Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

بناء نموذج الأغشية الدهنية دمج G-البروتين إلى جانب المستقبلات (GPCRs)

Published: February 5, 2022 doi: 10.3791/62830
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Mork Family Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of Southern California
* These authors contributed equally

Summary

يستخدم هذا البروتوكول تورم الآجاروز كتقنية قوية وقابلة للتعميم لدمج بروتينات الأغشية المتكاملة (IMPs) في الحويصلات الدهنية unilamellar العملاقة (GUVs) ، كما هو موضح هنا لإعادة تشكيل بروتين مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) ، وهي واحدة من فئات مستقبلات G ذات الأهمية الدوائية المقترنة بالبروتين.

Abstract

كانت التحقيقات القوية في المختبر لهيكل ووظيفة بروتينات الغشاء المتكاملة تحديا بسبب تعقيدات غشاء البلازما والعوامل العديدة التي تؤثر على سلوك البروتين في الخلايا الحية. الحويصلات العملاقة unilamellar (GUVs) هي نظام نموذج محاكاة حيوية وغير قادر للغاية في المختبر للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والغشاء والتحقيق في سلوك البروتين بطريقة دقيقة تعتمد على التحفيز. في هذا البروتوكول, نقدم طريقة غير مكلفة وفعالة لتصنيع GUVs مع مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) متكاملة بشكل ثابت في الغشاء. نحن تصنيع GUVs باستخدام طريقة تورم الهيدروجيل المعدلة; عن طريق إيداع فيلم الدهون على رأس خليط من الآغاروز و 5-HT1AR ومن ثم ترطيب النظام بأكمله، يمكن تشكيل الحويصلات مع موجهة بشكل صحيح والوظيفية 5-HT1AR دمجها في الغشاء. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه GUVs لفحص التفاعلات بين البروتين والأغشية وسلوك التعريب عن طريق المجهر. في نهاية المطاف ، يمكن لهذا البروتوكول تعزيز فهمنا لوظيفة بروتينات الأغشية المتكاملة ، مما يوفر رؤية فسيولوجية عميقة.

Introduction

الأغشية الاصطناعية النموذجية هي أدوات قوية في التحقيق في الخصائص والوظائف الأساسية للأغشية الحيوية. الحويصلات unilamellar العملاقة (GUVs) هي واحدة من أبرز المنصات لدراسة مجموعة متنوعة من خصائص غشاء البلازما ويمكن هندستها لمحاكاة الظروف الفسيولوجية المختلفة1،2،3،4،5،6،7،8. ومن الثابت أن غشاء البلازما وتنظيمه يلعبان دورا رئيسيا في العديد من العمليات الخلوية، مثل نقل الإشارات، والالتصاق، وداء الغدد الصماء، والنقل9،10،11،12،13،14،15.

وقد تم تصنيع GUVs باستخدام أساليب مختلفة، بما في ذلك الترطيب لطيف16، تورم الهيدروجيل17، التشكيل الكهربائي18، تقنيات microfluidic19،20،21،22، jetting23، وتبادل المذيبات24،25،26. بسبب التحديات في التعامل مع بروتينات الأغشية المتكاملة (IMPs) ، كانت منصات المختبر لمدرستها محدودة. تقدم GUVs منصة مبسطة لدراسة IMPs في بيئة تحاكي بيئتها الأصلية. على الرغم من وجود العديد من النهج لإعادة تشكيل البروتين في GUVs ، تنشأ تحديات من دمج البروتينات مع التوجه الصحيح والحفاظ على وظائف البروتين27.

تتطلب إعادة تشكيل البروتين الأكثر نجاحا في GUVs طريقة تبادل المنظفات؛ الذي ينطوي على solubilizing البروتينات من بيئتها الأصلية من المنظفات، تليها تنقية البروتين، ومن ثم استبدال جزيئات المنظفات مع الدهون من خلال أساليب مختلفة28. في حين أن المنظفات تعمل على تثبيت الهيكل الثالث ل IMPs أثناء التطهير ، فإن ميقات المنظفات هي بيئة غير طبيعية نسبيا لهذه البروتينات ، والتي يتم تثبيتها بشكل أفضل ، خاصة للدراسات الوظيفية ، في ثنائيات الطبقات الدهنية28،29،30. وعلاوة على ذلك، كان من الصعب دمج بروتينات ترانسممبران الوظيفية في طبقة الدهون باستخدام تقنيات تصنيع GUV التقليدية بسبب الحجم، وحساسية هذه البروتينات، وخطوات تبادل المنظفات الإضافية التي ستكون مطلوبة27،31،32،33. استخدام المذيبات العضوية لإزالة المنظفات يسبب تجميع البروتين وإزالة التورينج34. وقد تم تحسين طريقة بوساطة المنظفات واعدة، ومع ذلك، هناك حاجة إلى الحذر لخطوة إزالة المنظفات والتحسين قد تكون هناك حاجة لبروتينات محددة31،35. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تحد الطرق التي تستخدم التشكيل الكهربائي من اختيار البروتين وقد لا تكون مناسبة لجميع التراكيب الدهنية وخاصة الدهون المشحونة31,36,37. تقنية أخرى تم استخدامها هي الانصهار الناجم عن الببتيد من الحويصلات الكبيرة unilamellar (LUVs) التي تحتوي على البروتين المطلوب مع GUVs ، على الرغم من أنه وجد أن تكون شاقة ويمكن أن تؤدي إلى إدراج جزيئات غريبة - الببتيدات fusogenic333،38،39. يمكن استخدام الحويصلات العملاقة لغشاء البلازما (GPMVs) ، المشتقة من الخلايا الحية ، للتغلب على بعض هذه القضايا ، ومع ذلك فهي تسمح بالحد الأدنى من التحكم في تكوين الدهون والبروتين الناتج14،40،41. لذلك ، فإن دمج IMPs في طبقة ثنائية الدهون من GUVs باستخدام طريقة تورم الآغروز المعدلة لدينا يقدم طريقة موثوقة لمواصلة فحص هذه البروتينات في بيئة الغشاء42،43،44،45.

