد بدأت للتو31. لإجراء تحليل متعمق للآليات المناعية التي تستقطبها المركبات الكهربائية المناعية ، تشتمل الأدوات المفيدة على الفحص المجهري الفلوري الذي يتصور امتصاص EV بواسطة خلايا معينة ، ونشر الفئران التي تعاني من أوجه قصور وراثية لمسارات مناعية محددة ، وطرق فحص للتغيرات الجزيئية في محتوى EV. وفي نهاية المطاف، فإن تحديد المركبات الكهربائية المشتقة من الورم المناعي المنشأ، مع طرق الفحص الموضحة هنا، سيمكن من فهم أفضل للآليات الكامنة وراء المناعة بوساطة المركبات الكهربائية، وبالتالي يشكل خطوة حاسمة نحو تسخير إمكاناتها ضد السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة الأبحاث الألمانية) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 و Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (إلى H.P.) ، وهي منحة بحثية Mechtild Harf من مؤسسة DKMS لإعطاء الحياة (إلى H.P.) جائزة الباحث الشاب من قبل تحالف أبحاث سرطان الجلد (إلى S.H.) ، وهي منحة دراسية من قبل مؤسسة Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (إلى F.S.) ، صندوق تأسيسي من الجامعة التقنية في ميونيخ (إلى S.H) ومنحة بحثية من مؤسسة فيلهلم ساندر (2021.041.1 ، إلى S.H.). يتم دعم H. P. من قبل برنامج EMBO للمحققين الشباب.
مساهمات المؤلف:
قام F.S. ، H.P. ، و S.H. بتصميم البحث وتحليله وتفسيره للنتائج. كتب ف. س. و س. ه. المخطوطة. قام H.P. و S.H. بتوجيه الدراسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
References
- Kroemer, G., Galluzzi, L., Kepp, O., Zitvogel, L. Immunogenic cell death in cancer therapy. Annual Review of Immunology. 31, 51-72 (2013).
- Kepp, O., et al. Consensus guidelines for the detection of immunogenic cell death. Oncoimmunology. 3 (9), 955691 (2014).
- Fuertes, M. B., et al. Host type I IFN signals are required for antitumor CD8+ T cell responses through CD8{alpha}+ dendritic cells. The Journal of Experimental Medicine. 208 (10), 2005-2016 (2011).
- Sistigu, A., et al. Cancer cell-autonomous contribution of type I interferon signaling to the efficacy of chemotherapy. Nature Medicine. 20 (11), 1301-1309 (2014).
- Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome. Nature reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).
- Shankaran, V., et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature. 410 (6832), 1107-1111 (2001).
- Tesniere, A., et al. Immunogenic death of colon cancer cells treated with oxaliplatin. Oncogene. 29 (4), 482-491 (2010).
- van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
- Zomer, A., van Rheenen, J. Implications of extracellular vesicle transfer on cellular heterogeneity in cancer: What are the potential clinical ramifications. Cancer Research. 76 (8), 2071-2075 (2016).
- Whiteside, T. L. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1216-1223 (2016).
- Wolfers, J., et al. Tumor-derived exosomes are a source of shared tumor rejection antigens for CTL cross-priming. Nature Medicine. 7 (3), 297-303 (2001).
- Zeelenberg, I. S., et al. Targeting tumor antigens to secreted membrane vesicles in vivo induces efficient antitumor immune responses. Cancer Research. 68 (4), 1228-1235 (2008).
- Diamond, J. M., et al. Exosomes Shuttle TREX1-Sensitive IFN-Stimulatory dsDNA from Irradiated Cancer Cells to DCs. Cancer Immunology Research. 6 (8), 910-920 (2018).
- Kitai, Y., et al. DNA-containing exosomes derived from cancer cells treated with topotecan activate a STING-dependent pathway and reinforce antitumor immunity. Journal of Immunology. 198 (4), 1649-1659 (2017).
- Heidegger, S., et al. RIG-I activation is critical for responsiveness to checkpoint blockade. Science Immunology. 4 (39), 8943 (2019).
- Schadt, L., et al. Cancer-cell-intrinsic cGAS expression mediates tumor immunogenicity. Cell Reports. 29 (5), 1236-1248 (2019).
- Cheng, Y., et al. In situ immunization of a TLR9 agonist virus-like particle enhances anti-PD1 therapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 8 (2), (2020).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and storage stability of extracellular vesicles for therapeutic applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Suarez, H., et al. A bead-assisted flow cytometry method for the semi-quantitative analysis of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 7 (1), 11271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles in fresh plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Kapasi, Z. F., Murali-Krishna, K., McRae, M. L., Ahmed, R. Defective generation but normal maintenance of memory T cells in old mice. European Journal of Immunology. 32 (6), 1567-1573 (2002).
- Bloom, M. B., et al. Identification of tyrosinase-related protein 2 as a tumor rejection antigen for the B16 melanoma. The Journal of Experimental Medicine. 185 (3), 453-459 (1997).
- Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Scientific Reports. 9 (1), 5335 (2019).
- DeGrendele, H. C., Kosfiszer, M., Estess, P., Siegelman, M. H. CD44 activation and associated primary adhesion is inducible via T cell receptor stimulation. The Journal of Immunology. 159 (6), 2549-2553 (1997).
- Yang, S., Liu, F., Wang, Q. J., Rosenberg, S. A., Morgan, R. A. The shedding of CD62L (L-selectin) regulates the acquisition of lytic activity in human tumor reactive T lymphocytes. PLoS One. 6 (7), 22530 (2011).
- Bek, S., et al. Targeting intrinsic RIG-I signaling turns melanoma cells into type I interferon-releasing cellular antitumor vaccines. Oncoimmunology. 8 (4), 1570779 (2019).
- Nabet, B. Y., et al. Exosome RNA unshielding couples stromal activation to pattern recognition receptor signaling in cancer. Cell. 170 (2), 352-366 (2017).
- Pitt, J. M., Kroemer, G., Zitvogel, L. Extracellular vesicles: masters of intercellular communication and potential clinical interventions. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1139-1143 (2016).
