Summary
このプロトコルは、アガロース膨潤を、巨大な単層脂質小胞(GUV)に組み込むための強力かつ一般化可能な技術として利用し、ここで述べるように、ヒト1Aセロトニン受容体タンパク質(5-HT1AR)の再構成に関して、薬理学的に重要なGタンパク質結合型受容体の1つである。
Abstract
一体膜タンパク質の構造と機能の堅牢な インビトロ 調査は、原形質膜の複雑性と生細胞におけるタンパク質の挙動に影響を与える多くの要因による課題となっています。巨大なユニラメラ小胞(GUV)は、タンパク質膜相互作用を調査し、正確で刺激に依存する方法でタンパク質の挙動を探査するためのバイオミメティックで高度に調整可能な インビトロ モデルシステムです。本プロトコルでは、膜中に安定に統合されたヒトセロトニン1A受容体(5-HT1AR)を用いてGUVを製造するための安価で効果的な方法を提示する。我々は、修飾されたヒドロゲル膨潤法を用いてGUVを製造する。アガロースと5-HT1ARの混合物の上に脂質膜を堆積させ、その後、システム全体をハイドレートすることによって、小胞は膜に組み込まれた適切に配向し、機能的な5-HT1ARで形成することができる。これらのGUVは、顕微鏡を介してタンパク質膜相互作用と局在化行動を調べるために使用することができます。最終的に、このプロトコルは、深い生理学的洞察を提供し、一体膜タンパク質の機能性の理解を進めることができます。
Introduction
合成モデル膜は、生体膜の基本的な特性と機能の調査に強力なツールです。巨大な単層小胞(GUV)は、様々な形質膜特性を研究するための最も顕著なプラットフォームの1つであり、異なる生理学的条件を模倣するように設計することができます1、2、3、4、5、6、7、8。シグナル伝達、接着、エンドサイトーシス、輸送9,11,12,13,14,15など、細胞プロセスの多くにおいて、形質膜とその組織が重要な役割を果たしていることは十分に確立されています。
GUVは、穏やかな水和物16、ヒドロゲル膨潤17、電気形質18、マイクロ流体技術19、20、21、22、jetting23、および溶媒交換24、25、26を含む様々な方法を用いて製造されている。一体型膜タンパク質(IMP)の取り扱いにおける課題により、それらを研究するインビトロプラットフォームは限られています。GUVは、ネイティブ環境を模倣した環境でのIMPを研究するための簡略化されたプラットフォームを提供します。GUVではタンパク質再構成にはいくつかのアプローチがありましたが、正しい向きを持つタンパク質を組み込み、タンパク質の機能性を維持することで課題が生じます。
GUVで最も成功したタンパク質再構成には、洗剤交換法が必要です。これは、洗剤によって天然環境からタンパク質を可溶化し、続いてタンパク質精製を行い、その後、様々な方法で洗浄剤分子を脂質に置き換えることを含む28。洗浄剤は精製中にIPSの三次構造を安定させるのに役立ちますが、洗剤ミセルはこれらのタンパク質にとって比較的不自然な環境であり、特に脂質二重層における機能研究のために、より良い安定化を図ります。また、従来のGUV製造技術を用いて機能性膜貫通タンパク質を脂質二重層に組み込むことは、これらのタンパク質の大きさ、繊細さ、および必要となる追加の洗剤交換ステップ27,31,32,33のために困難であった。有機溶剤を使用して洗剤を除去すると、タンパク質の凝集と変性34が発生します。改善された洗剤媒介方法は有望であったが、洗剤除去ステップには注意が必要であり、特定のタンパク質31,35に対して最適化が必要となる可能性がある。さらに、電気的な形質を利用する方法はタンパク質の選択を制限し、特に帯電した脂質31,36,37のすべての脂質組成物に適していない可能性があります。もう一つの技術は、所望のタンパク質を含む大きなユニラメラ小胞(RV)とGUVのペプチド誘発融合であるが、骨の折れるものであり、外来分子の挿入につながる可能性があるが、フソジェニックペプチド33,38,39。生きた細胞に由来する巨大な原形質膜小胞(GPMV)は、これらの問題のいくつかを克服するために使用することができますが、結果として生じる脂質およびタンパク質組成の制御を最小限に抑えることができます14,40,41。従って、我々の修飾アガロース膨潤法を用いたGUVのバイリピッド層におけるIPSの統合は、膜環境におけるこれらのタンパク質をさらに調べる信頼性の高い方法を提示する42,43,44,45。