الإشارات الخلوية والاتصالات ينطوي على عائلة من البروتينات المعروفة باسم مستقبلات البروتين G مقرونة (GPCRs); GPCRs هي من بين أكبر عائلة من البروتينات وترتبط مع تعديل المزاج والشهية وضغط الدم ووظيفة القلب والأوعية الدموية والتنفس والنوم بين العديد من الوظائف الفسيولوجية الأخرى46. في هذه الدراسة, استخدمنا مستقبلات السيروتونين البشري 1A (5-HT1AR) وهو عضو نموذجي في الأسرة GPCR. 5-HT1AR يمكن العثور عليها في الجهاز العصبي المركزي (CNS) والأوعية الدموية. فإنه يؤثر على العديد من الوظائف مثل القلب والأوعية الدموية، الجهاز الهضمي، وظائف الغدد الصماء، فضلا عن المشاركة في تنظيم mood47. ينشأ حاجز كبير أمام أبحاث GPCR من بنيتها البرمائية المعقدة ، وتوفر GUVs منصة واعدة للتحقيق في الخصائص المختلفة ذات الاهتمام ، بدءا من وظائف البروتين ، والتفاعلات بين البروتين الدهني والبروتين ، والتفاعلات بين البروتين والبروتين. وقد استخدمت نهج مختلفة لدراسة التفاعلات بين البروتين الدهني مثل الرنين السطحي البلازمون (SPR)48,49، التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي (NMR)50,51، تراكب الدهون البروتينية (PLO) المقايسة51,52,53,54، قياس الطيف الكتلي الأصلي55، قياس حراري المعايرة الحرارية (ITC)56,57، والليبوسوم الترسيب المقايسة58,59. وقد استخدم مختبرنا نهج GUV المبسط للتحقيق في تأثير التفاعلات بين البروتين الدهني على وظائف البروتين عن طريق تحفيز BODIPY-GTPοS ، الذي يرتبط مع وحدة Giα الفرعية في الحالة النشطة للمستقبلات. ويفك ربطها الفلوروفور الذي ينتج إشارة مضانة يمكن اكتشافها بمرور الوقت45. وعلاوة على ذلك، حققت دراسات مختلفة في التفاعلات بين البروتين الدهني ودور البروتينات في استشعار أو تثبيت انحناء الأغشية60,61، ويمكن أن يكون استخدام نهج GUV الممكن ميزة رئيسية.

يوضح هذا البروتوكول طريقة مباشرة لدمج GPCRs في غشاء GUVs باستخدام نظام agarose هيدروجيل معدل17,42. وعلاوة على ذلك، واستنادا إلى عملنا السابق، يمكن أن تكون طريقتنا مناسبة لIMPs التي يمكن أن تحمل التعرض على المدى القصير إلى 30-40 درجة مئوية. باختصار، ونحن نشر فيلم رقيقة من الآغاروز جنبا إلى جنب مع شظايا الغشاء التي تحتوي على GPCR من الفائدة. بعد هلام هذه الطبقة، ونحن إيداع محلول الدهون فوق agarose والسماح للمذيب لتتبخر. ثم تم تنفيذ الإماهة للنظام مع عازل مائي، مما أدى إلى تشكيل GUVs مع البروتين المدرجة في طبقة ثنائية الدهون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. وضع العلامات البروتين

  1. السماح NHS-رودامين، 5-HT1A شظايا الغشاء، واحد 7 K MWCO تدور عمود تحلية إلى التوازن في درجة حرارة الغرفة.
  2. حل 1 ملغ من NHS-رودامين في 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO).
  3. إضافة 5 ميكرولتر من محلول بيكربونات الصوديوم 1 M لزيادة درجة الحموضة من محلول 5-HT1AR إلى درجة الحموضة 8.
  4. إضافة 3.66 ميكرولتر من محلول NHS-rhodamine إلى 50 ميكرولتر من محلول 5-HT1AR وماصة بلطف صعودا وهبوطا في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
    ملاحظة: تأكد من أن يكون على الأقل 10x الضرس الزائد من NHS-رودامين.
  5. الحفاظ على الخليط محمية من الضوء ووضعها على الدوار في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  6. اغسل عمود دوران 7 k MWCO مع 200 ميكرولتر من محلول ملحي عازل للفوسفات 1x (1x PBS) ثلاث مرات لمدة 1.5 دقيقة عند 1.5 RCF لكل غسل.
  7. أضف البروتين المسمى إلى عمود واحد وتوازن الكمية في أنبوب طرد مركزي آخر.
  8. تدور أسفل البروتين المسمى مرة واحدة لمدة 5 دقائق في 1.5 RCF.
  9. خذ طيف الأشعة فوق البنفسجية باستخدام مطياف قطرة النانو عند 280 نانومتر و554 نانومتر وحساب كفاءة وضع العلامات وفقا لدليل الشركة المصنعة.
  10. تخزين البروتين المسمى تغطية في 5 درجة مئوية حتى مزيد من الاستخدام. الحل مستقر لمدة أسبوع تقريبا بعد وضع العلامات.

