Summary
이 원고는 유세포 분석기를 사용하여 종양 세포 유래 세포밖 소포 (EVs)의 생체 내 면역원성을 평가하는 방법을 설명합니다. 치료를 받는 종양으로부터 유래된 EVs-유도된 면역원성 세포 사멸은 종양 면역감시에 특히 관련있는 것으로 보인다. 이 프로토콜은 옥살리플라틴-유도된 면역자극성 종양 EVs의 평가를 예시하지만, 다양한 설정에 적응될 수 있다.
Abstract
화학요법 또는 방사선 조사에 의해 야기된 종양의 면역원성 세포 사멸은 위험-관련 분자 패턴을 방출하고 타입 I 인터페론의 생산을 유도함으로써 종양 특이적 T 세포 반응을 촉발시킬 수 있다. 체크포인트 억제를 포함한 면역요법은 주로 치료 효과를 전개하기 위해 기존의 종양 특이적 T 세포에 의존한다. 따라서, 면역원성 세포 사멸을 내재적 항암 백신으로서 이용하는 상승적 치료 접근법은 그들의 반응성을 향상시킬 수 있다. 그러나, 치료-유도된 스트레스 하에서 세포에 의해 방출되는 면역원성 인자의 스펙트럼은 특히 세포밖 소포(EVs)와 관련하여 불완전하게 특성화되어 있다. 거의 모든 세포에서 방출되는 나노 규모의 막성 입자 인 EVs는 세포 간 통신을 용이하게하는 것으로 간주되며, 암에서는 종양 항원에 대한 교차 프라이밍을 매개하는 것으로 나타났습니다. 다양한 조건하에서 종양으로부터 유래된 EVs의 면역원성 효과를 평가하기 위해, 적응가능하고, 확장 가능하고, 유효한 방법들이 요구된다. 따라서, 본원에서 EVs'의 생체내 면역원성을 평가하기 위해 비교적 쉽고 강력한 접근법이 제시된다. 이 프로토콜은 EVs로 마우스를 생체내 면역화한 후 비장 T 세포의 유세포 분석 분석에 기초하며, 치료 또는 정상 상태 조건 하에서 종양 세포 배양물로부터 침전 기반 분석에 의해 단리된다. 예를 들어, 이 연구는 B16-OVA 뮤린 흑색종 세포의 옥살리플라틴 노출이 종양 반응성 세포독성 T 세포의 활성화를 매개할 수 있는 면역원성 EVs의 방출을 가져왔다는 것을 보여준다. 따라서, 생체내 면역화 및 유동 세포측정법을 통한 EV의 스크리닝은 면역원성 EV가 출현할 수 있는 조건을 식별한다. 면역원성 EV 방출의 조건을 확인하는 것은 암에 대한 EV의 치료 효능을 테스트하고 암 면역학에서 EV의 역할에 대한 새로운 통찰력을 궁극적으로 공개하기 위해 근본적인 분자 메커니즘을 탐구하는 데 필수적인 전제 조건을 제공합니다.
Introduction
면역 체계는 면역 체크포인트 억제에 의해 유발될 때와 종래의 암 치료법의 효능에 대해 암과의 싸움에서 중추적인 역할을 한다. 화학요법제인 옥살리플라틴 및 독소루비신과 같은 유전독성 요법에 굴복하거나 이온화 방사선 치료로 인해 항원 및 잠재적으로 적응성 항종양 면역 반응을 개시하는 위험 관련 분자 패턴(DAMP)을 방출할 수 있다1. 면역원성 세포 사멸의 맥락에서 가장 두드러진 DAMPs는 화학주성 ATP와 같은 find-me 신호, 칼레티쿨린의 노출과 같은 먹거리-나 신호, 항원 제시 세포에 의한 종양 세포 흡수를 촉진하고, 패턴 인식 수용체를 활성화시켜 종양 항원의 교차 제시를 증진시키는 HMGB1의 방출을 포함한다2. 또한, 종양 유래 면역원성 핵산 또는 다른 자극을 통해 유도되는 I형 인터페론(IFN-I)은 수지상 세포에 의해 감지되어 종양 특이적 세포독성 T 세포를 효과적으로 프라이밍할 수 있게 한다3,4. 임상적으로, 활성화되고 증식하는 CD8+ T 세포는 종양에 침윤하여 많은 암 환자에서 장기간 생존을 위한 독립적인 예후 인자를 제공한다. 이러한 활성화된 T 세포로부터 방출된 IFN-γ은 암 세포에 대한 직접적인 항증식 효과를 매개하고 Th1 분극화 및 세포독성 T 세포 분화를 유도하여 암에 대한 효과적인 면역감시에 기여한다5,6. 옥살리플라틴은 암에 대한 이러한 적응성 면역 반응을 매개하는 선의의 면역원성 세포 사멸 유도제이다7. 그러나, 치료-유도된 스트레스 하에서 종양 세포에 의해 방출되는 초기 면역원성 신호의 과다함은 완전히 밝혀진 채로 남아 있다. 암 면역 요법의 상당한 발전에도 불구하고, 환자의 더 많은 부분에 그 혜택을 확대하는 것은 여전히 어려운 과제입니다. T 세포 활성화를 개시하는 면역원성 신호에 대한 보다 상세한 이해는 새로운 치료법의 개발을 안내할 수 있다.