細胞シグナル伝達とコミュニケーションは、Gタンパク質共役受容体(GPCRs)として知られているタンパク質のファミリーを含みます。GPCRsはタンパク質の最大のファミリーの一つであり、気分、食欲、血圧、心血管機能、呼吸、および他の多くの生理学的機能の中で睡眠を調節することに関連しています46。本研究では、ヒトセロトニン1A受容体(5-HT1AR)を用いたGPCRファミリーの原型的なメンバーである。5-HT1AR は中枢神経系 (CNS) 血管で見つけることができます。;それは、心血管、胃腸、内分泌機能、ならびにmood47の調節に参加する多数の機能に影響を与える。GPCR研究の大きな障壁は、その複雑な両親媒性構造から生じ、GUVはタンパク質機能性、脂質タンパク質相互作用、タンパク質間相互作用に至るまで、関心のある様々な特性の調査のための有望なプラットフォームを提示します。表面プラズモン共鳴(SPR)48,49、核磁気共鳴分光法(NMR)50,51、タンパク質脂質オーバーレイ(PLO)アッセイ51,52,53,54、天然質量分析計55、等温滴定熱量測定(ITC)56,56,56,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,lipsome、及び567,576,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,576,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,5700,57,5700,57,57,57,57,57,57,57,57,57,57,5堆積アッセイ58,59.我々の研究室では、簡略化したGUVアプローチを用いて、受容体の活性状態でGiαサブユニットと結合するBODIPY-GTPγSをカプセル化することにより、脂質-タンパク質相互作用がタンパク質機能に及ぼす影響を調べています。彼らの結合は、時間45で検出され得る蛍光シグナルを産生する蛍光を解く。さらに、様々な研究が脂質タンパク質相互作用と、膜曲率60,61を感知または安定化するタンパク質の役割を調査し、実現可能なGUVアプローチを利用することが重要な利点となり得る。
このプロトコルは、修飾されたアガロースヒドロゲルシステム17,42を使用してGPVの膜にGPCRを組み込むための簡単な方法を示しています。さらに、当社の前の研究に基づいて、我々の方法は、30〜40°Cに短期的に曝すことができるIMPに適している可能性があります。 簡単に言うと、目的のGPCRを含む膜断片と組み合わせたアガロースの薄膜を広げる。この層のゲル化後、アガロースの上に脂質溶液を堆積させ、溶媒を蒸発させます。その後、システムの再水和を水溶液バッファーで行い、脂質二重層にタンパク質を取り込んだGUVの形成を行った。
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Protocol
1. タンパク質標識
- NHS-ローダミン、5-HT1A 膜断片、および室温で平衡化する1つの7 K MWCOスピン脱塩カラムを可能にする。
- 1mgのNHS-ローダミンをジメチルスルホキシド(DMSO)の100 μLに溶解します。
- 5-HT1AR溶液のpHをpH 8に増加させるために1 M重炭酸ナトリウム溶液の5 μLを加えます。
- 5-HT1AR溶液の50 μLに3.66 μLのNHS-ローダミン溶液を加え、ピペットをマイクロ遠心チューブで上下に軽く上下させます。
注:NHS-ローダミンの少なくとも10倍のモル過剰を持っていることを確認してください。 - 混合物を光から保護し、室温で1時間回転器を置きます。
- 1回のリン酸バッファー生理食塩紙(1x PBS)の200 μLで7 k MWCOスピンカラムを洗浄1.5 RCFで1.5分間3回洗浄します。
- 標識したタンパク質を1つのカラムに加え、別のマイクロ遠心分離管の量のバランスをとります。
- 標識タンパク質を1.5 RCFで5分間1回スピンダウンします。