2. GUVs مع غشاء أدرجت 5-HT 1A

  1. إعداد المواد والكواشف
    1. السماح للبروتين والدهون وBSA (الألبومين مصل البقري) إلى التوازن إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. خلال هذا الوقت، تنظيف coverlips عن طريق وضعها في الميثانول و sonicating لمدة 30 دقيقة في 40 درجة مئوية. تأكد من أن الميثانول يغطي تماما الأغطية ومستوى المياه في حمام الماء فوق مستوى الميثانول في الحاوية.
      ملاحظة: الميثانول سام ويجب التعامل معه في غطاء محرك السيارة الكيميائي المناسب.
    3. جفف الميثانول الزائد على الأغطية مع تيار لطيف من الهواء. ضع حامل الغطاء المغطى في فرن 40 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لضمان جفاف الأغطية الزائدة.
    4. ابدأ عملية تنظيف البلازما. أولا، ضع الأغطية في منظف البلازما وإغلاق صمام كمية الهواء لإخلاء كل الهواء داخل الغرفة.
    5. مرة واحدة في الغرفة تحت فراغ، وتنظيف coverlips لمدة 5 دقائق باستخدام إعداد قوة RF عالية وفراغ شبه كامل، مع كمية الهواء طفيف فقط في غرفة فراغ. لضمان المستوى المناسب للبلازما، ضبط فتح غرفة فراغ بحيث اللون الناتج من البلازما هو ثابت، وردي مشرق.
      ملاحظة: من المهم عند استخدام الهواء أن البلازما لا تزال لون وردي مشرق لمدة خطوة العلاج البلازما، كما لون أغمق الأرجواني يشير إلى أن هناك كمية غير لائقة من الهواء في الغرفة، وسوف يؤدي إلى علاج البلازما دون المستوى الأمثل.
    6. مرة واحدة وقد مرت 5 دقائق، إيقاف قوة RF والإفراج عن فراغ.
      ملاحظة: عند الإزالة من غرفة البلازما، يرجى التأكد من أن الأغطية تظل مغطاة.
  2. إعداد هيدروجيل
    1. الجمع بين 6 ملغ من agarose درجة حرارة ذوبان منخفضة جدا مع 300 ميكروغرام من المياه فائقة البور (أي 2٪ (ث / v) agarose).
      ملاحظة: سيتم استخدام 2٪ من الآجاروز لصنع GUVs خالية من البروتين. يمكن الاحتفاظ بحل Agarose عند 45 درجة مئوية لمدة يومين.
    2. الجمع بين 9 ملغ من agarose درجة حرارة منخفضة جدا مع 300 ميكرولتر من المياه فائقة البور ل3 ث / v٪ agarose حسبما أعدت في الخطوة 3.1. سيتم استخدام 3٪ agarose لجعل البروتين أدرجت GUVs.
    3. دوامة الحل لفترة وجيزة قبل وضعها على كتلة الحرارة 90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. ثم دوامة الأنبوب مرة أخرى قبل نقله إلى كتلة حرارة 45 درجة مئوية لإبقائه في شكل منصهر حتى مزيد من الاستخدام.
  3. الآغاروز وخلط البروتين
    1. مزيج 21 ميكرولتر من 3٪ agarose مع 7 ميكرولتر من شظايا غشاء 5-HT1AR. ماصة صعودا وهبوطا ببطء عدة مرات لضمان خلط كافية. ثم، احتضان في 45 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة.
  4. هيدروجيل وترسب الدهون
    1. ل GUVs الخالية من البروتين: قم بعمل فيلم رقيق على الأغطية الطازجة التي يتم تنظيفها بالبلازما باستخدام 20 ميكرولتر من 2٪ من الآجاروز. بسرعة إسقاط coverlip آخر على رأس قطرة agarose والانزلاق بلطف coverslips وبصرف النظر لجعل فيلم رقيقة على كل من coverslips.
      ملاحظة: هذه الخطوة صعبة في أن انزلاق القطيرات يجب أن يحدث بينما لا يزال الآغاروز في الشكل المنصهر.
    2. ل GUVs المدمجة في البروتين: ماصة خليط البروتين / الآغروز صعودا وهبوطا مرة أخرى، ومن ثم إيداع 20 ميكروغرام من 2٪ agarose على غطاء تنظيف البلازما. اتبع اتجاهات صب الانزلاق كما هو موضح أعلاه.
    3. السماح للأغروز إلى هلام محمية من الضوء لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. إيداع الدهون dropwise على رأس طبقة الآغاروز. استخدام ما مجموعه 10 ميكرولتر من 2 ملغ / مل من 1-بالميتويل-2-أوليويل-غليسيرو-3-فوسفوتشولين (POPC) مع 0.4 مول٪ 1,2-Dipalm سيتويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوإيثانولامين (DPPE) المسمى مع ATTO 488 (ATTO-488-DPPE) (أو خليط الدهون من الفائدة) في الكلوروفورم على رأس فيلم الآغاروز. إيداع قطرات باستخدام إبرة الكروماتوغرافيا الغاز ونشر قطرة واحدة في وقت واحد عبر تيار الهواء لطيف.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى الحذر مع هذه الخطوة لجعل طبقة موحدة نسبيا من الدهون على رأس هيدروجيل. أيضا، الكلوروفورم سامة وينبغي التعامل معها في غطاء محرك السيارة الكيميائية المناسبة.
    5. تجميع غرف سايكس مور (S-M) عن طريق وضع O-حلقة على رأس غطاء، ومن ثم وضع المكون العلوي من الغرفة على رأس O-حلقة. استخدام المفتاح الذي تقدمه الشركة المصنعة لتجميع الغرفة عن طريق الشد مكونات الغرفة معا لختم الغرفة ومنع أي تسرب.
      ملاحظة: يجب تشديد الجزء العلوي من الغرفة على O-ring ولكن هناك حاجة إلى الحذر لضمان بقاء الغطاء سليما حيث يمكن أن ينكسر الغطاء إذا لم يجلس O-ring بشكل صحيح في الغرفة. أيضا، تأكد من أن الغرفة مغلقة بما فيه الكفاية بحيث الغرفة لا تسرب عند إضافة محلول تورم. الفشل في تشديد الغرفة بما فيه الكفاية سيؤدي إلى تسرب وفقدان العينة.
  5. تورم وحصاد الحويصلات
    1. هيدرات النظام بأكمله عن طريق الأنابيب بلطف 450 ميكرولتر من السكروز 200 mM في برنامج تلفزيوني 1x والتنصت بلطف الغرف لضمان تغطية عازلة كافية من طبقات هيدروجيل الدهون.
      ملاحظة: يمكن استبدال محلول السكروز بمخزن مؤقت للإماهة يحتوي على مسابير بيولوجية ذات أهمية.
    2. ضع الغرف عند درجة حرارة 45 درجة مئوية وقم بتغطية الجزء العلوي من الغرفة بغطاء لمنع التبخر. السماح للعينة لتضخم، محمية من الحطام والضوء لمدة 1 ساعة.
    3. إضافة 100 ميكرولتر من 1 ملغم / مل BSA في المياه فائقة النبور في كل بئر من لوحة 96 بئرا المقصود لاستخدامها. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
    4. يغسل ثلاث مرات مع المياه النقية للغاية ومرة واحدة مع السكروز 200 mM في برنامج تلفزيوني 1x.
    5. وأخيرا، إضافة 200 مليون متر من الجلوكوز في برنامج تلفزيوني 1x حتى إضافة حل عينة GUV.
      ملاحظة: تم استخدام BSA لمنع الامتزاز GUV.
    6. بعد السماح للهيدرجيل بالانتفاخ، هز الغرفة بلطف واضغط عليها لطرد أي مركبات GUVs قد تظل متصلة بسطح الهيدروجيل. ثم، ماصة بعناية حتى حل GUV-السكروز.
      ملاحظة: كخطوة اختيارية لضمان فصل جميع الحويصلات عن السطح، ماصة بلطف بعض تعليق السكروز مرة أخرى على سطح الهيدروجيل.
    7. نقل التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي التي أعدت سابقا تحتوي على 700 ميكرولتر من الجلوكوز 200 mM في برنامج تلفزيوني 1x.
      ملاحظة: سيؤدي تدرج الكثافة إلى تسوية الحويصلات إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي.
    8. السماح للحواس لتسوية لمدة ساعة أخرى لضمان أن الحويصلات يمكن أن تغرق إلى الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق، مما يسمح لجمع الأمثل.
    9. بعد تسوية GUVs في الجلوكوز ، قم بنقل 300 ميكرولتر من أسفل أنبوب الطرد المركزي (الحويصلات المستقرة) إلى لوحة 96-well التي تم إعدادها مسبقا وBSA لفحص الحويصلات تحت المجهر الكونفوجال.
      ملاحظة: تأكد من تجنب الجزء السفلي جدا من أنبوب الطرد المركزي الدقيق لتقليل كمية الحطام التي تم جمعها في العينة النهائية.
  6. تحقق من العينات تحت المجهر.
    1. تألق ليزر 488 نانومتر على العينة (التي تسمح لنا لتصور الغشاء، كما تم تسمية ثنائي مع ATTO-488-DPPE).
    2. تألق ليزر 561 نانومتر على العينة (التي تسمح لنا لتصور البروتين، لأنه قد وصفت مع NHS-رودامين).
      ملاحظة: هناك حاجة الحذر أثناء تصوير العينة كما يمكن أن تزعزع السمية الضوئية الحويصلات. وقد لوحظ Vesicles في نفس اليوم.

