本方案利用琼脂糖溶胀技术，作为一种强大且具有广泛适用性的方法，将整合膜蛋白（IMPs）包封入巨型单层脂质囊泡（GUVs）中。文中以人源5-羟色胺1A受体蛋白（5-HT1AR）的重建为例，该蛋白属于药理学上重要的G蛋白偶联受体类别之一。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
由于质膜的复杂性以及活细胞中影响蛋白质行为的多种因素，对整合膜蛋白的结构与功能进行稳健的体外研究一直存在挑战。巨大单层囊泡（GUVs）是一种仿生性强且高度可调的体外模型系统，可用于研究蛋白质-膜相互作用，并以精确、刺激依赖的方式探测蛋白质行为。在本实验方案中，我们介绍了一种经济高效的方法，用于制备稳定整合人源5-羟色胺1A受体（5-HT1AR）的GUVs。我们采用改良的水凝胶溶胀法制备GUVs：将脂质膜沉积在琼脂糖与5-HT1AR的混合物表面，随后对整个系统进行水化，从而形成膜中正确取向且具有功能性的5-HT1AR整合的囊泡。这些GUVs随后可通过显微镜技术用于研究蛋白质-膜相互作用及定位行为。最终，该方案有助于加深对整合膜蛋白功能的理解，提供深刻的生理学洞察。
引言
合成模型膜是研究生物膜基本性质和功能的有力工具。巨大单层囊泡（GUVs）是研究多种质膜性质的最重要平台之一，可被设计用于模拟不同的生理条件1,2,3,4,5,6,7,8。已有充分证据表明，质膜及其组织结构在多种细胞过程中发挥关键作用，例如信号转导、黏附、内吞作用和物质运输9,10,11,12,13,14,15。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 蛋白质标记
- 将NHS-罗丹明、5-HT1A膜片段和一个7 K MWCO离心脱盐柱置于室温下平衡。
- 将1 mg NHS-罗丹明溶解于100 µL二甲基亚砜（DMSO）中。
- 加入5 µL 1 M碳酸氢钠溶液，将5-HT1AR溶液的pH值调节至8。
- 将3.66 µL NHS-罗丹明溶液加入50 µL的5-HT1AR溶液中，在微量离心管中轻轻吹打混匀。
注意：确保NHS-罗丹明的摩尔量至少过量10倍。 - 将混合物避光保存，并在室温下置于旋转仪上孵育1小时。
- 用200 µL 1×磷酸盐缓冲液（1× PBS）清洗7 k MWCO离心柱，每次1.5 min，共洗三次，每次离心条件为1.5 RCF。
- 将标记后的蛋白加入一个离心柱中，并在另一个微量离心管中平衡体积。
- 以1.5 RCF离心5 min，收集标记后的蛋白。
- 使用NanoDrop分光光度计在280 nm和554 nm处测定紫外-可见吸收光谱，并根据制造商说明书计算标记效率。
- 将标记后的蛋白避光保存于5 °C，直至后续使用。标记后溶液在约一周内保持稳定。
2. 膜整合5-HT1A的GUVs
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
测定蛋白质浓度，并计算染料与蛋白质的摩尔比，结果为1:1。通过共聚焦显微镜观察GUVs，我们确认了囊泡的成功形成及蛋白质的有效整合。脂质以0.4 mol%的ATTO 488-DPPE进行标记，蛋白质则通过罗丹明NHS酯对伯胺的共价修饰进行标记。图2a和图2b分别显示了在同一囊泡中ATTO 488通道和罗丹明通道下的含蛋白质囊泡。所有显微图像均经过暗电流和视场均匀性校正。图2c和图2d显示了未整合蛋白质的阴性对照GUV。图3a和图3b显示了一个整合了蛋白质的GUV，并给出了同一囊泡在两个通道中沿白色虚线的线强度分布图。线强度分布图展示了图像中沿所画白线方向各像素强度的二维图谱，其中x轴表示沿该线的距离，y轴表示像素强度。使用ImageJ软件绘制指定线段的强度分布曲线。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
我们已确定两个对整个实验方案成功至关重要的步骤： 等离子体处理与脂质沉积 盖玻片的等离子清洗至关重要 确保琼脂糖水凝胶对玻璃盖玻片具有充分的覆盖和良好的黏附性。等离子清洗可实现两个目的： 首先，去除玻璃表面的有机物残留；其次，活化盖玻片表面，随着玻璃表面亲水性增强，其润湿性得以提高62,63. 等离子清洗后触碰盖玻片表面会使超洁净表面失活并受到污染，应严格避免。我们建议仅触碰其最边缘和底面 在进行琼脂糖封片步骤时，操作盖玻片应避免触碰盖玻片的表面。 第二个关键步骤是将脂质沉积到干燥的水凝胶表面。该方法采用逐滴添加的方式进行脂质沉积， 需要使用气相色谱（GC）针头和气流，每次沉积数微升脂质溶液，从而精确控制所添加脂质的量及其在水凝胶表面的成膜位置。 该方法的缺点 是 若操作不慎， 它 可能导致少数情况 选择 脂质较厚的区域 薄膜，导.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢 Matthew Blosser 提供的宝贵讨论和建议。本工作由美国海军研究办公室（N00014-16-1-2382）和美国国家科学基金会（PHY-1915017）资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DOPC） | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850375C-25mg | |
