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Biology

Préparation d’échantillons par fraisage par faisceau d’ions focalisé corrélatif 3D pour la cryotomographie électronique haute résolution

Published: October 25, 2021 doi: 10.3791/62886
Automatic Translation
*1, *1, 1,2, 1, 1,3
1Max Planck Institute of Biochemistry, 2Max Planck Institute for Biophysics, 3Fondazione Human Technopole
* These authors contributed equally

Summary

Nous présentons ici un pipeline pour le fraisage par faisceau d’ions focalisés corrélatifs 3D sur le guidage de la préparation d’échantillons cellulaires pour la cryo-tomographie électronique. La position 3D des protéines d’intérêt marquées par fluorescence est d’abord déterminée par cryo-microscopie à fluorescence, puis ciblée pour le broyage. Le protocole convient aux cellules de mammifères, de levures et de bactéries.

Abstract

La cryotomographie électronique (cryo-ET) est devenue la méthode de choix pour étudier l’ultrastructure cellulaire et les complexes moléculaires dans leur état natif congelé-hydraté. Cependant, la cryo-ET exige que les échantillons soient suffisamment minces pour ne pas disperser ou bloquer le faisceau d’électrons incidents. Pour les échantillons à cellules épaisses, cela peut être réalisé par broyage par faisceau d’ions cryofocalisés (FIB). Ce protocole décrit comment cibler des sites cellulaires spécifiques pendant le broyage FIB à l’aide d’une approche corrélative 3D, qui combine des données de microscopie à fluorescence tridimensionnelle avec des informations provenant du microscope électronique à balayage FIB. Grâce à cette technique, des événements et des structures cellulaires rares peuvent être ciblés avec une grande précision et visualisés à une résolution moléculaire à l’aide de la cryo-microscopie électronique à transmission (cryo-MET).

Introduction

Le fraisage par faisceau d’ions focalisé permet la préparation d’échantillons biologiques minces à partir d’échantillons cryofixés sans les problèmes généralement associés aux coupes mécaniques telles que les marques de couteau et les artefacts de compression1. Lorsqu’il est associé à la cryotomographie électronique, le broyage FIB permet des études biologiques à haute résolution de la morphologie cellulaire et la détermination de la structure des complexes macromoléculaires directement à l’intérieur des cellules à une résolution sub-nanométrique 2,3,4. Alors que des espèces abondantes, telles que les ribosomes, se trouvent facilement dans les lamelles FIB coupées au hasard, de nombreux processus cellulaires reposent sur la colocalisation de plusieurs complexes ou sont localisés à des sites spécifiques dans la cellule. Par conséquent, un ciblage efficace est nécessaire pour ne pas perdre la caractéristique biologique d’intérêt pendant le processus de broyage et être limité à des coups aléatoires. Une approche corrélative combinant les données du microscope électronique à balayage (MEB)-FIB et d’un microscope optique à cryofluorescence (FLM) est donc nécessaire. Bien qu’il soit possible d’omettre la corrélation initiale et de combiner les données FLM et cryo-ET uniquement après l’acquisition TEM5,6, le fraisage par faisceau d’ions focalisé guidé par fluorescence permet une sélection précise de la zone de fraisage au préalable, ce qui se traduit par une acquisition de données plus efficace. Depuis sa conception7, l’application du broyage FIB corrélé 3D dans les études biologiques avait été limitée jusqu’à ce que nous rapportions récemment l’identification d’un nouveau compartiment à séparation de phase liquide-liquide (LLPS) chez la levure à l’aide de cette technique8.

Nous décrivons ici un protocole de microscopie optique et électronique 3D corrélée (CLEM) généralisée, qui peut être utilisé pour étudier une grande variété d’échantillons allant des bactéries aux cellules de levure et de mammifères. Bien que les expériences aient été réalisées à l’aide d’un certain ensemble d’instruments, les différentes étapes ne sont pas liées à un matériel spécifique et peuvent facilement être transférées à d’autres systèmes en tant qu’extension des protocoles existants 3,5. Une liste de l’équipement testé et des réglages suggérés sont fournis dans le tableau des matériaux et le tableau 1. Les quatre étapes clés de la chaîne sont (1) la préparation des échantillons, (2) la localisation des caractéristiques d’intérêt par cryo-microscopie à fluorescence, (3) le fraisage par faisceau d’ions focalisés corrélé en 3D, et (4) la localisation des structures ciblées pour l’acquisition de données cryo-ET sur les lamelles dans le microscope électronique à cryo-transmission (Figure 1).

Protocol

Figure 1
Figure 1 : Récapitulatif du flux de travail avec une sélection d’étapes critiques. L’ensemble du protocole est divisé en quatre étapes en fonction de l’équipement utilisé : la préparation des échantillons, y compris la congélation en plongée, la cryo-microscopie à fluorescence, le broyage cryo-focalisé par faisceau d’ions et la cryo-microscopie électronique. Pour chaque étape, plusieurs points clés sont mis en évidence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