Figure 1
الشكل 1: توضيح لخطوات البروتوكول التفصيلية. تم إنشاؤها باستخدام BioRender.com الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم قياس تركيز البروتين، وتم حساب درجة وضع العلامات كنسبة الضرس بين الصبغة والبروتين لتكون 1:1. من خلال فحص GUVs باستخدام المجهر الكونف البؤري ، تمكنا من تأكيد نجاح تكوين وتكامل البروتين من الحويصلات. وصفت الدهون مع 0.4 مول٪ ATTO 488-DPPE، ووصفت البروتين بشكل مشترك عن طريق تعديل رودامين NHS-ester من الأمينات الأولية. الشكل 2a والشكل 2b تظهر الحويكل البروتين المدمج في قنوات ATTO 488 ورودامين، على التوالي. وقد تم تصحيح جميع micrographs التيار المظلم وflatfield. الشكل 2C والشكل 2D تظهر GUV السيطرة السلبية مع عدم وجود البروتين المدرجة. الشكل 3a والشكل 3b تظهر بروتين GUV أدرجت مع ملامح كثافة الخط التي قدمها خط أبيض متقطع من نفس الحويكل في كلتا القناتين. يظهر ملف تعريف كثافة الخط مؤامرة ثنائية الأبعاد لشدة البكسل على طول الخط المرسوم الأبيض داخل الصورة. المحور x هو المسافة على طول الخط والمحور ص هو كثافة البكسل. تم استخدام برنامج ImageJ لرسم كثافة الملف الشخصي للخط المشار إليه.

Figure 2
الشكل 2: أدرجت الصور الدقيقة التي تقارن البروتين GUVs وGUVs دون بروتين (التحكم). وتظهر الصور الدقيقة (أ) و(ب) أن البروتين أدرج مضان GUV مع قناتي ATTO 488 ورودامين المعنيتين، على التوالي. تظهر الصور الدقيقة (ج) و (د) بروتينا تم حذفه من GUV عندما يكون متحمسا لقنوات ATTO 488 و rhodamine على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: يعرض الصف العلوي ميكروجرافات البروتين المدمجة في قنوات ATTO 488 (أ) ورودامين (ب). تكون ملفات تعريف كثافة الخط للخطوط الموضحة ذات الخطوط البيضاء متقطعة أدناه. تم إجراء التحليل باستخدام برنامج ImageJ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لقد حددنا خطوتين حاسمتين لنجاح البروتوكول العام: علاج البلازما وترسب الدهون. تنظيف البلازما ينجز شيئين: أولا، فإنه يزيل آثار المواد العضوية من سطح الزجاج. ثانيا، فإنه ينشط سطح الغطاء، مما يسمح لزيادة في wettability كما يزيد hydrophilicity سطح الزجاج62،63. لمس سطح coverlip تنظيف ما بعد البلازما سوف تعطيل وتلوث سطح ultraclean وينصح بشدة ضد. توصيتنا هي لمس حواف جدا وs undersides فقط من coverlip عند التعامل مع coverlips لخطوة صب زلة agarose. الخطوة الحاسمة الثانية هي ترسب الدهون على سطح الهيدروجيل الجاف. تستخدم هذه الطريقة ترسب الدهون المنسدل ، والذي يتطلب إبرة كروماتوغرافيا الغاز (GC) وتيار الهواء لإيداع عدد قليل من ميكرولترات محلول الدهون في وقت واحد ، مما يسمح بالتحكم الدقيق في كمية الدهون المضافة ووضع فيلم الدهون على سطح الهيدروجيل. العيب في هذه الطريقة هو أنه إذا لم يتم ذلك بعناية ، فإنه يمكن أن يؤدي إلى عدد قليل من المناطق المختارة مع فيلم الدهون سمكا ، مما أدى إلى انخفاض غلة GUV. وبالتالي ، فمن الأهمية بمكان التأكد من أن هناك رقيقة بشكل موحد من طبقة الدهون ممكن على سطح الآغروز.