| TI-Eclipse 倒置显微镜 | Nikon, Melville, NY | Eclipse Ti | |
| 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPPC） | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850355C-25mg | |
| 13/16″ 内径，1″ 外径硅胶O型圈 | Sterling Seal & Supply, Neptune, IN | 5-003-8770 | |
| 16位级联II 512电子倍增电荷耦合器件相机 | Photometrics, Huntington Beach, CA | Cascade II 512 | |
| 1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷脂酰胆碱（POPC） | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C-25mg | |
| 488 nm波长50 mW固态激光器，发射滤光片中心波长525 nm；561 nm波长激光器，发射滤光片中心波长595 nm | Coherent, Santa Clara, CA | 488/561-50-LS | |
| 5-HT1AR膜片段 | Perkin Elmer, Waltham, MA | RBHS1AM400UA | |
| ATTO-488标记的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺（DPPE） | ATTO-TEC, Siegen, Germany | AD 488-155 | |
| 台式等离子清洗仪 | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-32G | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
| 氯仿（CHCl3） | Millipore Sigma, Burlington, MA | CX1055 | |
| 胆固醇（Chol） | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | C8667-5G | |
| Corning 96孔平底透明板 | Corning, Corning, NY | 3904 | |
| Elmasonic E系列E15H超声波清洗仪 | Elma, Singen, Germany | [主网站已不再销售] | |
| 葡萄糖 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G7528 | |
| 甲醇（MeOH） | Millipore Sigma, Burlington, MA | MX0485 | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ND-1000 | |
| NHS-罗丹明 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 46406 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）（10倍浓缩PBS） | Corning, Corning, NY | 21-040 | |
| 旋转盘CSUX共聚焦显微镜头 | Yokogawa, Tokyo, Japan | CSU-X1 | |
| 标准25 mm 1号玻璃盖玻片 | ChemGlass, Vineland, NJ | CLS-1760 | |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S7903 | |
| Sykes-Moore反应室 | Bellco, Vineland, NJ | 1943-11111 | |
| 超低熔点琼脂糖 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5030 | |
| VWR模拟加热块 | VWR International, Radnor, PA | [主网站已不再销售] | |
| VWR试管旋转仪 | VWR International, Radnor, PA | 10136-084 | |
| Zeba Spin脱盐柱，7K分子量截留，0.5 mL | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 89882 |
参考文献
- Szoka, F., Papahadjopoulos, D. Comparative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes). Annual Review of Biophysics and Bioengineering. 9, 467-508 (1980).
- Mouritsen, O. G. Model answers to lipid membrane q....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