1. Culture cellulaire et congélation en plongée des grilles

  1. Cultivez les cellules de votre choix et optimisez les stratégies de marquage et de traitement à température ambiante avant de passer aux cryo-expériences. Les cibles d’intérêt sont soit marquées à l’aide de fusions de protéines fluorescentes, soit par coloration vivante (par exemple, Halo-Tag, LysoTracker, BODIPY, coloration d’anticorps vivants, etc.). Si un traitement avec des agents chimiques ou biologiques (petites molécules, milieux spéciaux, siRNA, etc.) est nécessaire pour étudier le processus biologique d’intérêt, optimiser les conditions (p. ex., temps, concentration) à l’aide de l’imagerie FLM de cellules vivantes.
    1. S’assurer que les sites d’intérêt peuvent être localisés avec succès au-dessus du bruit de fond dans un nombre suffisant de cellules à l’aide de paramètres d’imagerie qui correspondent le plus possible aux conditions cryogéniques ultérieures (c.-à-d. NA, temps d’exposition, etc.).
  2. Sélection et préparation des grilles
    1. Sélectionnez des grilles dont la taille et l’espacement des trous sont adaptés aux cellules et aux repères utilisés (voir l’étape 1.3.1). N’utilisez pas de film continu sans trous, car cela pourrait entraîner une trop grande quantité de tampon résiduel après le transfert et ainsi réduire l’efficacité de la vitrification et entraver la détection des perles de repère. Pour un contact prolongé des cellules avec les grilles, assurez-vous que le support de la grille et le matériau du film sont biocompatibles.
    2. Nettoyez au plasma les grilles cryo-EM pour les rendre plus hydrophiles. Pour une utilisation en culture cellulaire adhérente, stériliser les grilles après un nettoyage au plasma avec des rayons UV pendant 20 minutes dans une hotte à flux laminaire. En option, les grilles peuvent être prétraitées avec des composés qui aident à l’adhésion cellulaire, tels que la poly-L-lysine ou la concanavaline A, comme décrit ci-dessous.
      REMARQUE : En général, les combinaisons grille/échantillon suivantes ont été utilisées avec succès dans le flux de travail cryo-FIB corrélatif : Levure : Cu ou Au, 200 mailles, film de carbone R1/4 ou SiO2 , éventuellement enrobé de concanavaline A ; Escherichia coli : Cu ou Au, 200 mesh, film de carbone R1/4 ou SiO2 ; Chlamydomonas reinhardtii : Cu ou Au, 200 mesh, R1/2 ou R1/4 carbone ou SiO2  ; HeLa : Au, 200 mailles, film R1/4 SiO2 , enduit de poly-L-lysine ; HEK293 : Au, 200 mailles, film R1/4 SiO2 , enduit de poly-L-lysine.
    3. Concanavalin Un enrobage pour améliorer la fixation des cellules de levure :
      • Préparer une solution d’enrobage de 1 mg/mL de concanavaline A dans un tampon HEPES de 10 mM avec 100 μM de CaCl2, pH 8,5. Placez une goutte (50 μL) de solution d’enrobage et deux gouttes d’eau distillée séparément sur un morceau de film de paraffine.
      • Prélevez la grille nettoyée au plasma à l’aide d’une pince à épiler à force inverse et insérez-la soigneusement dans la goutte de la solution de revêtement, en évitant les mouvements perpendiculaires à la grille pour éviter d’endommager le film.
      • Après ~5 s d’incubation, lavez la grille deux fois en l’insérant dans les gouttes d’eau de la même manière. Enfin, épongez l’excès de liquide en appliquant un papier filtre à l’arrière de la grille et laissez la grille sécher complètement avant de la libérer de la pince à épiler. Utilisez les grilles séchées pour la congélation en plongée.
    4. Revêtement Poly-L-lysine pour la culture en suspension et les cellules adhérentes :
      • Préparer une solution d’enrobage de 1 mg/mL de poly-L-lysine dans un tampon de borate de sodium de 0,1 M, pH 8,5.
      • Placez les grilles nettoyées au plasma dans une boîte appropriée pour la culture cellulaire et stérilisez-les pendant 20 minutes par rayonnement UV.
      • Ajouter délicatement suffisamment de solution d’enrobage pour couvrir toutes les grilles et incuber à 37 °C pendant au moins 2 h. Aspirez le liquide et lavez doucement les grilles deux fois avec du PBS avant d’ensemencer les cellules à la concentration souhaitée.
  3. Préparation des cellules et des perles de repère
    REMARQUE : Des billes de repère sont nécessaires pour le recalage 3D des données de fluorescence avec des images prises au microscope FIB/MEB afin de permettre le fraisage FIB corrélatif 3D.
    1. Choisissez des billes reconnaissables dans toutes les modalités d’imagerie, c’est-à-dire FLM, MEB et IB (diamètre recommandé de 0,5 à 1 μm), mais assurez-vous qu’elles ne surpassent pas la structure cible cellulaire lors de l’imagerie par fluorescence pour faciliter la différenciation des billes et de la caractéristique biologique d’intérêt. Éliminer les agents de conservation cytotoxiques contenus dans les billes de repère (p. ex., NaN3) selon les instructions du fabricant.
      NOTE : Pour faciliter la distinction entre les caractéristiques biologiques d’intérêt et les repères, il est utile que les spectres d’émission de fluorescence ne se chevauchent que partiellement afin que les signaux puissent être distingués en fonction des différences d’intensité dans les canaux FLM.
    2. Si la culture en suspension est utilisée, cultiver les cellules jusqu’à une densité appropriée (p. ex., levure OD 600 = 0,8, E. coli OD 600 = 0,8-1,0, C. reinhardtii 1500 cellules/μL) et effectuer les traitements requis pour l’expérience, tels que le changement de milieu, l’ajout de produits chimiques, la famine, etc. Fixez les grilles nettoyées au plasma à la pince à épiler comme requis pour la méthode de plongée (manuelle/automatique) et appliquez 4 μL de suspension cellulaire mélangée à ~1 x 105 perles/μL de suspension de billes de repère sur le côté film des grilles.
      REMARQUE : Déterminer la dilution optimale des cellules et des repères dans les expériences de titrage (par exemple, en vérifiant le cryo-FLM ou le FIB/SEM, voir ci-dessous). Cependant, pour la plupart des cellules cultivées en suspension, une concentration finale de ~1 x 105 billes/μL des billes de repère de 1 μm (dilution de 1 :20 à partir du stock ; voir le tableau des matériaux pour plus de détails) s’est avérée un bon point de départ.
    3. Si une culture adhérente est utilisée, nettoyez les grilles au plasma et stérilisez-les à l’aide d’un rayonnement UV pour une culture aseptique. Si nécessaire, pré-enduisez les grilles avec des composés qui aident à l’adhésion cellulaire (par exemple, poly-l-lysine, fibronectine, laminine ; voir l’étape 1.2.2). Ensemencer et cultiver des cellules sur les grilles dans des boîtes de culture normales ou des boîtes avec des subdivisions pour les grilles.
    4. Traiter les échantillons selon les besoins de l’expérience et maintenir les cellules dans des conditions optimales jusqu’à la congélation en plongée (p. ex., 37 °C/5 % de CO2 pour HEK/HeLa). Retirez délicatement les grilles de la boîte de culture et fixez-les à la pince à épiler plongeante. Appliquer 4 μL du milieu de culture mélangé à des repères (1 x 105 billes/μL pour les repères de 1 μm) sur le côté porteur de cellules.
  4. Congelez les cellules à l’aide d’une procédure de congélation manuelle ou automatisée. Si possible, n’épongez la grille que du côté opposé aux cellules pour éviter d’endommager mécaniquement les cellules (Figure 2A). Sur les systèmes de plongée automatisés à deux bras, y parvenir en plaçant une feuille de polytétrafluoroéthylène (par exemple, du téflon) au lieu d’un papier buvard sur le tampon face aux cellules. Transférez les grilles dans des boîtes de stockage et conservez-les dans de l’azote liquide (lN2) jusqu’à leur utilisation.
    ATTENTION : le lN2 et d’autres cryogènes peuvent causer de graves dommages aux yeux et à la peau. Utilisez un équipement de protection individuelle (EPI) et ne travaillez que dans un espace bien ventilé pour éviter l’accumulation de concentrations dangereuses de N2 .
    REMARQUE : Toutes les étapes ultérieures doivent être effectuées de préférence dans la phase liquide de lN2 pour éviter la contamination des surfaces cellulaires et lamellaires, car cela pourrait compliquer le traitement en aval. Réduisez le contact avec les cristaux de glace flottants en utilisant toujours de l’azote liquide propre (p. ex., un filtre pour éliminer la glace flottante), en éliminant les étapes de transfert inutiles et, si possible, en travaillant dans un environnement à humidité contrôlée.
  5. Montez et clipsez les grilles de congélation en plongée dans AutoGrids avec la découpe et les cellules vers le haut (Figure 2A) pour l’imagerie par cryofluorescence et le fraisage FIB ultérieurs. Pour assurer un alignement correct des échantillons dans le MET, la direction de fraisage doit être orthogonale à l’axe d’inclinaison cryo-ET. En conséquence, placez les repères d’orientation (par exemple, une gravure LASER ou des points de repère amovibles) sur les grilles automatiques avant de les découper pour faciliter cet alignement (Figure 2A).
  6. Filtrez la qualité de la grille (Figure 2B) sur le cryo-FLM et le FIB/SEM. Optimisez la densité cellulaire, le temps et la force de transfert pour obtenir une distribution uniforme des cellules et des billes. Utilisez l’imagerie en lumière réfléchie sur un microscope à cryofluorescence ou utilisez le cryo-FIB-SEM pour vous assurer que les cellules et les billes de repère sont clairement visibles (Figure 2B, flèches blanches).
  7. Si nécessaire, répétez la plongée dans de meilleures conditions, par exemple en variant la concentration cellulaire et/ou le temps de transfert. Une fois que les paramètres de plongée appropriés ont été trouvés, ne répétez pas le criblage de la grille à chaque nouvelle série d’expériences.