واحدة من أهم فوائد هذا البروتوكول هو مرونة المنصة نفسها؛ هذه الطريقة تفسح المجال بشكل جيد للغاية للتغيرات في تكوين البروتين والدهون، فضلا عن التغليف والتعديلات العازلة. هذا البروتوكول يمكن، من حيث المبدأ، تشمل أي بروتين transmembrane، كما تمكنا من دمج بنجاح عدد من البروتينات عبر الميمبران المختلفة، بدءا من مستقبلات الأدينوزين (A2AR) لزراعة aquaporins دون التضحية functionality42,45,64. تقليديا، تم دمج البروتينات في GUVs بعد التشحيم من قبل المنظفات أو دمجها في بروتيو ليبوسومات أو الحويصلات unilamellar الصغيرة التي يمكن دمجها في وقت لاحق في GUV65 مسبقة التشكيل. ميزة لدينا تعديل طريقة تورم الهيدروجيل هو أنه يزيل اعتماد المنظفات أو الحويصلات المتوسطة ويوفر سقالة رطبة وسيطة. فوائد هذا ذات شقين: يمكننا دمج GPCRs الوظيفية في الغشاء في عازل أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية دون الاعتماد على طرق تبادل المنظفات التي تتطلب المزيد من التحضير والرعاية فيما يتعلق بتركيز المنظفات المذكورة ، وأن العملية التي تتزحزح بها GUVs عن سطح الهيدروجيل تسمح بالتوجه الصحيح للبروتينات في طبقة ثنائية66 . لقد أظهرنا أن عملية GUV الناشئة تنطوي على تجمع العديد من الحويصلات الصغيرة على نطاق النانومتر في الحويصلات الأكبر حجما على نطاق ميكرون ، مما يشجع على التوجه الصحيح للبروتين من البداية. وقد أظهرنا أن هذا هو الحال في عملنا السابق؛ وقد رأينا أن هذا هو الحال في أعمالنا السابقة. باختصار، قمنا بتصنيف الجسم المضاد بشكل متناقض مستهدفا حلقة سيتوسوليك محددة لمستقبلات الأدينوزين واحتضننا الجسم المضاد المسمى بالبروتين، ثم أدرجنا البروتين المسمى في GUVs المسمى بصبغة الدهون باستخدام طريقة تورم الهيدروجيل المعدلة. ثم عرضنا الحويصلات المدمجة في البروتين إلى quencher مشحونة ، والتي هي غير قادرة على عبور طبقة ثنائية. نرى في وقت لاحق انخفاضا بنسبة 50٪ في فلورة صبغة الدهون ، ولكن مضان البروتين المسمى لا يزال غير متأثر بالquencher ، مما يدل على التوجه السليم44.

وقد حقق العمل السابق من مختبرنا في الدور الذي تهمة مجموعة رأس الدهون، zwitterionic والدهون المشحونة صافي الأيونية، فضلا عن خصائص العازلة والهيدرجيل مثل درجة الحموضة، والقوة الأيونية، osmolarity، وتركيز الهيدروجيل لديها على ديناميات تشكيل GUV67. باختصار، لا تؤثر شحنة الدهون إلى حد كبير على تكوين GUV، في حين أن الخصائص العازلة مثل الزيادات في تركيز السكروز (على سبيل المثال، 500 mM Sucrose في 185 mM العازلة قوة الأيونية PBS) تؤثر سلبا على تشكيل GUV، مما أدى إلى الحويصلات على شكل غير منتظم التي من المرجح أن لا تصلح بسهولة للحصاد. الحلول الحمضية (pH = 3) تزيد من معدل التكوين ، في حين أن الحل الأساسي (pH = 8) يقمع معدل تكوين GUV. ولا تزال مركبات GUVs تتشكل عند كل من المخازن العازلة الحمضية والأساسية، مع اختلافات هامشية فقط في حجم الحويكل. تركيزات الآغروز المنخفضة (~0.1-1 ث/v٪) تؤثر سلبا أيضا على تشكيل GUV بسبب عدم وجود تغطية سطحية متجانسة وانخفاض في تورم الهيدروجيل، وهي قوة ضرورية في الالتحام وبروز GUVs قبالة سطح الهيدروجيل. وهكذا، قررنا أن تركيز agarose النهائي 2 ث / v٪ مع محلول السكروز / الجلوكوز من 100-200 mM، جنبا إلى جنب مع قوة الأيونية العازلة من 185 MM PBS في درجة الحموضة 7.4 يحقق توازنا جيدا من تورم الآغروز، ومعدل تشكيل GUV، وحجم الحويذ اللاحقة. الحويصلات التي تحتوي على البروتين، وزيادة تركيز الآغاروز الأولي إلى 3 ث / v٪ يسمح لتركيز الآغاروز النهائي من 2 ث / v٪ بعد إضافة محلول البروتين. وبالإضافة إلى ديناميات التكوين، يسهل نظام التخزين المؤقت للسكروز/الجلوكوز أيضا الترسيب وما تلاه من مجموعات من مركبات الكربون غير المشروعة المتشكلة، فضلا عن التصور في إطار المجهر التبايني للمرحلة 65,68.