- 280 nm および 554 nm のナノドロップ分光光度計を使用して UV-vis スペクトルを取り、メーカーズマニュアルに従ってラベリング効率を計算します。
- さらに使用するまで5°Cで覆われた標識タンパク質を保管してください。このソリューションは、ラベル付け後約1週間安定しています。
2. 膜組み込み 5-HT 1A を持つ GUV
- 材料・試薬の製造
- タンパク質、脂質およびBSA(ウシ血清アルブミン)を室温まで平衡化することを許可する。
- この間、カバーリップをメタノールに入れ、40°Cで30分間超音波処理して清掃してください。 メタノールがカバースリップを完全に覆い、水浴中の水位が容器内のメタノールのレベルを上回っていることを確認してください。
注:メタノールは毒性があり、適切な化学フードで取り扱う必要があります。 - 空気の穏やかな流れでカバーリップの余分なメタノールを乾燥させます。40°Cのオーブンで覆われたカバースリップラックを15分間置き、余分なカバーリップが乾燥していることを確認します。
- プラズマ洗浄プロセスを開始します。まず、カバースリップをプラズマクリーナーに入れ、空気取り入れバルブを閉じてチャンバー内のすべての空気を避難させます。
- チャンバーが真空状態になったら、高いRF電源設定とほぼ完全な真空を使用して、真空チャンバーにわずかな空気を入れて5分間カバーリップを清掃します。プラズマの適切なレベルを確保するために、プラズマの結果として生じる色が安定した明るいピンク色になるように真空チャンバの開口部を調整します。
注:空気を使用する場合、プラズマ処理工程の間プラズマが明るいピンク色のままで、暗い紫色がチャンバー内に不適切な量の空気があることを示し、最適でないプラズマ処理を行う可能性があります。 - 5分が過ぎたら、RF電源を遮断し、真空を放します。
注:プラズマチャンバから取り外した際は、カバーリップが覆われたままであることを確認してください。
- ヒドロゲル調製物
- 超低温融解温度アガロース6mgと300μLの超純水(すなわち、2%(w/v)アガロース)を組み合わせます。
注:2%アガロースは、タンパク質を含まないGUVを作るために使用されます。アガロース溶液は、45°Cで2日間保つことができます。 - ステップ3.1で調製した3 w/v%アガロース用300μLの超純水と9mgの超低温アガロースを組み合わせます。3%アガロースはタンパク質組み込みGUVを作るために使用されます。
- 90°Cのヒートブロックに10分間置く前に溶液を短時間渦液にします。次いで、チューブを45°Cのヒートブロックに移す前に再び渦を出し、さらに使用するまで溶融形態に保つ。
- 超低温融解温度アガロース6mgと300μLの超純水(すなわち、2%(w/v)アガロース)を組み合わせます。
- アガロースとタンパク質混合
- 21 μLの3%アガロースを、5-HT1AR膜フラグメントの7 μLと混合します。ピペットは何度も何度もゆっくりと上下し、十分な混合を確保します。その後、45°Cで1分間インキュベートする。
- ヒドロゲルと脂質沈着
- タンパク質を含まないGUVの場合:2%アガロースの20 μLを使用して、プラズマ洗浄の新鮮なカバーリップに薄膜を作ります。アガロース液滴の上に別のカバースリップを素早く落とし、カバーリップをそっとスライドさせて両方のカバーリップに薄いフィルムを作ります。
注:このステップは、アガロースがまだ溶融形態にある間に液滴の滑りが起こらなければならないという点で難しいです。 - タンパク質組み込みGUVの場合:ピペットタンパク質/アガロース混合物をもう1回上下し、2%アガロースの20 μLを血漿洗浄カバースリップに沈着させます。上で説明したスリップキャストの指示に従います。
- アガロースを室温で30分間光から保護してゲル化させます。
- アガロース層の上に滴下して脂質を堆積させます.1-パルミトイル-2-オレロイルグリセロ-3-ホスホコリン(POPC)の合計10 μLを0.4モル%1,2-ジパルミトイルsで使用 アガロースフィルムの上にクロロホルムにATTO 488(ATTO-488-DPPE)(または脂質混合物)で標識した3-ホスホエタノールアミン(DPPE)ガスクロマトグラフィー針を使用して液滴を堆積させ、穏やかな気流を介して一度に1滴ずつ広げます。
注: このステップでは、ヒドロゲルの上に比較的均一な脂質層を作る場合は注意が必要です。また、クロロホルムは有毒であり、適切な化学フードで取り扱われるべきである。 - カバースリップの上にOリングを置き、Oリングの上にチャンバーの上部コンポーネントを置くことによって、サイクスムーア(S-M)チャンバーを組み立てます。チャンバーコンポーネントを一緒にねじ込んでチャンバーを組み立てるので、チャンバーを組み立てるのにメーカーから提供されたキーを使用して、チャンバを密封し、漏れを防ぎます。
注:チャンバーの上部はOリングで締め付ける必要がありますが、Oリングがチャンバーに正しく座っていない場合、カバースリップが割れる可能性がありますので、カバースリップがそのまま残っていることを確認するには注意が必要です。また、膨潤液を添加してもチャンバーが漏れないように、チャンバーが十分に密閉されていることを確認してください。チャンバーを十分に締め付けに失敗すると、漏れやサンプルの損失が発生します。
- タンパク質を含まないGUVの場合:2%アガロースの20 μLを使用して、プラズマ洗浄の新鮮なカバーリップに薄膜を作ります。アガロース液滴の上に別のカバースリップを素早く落とし、カバーリップをそっとスライドさせて両方のカバーリップに薄いフィルムを作ります。
- 小胞の腫れと収穫
- 200 mMスクロース450 μLを1x PBSで静かにピペットし、チャンバーを軽くタップしてヒドロゲル-脂質層の十分なバッファーカバレッジを確保することで、システム全体をハイドレートします。
注:スクロース溶液は、目的の生物学的プローブを含む水分補給緩衝液に置き換えることができます。 - チャンバーを45°Cに置き、チャンバーの上部をカバースリップで覆い、蒸発を防ぎます。サンプルが膨らみ、破片や光から1時間保護されます。
- 使用する96ウェルプレートの各ウェルに、1 mg/mL BSAを超純水に100 μL加えます。室温で1時間インキュベートする。
- 超純水で3回、1x PBSで200mMスクロースで1回洗浄します。
- 最後に、GUVサンプル溶液を添加するまで1x PBSに200mMのグルコースを添加する。
注: BSA は GUV 吸着をブロックするために使用されました。 - ヒドロゲルを膨らませた後、チャンバーを軽く振ってタップして、ヒドロゲル表面に取り付けられたままのGUVを取り外します。次いで、GUV-スクロース溶液を慎重にピペットアップする。
注:すべての小胞が表面から取り外されることを確認するための任意のステップとして、ショ糖懸濁液の一部をヒドロゲル表面に静かにピペットします。 - 1x PBSで200 mMのグルコースの700 μLを含む以前に調製されたマイクロ遠心分離チューブに懸濁液を移動します。
注: 密度勾配は遠心管の底に小胞の沈降につながります。 - 小胞がマイクロ遠心チューブの底に沈み、最適な回収を可能にするために、さらに1時間落ち着くようにします。
- グルコースにGUVを沈降した後、遠心分離管の底部(沈着小胞)から、前に調製したBSA処理した96ウェルプレートに300μLを移し、共焦点顕微鏡下の小胞を調べます。
注:最終的なサンプルで収集された破片の量を最小限に抑えるために、マイクロ遠心チューブの一番下を避けるようにしてください。
- 200 mMスクロース450 μLを1x PBSで静かにピペットし、チャンバーを軽くタップしてヒドロゲル-脂質層の十分なバッファーカバレッジを確保することで、システム全体をハイドレートします。
- 顕微鏡下でサンプルを確認します。
- サンプルに488 nmレーザーを照射します(二重層がATTO-488-DPPEで標識されているように、膜を視覚化することができます)。
- サンプルに561 nmのレーザーを照らします(NHS-ローダミンで標識されているので、タンパク質を視覚化することができます)。
注:光酸化が小胞を不安定にする可能性があるとしてサンプルをイメージングする際には注意が必要です。同じ日に小胞が観察された。
図1:詳細なプロトコル手順の図。BioRender.com で作成されたこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
タンパク質の濃度を測定し、標識の程度を、色素とタンパク質との間のモル比を1:1と計算した。共焦点顕微鏡を用いてGUVを調べることで、小胞の形成とタンパク質の統合が成功したことを確認することができました。脂質を0.4モル%ATTO 488-DPPEで標識し、タンパク質を一次アミンのローダミンNHSエステル修飾を介して共有結合標識した。 図2a および 図2b は、それぞれATTO 488およびローダミンチャネルにおけるタンパク質組み込み小胞を示す。すべての顕微鏡写真は暗電流であり、フラットフィールドは修正されています。 図2c および 図2d は、タンパク質を組み込みずに負のコントロールGUVを示す。 図3a および 図3b は、両方のチャネルにおいて同じ小胞の破線白線によって与えられた線強度プロファイルを有するGUVを組み込んだタンパク質を示す。線の強度プロファイルは、画像内の白い線に沿ったピクセルの強度を 2 次元プロットで示します。x 軸は線に沿った距離で、y 軸はピクセルの強度です。ImageJソフトウェアは、示された線のプロファイル強度をプロットするために使用されました。
図2:タンパク質を組み込んだGUVとタンパク質を含まないGUV(コントロール)を比較した顕微鏡写真。 顕微鏡写真(a)および(b)は、それぞれATTO 488およびローダミンチャネルを有するGUV蛍光を組み込んだタンパク質を示す。顕微鏡写真(c)および(d)は、ATTO 488およびローダミンチャネルで励起した場合にそれぞれGUVを省略したタンパク質を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:上の行は、ATTO 488(a)およびローダミン(b)チャネルに組み込まれたタンパク質のGUVの顕微鏡写真を示しています。示された白い破線の線強度プロファイルは以下の通りです。解析はImageJソフトウェアを使用して行った。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々は、全体的なプロトコルの成功に不可欠な2つのステップを同定しました:プラズマ処理と脂質堆積。カバーリップのプラズマ洗浄は、ガラスカバースリップにアガロースヒドロゲルの十分なカバレッジと接着性を確保するために不可欠です。プラズマ洗浄は、まず、ガラス表面から有機物の痕跡を取り除く、という2つのことを達成します。第二に、それはカバースリップ表面を活性化し、ガラス表面の親水性が増加するにつれて濡れ性の増加を可能にする62,63.カバースリップ表面ポストプラズマ洗浄に触れると、超クリーン表面が不活性化し、汚染され、強く推奨されます。私たちの推奨は、アガローススリップ鋳造工程のカバーリップを扱う際にカバースリップの非常に端部と裏側に触れることです。この方法は、滴下脂質沈着を使用し、ガスクロマトグラフィー(GC)ニードルと空気流を必要とし、一度に数マイクロリットルの脂質溶液を沈着させ、加えられる脂質の量とヒドロゲル表面への脂質膜の配置を正確に制御することを可能にする。この方法の欠点は、慎重に行わなければ、より厚い脂質膜を有するいくつかの選択領域をもたらし、結果として、GUV収量を減少させることが重要である。
このプロトコルの最も重要な利点の1つは、プラットフォーム自体の柔軟性であり、この方法はタンパク質および脂質組成の変化、ならびにカプセル化およびバッファ修飾に非常によく役立つ。このプロトコルは、原則として、アデノシン受容体(A2AR)から機能性を犠牲にすることなくアクアポリンを植えるまで、多くの異なる膜貫通タンパク質を組み込むことができたため、任意の膜貫通タンパク質を含むことができます。従来、タンパク質は、洗浄剤による可溶化後、またはプロテオリポソームまたは小さな単層小胞に組み込まれ、その後、予め形成されたGUV65に統合することができるGUVに組み込まれてきました。当社の改変ヒドロゲル膨潤法の利点は、洗剤または中間小胞の依存性を除去し、中間水化足場を提供することです。この利点は2つあります:我々は、上記の洗剤の濃度に関してより多くの準備と注意を必要とする洗剤交換方法に依存することなく、より生理学的に関連するバッファ内の膜に機能的なGPCRを安定的に組み込むことができること、およびGUVがヒドロゲルの表面から芽を出すプロセスが二層66のタンパク質の正しい配向を可能にすることです。.GUVの出芽プロセスは、多くの小さなナノメートルスケールの小胞を、最初から正しいタンパク質の配向を奨励するより大きなミクロンスケールの小胞に合体することを示しました。私たちは、前の作業ではそうであることを示しています。つまり、アデノシン受容体の特異的細胞質ループを標的とする抗体を共有的に標識し、その標識抗体をタンパク質と共にインキュベートし、次いで改変ヒドロゲル膨潤法を用いて脂質染料標識GUVに標識タンパク質を組み込んだ。その後、タンパク質組み込まれた小胞を、二重層を越えることができない荷電クエンチャーにさらした。その後、脂質染料の蛍光が50%減少しますが、標識タンパク質の蛍光はクエンチャーの影響を受けず、適切な配向を実証します44。
私たちの研究室のこれまでの研究では、脂質ヘッドグループ電荷、ジウテリオニックおよびネットイオン性帯電脂質、ならびにpH、イオン強度、浸透圧、ヒドロゲル濃度などの緩衝剤およびヒドロゲル特性がGUV形成67のダイナミクスに及ぼす役割を調査しました。要するに、脂質電荷はGUV形成に大きな影響を及ぼさないが、スクロース濃度の上昇などの緩衝特性(例えば、185mイオン強度PBS緩衝液中の500mMスクロース)がGUV形成に悪影響を及ぼし、その結果、不定形の小胞が収穫に容易に与えないだろう。酸性溶液(pH=3)は形成速度を増加させ、一方、より塩基性溶液(pH=8)はGUV形成の速度を抑制する。GUVは依然として酸性バッファーと塩基性バッファーの両方で形成され、小胞サイズのわずかな差しかありません。低いアガロース濃度(〜0.1-1 w/v%)も、均質な表面被覆率の欠如およびヒドロゲルの腫脹の減少、ヒドロゲル表面からのGUVの合体および出芽に必要な力のためにGUV形成に悪影響を及ぼす。したがって、100-200mMのスクロース/グルコース溶液を有する2w/v%最終アガロース濃度をpH7.4で185mMPBSの緩衝イオン強度と組み合わせることで、アガロース腫脹、GUV形成率、および後続の小胞サイズの良好なバランスを達成すると判断した。タンパク質を含む小胞の場合、初期アガロース濃度を3 w/v%に増加させることで、タンパク質溶液の添加後に2w/v%の最終的なアガロース濃度が可能になります。形成ダイナミクスに加えて、ショ糖/グルコース緩衝システムはまた、形成されたGUVの沈殿および後続の収集、ならびに位相対比顕微鏡の下での視覚化を促進する65,68。
このプロトコル、特にアガロースと小胞の選択に関してはいくつかの注意点があります。例えば、超低融解温度アガロースを使用する一方で、アガロース水懸濁液は少なくとも60°Cに達して溶融する必要があり、アガロースタンパク質混合物は45°Cでインキュベートされます。 我々の経験では、この温度は5-HT1ARの活性を排除するものではありませんが、他のタンパク質に対する注意が必要です。一般に、使用するアガロースは20°Cでゲル化し始め、20°C以上の温度で膨潤反応が起こる可能性がありますが、このプロセスはその温度を下回って機能しません。また、温度が20°Cに近づくほど、膨潤ステップが効率が悪くなり、その後のGUV収量の低下につながり、アガロースは沈降/回収管の底部に破片として持続する可能性もあるため、沈降および可視化ステップ中に問題を提示する可能性があります。したがって、溶融アガロースを維持するために必要な温度に注意が必要であり、上記の温度が目的のタンパク質を変性させないことを保証するだけでなく、最終的なサンプルに含まれる余分な懸濁アガロースを避けるために沈降溶液を刺激する。この方法は現在の状態でも異種のGUV個体数の大きさをもたらし、一部の小胞は多層性を示し、小胞内の小胞などの他の欠陥のある小胞現象を示す。これは一般的なGUV形成方法の典型であり、顕微鏡検査および分析のために小胞を選択する際に警戒と裁量を必要とする。異常に高いレベルの蛍光を表示するGUVは、アガロースがこれらの小胞の内部に見られるため、分析にも推奨されません。私たちの研究室の未発表の研究は、この技術を使用して作られた小胞を使用してマイクロピペット吸引実験を行うことができました, アガロース法は、内腔内の力学を変えることなく小胞を生成することを示しています.
制限はさておき、このプロトコルは、タンパク質を組み込んだGUVを生成するための堅牢で簡単な方法を提示します。これは、電流や穏やかな水分補給を伴うベシクル形成の他の方法からの逸脱であり、タンパク質の構造に大きなダメージを与え、機能しなくなるか、さらなる洗剤の可溶化および除去ステップを必要とする。GPCRsがすべての医薬品標的の3分の1以上を占めていることを考えると、このタンパク質ファミリーを高度に調整可能で高スループットのバイオミメティックプラットフォームで研究できることに大きな関心があります。具体的には、タンパク質と脂質相互作用の研究、脂質微小環境がタンパク質の機能性や局在性に影響を与える方法、医薬品の開発と発見を知らせることができるその他の基本的な生物物理学的質問の研究から、この研究の応用範囲です。この例は、脂質酸化の結果として受容体機能の差異を識別することができた私たちの研究室内で完了した作業で見つけることができます。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反はない。
Acknowledgments
私たちは、貴重な議論とアドバイスのためにマシュー・ブロッサーに感謝します。この研究は、海軍研究局(N00014-16-1-2382)と国立科学財団(PHY-1915017)によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850375C-25mg | |
| TI-Eclipse inverted microscope | Nikon, Melville, NY | Eclipse Ti | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850355C-25mg | |
| 13/16″ ID, 1″ OD silicon O-rings | Sterling Seal & Supply, Neptune, IN | 5-003-8770 | |
| 16-bit Cascade II 512 electron-multiplied charge coupled device camera | Photometrics, Huntington Beach, CA | Cascade II 512 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C-25mg | |
| 50 mW solid-state lasers at 488 nm and emission filter centered at 525 nm, and 561 nm with emission filter centered at 595 nm | Coherent, Santa Clara, CA | 488/561-50-LS | |
| 5-HT1AR membrane fragments | Perkin Elmer, Waltham, MA | RBHS1AM400UA | |
| ATTO-488-1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DPPE) | ATTO-TEC, Siegen, Germany | AD 488-155 | |
| Bench top plasma cleaner | Harrick Plasma, Ithaca, NY | PDC-32G | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A9418 | |
| chloroform (CHCl3) | Millipore Sigma, Burlington, MA | CX1055 | |
| Cholesterol (Chol) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | C8667-5G | |
| Corning 96-well Flat Clear Bottom | Corning, Corning, NY | 3904 | |
| Elmasonic E-Series E15H Ultrasonic | Elma, Singen, Germany | [no longer sold on main website] | |
| glucose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G7528 | |
| methanol (MeOH) | Millipore Sigma, Burlington, MA | MX0485 | |
| NanoDrop ND-1000 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | ND-1000 | |
| NHS-Rhodamine | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 46406 | |
| phosphate buffered saline (PBS) (10x PBS) | Corning, Corning, NY | 21-040 | |
| spinning-disc CSUX confocal head | Yokogawa,Tokyo, Japan | CSU-X1 | |
| standard 25 mm no. 1 glass coverslips | ChemGlass, Vineland, NJ | CLS-1760 | |
| sucrose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S7903 | |
| Sykes-Moore chambers | Bellco, Vineland, NJ | 1943-11111 | |
| Ultra-low melting temperature agarose | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | A5030 | |
| VWR Analog Heatblock | VWR International, Radnor, PA | [no longer sold on main website] | |
| VWR Tube Rotator | VWR International, Radnor, PA | 10136-084 | |
| Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 89882 |
References
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