세포밖 소포 (EVs)로 알려진 막으로 둘러싸인 구조의 이종 그룹은 세포 간 통신 장치 역할을하는 것으로 보인다. 거의 모든 세포 유형에 의해 방출되는 EV는 기능적 단백질, RNA, DNA 및 기타 분자를 수용자 세포에 운반하거나 세포 표면의 수용체에 결합함으로써 세포의 기능 상태를 변경할 수 있습니다. 이들의 생물학적 활성 화물은 생성 세포의 유형 및 기능 상태에 따라 크게 달라진다8. 암 면역학에서, 종양 세포로부터 방출된 EV는 결국 침습적 성장을 촉진하고, 전이성 틈새를 형성하며9, 면역 반응을 억제하기 때문에 면역요법에 대한 적대적인 것으로 우세하게 간주되어 왔다10. 대조적으로, 일부 연구는 EV가 효과적인 교차 프리젠 테이션을 위해 종양 항원을 수지상 세포로 옮길 수 있음을 보여주었습니다11,12. EVs는 치료-유도된 스트레스 하에서 출현하는 경우 면역자극성 핵산을 제공할 수 있고, 항종양 면역 반응을 촉진시킨다13,14. 종양 미세환경에서 이러한 RNA 및 DNA 선천적 면역 리간드의 감지는 최근 체크포인트 봉쇄에 대한 반응성을 유의적으로 조절하는 것으로 나타났다15,16,17. 따라서, 상이한 요법-유도된 스트레스 하에서 종양 세포에 의해 방출되는 EVs의 면역원성 역할은 추가로 해명될 필요가 있다. EV는 젊지만 성장하는 연구 분야를 구성하기 때문에 방법의 표준화는 여전히 진행 중입니다. 따라서 EV와 암 면역학 간의 상호 작용에 대한 연구 재현성을 향상시키기 위해 지식을 공유하는 것이 필수적입니다. 이를 염두에두고,이 원고는 생체 내에서 종양 유래 EV의 면역원성 효과를 평가하기위한 간단한 프로토콜을 설명합니다.
이 평가는 종양 유래 EV를 생성하고, 수용자 마우스를 그 EV로 면역화하고, 유세포 분석기를 통해 비장 T 세포를 분석함으로써 수행됩니다. EV 생성은 뮤린 종양 세포를 높은 순도의 EV가 없는 세포 배양 배지에 시딩함으로써 이상적으로 수행된다. 세포는 화학요법과 같은 특정 세포 스트레스 자극으로 처리되어, 치료-유도된 EVs의 효과를 각각의 종양 유래 EVs의 기준선 면역원성과 비교한다. EV들의 단리는 생체내 적용가능성 및 국부적 이용가능성에 따라 선택되어야 하는 다양한 기술들에 의해 잘 수행될 수 있다. 다음 프로토콜은 EV 정제를 위한 상용 키트를 사용한 침전 기반 분석을 기술한다. 마우스는 EV로 두 번 예방 접종을받습니다. 첫 번째 주사 후 십사일 후, T 세포는 비장으로부터 추출되고 유세포 분석기를 통해 IFN-γ 생산을 분석하여 전신 면역 반응을 평가하였다. 이와 함께, 상이한 치료 요법 하에서 출현하는 종양 유래 EVs의 잠재성은 항종양 T 세포 반응을 유도하기 위해 비교적 쉽고, 신속하며, 높은 타당성으로 평가된다13. 따라서, 이 방법은 다양한 조건하에서 암 세포로부터 유래된 EVs의 면역학적 스크리닝에 적합하다.
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Protocol
실험 개시시, 마우스는 적어도 6주령이었고, 특정 병원체가 없는 조건 하에서 유지되었다. 본 프로토콜은 제도적 윤리 기준과 통용되는 지역 규정을 준수합니다. 동물 연구는 현지 규제 기관 (Regierung von Oberbayern, 독일 뮌헨)의 승인을 받았습니다. 가능한 성 관련 편향은 이들 연구에서 조사되지 않았다.
1. 화학요법 노출 후 종양 세포로부터 유래된 EVs의 생성 및 분리
- 오브알부민(B16-OVA)을 발현하는 뮤린 B16 흑색종 세포를 FCS(10% v/v), 페니실린(100 Units/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 보충된 DMEM(4 mM L-글루타민 및 4.5 g/L D-글루코스 함유)에서 37°C에서 배양하여, 세포가 꾸준히 성장하고 약 90% 컨플루언트될 때까지 배양한다.
참고: 프로토콜의 이 섹션은 전적으로 세포 배양 후드를 사용하여 멸균 조건 하에서 수행하십시오. 다른 암 개체의 분석을 위해, 강력한 항원을 발현하는 세포주는 특정 생체외 항원 재자극을 허용하기 때문에 항원 특이적 T 세포 반응을 평가하는 것이 바람직하다. - EV 생성에 필요한 세포 배양 배지를 제조하기 위해, 4°C에서 24시간 동안 100,000 x g 에서 초원심분리하여 소 EVs를 고갈시킨 다음, 펠렛을 폐기한다. 또는 동물 EV가 낮은 상업용 제제를 미리 선택하십시오.
- B16-OVA 세포를 수확하고 PBS에서 두 번 세척한 다음, EV 고갈 배지에서 400,000 cells/mL의 농도로 시드한다.
참고: 세포가 과도하게 자라지 않도록 조사중인 세포주의 성장 역학에 세포 농도를 조정하십시오. - mL당 30μg의 옥살리플라틴을 첨가하여 B16-OVA 세포를 치료하고 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다. 제어 조건을 치료하지 않은 상태로 두십시오. 유전독성 물질의 최초 사용시, 트리판 블루 배제18과 같은 세포 생존성 검정을 사용하여 원하는 세포독성 효능을 적정한다.
참고: 이 분석은 또한 화학요법제 외에 다른 면역 조절 물질 또는 이온화 조사로 처리된 세포 배양물에서 생성된 EV를 평가할 수 있다.
주의: 옥살리플라틴은 피부와 심한 눈 자극을 유발하며 알레르기 성 피부 반응과 호흡기 자극을 유발할 수 있습니다. 옥살리플라틴은 암을 유발하는 것으로 의심된다. 예방 조치로 적절한 장갑, 고글, 마스크 및 의복을 포함한 개인 보호 장비를 재사용 전에 청소하십시오. 흡입을 피하고 취급 후 손을 깨끗이 씻으십시오. 환경으로의 방출을 피하고 지배적 인 규정에 따라 옥살리 플라틴을 처분하십시오. 안전 데이터 시트에서 자세한 정보를 얻으십시오. - 세포 배양 상청액을 수집한다. 원심분리기는 먼저 4°C에서 5분 동안 400 x g에서 5분 동안 원심분리한 다음, 2,000 x g에서 4°C에서 30분 동안 매번 펠렛을 폐기한다. 마지막으로, 220 nm PVDF 멤브레인을 통해 여과한다. 각 단계마다 신선한 튜브를 사용하여 세포 파편을 제거하십시오.
참고: 이 단계에서, EV-함유 상청액은 프로토콜을 재개하기 전에 하루 동안 4°C에서 저장될 수 있다. 그러나 즉각적인 EV 정화로 설명 된 일정을 준수하는 것이 좋습니다. - 1 mL의 상청액을 0.5 mL의 특정 상업적으로 입수가능한 엑소좀 분리 시약 ( 표 표 참조)과 V자형 1.5 mL 튜브에 섞는다. 철저하게 피펫을 위아래로 피펫하거나 와류하여 균질 한 솔루션을 만듭니다. 4°C에서 하룻밤 동안 인큐베이션한다.
- 4°C에서 60분 동안 10,000 x g 에서 원심분리한다. 조심스럽게 상층액을 버리십시오. 1.5 mL 튜브를 종이 타월에 거꾸로 두드리고, 바닥의 EV 펠릿을 만지지 않고 미세한 팁이 있는 피펫을 통해 흡인하여 나머지 방울을 제거하십시오.
- EV-펠릿의 제어되지 않은 희석을 방지하기 위해 모든 유체를 철저히 제거하십시오. 또한 펠릿이 건조되는 것을 방지하기 위해 이러한 작업을 신속하게 실행하십시오.
- 튜브 벽에서 펠릿을 팁으로 긁지 않고 위아래로 피펫팅하여 차가운 PBS에서 EV를 재현탁하십시오. 이제 서스펜션을 첫 번째 튜브에서 마지막 튜브로 단계별로 전송하여 EV를 풀링합니다.
참고: 5μL에 튜브 수를 곱한 PBS 부피를 사용하십시오. 최종 현탁액의 5 μL는 화학요법 하에 또는 정상 상태에서 400,000 세포로부터 방출된 단리된 EV를 함유한다. - EV를 직접 사용하는 것이 좋습니다. 이것이 가능하지 않은 경우, EV 현탁액을 적용 할 때까지 최대 28 일 동안 실리콘 용기에 -80 °C에서 보관하십시오.
참고: 여기 및 몇몇 다른 간행물에서 기술된 EVs는 그 기간 동안 -80°C에서 저장될 때 각각의 생물학적 기능을 잃지 않는다19. - MISEV2018 지침에 따라 EV 분리물을 정량화하고 특성화하십시오20.
참고: 정량화를 위한 가능한 방법에는 나노입자 추적 분석(NTA)21 및 EV의 막 결합 단백질22의 검출이 포함된다. EV를 추가로 특성화하기 위한 가능한 접근법은 전자 현미경23 및 웨스턴 블롯(Western blot20)을 포함한다.
2. EVs를 가진 쥐의 예방접종
- C57BL/6 마우스(또는 종양 세포주에 상응하는 다른 syngeneic 마우스)를 사용한 생체내 실험을 각각 계획된 단계, 처리되지 않은 세포, 및 PBS(비히클)로부터 유래된 EVs를 투여받은 처리군을 포함한다.
참고: 생리적 노화가 면역 반응을 감소시키는 것을 방지하기 위해 6-8주의 나이에 마우스를 사용하는 것이 바람직합니다24. - 5 μL의 EV 현탁액을 각각의 처리군 내의 각 마우스에 대해 55 μL 차가운 PBS와 혼합하여 이를 4.0 x 105 B16-OVA 세포로부터 단리된 EVs로 면역화시킨다.
참고: 이 EV의 양은 나노입자 추적 분석(데이터 미도시)에 의해 측정된 약 2 x 109 입자에 해당합니다. 애쥬번트와 혼합된 OVA 단백질 (예를 들어, LPS)은 강력한 백신 양성 대조군으로서 적용될 수 있다.- 주사기 (바늘 크기 26-30 G)를 희석된 EV 또는 PBS의 60 μL로 각각 채우고 즉시 얼음 위에 놓는다.
참고: 프로토콜에서, 주입된 EVs의 양은 종양 세포 EV 생물발생에 대한 옥살리플라틴의 질적 및 양적 효과를 실험적으로 고려하기 위해 EV 방출 종양 세포의 수로 정규화된다. 일부 독자의 경우, 생산 된 EV의 특정 농도로 정규화하는 것은 과학적 질문에 따라 실험 설정에 더 적합 할 수 있습니다.
- 주사기 (바늘 크기 26-30 G)를 희석된 EV 또는 PBS의 60 μL로 각각 채우고 즉시 얼음 위에 놓는다.
- EV 또는 PBS를 마우스의 허벅지의 내측 측면에 피하 접종하고 7일 후에 면역화를 반복한다. 첫 번째 치료 후 열네 일 후, 희생 마우스, 예를 들어, 자궁 경부 탈구에 의해 면역 반응을 분석한다.
참고: 현지 표준에 따라 대체 피하 주입 경로를 사용할 수 있습니다.
3. 비장 T 세포의 유세포 분석
- RPMI-1640에 FCS(10% v/v), 페니실린(100 유닛/mL), 스트렙토마이신(100 μg/mL), L-글루타민(2mM) 및 β-머캅토에탄올(50 μM)을 보충하여 완전한 RPMI(cRPMI)를 준비하고 식히십시오.
- 열린 복강에서 비장을 절제하십시오. 축축한 100 μm 세포 스트레이너와 주사기의 플라스틱 플런저로 비장을 으깬 다음 비장 세포를 5-10 mL의 cRPMI가있는 50 mL 튜브로 플러시하십시오. 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하고 상층액을 버린다.
참고: 가능하면 세포를 얼음 위에 보관하십시오. 비장 면역 반응보다는 국소적 반응을 분석하려면 동일한 프로토콜에 따라 배수되는 포플라이트 림프절과 사타구니 림프절을 절제하십시오. 이 경우 적혈구 용해를위한 다음 단계를 건너 뜁니다. - 세포 현탁액으로부터 적혈구를 제거하기 위해, 펠렛을 적혈구 용해 완충액 2 mL ( 표 표 참조)로 재현탁시키고 실온에서 5분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음, cRPMI를 첨가하여 반응을 중지시킨다. 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하고 상층액을 버린다.
- 시딩을 위해, 세포 펠릿을 cRPMI에 재현탁시키고, U자형 바닥을 갖는 96-웰 플레이트를 사용하여 200 μL cRPMI를 갖는 200,000개의 세포의 삼중항을 각 웰 내로 배치하기 위해 세포를 계수한다. 37°C에서 48시간 동안 인큐베이션한다.
참고: 활성화된 T 세포의 항원 특이성을 다루려면 1μg/mL 가용성 난알부민(또는 조사 중인 세포주에 해당하는 다른 종양 항원)을 추가하거나 각각 추가 자극 없이 방치하십시오. 면역우성 펩티드 에피토프 SIINFEKL을 전장 오브알부민 대신에 첨가하는 것은 더 짧은 잠복기를 허용한다. 유세포 분석 외에, 마우스의 혈청 및 세포 배양 상청액은 48시간의 배양 후에 다양한 사이토카인에 대해 분석될 수 있다. - 48시간 후, 특히 골지 매개 단백질 분비를 차단하여 세포내 IFN-γ 염색을 강화하려면 브레펠딘 A(5 ng/mL), PMA(20 ng/mL) 및 이오노마이신(1 μg/mL)을 세포 배양에 첨가한다. 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션한다.
- 표면 바이오마커를 염색하기 전에, 비장세포를 V자형 바닥을 가진 96-웰 플레이트로 옮기고 PBS로 두 번 세척한다. 이어서, 국소 이용가능한 유동 세포계와 상용성인 형광 항체를 추가하고, 표면 바이오마커, CD3, CD8, 및 CD4 ( 표 물질 참조)에 대해 지시하고, 1:400으로 희석하고, 고정성 생존성 염료를 더하고, PBS에서 1:1,000으로 희석하였다. 펠렛화된 비장세포를 염색 용액에 재현탁시키고, 4°C에서 30분 동안 인큐베이션하고, 빛으로부터 보호한다.
- 비장세포의 고정 및 투과를 위해, FACS-완충액(PBS 플러스 3% v/v FCS)에서 두 번 세척한 다음, 웰당 100μL의 고정/투과 완충액( 물질 표 참조)에 재현탁시킨다. 4°C에서 30분 동안 인큐베이션하고, 빛으로부터 보호한다.
- 세포 내 IFN-γ의 염색을 위해, 비장세포를 고정/투과 완충액으로 세척하고 IFN-γ에 대한 형광 항체로 재현탁하여 완충액에 1:200으로 희석하십시오. 4°C에서 적어도 1시간(최대 12시간) 동안 인큐베이션하고, 빛으로부터 보호한다.
- 유세포 분석기로 샘플을 측정하기 전에 비장 세포를 고정 / 투과 완충액에서 두 번 씻고 FACS 버퍼에 재현탁하십시오. 도 2에 표시된 게이팅 전략에 따른 세포독성 T 세포의 활성화를 분석한다.
- 먼저, 단일 세포를 검출하기 위해, FSC-A에 대해 FSC-H를 블롯한다. 그런 다음, 림프성 세포를 검출하기 위해, FSC-A에 대해 SSC를 블롯한다. 이어서, 살아있는 CD3+, CD4-, CD8+ 세포를 선택하고 비장에서의 세포독성 T 세포의 활성화를 정량화하기 위해 그들의 IFN-γ-생산 서브세트를 결정한다.
참고: IFN-γ에 대해 표적화된 형광 크롬을 제외한 모든 형광 크롬을 음성 기술 대조군으로 포함하는 형광-마이너스-온(FMO) 염색을 포함한다.
- 먼저, 단일 세포를 검출하기 위해, FSC-A에 대해 FSC-H를 블롯한다. 그런 다음, 림프성 세포를 검출하기 위해, FSC-A에 대해 SSC를 블롯한다. 이어서, 살아있는 CD3+, CD4-, CD8+ 세포를 선택하고 비장에서의 세포독성 T 세포의 활성화를 정량화하기 위해 그들의 IFN-γ-생산 서브세트를 결정한다.
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Representative Results
이 프로토콜은 종양 유래 EVs의 면역원성의 간단하고 쉽게 재현가능한 평가를 용이하게 하기 위한 것이다. 이에 의해, 마우스는 모델 항원인 닭 난알부민(OVA)을 발현하는 종양 세포의 시험관내 배양물 로부터 유래된 EVs를 접종한다. 후속 면역 반응은 유세포 분석기를 통해 비장 T 세포에서 분석된다.
그림 1은 전체 프로토콜의 실제 단계에 대한 개요를 제공합니다. 이 연구는 면역원성 세포 사멸, 교차 제시 및 EV 유도 항종양 면역에 초점을 맞추기 때문에, 이 프로토콜은 CD8+ 세포독성 T 세포의 기능으로 제한된다. 도 2에 표시된 바와 같이, 세포는 단일 세포, 림프구 서브세트(크기 및 과립성에 의한), 생존 세포(생명/사형 마커 제외) 및 CD3+ CD4-CD8+ 세포독성 T 세포로서 게이팅되었다. IFN-γ의 세포내 축적은 활성화를 위한 대리 마커로서 평가되었다. T 세포 분화 및 고갈에 관한 가능한 추가적인 마커는 하기에 논의된다.
본원에 기재된 방법을 사용하여, 마우스를 정상 상태(미처리) 또는 유전독성 스트레스 조건(옥살리플라틴-처리) 하에서 배양된 OVA 발현 종양 세포로부터 유래된 EVs로 면역화시켰다. 유전독성 스트레스 조건 하에서 종양 세포로부터 유래된 EVs를 주입한 마우스만이 수용자 동물에서 비장 세포독성 T 세포의 강력한 활성화를 유도하였다(도 3A). 정상 상태 조건 하에서 종양으로부터 유래된 EVs의 주입은 일부 T 세포 활성화를 초래했지만, 이는 PBS 비히클을 주입한 마우스에서의 T 세포 활성화와 유의하게 다르지 않았다. 이들 데이터는 유전독성 스트레스 하에서, 종양 세포가 강력하게 면역원성 EVs를 방출할 수 있다는 것을 보여준다. IFN-γ의 생산은 종양 EV 처리된 동물의 비장세포가 분석 전에 모델 종양 항원 OVA로 생체외 에서 재자극되었을 때 특히 증가하였다(도 3B). 이들 데이터는 종양 유래 EV가 종양 항원-특이적 면역 반응을 유도할 수 있음을 시사한다. 흥미롭게도, IFN-γ-생산은 비록 훨씬 더 적은 정도로도- 항원-특이적 재자극의 부재 하에서도 검출된다. 아마도, 분화 항원 TRP225와 같은 다른 흑색종-관련 항원은 EV 유도된 T 세포 반응의 일부 부분에 의해 표적화될 수 있다.
도 1: 프로토콜의 그림 개요 . (A) 화학요법과 유사한 종양 세포 배양물에서 생성된 EVs의 단리 절차. (b) 마우스를 EV로 면역화하기 위한 스케줄. (c) 세포독성 T 세포의 유세포 분석을 위한 염색 프로토콜. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 비장에서의 세포독성 T 세포 활성화를 분석하기 위한 유세포 게이팅 전략. 숫자는 각 부모 모집단의 비율을 나타냅니다. FSC-A: 전방 산란 영역; FSC-H: 전방 산란 높이; SSC: 측면 산란; 살아있는 / 죽은 : 세포 죽음 마커. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 유전독성 스트레스 하에서 종양 세포로부터 유래된 EVs는 수용자 동물에서 항원-특이적 T 세포 반응을 유도할 수 있다. (A) 마우스는 정상 상태(미처리) 또는 유전독성 스트레스 조건(옥살리플라틴-처리) 하에서 배양된 종양 세포로부터 유래된 EVs로 면역화되었다. 비히클(PBS) 주사제는 음성 대조군으로 사용하였다. IFN-γ EV 면역화 시 비장에서의 세포독성 T 세포에 의한 생산을 결정하였다. 이것으로, 비장 세포 현탁액을 분석 전에 생체외 난알부민으로 재자극하였다. (b) 마우스는 상기와 같은 유전독성 스트레스 조건 하에서 종양 세포로부터 유래된 EVs로 처리되었다. 비장 T 세포 활성화는 난알부민의 존재 또는 부재 하에 생체외 재자극 후에 결정되었다. 막대는 그룹당 평균을 묘사하고 표준 오류를 수염으로 표시합니다. Bonferroni 사후 테스트를 사용한 분산 분석(ANOVA) 검정을 사용하여 데이터 세트의 여러 통계적 비교를 수행했습니다. 유의 수준은 P < 0.05, P < 0.01 및 P < 0.001로 설정되었으며 여기에 별표 (*, **, 및 ***)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 다양한 치료 하에서 다양한 암으로부터 방출되는 EV에 적응하면서 화학요법-유도된 스트레스 하에서 흑색종 세포로부터 유래된 EVs의 면역학적 생체내 평가를 제공한다. 옥살리플라틴-처리된 B16-OVA 세포로부터 유래된 EVs로 마우스를 면역화시키는 것은, 예를 들어, 비장에서 IFN-γ-생산 CD8+ T 세포를 확장시키고, 이는 오브알부민을 사용한 생체외 인큐베이션에 의해 추가로 자극되어, 종양 특이적 면역 반응을 나타낸다. 따라서, 이 프로토콜을 통한 스크리닝에 의한 면역원성 EVs의 검출은 종래의 암 치료법에 대한 보다 포괄적인 이해를 용이하게 하고, 암 면역학에서 EVs의 역할에 대한 집중적인 조사를 가능하게 한다.
EV를 사용한 실험에는 몇 가지 특별한 고려 사항이 필요합니다. 이 프로토콜에서, EVs는 24시간 이내에 방출된 종양 세포의 수로 반-정량적으로 정규화된다. 이 접근법은 방출 된 EV의 품질 또는 수량의 변화로 인해 발생하는지 여부에 관계없이 향상된 면역원성을 확인하려는 목표를 반영합니다. 따라서, 재현가능한 생체내 결과는 EVs의 지속적인 분리 효능에 의존한다. 이를 위해 건조를 피하기 위해 EV 펠릿을 완전하고 신속하게 재현탁시키는 것이 중요한 단계입니다.
추가적으로, EV는 예를 들어, 나노입자 추적 분석 및 정준 횡단막, 발광 및 적어도 하나의 네거티브 EV-마커20의 웨스턴 블롯에 의해 정량화되고 특성화되어야 한다. EV를 정량화하고 특성화하여 불변의 분리를 제어하고 EV 또는 EV 서브세트의 정량적 차이를 해결합니다. 이러한 유형의 EV 특성화는 국제 세포 밖 소포 학회 (ISEV) 지침에 따라 세포 밖 소포에 관한 연구에서보고되어야하는 최소 정보의 일부를 구성합니다. 그러나 다양한 특성화 방법은 똑같이 합법적이며 지역 가용성 및 개별 연구 문제와 관련하여 선택해야합니다. 특히, 관심있는 물질의 투여량을 정의하거나 이온화 조사를 하는 것은 프로토콜의 또 다른 중요한 단계를 구성하며, 이는 적절한 수준의 세포 사멸을 달성하기 위해 실험적 검증이 필요할 수 있다.
일반적으로, 처리 물질, 가용성 단백질 및 지단백질로 분리된 EVs의 잠재적 오염이 고려되어야 한다. 이와 관련하여 한 가지 전략은 동일한 유형의 오염20 이 손상되지 않을 수 있는 보완적인 EV-격리 기술로 실험을 재현하는 것입니다. 면역친화도는, 예를 들어, 순전히 침전-기반 방법보다 더 낮은 수율이지만 더 높은 특이성을 갖는 EVs를 단리하고, 이와 관련하여 적절한 조절을 제공할 수 있다26. 대안적인 접근법은 야생형 세포 유래 EV를 유전자 조작된 세포로부터의 분리와 EV 생물발생에 관여하는 유전자의 특정 결실과 비교하거나 EV 방출을 감소시키는 물질을 전개하는 것이다20.
이 프로토콜로부터 수득된 결과는 EV 매개 면역 반응의 보다 포괄적인 특성화에 의해 보완되어야 한다. 특히 CD4427을 통해 CD8+ T 세포를 이펙터 및 이펙터 기억 세포로 분류하는 것은 CD62L28을 통해 항원 순진하고 중앙 기억 세포뿐만 아니라 더 깊은 통찰력을 전달할 수 있습니다. 또한, T 헬퍼 세포, 조절 T 세포, 및 NK 세포의 분석이 관심의 대상이 될 수 있다. EVs의 항종양 효능을 시험하기 위해, 마우스는 EV 면역화를 받거나 미리 확립된 암에 대해 EVs로 치료한 후에 상응하는 암 세포에 도전할 수 있고, 이로써 면역원성 세포 사멸2,29의 검출을 위한 가이드라인을 이 무세포 종양 유도체에 적응시킬 수 있다. 그러나, 이러한 모든 실험 설정으로부터의 결론은 페트리 접시의 암 세포가 종종 항암 면역을 억제하는 동적 종양 미세 환경30에 매립된 암 세포와는 기능적으로 다른 EV를 잠재적으로 생성한다는 사실에 의해 제한된다. 따라서, 종양/섬유아세포 공동배양물 또는 생체외 종양 조직으로부터 유래된 EV를 평가하는 것은 실제 상황을 더 잘 반영할 수 있다. 임상 현실을 향한 다음 번역 단계에서, 환자 물질로부터의 EVs는 바이오마커로서의 유용성을 평가하기 위해 치료 전과 치료 중에 면역원성에 대해 분석될 수 있다.
암 유래 EV가 최근 특정 상황에서 면역 체계를 조절하는 것으로 밝혀짐에 따라 임상 잠재력을 탐구하는 여정은 이제 막 시작되었습니다31. 면역원성 EV에 의해 공동 선택된 면역 메커니즘의 심층 분석을 위해, 유용한 도구는 특정 세포에 의한 EV 흡수를 시각화하는 형광 현미경 검사, 특정 면역 경로에 대한 유전적 결함을 가진 마우스의 전개 및 EV 함량의 분자 변경에 대한 스크리닝 방법을 포함한다. 궁극적으로, 본원에 기술된 스크리닝 방법을 사용하여 면역원성 종양 유래 EV를 동정하는 것은 EV-매개 면역의 배후에 있는 근본적인 메카니즘에 대한 더 나은 이해를 가능하게 할 것이며, 따라서 암에 대한 그들의 잠재력을 이용하기 위한 중요한 단계를 구성한다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - Projektnummer 360372040 - SFB 1335 및 Projektnummer 395357507 - SFB 1371 (H.P.), DKMS Foundation for Giving Life (H.P.)의 Mechtild Harf Research Grant, Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (F.S.)의 장학금 인 Melanoma Research Alliance (S.H.)의 Young Investigator Award를 지원했습니다. 뮌헨 기술 대학 (S.H.)의 종자 기금과 빌헬름 샌더 재단 (2021.041.1, S.H.)의 연구 보조금. H. P.는 EMBO Young Investigator Program의 지원을 받습니다.
저자 기여 :
F.S., H.P., S.H.는 연구를 설계하고, 분석하고, 결과를 해석했습니다. F.S.와 S.H.는 원고를 썼다. H.P.와 S.H.가 연구를 이끌었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-CD3 FITC | Biolegend | 100204 | Clone 17A2 |
| Anti-CD4 PacBlue | Biolegend | 100428 | Clone GK1.5 |
| Anti-CD8 APC | Biolegend | 100712 | Clone 53-6.7 |
| Anti-IFNγ PE | eBioscience | RM90022 | Clone XMG1.2 |
| Brefeldin A | Biolegend | 420601 | Brefeldin A Solution (1,000x) |
| Cell Strainer, 100 µm | Greiner | 542000 | EASYstrainer 100 µm |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Dulbecco's Modified Eagle's Medium with D-glucose (4.5 g/L) and L-glutamine (4 mM) |
| FBS Good Forte | PAN BIOTECH | P40-47500 | Fetal Calf Serum (FCS) |
| Fixable Viability Dye eFluor 506 | eBioscience, division of Thermo Fischer Scientific | 65-0866-14 | |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | Fixation/Permeabilization Concentrate (10x) |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | 407952 | From Streptomyces conglobatus - CAS 56092-82-1, ≥ 97% (HPLC) |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-032 | L-Glutamine (200 mM) |
| Ovalbumin | InvivoGen | vac-pova | Ovalbumine with < 1 EU/mg endotoxin - CAS 9006-59-1 |
| Oxaliplatin | Pharmacy of MRI hospital | ||
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Phosphate Buffered Saline without calcium chloride and magnesium chloride |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 1514-122 | Mixture of penicillin (10,000 U/mL) and streptomycin (10,000 ug/mL) |
| PMA | Sigma-Aldrich | P1585 | Phorbol 12-myristate 13-acetate, ≥ 99% (HPLC) |
| PVDF filter, 0,22 µm, for syringes | Merck Millipore | SLGV033RS | Millex-GV Filter Unit 0.22 µm Durapore PVDF Membrane |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
| RPMI 1640 | Thermo Fischer Scientific | 11875 | Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium with D-glucose (2.00 g/L) and L-glutamine (300 mg/L), without HEPES |
| Syringe, 26 G | BD Biosciences | 305501 | 1 mL Sub-Q Syringes with needle (0.45 mm x 12.7 mm) |
| Total Exosome Isolation Reagent | Invitrogen | 4478359 | For isolation from cell culture media |
| β-Mercaptoethanol | Thermo Fischer Scientific | 31350 | β-Mercaptoethanol (50 mM) |
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