هناك بعض نقاط الحذر فيما يتعلق بهذا البروتوكول، وتحديدا فيما يتعلق بالغاروز واختيار الحويصلات.  في تجربتنا، هذه الحرارة لا يلغي نشاط 5-HT1AR، ولكن هناك ما يبرر الحذر للبروتينات الأخرى. بشكل عام ، يبدأ الآغاروز الذي نستخدمه في الهلام عند 20 درجة مئوية ، وبالتالي يمكن أن يحدث رد فعل التورم في درجات حرارة أعلى من 20 درجة مئوية ، ولكن هذه العملية لا يمكن أن تعمل تحت درجة الحرارة تلك. وتجدر الإشارة أيضا إلى أنه كلما اقتربت درجة الحرارة من 20 درجة مئوية، كلما قلت كفاءة خطوة التورم، مما يؤدي إلى انخفاضات لاحقة في غلة GUV. ويمكن أن يمثل الآغروز أيضا مشكلة أثناء خطوات التسوية والتصور، حيث يمكن أن يستمر في الجزء السفلي من أنبوب التسوية /التجميع كحطام. وبالتالي، مطلوب الحذر لدرجة الحرارة المطلوبة للحفاظ على agarose المنصهر وضمان أن درجة الحرارة المذكورة لن تحط من البروتين من الفائدة، فضلا عن سبيرينج حل تسوية لتجنب أي agarose المعلقة الزائدة من إدراجها في العينة النهائية. هذه الطريقة في حالتها الراهنة يؤدي أيضا إلى حجم السكان GUV غير متجانسة، مع بعض الحويصلات عرض متعددةlamellarity وغيرها من الظواهر الحويصلات معيبة مثل الحويصلات داخل الحويصلات. هذا هو نموذجي من أساليب تشكيل GUV المشتركة ويتطلب اليقظة والتحفظ عند اختيار الحويصلات للفحص المجهري والتحليل. كما لا يوصى بتحليل مركبات GUVs التي تعرض مستويات عالية بشكل غير عادي من الفلورسينس، حيث يمكن العثور على الآغروز في المناطق الداخلية من بعض هذه الحويصلات. وقد تم العمل غير المنشورة من مختبرنا قادرة على تشغيل التجارب الطموح micropipette باستخدام الحويصلات المصنوعة باستخدام هذه التقنية، مما يدل على أن طريقة الآغاروز تنتج الحويصلات دون الميكانيكا تغيير الآغاروز في التجويف.

وبصرف النظر عن القيود، يقدم هذا البروتوكول طريقة قوية ومباشرة لتوليد البروتين المدمج GUVs. ويمكن أن تولد غلة عالية من GUVs في الظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية التي تدمج البروتينات عبر الميمبران الموجهة بشكل صحيح في طبقة ثنائية دون المساس بوظائفها. هذا هو الخروج عن أساليب أخرى لتشكيل الحويكل، والتي تنطوي على التيارات الكهربائية أو الترطيب لطيف، من شأنها أن تلحق ضررا كبيرا هيكل البروتين وجعله غير وظيفي أو تتطلب المزيد من المنظفات التشحيم وإزالة الخطوات. وبالنظر إلى أن هذه الكائنات تمثل أكثر من ثلث جميع الأهداف الصيدلانية، هناك اهتمام كبير بالقدرة على دراسة هذه العائلة من البروتينات في منصة محاكاة حيوية عالية القدرة وعالية الإنتاجية. وبشكل أكثر تحديدا، تتراوح تطبيقات هذا العمل من دراسة التفاعلات بين البروتين والدهون، وكيف تؤثر البيئة الدقيقة الدهنية على وظائف البروتين وتوطينه، وغيرها من الأسئلة الفيزيائية الحيوية الأساسية التي يمكن أن تسترشد بها تطوير الأدوية الصيدلانية واكتشافها. ويمكن الاطلاع على مثال على ذلك في العمل المنجز داخل مختبرنا، الذي تمكن من تمييز التباينات في وظائف المستقبلات نتيجة لأكسدة الدهون.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