Figure 2
Figure 2 : Criblage des grilles appropriées à l’aide du MEB et de l’IB. (A) Des marques d’orientation doivent être placées sur les grilles automatiques perpendiculairement à la direction de fraisage afin de simplifier le chargement correct dans le MET. Les cellules sont montées vers le haut dans l’AutoGrid assemblé. (B) Après la congélation en plongée, les grilles sont inspectées dans le MEB afin d’évaluer et d’optimiser les conditions de plongée : a) Il ne doit pas y avoir trop de cellules par grille. Pour les cellules HeLa, par exemple, n’utilisez pas plus de 1 à 4 cellules/carré. Pour les cellules plus petites telles que Saccharomyces cerevisiae (illustrées ici), des amas de 4 à 6 cellules se sont avérés utiles. b) Les perles de repère (flèches blanches) doivent être clairement visibles et il ne doit pas y avoir trop de tampon autour des cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Microscopie optique à cryofluorescence

  1. Pour chaque grille, obtenez une vue d’ensemble en fluorescence (grand champ) et en contraste d’interférence différentiel (DIC) ou en mode réfléchi et sélectionnez les carrés de grille appropriés avec signal de fluorescence. Choisissez des champs de vision qui contiennent à la fois les cellules d’intérêt et un nombre suffisant de marqueurs de repère (6-12).
    1. Assurez-vous que les cellules et les perles sont uniformément réparties, pas trop denses et vers le centre de chaque carré. Ne choisissez que des carrés accessibles à la fois à l’instrument FIB-SEM et à l’instrument TEM, c’est-à-dire ceux qui se trouvent à au moins trois carrés du bord de la grille sur des grilles de 200 mailles (Figure 3A, à l’intérieur du cercle rouge).
  2. Sur chacun des carrés de grille sélectionnés, acquérir un empilement fluorescent avec un pas de mise au point approprié pour une déconvolution ultérieure, c’est-à-dire <1/2 de la limite de résolution axiale. Si possible, utilisez des objectifs à ouverture numérique élevée (NA) pour augmenter le nombre de photons et la précision de la localisation.
    1. Dans un microscope confocal avec un objectif NA 0,9, acquérir des piles avec une taille de pas de 300 nm, en suréchantillonnant la valeur de Nyquist. Enregistrez plusieurs piles de couleurs si nécessaire (Figure 2B). Conservez les grilles sous lN2 jusqu’à ce que vous les utilisiez à nouveau.
      REMARQUE : Pour déterminer la taille optimale du pas, choisissez les valeurs calculées par le logiciel de contrôle du microscope ou utilisez des outils en ligne9. Vérifiez qu’il n’y a pas de purge du signal entre les canaux, car une purge excessive est préjudiciable aux expériences de colocalisation. Cependant, certains peuvent être avantageux pour corriger les aberrations chromatiques dans les empilements multicolores.
  3. Déconvoluez les piles à l’aide du logicielapproprié 10,11 et découpez-lesà nouveau 7 si une taille de pixel isotrope est requise. La déconvolution, tout comme à température ambiante, nettoie le signal FLM et peut améliorer la précision de la localisation (Figure 3C).

Figure 3
Figure 3 : Sélection des carrés pour l’acquisition de la pile FLM et amélioration des données par déconvolution. (A) Vue d’ensemble d’une grille plongée avec des cellules de levure exprimant eGFP-Ede1 (vert) et mCherry-Atg8 (magenta). Choisissez des positions avec une bonne répartition des perles et des cellules, mais évitez les bords de la grille (ombrés en rouge). Les cases indiquent les positions avec de bonnes distributions de cellules où les empilements de fluorescence ont été pris. (B) Projection d’intensité maximale (MIP) de l’empilement multicolore prise sur le carré à cases jaunes (à partir de A) après déconvolution. La déconvolution des empilements FLM nettoie considérablement les signaux de fond indésirables et aide à localiser les billes en z avec plus de précision, comme le montrent les ajustements gaussiens avant (C) et après la déconvolution (D) (les ajustements ont été effectués en 3DCT et sont indiqués pour le cordon marqué d’un 1). Les images montrent des vues MIP agrandies du canal rouge (excitation : 552 nm, émission : 585-650 nm). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Fraisage par faisceau d’ions focalisé