Acknowledgments

نشكر ماثيو بلوسر على النقاش والمشورة القيمة. وقد دعم هذا العمل مكتب البحوث البحرية (N00014-16-1-2382) والمؤسسة الوطنية للعلوم (PHY-1915017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850375C-25mg
 TI-Eclipse inverted microscope Nikon, Melville, NY Eclipse Ti
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850355C-25mg
13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings Sterling Seal & Supply, Neptune, IN 5-003-8770
16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera Photometrics, Huntington Beach, CA  Cascade II 512
1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL 850457C-25mg
50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm Coherent, Santa Clara, CA 488/561-50-LS
5-HT1AR membrane fragments Perkin Elmer, Waltham, MA RBHS1AM400UA
ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) ATTO-TEC, Siegen, Germany AD 488-155
Bench top plasma cleaner Harrick Plasma, Ithaca, NY PDC-32G
bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich, St. Louis, MO A9418
chloroform (CHCl3) Millipore Sigma, Burlington, MA CX1055
Cholesterol (Chol) Sigma Aldrich, St. Louis, MO C8667-5G
Corning 96-well Flat Clear Bottom Corning, Corning, NY 3904
Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic Elma, Singen, Germany [no longer sold on main website]
glucose Sigma Aldrich, St. Louis, MO G7528
methanol (MeOH) Millipore Sigma, Burlington, MA MX0485
NanoDrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA ND-1000
NHS-Rhodamine Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 46406
phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) Corning, Corning, NY 21-040
spinning-disc CSUX confocal head Yokogawa,Tokyo, Japan CSU-X1
standard 25 mm no. 1 glass coverslips ChemGlass, Vineland, NJ CLS-1760
sucrose Sigma Aldrich, St. Louis, MO S7903
Sykes-Moore chambers Bellco, Vineland, NJ 1943-11111
Ultra-low melting temperature agarose Sigma Aldrich, St. Louis, MO A5030
VWR Analog Heatblock VWR International, Radnor, PA [no longer sold on main website]
VWR Tube Rotator VWR International, Radnor, PA 10136-084
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
  2. Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane questions. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (9), 004622 (2011).
  3. Chan, Y. -H. M., Boxer, S. G. Model membrane systems and their applications. Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).
  4. Li, S., Hu, P., Malmstadt, N. Confocal imaging to quantify passive transport across biomimetic lipid membranes. Analytical Chemistry. 82 (18), 7766-7771 (2010).
  5. Lingwood, D., Simons, K. Lipid rafts as a membrane-organizing principle. Science. 327 (5961), 46-50 (2010).
  6. Elbaradei, A., Brown, S. L., Miller, J. B., May, S., Hobbie, E. K. Interaction of polymer-coated silicon nanocrystals with lipid bilayers and surfactant interfaces. Physical Review E. 94 (4), 042804 (2016).
  7. Veatch, S. L., Keller, S. L. Organization in lipid membranes containing cholesterol. Physical Review Letters. 89 (26), 268101 (2002).
  8. Plasencia, I., Norlén, L., Bagatolli, L. A. Direct visualization of lipid domains in human skin stratum corneum's lipid membranes: Effect of pH and temperature. Biophysical Journal. 93 (9), 3142-3155 (2007).
  9. Dietrich, C., et al. Lipid rafts reconstituted in model membranes. Biophysical Journal. 80 (3), 1417-1428 (2001).
  10. Deans, J. P., Li, H., Polyak, M. J. CD20-mediated apoptosis: signalling through lipid rafts. Immunology. 107 (2), 176-182 (2002).
  11. Edidin, M. The state of lipid rafts: from model membranes to cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 32, 257-283 (2003).
  12. Pike, L. J. Lipid rafts: bringing order to chaos. Journal of Lipid Research. 44 (4), 655-667 (2003).
  13. Tsui-Pierchala, B. A., Encinas, M., Milbrandt, J., Johnson, E. M. Lipid rafts in neuronal signaling and function. Trends in Neurosciences. 25 (8), 412-417 (2002).
  14. Sezgin, E., Levental, I., Mayor, S., Eggeling, C. The mystery of membrane organization: composition, regulation and roles of lipid rafts. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (6), 361-374 (2017).
  15. Scheve, C. S., Gonzales, P. A., Momin, N., Stachowiak, J. C. Steric pressure between membrane-bound proteins opposes lipid phase separation. Journal of the American Chemical Society. 135 (4), 1185-1188 (2013).
  16. Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid vesicles. Journal of Cellular Physiology. 73 (1), 49-60 (1969).
  17. Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of agarose enable rapid formation of giant liposomes in solutions of physiologic ionic strength. Journal of the American Chemical Society. 131 (5), 1810-1819 (2009).
  18. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discussions of the Chemical Society. 81 (0), 303-311 (1986).
  19. Teh, S. -Y., Khnouf, R., Fan, H., Lee, A. P. Stable, biocompatible lipid vesicle generation by solvent extraction-based droplet microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (4), (2011).
  20. Hu, P. C., Li, S., Malmstadt, N. Microfluidic fabrication of asymmetric giant lipid vesicles. ACS Applied Materials & Interfaces. 3 (5), 1434-1440 (2011).
  21. Lu, L., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Continuous microfluidic fabrication of synthetic asymmetric vesicles. Lab on a Chip. 15 (17), 3591-3599 (2015).
  22. Maktabi, S., Schertzer, J. W., Chiarot, P. R. Dewetting-induced formation and mechanical properties of synthetic bacterial outer membrane models (GUVs) with controlled inner-leaflet lipid composition. Soft Matter. 15 (19), 3938-3948 (2019).
  23. Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4697-4702 (2008).
  24. Kim, S., Martin, G. M. Preparation of cell-size unilamellar liposomes with high captured volume and defined size distribution. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 646 (1), 1-9 (1981).
  25. Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).
  26. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  27. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1), 105-117 (2004).
  28. le Maire, M., Champeil, P., Møller, J. V. Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1508 (1), 86-111 (2000).
  29. Rigaud, J. -L., Lévy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes. Methods in Enzymology. 372, 65-86 (2003).
  30. Renthal, R. An unfolding story of helical transmembrane proteins. Biochemistry. 45 (49), 14559-14566 (2006).
  31. Jørgensen, I. L., Kemmer, G. C., Pomorski, T. G. Membrane protein reconstitution into giant unilamellar vesicles: a review on current techniques. European Biophysics Journal. 46 (2), 103-119 (2017).
  32. Hansen, J. S., et al. Formation of giant protein vesicles by a lipid cosolvent method. ChemBioChem. 12 (18), 2856-2862 (2011).