  1. Chargez les grilles dans l’instrument cryo-FIB-SEM et utilisez les marques de découpe et/ou d’orientation pour assurer une orientation correcte en vue d’un placement ultérieur dans le MET (Figure 2A). Assurez-vous que la direction de fraisage est perpendiculaire à l’axe d’inclinaison du MET.
  2. Utiliser un système d’injection de gaz (SIG ; CpMePtMe3) aux positions de la scène prédéfinies par la configuration FIB-SEM pour recouvrir les grilles d’une couche organométallique protectrice. N’en appliquez pas trop, car cela pourrait interférer avec la localisation du cordon de repère dans le MET plus tard. Utilisez une enduiseuse plasma pour appliquer du platine métallique afin de réduire la charge de l’échantillon.
    REMARQUE : Si aucun réglage pour le revêtement GIS n’est disponible, ils peuvent facilement être trouvés en effectuant des cycles successifs de revêtement court (~2 s), suivis d’un fraisage FIB. Assurez-vous que l’échantillon peut toujours être coupé avec succès à des courants moyens (~100 pA) sans franges apparentes de la couche organométallique protectrice autour des bords lamellaires. Le temps et la distance de l’aiguille SIG (par rapport à l’échantillon) sont des paramètres importants à prendre en compte. N’utilisez pas l’aiguille GIS à température ambiante (c’est-à-dire 45 °C), mais aussi froide que possible pour obtenir un revêtement uniforme (25-27 °C).
  3. Enregistrez une vue d’ensemble de la grille MEB et effectuez une corrélation 2D avec des vues d’ensemble FLM pour trouver les carrés de la grille pour lesquels des cheminées fluorescentes ont été enregistrées. Inspectez manuellement les deux vues ou utilisez divers progiciels 7,10,12 pour trouver les carrés de la grille. Ici, l’accent est mis sur la boîte à outils de corrélation 3D (3DCT)7, qui utilise la transformation de corps rigides 3D avec une mise à l’échelle isotrope entre les vues. Une excellente présentation des fonctions 3DCT est disponible en ligne13.
    1. Sélectionnez et marquez au moins quatre positions correspondantes, par exemple des points de repère tels que des barres de grille ou des trous dans le film de support, dans la vue d’ensemble de la grille FLM et MEB (clic droit) et calculez la transformation entre les points marqués (corréler).
    2. Ensuite, placez les marqueurs au centre des carrés de grille correspondants pour lesquels les piles FLM ont été acquises et prédisez leur position dans la vue MEB (corréler ; Graphique 4A).
  4. Pour chaque carré de grille corrélé, prenez une image de faisceau d’ions (IB) à faible courant (≤10 pA) à l’angle de fraisage FIB de votre choix (10°-25° pour une navette de pré-inclinaison de 45°). Sélectionnez un champ de vision (c’est-à-dire la position et le grossissement) qui correspond aux données de fluorescence. Pour les grilles à 200 mailles, acquérez des données de fluorescence et FIB/MEB pour contenir des carrés de grille uniques, y compris les barres de grille (voir Figure 3A et Figure 4A).
    NOTA : Le fraisage doit être effectué à un angle aussi faible que possible pour éviter de perdre une plage angulaire importante pendant la cryo-ET et pour permettre l’identification d’un nombre suffisant de billes de repère. Par exemple : avec une inclinaison de la platine de 17°, une pré-inclinaison de la navette de 45° et une inclinaison de la poutre FIB de 52° par rapport au plomb, la pré-inclinaison des lamelles est de 10°, ce qui correspond à peu près à la plage angulaire préférée de ±60° dans le TEM en inclinant de -50° à +70°, le maximum de nombreux cryo-supports TEM.
  5. Prenez une image MEB du même carré pour faciliter l’identification des billes correspondantes dans la vue de fluorescence et de faisceau d’ions.
  6. Effectuez l’enregistrement de la pile FLM 3D déconvoluée et de la vue du faisceau d’ions 2D pour chaque position avec le 3DCT comme décrit dans les étapes suivantes (Figure 4B).
    1. Chargez la pile FLM 3D découpée et la vue du faisceau d’ions (IB) correspondante dans 3DCT.
      REMARQUE : Les données de fluorescence multicolores peuvent être chargées sous la forme d’un maximum de trois fichiers de pile monocanal distincts.
    2. Sélectionnez 4 billes de repère dans les données de fluorescence et cliquez avec le bouton droit de la souris sur la liste des positions pour déterminer leur position 3D via un ajustement gaussien du signal en x, y et z. Sélectionnez les perles correspondantes dans l’image IB et effectuez une corrélation 3D initiale (corréler).
    3. Ajoutez de manière itérative d’autres billes dans l’image de fluorescence, affinez leur position 3D et prédisez leur position dans la vue IB afin d’ajouter rapidement d’autres billes à l’enregistrement et de vérifier l’exactitude de la corrélation. Dans 3DCT, les valeurs de l’erreur quadratique moyenne (RMSE) sont fournies pour évaluer la cohérence de la corrélation7.
      1. Assurez-vous que les valeurs RMSE sont faibles et de l’ordre de la précision de localisation (~300 nm). Pour déterminer la précision de la corrélation, omettre délibérément certaines billes de repère clairement identifiables à la fois dans la fluorescence et dans le faisceau d’ions lors de l’étape d’enregistrement. Pour ce faire, vérifiez leur emplacement prévu par rapport à leur emplacement réel dans l’image du faisceau d’ions. Si la position prédite diffère significativement de la position réelle, répétez la corrélation initiale avec un nouvel ensemble de points de repère.
        REMARQUE : La corrélation de 6 à 8 billes s’est avérée suffisante pour un recalage précis des piles FLM et des vues IB. Cependant, l’ajout de repères supplémentaires (jusqu’à 12-15) sur une large gamme de valeurs z (par exemple, en sélectionnant des perles sur la barre de la grille ou dans des carrés voisins) peut améliorer la précision de la corrélation.
    4. Sélectionnez les signaux cellulaires ciblés, ajustez leur position 3D dans la pile FLM et appliquez la transformation pour prédire les positions cibles dans la vue IB (Figure 4B).
      REMARQUE : Toute entrée dans la liste des positions du MLF, qui n’a pas d’équivalent dans la liste de l’IB, sera traitée comme un signal à prédire.
  7. Pour chaque carré corrélé, transférez les positions prédites des caractéristiques d’intérêt à l’instrument FIB-MEM et placez des motifs de fraisage lamellaire (Figure 4C). Transférez des positions manuellement (par exemple, en mesurant la distance par rapport aux points de repère visibles, tels que des cellules ou des perles de repère) ou utilisez l’automatisation et les scripts tels qu’ils sont implémentés, par exemple, dans SerialFIB14. S’il y a plusieurs signaux par cellule, placez les modèles de manière à inclure autant de points d’intérêt (POI) que possible dans la même lamelle afin d’augmenter le débit.
  8. D’abord grossièrement, puis fraiser finement les lamelles jusqu’à une épaisseur finale de 150-250 nm. Éviter les étapes (p. ex., les coupures de soulagement des contraintes15) qui provoquent l’affaissement de la lamelle et entraînent ainsi le déplacement de l’élément d’intérêt réel par rapport aux piles FLM précédemment acquises. Utilisez les procédures de fraisage manuel3 ou automatisé 14,16,17,18 FIB. Avec l’une ou l’autre méthode, assurez-vous que l’élément d’intérêt reste au centre de la lamelle en l’amincissant symétriquement par le haut et le bas.
  9. Pour évaluer la précision du fraisage pour chaque lamelle, effectuez le même repérage qu’à l’étape 3.4. Cependant, cette fois-ci, utilisez l’image finale de l’IB après le fraisage FIB et vérifiez si les positions prédites des caractéristiques d’intérêt sont contenues dans la lamelle finale. Vous pouvez également superposer les projections pivotées des piles FLM, obtenues à partir de la sortie de 3DCT et des scripts personnalisés19, avec l’image finale de l’IB (Figure 4C, petit encart ).

Figure 4
Figure 4 : Procédure de fraisage FIB corrélative 3D. (A) La corrélation 2D-2D des vues d’ensemble FLM (à gauche) et MEB (à droite) de la grille est utilisée pour localiser les carrés de la grille sur lesquels les cheminées fluorescentes ont été prises précédemment. (B) Pour chaque carré sélectionné, après l’enregistrement 3D-2D des positions de repère correspondantes dans 3DCT (cases colorées), les positions des caractéristiques biologiques d’intérêt sont sélectionnées dans les données FLM. Sur la base de la prédiction des positions correspondantes dans l’image du faisceau d’ions (cercles rouges), les sites de préparation des lamelles sont sélectionnés. (C) Des images au microscope électronique à balayage (MEB) et à faisceau d’ions (IB) sont utilisées pour maintenir la cible centrée pendant le fraisage. Des épaisseurs finales de 150 à 250 nm ont été jugées suffisantes pour un traitement ultérieur en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. MET corrélatif

  1. Chargez les grilles dans le TEM, en vous assurant que l’orientation des lamelles (telle qu’elle ressort des marques de découpe ou d’orientation) est perpendiculaire à l’axe d’inclinaison.
    REMARQUE : Les microscopes de différents fabricants peuvent être contrôlés à l’aide de divers logiciels, par exemple, Tomo5, TOM ou SerialEM20. Ici, l’accent est mis sur ce dernier.
  2. Acquérez un montage de grille et des vues d’ensemble pour chaque carré de grille contenant des lamelles. Assurez-vous que le grossissement et le temps d’exposition sont appropriés pour visualiser les perles de repère dans les images TEM sans ajouter de manière significative à la dose totale d’électrons. Acquérir des cartes MET haute résolution (montages) de chaque lamelle.
  3. Le registre et la 3D-2D corrèlent la pile FLM avec le carré de la grille TEM et les vues d’ensemble des lamelles dans 3DCT. Utilisez la même procédure que celle décrite à l’étape 3.6 en sélectionnant les positions de billes correspondantes dans les images de fluorescence (x, y, z - ajustement gaussien) et de microscope électronique à transmission. Ensuite, sélectionnez les positions d’intérêt dans les canaux FLM et transférez-les dans les aperçus TEM. Si nécessaire, utiliser une procédure en deux étapes comprenant une première corrélation entre le MET FLM et le MET à faible grossissement, et la seconde une corrélation entre le MET à faible grossissement et le MET à fort grossissement (Figure 5).
  4. Transférez les positions manuellement (en mesurant les distances par rapport aux points de repère), à l’aide des outils d’enregistrement et de cartographie disponibles dans SerialEM20 ou d’un logiciel externe tel que CorRelator21.
  5. Configurer et exécuter des séries d’inclinaison à des positions corrélées. Utilisez un grossissement, un défocalisement et une dose totale appropriés (voir le tableau des matériaux et le tableau 1 pour plus de détails). Commencer l’acquisition à la pré-inclinaison déterminée par la lamelle (voir également la note à l’étape 3.4) et utiliser un schéma d’inclinaison à symétriedose-22. Utilisez l’acquisition manuelle ou par lots.

Figure 5
Figure 5 : Localisation des positions corrélées dans le MET. Après un fraisage FIB corrélatif 3D réussi et un transfert au microscope électronique à transmission, un recalage 3D-2D est effectué pour chaque carré fraisé entre les billes de repère (boîtes colorées) dans les empilements FLM et les aperçus TEM afin de localiser les sites potentiels pour la cryo-ET (cercles rouges). Des vues d’ensemble lamellaires à fort grossissement (zoom-in) peuvent ensuite être acquises pour configurer des tomogrammes plus précis. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Representative Results

Le protocole fournit une visite guidée du pipeline utilisé pour découvrir le dépôt de protéine endocytaire (END) dépendant de la protéine 1 (Ede1) contenant le domaine EH et l’endocytose (Ede1) et sa dégradation et son piégeage dans les corps autophagiques8. L’END est un compartiment séparé en phase liquide-liquide chez S. cerevisiae, qui tamponne une variété de protéines impliquées dans l’endocytose médiée par la clathrine (CME) après l’échec des événements endocytaires. L’un de ses principaux composants est Ede1, qui sert également de composant CME et de récepteur d’autophagie sélectif pour la dégradation de ce nouveau compartiment LLPS. En conséquence, une fusion EGFP d’Ede1 (EGFP-Ede1) sous le contrôle du promoteur de l’alcool déshydrogénase (ADH) a été utilisée pour visualiser les ENDs car la surexpression d’Ede1 interfère avec les premiers stades de l’endocytose et induit donc constitutivement le LLPS.

Sur une grille de congélation en plongée avec des cellules de levure surexprimant l’EGFP-Ede1 et des marqueurs de repère de 1 μm, cinq positions ont été sélectionnées pour l’acquisition de la pile FLM dans le canal GFP (Figure 6A ; TFS Corrsight ; mode confocal, pas de mise au point de 300 nm, plage de 10 μm). La grille a été transférée à l’instrument FIB (Quanta 3D FEG), et les carrés de grille pour lesquels les empilements FLM avaient été acquis ont été identifiés en effectuant une corrélation 2D-2D des aperçus de la grille de fluorescence et du MEB (comparer l’étape 3.2).

Pour chacun des carrés choisis, des images de faisceaux d’ions ont été prises à un faible courant (10 pA, grossissement 1200x), et les positions de repère correspondantes ont été enregistrées en 3DCT. Après avoir sélectionné les positions présentant la caractéristique biologique d’intérêt et ajusté leur position 3D dans l’empilement FLM, la transformation trouvée a été appliquée aux positions END putatives, et les sites de préparation des lamelles ont été sélectionnés (Figure 6B). Une poutre FIB inclinée de 11° par rapport à la surface de la grille a été utilisée dans les exemples présentés ici (pré-inclinaison de la navette FIB de 45° ; inclinaison de la platine de 18°). Les positions d’intérêt ont été transférées, et les motifs FIB ont été dessinés manuellement (figure 6D) en mesurant la distance des positions prévues par rapport aux points de repère importants dans l’image FIB (p. ex., trous, contaminations par la glace, perles de repère). La précision de l’enregistrement a été évaluée en omettant délibérément les billes qui pouvaient être clairement identifiées dans l’image FLM et IB, puis en comparant leurs positions réelles et prévues dans la vue du faisceau d’ions (par exemple, le diamant dans la figure 6B,C). La corrélation pour le carré illustré à la figure 6C s’est avérée exacte (c’est-à-dire que la position prédite des positions des billes FLM coïncidait parfaitement avec leur emplacement IB correspondant et les valeurs RMSE des sous-pixels rapportées par 3DCT pour le recalage). Ainsi, les lamelles ont été coupées aux positions prévues (site B) et broyées finement à une épaisseur de ~200 nm (décalage final du motif).

Figure 6
Figure 6 : Résultats représentatifs du ciblage corrélatif 3D des dépôts de protéines endocytaires (END) chez la levure. (A) Vue d’ensemble MEB de la grille avant fraisage. Les cases colorées indiquent les carrés de la grille pour lesquels des piles de fluorescence ont été prises au préalable. (B-C) Corrélation 3D dans un carré de grille. Après l’enregistrement de plusieurs perles de repère correspondantes (cases colorées) dans les données FLM (B, représentées ici comme projection d’intensité maximale) et l’image du faisceau d’ions (C), la précision du repère 3D a été vérifiée en prédisant la position de la bille indiquée par le diamant. Ensuite, les positions du signal cible (cercles rouges) ont été prédites dans la vue du faisceau d’ions pour deux sites de fraisage potentiels. (D) Zoom avant sur le site B montrant les positions prévues de trois puncta cibles (cercles rouges) et les motifs de fraisage initiaux (cases jaunes). On a prédit qu’un quatrième punctum de fluorescence était beaucoup plus faible que les autres puncta et qu’il n’était donc pas ciblé lors du broyage (cercle gris). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Après un fraisage FIB réussi et le transfert de la grille au microscope électronique à cryo-transmission (Titan Krios fonctionnant à 300 kV et équipé d’un détecteur d’électrons directs Gatan K2 et d’un filtre d’énergie Bioquantum), une vue d’ensemble de la grille a été enregistrée dans SerialEM et utilisée pour localiser les carrés avec des lamelles. Pour chaque lamelle, des images d’ensemble ont été acquises, et les données FLM ont été enregistrées en 3DCT (3D-2D) à l’aide de perles de repère correspondantes. Les positions des caractéristiques biologiques d’intérêt (Figure 7A) ont ensuite été prédites à l’aide de la transformation calculée à partir des billes de repère. Les vues d’ensemble des lamelles enregistrées à un grossissement plus élevé ont été cousues, et les sites d’intérêt ont été corrélés à l’aide de points de repère clairement visibles (par exemple, des perles de repère). Alternativement, des vues d’ensemble CLEM classiques peuvent être produites dans différents logiciels10,12.

Sur la base de la corrélation, quatre sites potentiels pour l’acquisition d’un tomogramme ont été trouvés pour la lamelle illustrée à la figure 7A. Cependant, cela inclut également une position qui n’a pas été ciblée lors du fraisage FIB corrélé 3D (comparer la figure 6D ; cercle gris) et une position bloquée par la contamination par la glace (figure 7 ; cases grises). Par conséquent, les tomogrammes n’ont pu être enregistrés que pour deux positions (figure 7B). Dans l’ensemble, un succès de corrélation de ~75%, c’est-à-dire que les lamelles qui ont survécu au transfert vers les structures TEM et END ont été trouvées sur les sites prévus, a été atteint (12 sites corrélés). Après la reconstruction du tomogramme, la segmentation et l’appariement des modèles, les structures END individuelles peuvent être visualisées dans leur contexte natif (Figure 7C,D). Il s’agit notamment du réticulum endoplasmique fenêtré (RE) entourant l’END, des gouttelettes lipidiques qui entrent parfois en contact et des ribosomes, qui sont exclus du compartiment LLPS. Dans l’ensemble, cela montre comment le broyage FIB corrélatif 3D peut fournir des informations au niveau moléculaire sur les processus biologiques rares à partir de cellules intactes.

Figure 7
Figure 7 : Résultats représentatifs de la visualisation de l’END avec la cryo-ET. (A) La vue d’ensemble TEM à faible grossissement du site de broyage illustrée à la figure 6 peut facilement être corrélée avec la projection de l’intensité maximale du FLM (figure 6B) pour localiser les caractéristiques biologiques d’intérêt (croix rouges). (B) Dans un deuxième temps, une vue à fort grossissement (cousue) peut être corrélée, et des positions pour l’acquisition du tomogramme (cases jaunes) sont mises en place. Les emplacements résultant du signal hors plan (boîte grise, comparez la figure 6D) ont été ignorés. (C-D) À l’aide de cette approche FIB corrélative 3D, le dépôt de protéines endocytaires (END) peut être visualisé dans son environnement d’origine. Des structures telles que le réticulum endoplasmique (RE), les ribosomes, les membranes et les gouttelettes lipidiques peuvent être identifiées et visualisées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Paramètres du nettoyeur de plasma
Nettoyeur plasma Harrick PDG-3XG : Réglage des radiofréquences : « HI », 30 s ; Plasma N2
Réglages du piston
TFS Vitrobot Mk IV : 100 % d’humidité ; blotforce = 8 ; temps de transfert = 10 s ; temps d’attente 0 s ; (cela devrait fonctionner pour la plupart des cellules en suspension et adhérentes)
Positions et horaires des SIG FIB
Quanta 3D FEG : Inclinaison = 0, Rotation = -180, Position Z = 13,5, Température de consigne = 26,15°, Temps = 8 s
Scios de TFS : Inclinaison = 0, Rotation = -180, Position Z = 9,8, Température de consigne = 28° C, Temps = 7 s
TFS Aquilos 1 : Position prédéfinie par logiciel, Consigne de température = 28°, Temps = 7 s
TFS Aquilos 2 : Position prédéfinie par logiciel, Consigne de température = 28°, Temps = 7 s
Paramètres de la coucheuse par pulvérisation cathodique FIB
Système de quorum : Dans la chambre de préparation du quorum : 10 mA, 40 s
Scios de TFS : 10 W, 500 V, 250 mA, 0,2 mbar, 15 s
TFS Aquilos 1 : 1 kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s
TFS Aquilos 2 : 1 kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s
Tomogram Acquisition
Titan Krios Gi2 Caméra K2, filtre d’énergie Gatan Bioquantum
Fente de 20 eV ; schéma d’inclinaison symétrique de la dose (Hagen) par pas de 2° ; Commencer à +10° (pré-inclinaison lamellaire !) à +70° et -50°
Titan Krios Gi4 Faucon 4 ; Filtre d’énergie Selectris X
Fente de 10 eV ; schéma d’inclinaison symétrique de la dose (Hagen) par pas de 2° ; Commencer à +10° (pré-inclinaison des lamelles !) à +70° et -50°
FLM Acquisition
Corrsight (mode confocal) Objectif : Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0,9 NA Pol ; Paramètres d’acquisition de la pile : taille de pixel x-y = 161,25 nm, taille du pas z = 300 nm.
Leica SP8 Cryo-Confocal Objectif : Leica HCX PL APO 50x / 0.90 CLEM ; Paramètres d’acquisition de la pile : taille de pixel x-y = 84 nm, taille du pas z = 300 nm.

Tableau 1 : Liste des équipements testés et réglages suggérés.

Discussion

1. Étapes critiques du protocole

L’optimisation des paramètres de culture cellulaire et de plongement de la grille est fondamentale pour ce flux de travail. Au début d’un projet, il vaut la peine d’investir du temps pour optimiser les stratégies de marquage, la distribution des cellules et des billes de repère, et tester différents paramètres de préparation de grille et de buvard. Travailler avec un échantillon congelé en plongée de manière optimale facilitera considérablement le traitement en aval.

Comme pour toute expérience TEM, des échantillons de vitré sont nécessaires. Pour les grandes cellules de mammifères telles que HeLa, 1 à 2 cellules par carré de grille sont préférables, mais les cellules peuvent encore être vitrées à une densité plus élevée. En option, la vitrification peut être améliorée dans les cellules de mammifères (par exemple, HEK293, HeLa) en les incubant avec 2,5 à 10 % (v/v) de glycérol ajouté au milieu de culture 10 min avant de plonger23. S’il est disponible, la mise en forme de grille peut être utilisée pour assurer un placement et une distribution parfaits des cellules, améliorant ainsi la vitrification et la corrélation ultérieure24.

Bien que des cellules spécifiques puissent être sélectionnées au cours du flux de travail, trop peu de cellules présentant la caractéristique biologique d’intérêt réduiront considérablement le débit global. Pour améliorer la corrélation dans les cellules POI positives, il convient d’utiliser des fluorophores suffisamment brillants. Ceci est particulièrement important au niveau de l’expression endogène. Nous avons constaté que dans des conditions cryogéniques, mVenus fonctionnait souvent mieux que l’EGFP en raison de sa luminosité accrue25 et du décalage hypsochrome, ce qui le maintient adapté aux configurations de filtres GFP standard dans des conditions cryogéniques26. Pour les structures cibles non ponctuelles, le compromis entre la longueur d’onde et la précision de localisation (limite de diffraction d’Abbe) doit également être pris en compte.

Une corrélation 3D efficace exige également que les grilles soient mécaniquement stables et manipulées avec le plus grand soin. Bien que des grilles standard en or ou en cuivre avec support en carbone puissent être utilisées, le taux de réussite peut être considérablement augmenté en utilisant des films SiO2 plus rigides en fonction du projet. Cependant, il n’a pas encore été déterminé de manière concluante si (a) la stabilité mécanique ou (b) l’adaptation des coefficients de dilatation thermique (substrat vs film) pour réduire le froissement cryogénique27, est le facteur le plus crucial pour une corrélation 3D réussie. De plus, pour ramasser les grilles d’or fragiles, des boîtes revêtues de polydiméthylsiloxane peuvent être utilisées5.

En plus d’assurer la stabilité de l’échantillon, un choix minutieux des paramètres d’imagerie FLM est nécessaire pour obtenir des empilements de fluorescence de haute qualité adaptés à un ciblage optimal lors du broyage FIB. À cet égard, il est également conseillé de tester différentes techniques de débruitage28 ou de déconvolution sur les données FLM, car cela peut améliorer considérablement la localisation des repères et des signaux cellulaires. Lors de la corrélation du signal de fluorescence avec des images FIB-SEM, un bon échantillonnage des billes de repère est important. Ils doivent être bien répartis autour des cellules et éventuellement à différentes hauteurs z. Il est également recommandé de valider la cohérence de la corrélation en vérifiant les positions prédites par rapport aux positions réelles des billes qui ont été délibérément exclues du modèle de repère, mais qui peuvent clairement être corrélées à l’œil nu. Les valeurs RMSE de 3DCT doivent également toujours être prises en compte pour vérifier la cohérence de l’enregistrement.

Étant donné que le dépôt de matériau broyé et d’eau résiduelle de la chambre FIB-SEM (c’est-à-dire la recontamination) augmente l’épaisseur effective des lamelles en ajoutant un matériau amorphe des deux côtés de celle-ci, le fait de conserver des lamelles finement broyées dans le microscope pendant une période prolongée réduit généralement la qualité des données TEM en raison d’événements supplémentaires de diffusion d’électrons. En conséquence, le fraisage est le plus souvent effectué en deux étapes : d’abord, toutes les positions sont fraisées grossièrement (c’est-à-dire à environ 800 nm), puis finement (à ~150-250 nm), et la grille est immédiatement déchargée après la fin de la dernière lamelle. Il est toutefois possible d’obtenir un meilleur succès de corrélation en traitant les positions d’intérêt de manière ponctuelle, ce qui permet d’effectuer un fraisage grossier et fin sur la même lamelle directement l’une après l’autre, car cela ne laisse pas de temps pour la flexion ou la déformation. Cependant, cela réduit le nombre maximum de lamelles pouvant être produites par grille en fonction du taux de recontamination du système. Pour une vitesse de 20 nm/h, 4 à 6 lamelles sont produites en 1 à 1,5 h.

Le mouvement de l’ensemble de la grille ou des lamelles grossièrement fraisées >300 nm entraînera une corrélation médiocre ou infructueuse (voir également les limitations discutées ci-dessous). Il doit donc être vérifié régulièrement, par exemple en comparant les images IB avant, pendant et après le fraisage FIB. Les sites qui présentent un mouvement important (>300 nm) doivent être éliminés. Optimiser la préparation de l’échantillon (c’est-à-dire le choix du type de grille, de la densité cellulaire et des paramètres de plongée ; voir la section 1 du protocole) et la stratégie de broyage pour éviter ces mouvements. La flexion des lamelles peut être considérablement réduite par le fraisage par site comme décrit à l’étape 3.6 et la réduction de la largeur des lamelles. Comme mentionné précédemment, bien que les coupes de soulagement des contraintes15 aient été conçues pour réduire la flexion des lamelles, elles entraînent souvent un mouvement concerté de la lamelle découplée, empêchant ainsi efficacement la corrélation. Des systèmes FLM intégrés peuvent être utilisés pour résoudre ce problème.

2. Modifications et dépannage de la méthode

Il est fortement conseillé d’effectuer une caractérisation approfondie de l’échantillon en imagerie de cellules vivantes avant de passer aux cryo-conditions. L’optimisation des échantillons cellulaires, des schémas de traitement et le fait de savoir à quel type de signal s’attendre avant d’entrer dans le flux de travail cryogénique peuvent améliorer considérablement son taux de réussite.

Dans le flux de travail présenté ici, un microscope à fluorescence autonome avec une platine cryogénique est utilisé pour imager les échantillons, suivi d’un transfert des grilles dans le microscope à faisceau d’ions focalisé. Cependant, il a été testé sur des systèmes où un microscope à fluorescence est intégré dans la chambre FIB-SEM, et donc aucun transfert d’échantillon n’est nécessaire pour acquérir des images de fluorescence 29,30,31. À l’aide de tels systèmes intégrés, les positions d’intérêt peuvent être imagées pendant et après le fraisage FIB pour vérifier la présence du signal de fluorescence cible sans augmenter le risque de contamination des lamelles finales. Il est cependant important de garder à l’esprit les paramètres optiques des microscopes utilisés, car, par exemple, un objectif à faible NA limitera la précision avec laquelle les billes de repère et les signaux cibles peuvent être localisés. Néanmoins, les configurations FLM intégrées aideront également à mieux gérer les légères déformations des grilles et des lamelles, car les piles FLM peuvent être mises à jour en permanence et comparées aux vues MEB et IB les plus récentes.

Comme alternative à l’imagerie par fluorescence de la lamelle entre le fraisage FIB et l’acquisition de données TEM, la corrélation post-TEM peut être utilisée pour vérifier le placement et le fraisage corrects des lamelles 5,6.

Pendant toutes les étapes du flux de travail corrélatif, mais surtout pendant la MET, il est recommandé de créer une superposition des données de fluorescence projetées sur les images FIB-SEM/TEM. De telles vues CLEM classiques aident à comprendre plus intuitivement quelle partie des cellules est contenue dans les lamelles. Il s’agit également d’une vérification utile de l’intégrité pour vérifier l’exactitude de la corrélation.

3. Limites de la méthode

L’approche FIB corrélative 3D nécessite des échantillons qui peuvent être fournis avec des billes de repère. Par conséquent, cette méthode est actuellement limitée aux grilles de congélation en plongée. Pour les échantillons congelés (tissus) à haute pression (HPF), seules les corrélations 2D-2D peuvent actuellement être effectuées. Potentiellement, les marqueurs de repère internes (par exemple, les organites, les gouttelettes lipidiques colorées) pourraient être une solution à ce problème32,33. Le taux de réussite de la corrélation finale dépend de nombreux facteurs, notamment la qualité de l’échantillon, la configuration de la microscopie à fluorescence, l’épaisseur des lamelles et la taille de la structure ciblée. La précision de corrélation à l’aide de l’approche de recalage 3D décrite est estimée à une plage de 200 à 300 nm sur l’image finale de l’IB, ce qui correspond à peu près à l’épaisseur typique des lamelles fraisées FIB7. En conséquence, les structures cellulaires beaucoup plus petites que cela seront difficiles à cibler à l’heure actuelle. De plus, un mouvement excessif sur le site de fraisage (>300 nm) réduit également la précision de la corrélation, un problème qui peut potentiellement être résolu avec des configurations FLM intégrées dans les instruments FIB/SEM. Les lamelles qui présentent une forte déformation ou flexion pendant le fraisage doivent, dans tous les cas, être exclues du flux de travail en aval.

Dans l’ensemble, l’imagerie par cryofluorescence est actuellement limitée par le critère de diffraction d’Abbe. Avec une application (et une commercialisation) plus systématiques des méthodes cryo-FLM super-résolues, un ciblage plus précis des structures cellulaires pourrait devenir possible, en particulier lorsqu’elles sont intégrées dans le FIB/SEM pour un fonctionnement à la volée.

4. Importance de la méthode

En particulier par rapport aux techniques non ciblées et post-corrélation, l’approche de fraisage FIB corrélée en 3D permet de sélectionner les positions appropriées avant l’étape TEM qui prend beaucoup de temps et de ressources. Cela permet une collecte de données et une planification de projet plus efficaces. De plus, les données de fluorescence corrélées ajoutent une couche d’informations qui peuvent être cruciales pour l’interprétation des tomogrammes et pour l’intégration des résultats cryo-ET dans les projets multi-échelles, en particulier lorsqu’il s’agit d’assemblages de protéines non structurées ou trop petits pour l’appariement de modèles et la moyenne des sous-tomogrammes.

5. Importance et applications futures potentielles

En combinaison avec des flux de travail avancés tels que la cryo-extraction d’échantillons HPF 34,35, le volume cryo-FIB-SEM 36 et l’imagerie par fluorescence à super-résolution26,37,38,39, la préparation lamellaire ciblée en 3D offre la perspective non seulement de disséquer les processus biologiques dans des cellules isolées, mais aussi de rendre les échantillons de tissus et de patients accessibles au broyage FIB et à la cryotomographie électronique. En tant que tel, il permettra de disséquer les processus pathologiques à haute résolution et constituera ainsi un élément intégral d’une biopsie à l’échelle nanométrique.

Disclosures

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous remercions Inga Wolf pour son soutien à l’infrastructure informatique, Florian Beck pour son soutien informatique et Oda H. Schiøtz pour la lecture critique du manuscrit. Le financement a été fourni en partie par le biais d’une bourse Alexander von Humboldt à Philipp S. Erdmann et d’une bourse à long terme ALTF 764-2014 de l’EMBO à Florian Wilfling. Anna Bieber a bénéficié d’une bourse de doctorat du Fonds Boehringer Ingelheim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Autogrids Thermo Fisher Scientific / Homemade 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout)
C-rings Thermo Fisher Scientific 1036171
Corrsight with cryo module Thermo Fisher Scientific FLM Alternative 1
Dynabeads MyOne COOH Thermo Fisher Scientific 65011 recommended 1 µm fiducial beads
EM Grids R1/4 SiO2 Quantifoil N1-S13nAu20-01
Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter Thermo Fisher Scientific Camera/Filter Alternative 1
FIB Aquilos 1 Thermo Fisher Scientific FIB Alternative 1
FIB Aquilos 2 Thermo Fisher Scientific FIB Alternative 2
FIB Quanta 3D FEG Thermo Fisher Scientific FIB Alternative 3
FIB Scios Thermo Fisher Scientific FIB Alternative 4
K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 Gatan Camera/Filter Alternative 2
Leica TCS SP8 with cryo module Thermo Fisher Scientific FLM Alternative 2
Plasma Cleaner PDC-3XG Harrick
Teflon Sheet (0.25 mm) plastx24.de 11645 Cut to same dimensions as filter paper
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 Thermo Fisher Scientific TEM Alternative 1
TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 Thermo Fisher Scientific TEM Alternative 2
THUNDER Imager  EM Cryo CLEM Thermo Fisher Scientific FLM Alternative 3
Vitrobot Mark IV Thermo Fisher Scientific alternativevly, use manaual plunger
Whatman filter paper Sigma Aldrich 10311807 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot

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Ce mois-ci dans JoVE numéro 176 cryo-tomographie électronique broyage cryo-focalisé par faisceau d’ions biologie structurale in situ
Préparation d’échantillons par fraisage par faisceau d’ions focalisé corrélatif 3D pour la cryotomographie électronique haute résolution
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Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, … More

Bieber, A., Capitanio, C., Wilfling, F., Plitzko, J., Erdmann, P. S. Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography. J. Vis. Exp. (176), e62886, doi:10.3791/62886 (2021).

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