  33. Kahya, N., Pécheur, E. -I., de Boeij, W. P., Wiersma, D. A., Hoekstra, D. Reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles via peptide-induced fusion. Biophysical Journal. 81 (3), 1464-1474 (2001).
  34. Kahya, N., Merkle, D., Schwille, P. Pushing the complexity of model bilayers: Novel prospects for membrane biophysics. Fluorescence of Supermolecules, Polymers, and Nanosystems. , 339-359 (2008).
  35. Dezi, M., Di Cicco, A., Bassereau, P., Lévy, D. Detergent-mediated incorporation of transmembrane proteins in giant unilamellar vesicles with controlled physiological contents. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (18), 7276-7281 (2013).
  36. Shaklee, P. M., et al. Protein incorporation in giant lipid vesicles under physiological conditions. ChemBioChem. 11 (2), 175-179 (2010).
  37. Estes, D. J., Mayer, M. Giant liposomes in physiological buffer using electroformation in a flow chamber. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1712 (2), 152-160 (2005).
  38. Girard, P., et al. A new method for the reconstitution of membrane proteins into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 87 (1), 419-429 (2004).
  39. Doeven, M. K., et al. lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 88 (2), 1134-1142 (2005).
  40. Levental, I., et al. Cholesterol-dependent phase separation in cell-derived giant plasma-membrane vesicles. The Biochemical Journal. 424 (2), 163-167 (2009).
  41. López-Montero, I., Rodríguez-García, R., Monroy, F. Artificial spectrin shells reconstituted on giant vesicles. The Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (12), 1583-1588 (2012).
  42. Hansen, J. S., Thompson, J. R., Hélix-Nielsen, C., Malmstadt, N. Lipid directed intrinsic membrane protein segregation. Journal of the American Chemical Society. 135 (46), 17294-17297 (2013).
  43. Gutierrez, M. G., Malmstadt, N. Human serotonin receptor 5-HT 1A preferentially segregates to the liquid disordered phase in synthetic lipid bilayers. Journal of the American Chemical Society. 136 (39), 13530-13533 (2014).
  44. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  45. Gutierrez, M. G., Mansfield, K. S., Malmstadt, N. The functional activity of the human serotonin 5-HT 1A receptor is controlled by lipid bilayer composition. Biophysical Journal. 110, 2486-2495 (2016).
  46. Sriram, K., Insel, P. A. G Protein-coupled receptors as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs. Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
  47. Nichols, D. E., Nichols, C. D. Serotonin receptors. Chemical Reviews. 108 (5), 1614-1641 (2008).
  48. Del Vecchio, K., Stahelin, R. V. Using surface plasmon resonance to quantitatively assess lipid-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1376, Clifton, N.J. 141-153 (2016).
  49. Place, J. F., Sutherland, R. M., Dähne, C. Opto-electronic immunosensors: a review of optical immunoassay at continuous surfaces. Biosensors. 1 (4), 321-353 (1985).
  50. Brown, M. F., Miljanich, G. P., Franklin, L. K., Dratz, E. A. H-NMR studies of protein-lipid interactions in retinal rod outer segment disc membranes. FEBS letters. 70 (1), 56-60 (1976).
  51. Sun, F., et al. Structural basis for interactions of the Phytophthora sojae RxLR effector Avh5 with phosphatidylinositol 3-phosphate and for host cell entry. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (3), 330-344 (2013).
  52. Kavran, J. M., et al. Specificity and promiscuity in phosphoinositide binding by pleckstrin homology domains. The Journal of Biological Chemistry. 273 (46), 30497-30508 (1998).
  53. Stevenson, J. M., Perera, I. Y., Boss, W. F. A phosphatidylinositol 4-Kinase pleckstrin homology domain that binds phosphatidylinositol 4-Monophosphate. Journal of Biological Chemistry. 273 (35), 22761-22767 (1998).
  54. Han, X., Yang, Y., Zhao, F., Zhang, T., Yu, X. An improved protein lipid overlay assay for studying lipid-protein interactions. Plant Methods. 16 (1), 33 (2020).
  55. Yen, H. -Y., et al. PtdIns(4,5)P 2 stabilizes active states of GPCRs and enhances selectivity of G-protein coupling. Nature. 559 (7714), 423-427 (2018).
  56. Myers, M., Mayorga, O. L., Emtage, J., Freire, E. Thermodynamic characterization of interactions between ornithine transcarbamylase leader peptide and phospholipid bilayer membranes. Biochemistry. 26 (14), 4309-4315 (1987).
  57. Swamy, M. J., Sankhala, R. S. Probing the thermodynamics of protein-lipid interactions by isothermal titration calorimetry. Lipid-Protein Interactions: Methods and Protocols. , 37-53 (2013).
  58. Han, X., Shi, Y., Liu, G., Guo, Y., Yang, Y. Activation of ROP6 GTPase by phosphatidylglycerol in arabidopsis. Frontiers in Plant Science. 0, (2018).
  59. Surolia, A., Bachhawat, B. K. The effect of lipid composition on liposome-lectin interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 83 (3), 779-785 (1978).
  60. Sarkis, J., Vié, V. Biomimetic models to investigate membrane biophysics affecting lipid-protein interaction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 270 (2020).
  61. McMahon, H. T., Boucrot, E. Membrane curvature at a glance. Journal of Cell Science. 128 (6), 1065-1070 (2015).
  62. Banerjee, K. K., Kumar, S., Bremmell, K. E., Griesser, H. J. Molecular-level removal of proteinaceous contamination from model surfaces and biomedical device materials by air plasma treatment. Journal of Hospital Infection. 76 (3), 234-242 (2010).
  63. Raiber, K., Terfort, A., Benndorf, C., Krings, N., Strehblow, H. -H. Removal of self-assembled monolayers of alkanethiolates on gold by plasma cleaning. Surface Science. 595 (1), 56-63 (2005).
  64. Gutierrez, M. G., et al. The lipid phase preference of the adenosine A 2A receptor depends on its ligand binding state. Chemical Communications. 55 (40), 5724-5727 (2019).
  65. Garten, M., Levy, D., Bassereau, P. The giant vesicle book. The giant vesicle book. , 38-51 (2021).
  66. Gutierrez, M. G., et al. G Protein-coupled receptors incorporated into rehydrated diblock copolymer vesicles retain functionality. Small. 12 (38), Weinheim an der Bergstrasse, Germany. 5256-5260 (2016).
  67. Peruzzi, J., Gutierrez, M. G., Mansfield, K., Malmstadt, N. Dynamics of hydrogel-assisted giant unilamellar vesicle formation from unsaturated lipid systems. Langmuir. 32 (48), 12702-12709 (2016).
  68. Shchelokovskyy, P., Tristram-Nagle, S., Dimova, R. Effect of the HIV-1 fusion peptide on the mechanical properties and leaflet coupling of lipid bilayers. New Journal of Physics. 13, 025004 (2011).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 180،
بناء نموذج الأغشية الدهنية دمج G-البروتين إلى جانب المستقبلات (GPCRs)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C.,… More

Elbaradei, A., Dalle Ore, L. C., Malmstadt, N. Construction of Model Lipid Membranes Incorporating G-protein Coupled Receptors (GPCRs). J. Vis. Exp. (180), e62830, doi:10.3791/62830 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter