Summary
Hier stellen wir eine Pipeline für das 3D-korrelative fokussierte Ionenstrahlfräsen vor, um die Präparation zellulärer Proben für die Kryo-Elektronentomographie zu steuern. Die 3D-Position von fluoreszenzmarkierten Proteinen von Interesse wird zunächst durch Kryo-Fluoreszenzmikroskopie bestimmt und dann gezielt gemahlen. Das Protokoll eignet sich für Säugetier-, Hefe- und Bakterienzellen.
Abstract
Die Kryo-Elektronentomographie (Kryo-ET) hat sich zur Methode der Wahl entwickelt, um zelluläre Ultrastrukturen und Molekülkomplexe in ihrem nativen, gefroren-hydratisierten Zustand zu untersuchen. Kryo-ET erfordert jedoch, dass die Proben dünn genug sind, um den einfallenden Elektronenstrahl nicht zu streuen oder zu blockieren. Bei dicken zellulären Proben kann dies durch kryofokussiertes Ionenstrahlmahlen (FIB) erreicht werden. Dieses Protokoll beschreibt, wie bestimmte zelluläre Stellen während des FIB-Fräsens mit einem 3D-korrelativen Ansatz anvisiert werden können, der dreidimensionale Fluoreszenzmikroskopiedaten mit Informationen aus dem FIB-Rasterelektronenmikroskop kombiniert. Mit dieser Technik können seltene zelluläre Ereignisse und Strukturen mit hoher Genauigkeit gezielt und mit molekularer Auflösung mittels Kryo-Transmissionselektronenmikroskopie (Kryo-TEM) sichtbar gemacht werden.
Introduction
Das fokussierte Ionenstrahlfräsen ermöglicht die Präparation dünner biologischer Proben aus kryofixierten Proben ohne die Probleme, die üblicherweise mit mechanischen Schnitten verbunden sind, wie z. B. Messerspuren und Kompressionsartefakte1. In Kombination mit der Kryo-Elektronentomographie ermöglicht das FIB-Fräsen hochauflösende biologische Untersuchungen der Zellmorphologie und die Bestimmung der Struktur makromolekularer Komplexe direkt aus dem Inneren von Zellen mit einer Auflösung von 2,3,4. Während reichlich vorhandene Spezies, wie z. B. Ribosomen, leicht in zufällig geschnittenen FIB-Lamellen zu finden sind, beruhen viele zelluläre Prozesse auf der Kolokalisation mehrerer Komplexe oder sind an bestimmten Stellen innerhalb der Zelle lokalisiert. Folglich ist ein effizientes Targeting erforderlich, um das biologische Merkmal während des Mahlprozesses nicht zu verlieren und auf zufällige Treffer beschränkt zu sein. Daher ist ein korrelativer Ansatz notwendig, der Daten aus dem Rasterelektronenmikroskop (REM)-FIB und einem Kryo-Fluoreszenz-Lichtmikroskop (FLM) kombiniert. Während es möglich ist, die anfängliche Korrelation wegzulassen und FLM- und Kryo-ET-Daten erst nach der TEM-Erfassung zu kombinieren 5,6, ermöglicht das fluoreszenzgeführte fokussierte Ionenstrahlfräsen eine genaue Auswahl des Fräsbereichs im Vorfeld, waszu einer effizienteren Datenerfassung führt. Seit seiner Konzeption7 war die Anwendung des 3D-korrelierten FIB-Mahlens in biologischen Studien begrenzt, bis wir kürzlich berichteten, dass wir mit dieser Technik ein neues Phasen-Flüssig-Kompartiment (LLPS) in Hefe identifizierthaben 8.
Hier wird ein generalisiertes 3D-Kryo-korreliertes Licht- und Elektronenmikroskopie-Protokoll (CLEM) beschrieben, mit dem eine Vielzahl von Proben untersucht werden kann, die von Bakterien über Hefen bis hin zu Säugetierzellen reichen. Während die Experimente mit einem bestimmten Instrumentarium durchgeführt wurden, sind die einzelnen Schritte nicht an bestimmte Hardware gebunden und können als Erweiterung bestehender Protokolle leicht auf andere Systeme übertragen werden 3,5. Eine Liste der getesteten Geräte und die empfohlenen Einstellungen finden Sie in der Materialtabelle und in Tabelle 1. Die vier Hauptschritte der Pipeline sind (1) Probenvorbereitung, (2) Lokalisierung von interessierenden Merkmalen durch Kryo-Fluoreszenzmikroskopie, (3) 3D-korreliertes fokussiertes Ionenstrahlmahlen und (4) Lokalisierung der Zielstrukturen für die Kryo-ET-Datenerfassung auf den Lamellen im Kryo-Transmissionselektronenmikroskop (Abbildung 1).
Protocol
Abbildung 1: Zusammenfassung des Workflows mit einer Auswahl kritischer Schritte. Das gesamte Protokoll ist je nach verwendeter Ausrüstung in vier Stufen unterteilt: Probenvorbereitung, einschließlich Tauchgefrieren, Kryo-Fluoreszenzmikroskopie, kryofokussiertes Ionenstrahlmahlen und Kryo-Elektronenmikroskopie. Für jeden Schritt werden mehrere wichtige Punkte hervorgehoben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
1. Zellkultur und Tauchgefrieren von Gittern
- Kultivieren Sie Zellen Ihrer Wahl und optimieren Sie Markierungs- und Behandlungsstrategien bei Raumtemperatur, bevor Sie zu Kryo-Experimenten übergehen. Targets von Interesse werden entweder mit fluoreszierenden Proteinfusionen oder Lebendfärbung (z. B. Halo-Tag, LysoTracker, BODIPY, Lebendantikörper-Färbung usw.) markiert. Wenn eine Behandlung mit chemischen oder biologischen Wirkstoffen (kleine Moleküle, spezielle Medien, siRNA usw.) erforderlich ist, um den interessierenden biologischen Prozess zu untersuchen, optimieren Sie die Bedingungen (z. B. Zeit, Konzentration) mit Hilfe der FLM-Bildgebung von lebenden Zellen.
- Stellen Sie sicher, dass die interessierenden Stellen erfolgreich über dem Hintergrund in einer ausreichenden Anzahl von Zellen lokalisiert werden können, indem Bildgebungseinstellungen verwendet werden, die den späteren Kryobedingungen so genau wie möglich entsprechen (d. h. NA, Belichtungszeit usw.).
- Auswahl und Vorbereitung von Gittern
- Wählen Sie Raster mit Lochgröße und Abstand aus, die für die Zellen und die verwendeten Passermarken geeignet sind (siehe Schritt 1.3.1). Verwenden Sie keine Endlosfolie ohne Löcher, da dies zu einem zu großen Restpuffer nach dem Blotting führen und somit die Vitrifikationseffizienz verringern und die Detektion von Fiducialkügelchen behindern kann. Bei längerem Kontakt der Zellen mit den Gittern ist darauf zu achten, dass der Gitterträger und das Folienmaterial biokompatibel sind.
- Reinigen Sie die Kryo-EM-Gitter mit Plasma, um sie hydrophiler zu machen. Für den Einsatz in adhärenten Zellkulturen sterilisieren Sie die Gitter nach der Plasmareinigung mit UV-Strahlung für 20 min in einer Laminar-Flow-Haube. Optional können Gitter mit Verbindungen vorbehandelt werden, die bei der Zelladhäsion helfen, wie Poly-L-Lysin oder Concanavalin A, wie unten beschrieben.
HINWEIS: Im Allgemeinen wurden die folgenden Gitter-/Probenkombinationen erfolgreich im korrelativen Kryo-FIB-Arbeitsablauf verwendet: Hefe: Cu oder Au, 200 mesh, R1/4 Kohlenstoff oder SiO2 -Folie, optional beschichtet mit Concanavalin A; Escherichia coli: Cu oder Au, 200 mesh, R1/4 Kohlenstoff oder SiO2 -Folie; Chlamydomonas reinhardtii: Cu oder Au, 200 mesh, R1/2 oder R1/4 Kohlenstoff oderSiO2-Folie; HeLa: Au, 200 mesh, R1/4SiO2-Folie, beschichtet mit Poly-L-Lysin; HEK293: Au, 200 mesh, R1/4 SiO2-Folie, beschichtet mit Poly-L-Lysin. - Concanavalin A-Beschichtung zur Verbesserung der Anheftung von Hefezellen:
- Bereiten Sie eine Beschichtungslösung von 1 mg/ml Concanavalin A in 10 mM HEPES-Puffer mit 100 μM CaCl2, pH 8,5 vor. Geben Sie einen Tropfen (50 μl) der Beschichtungslösung und zwei Tropfen destilliertes Wasser separat auf ein Stück Paraffinfolie.
- Nehmen Sie das plasmagereinigte Gitter mit einer Umkehrkraftpinzette auf und führen Sie es vorsichtig in den Tropfen der Beschichtungslösung ein, wobei Sie Bewegungen senkrecht zum Gitter vermeiden, um eine Beschädigung der Folie zu vermeiden.
- Nach ~5 s Inkubation waschen Sie das Gitter zweimal, indem Sie es auf ähnliche Weise in die Wassertropfen einführen. Zum Schluss tupfst du die überschüssige Flüssigkeit ab, indem du ein Filterpapier auf die Rückseite des Gitters legst und das Gitter vollständig trocknen lässt, bevor du es von der Pinzette löst. Verwenden Sie die getrockneten Gitter zum Einfrieren.
- Poly-L-Lysin-Beschichtung für Suspensionskultur und adhärente Zellen:
- Es wird eine Beschichtungslösung von 1 mg/ml Poly-L-Lysin in 0,1 M Natriumboratpuffer mit einem pH-Wert von 8,5 hergestellt.
- Die plasmagereinigten Gitter werden in eine für die Zellkultur geeignete Schale gegeben und 20 Minuten lang mit UV-Strahlung sterilisiert.
- Geben Sie vorsichtig so viel Beschichtungslösung hinzu, dass alle Gitter bedeckt sind, und inkubieren Sie bei 37 °C für mindestens 2 Stunden. Saugen Sie die Flüssigkeit an und waschen Sie die Gitter vorsichtig zweimal mit PBS, bevor Sie die Zellen auf die gewünschte Konzentration aussäen.
- Präparation von Zellen und Fiducialperlen
HINWEIS: Für die 3D-Registrierung der Fluoreszenzdaten mit Bildern, die im FIB/REM-Mikroskop aufgenommen wurden, werden Fiducial-Perlen benötigt, um ein 3D-korrelatives FIB-Fräsen zu ermöglichen.- Wählen Sie Kügelchen, die in allen Bildgebungsmodalitäten erkennbar sind, d. h. FLM, SEM und IB (empfohlener Durchmesser 0,5-1 μm), aber stellen Sie sicher, dass diese die zelluläre Zielstruktur während der Fluoreszenzbildgebung nicht überstrahlen, um die Unterscheidung der Kügelchen und des interessierenden biologischen Merkmals zu erleichtern. Zytotoxische Konservierungsstoffe in Fiducial-Kügelchen (z. B. NaN3) nach Anweisung des Herstellers entfernen.
ANMERKUNG: Für eine einfachere Unterscheidung zwischen den biologischen Merkmalen von Interesse und den Fiducials ist es nützlich, wenn sich die Fluoreszenzemissionsspektren nur teilweise überlappen, so dass die Signale anhand von Intensitätsunterschieden in den FLM-Kanälen unterschieden werden können. - Wenn eine Suspensionskultur verwendet wird, züchten Sie die Zellen auf eine geeignete Dichte (z. B. Hefe OD 600 = 0,8, E. coli OD 600 = 0,8-1,0, C. reinhardtii 1500 Zellen/μL) und führen Sie die für das Experiment erforderlichen Behandlungen durch, wie z. B. Wechsel des Mediums, Zugabe von Chemikalien, Hungern usw. Befestigen Sie die plasmagereinigten Gitter an Pinzetten, wie es für die Tauchmethode (manuell/automatisch) erforderlich ist, und tragen Sie 4 μl der Zellsuspension gemischt mit ~1 x 105 Kügelchen/μl Suspensionsflüssigkeit auf die Folienseite der Gitter auf.
HINWEIS: Bestimmen Sie die optimale Verdünnung von Zellen und Fiducials in Titrationsexperimenten (z. B. durch Überprüfung des Kryo-FLM oder FIB/REM, siehe unten). Für die meisten Zellen, die in Suspension gezüchtet wurden, hat sich jedoch eine Endkonzentration von ~1 x 105 Beads/μL der 1 μm Fiducial-Beads (1:20 Verdünnung vom Vorrat; siehe Materialtabelle für Details) als guter Ausgangspunkt erwiesen. - Wenn adhärente Kultur verwendet wird, reinigen und sterilisieren Sie die Gitter mit UV-Strahlung für die aseptische Kultur. Falls erforderlich, Gitter mit Verbindungen voranstreichen, die die Zelladhäsion unterstützen (z. B. Poly-L-Lysin, Fibronektin, Laminin; siehe Schritt 1.2.2). Säen und züchten Sie Zellen auf den Gittern in normalen Kulturschalen oder Schalen mit Unterteilungen für Gitter.
- Behandeln Sie die Proben so, wie es für das Experiment erforderlich ist, und halten Sie die Zellen bis zum Eintauchen unter optimalen Bedingungen (z. B. 37 °C/5 % CO2 für HEK/HeLa). Entferne vorsichtig die Gitter aus der Kulturschale und befestige sie an der Tauchpinzette. Tragen Sie 4 μl des mit Fiducials gemischten Nährmediums (1 x 105 Kügelchen/μL für 1 μm Fiducials) auf die zelltragende Seite auf.
- Wählen Sie Kügelchen, die in allen Bildgebungsmodalitäten erkennbar sind, d. h. FLM, SEM und IB (empfohlener Durchmesser 0,5-1 μm), aber stellen Sie sicher, dass diese die zelluläre Zielstruktur während der Fluoreszenzbildgebung nicht überstrahlen, um die Unterscheidung der Kügelchen und des interessierenden biologischen Merkmals zu erleichtern. Zytotoxische Konservierungsstoffe in Fiducial-Kügelchen (z. B. NaN3) nach Anweisung des Herstellers entfernen.
- Tauchen Sie die Zellen entweder mit einem manuellen oder einem automatisierten Gefrierverfahren ein. Tupfen Sie das Gitter nach Möglichkeit nur von der den Zellen gegenüberliegenden Seite ab, um eine mechanische Beschädigung der Zellen zu vermeiden (Abbildung 2A). Bei zweiarmigen automatischen Tauchsystemen erreichen Sie dies, indem Sie eine Polytetrafluorethylen-Folie (z. B. Teflon) anstelle von Löschpapier auf das Pad legen, das den Zellen zugewandt ist. Füllen Sie die Gitter in Aufbewahrungsboxen und bewahren Sie sie bis zur Verwendung in flüssigem Stickstoff (lN 2) auf.
VORSICHT: lN2 und andere Kryogene können schwere Schäden an Augen und Haut verursachen. Verwenden Sie persönliche Schutzausrüstung (PSA) und arbeiten Sie nur in einem gut belüfteten Raum, um die Ansammlung gefährlicher N2 -Konzentrationen zu vermeiden.
HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte sollten am besten in der flüssigen Phase von lN2 durchgeführt werden, um eine Kontamination der Zell- und Lamellenoberflächen zu vermeiden, da dies die nachgeschaltete Verarbeitung erschweren könnte. Reduzieren Sie den Kontakt mit schwimmenden Eiskristallen, indem Sie immer sauberen flüssigen Stickstoff verwenden (z. B. Filter zur Entfernung von Schwebeeis), unnötige Transferschritte vermeiden und wenn möglich in einer feuchtigkeitskontrollierten Umgebung arbeiten. - Montieren und clipsen Sie die eingefrorenen Gitter in AutoGrids mit Ausschnitt und den Zellen nach oben (Abbildung 2A) für die anschließende Kryofluoreszenzbildgebung und das FIB-Fräsen. Um eine korrekte Ausrichtung der Proben im TEM zu gewährleisten, muss die Fräsrichtung orthogonal zur Kryo-ET-Kippachse sein. Platzieren Sie daher die Ausrichtungsmarkierungen (z. B. LASERGRAVUR oder abnehmbare Markierungspunkte) vor dem Beschneiden auf AutoGrids, um diese Ausrichtung zu erleichtern (Abbildung 2A).
- Screening der Gitterqualität (Abbildung 2B) auf dem Kryo-FLM und FIB/SEM. Optimieren Sie die Zelldichte, die Löschzeit und die Kraft, um eine gleichmäßige Verteilung von Zellen und Kügelchen zu erhalten. Verwenden Sie die Auflichtbildgebung auf einem Kryo-Fluoreszenzmikroskop oder verwenden Sie das Kryo-FIB-REM, um sicherzustellen, dass sowohl die Zellen als auch die Passermarkenkügelchen deutlich sichtbar sind (Abbildung 2B, weiße Pfeile).
- Falls erforderlich, wiederholen Sie das Eintauchen unter besseren Bedingungen, z. B. durch Variation der Zellkonzentration und/oder der Blotting-Zeit. Sobald geeignete Eintauchparameter gefunden wurden, wiederholen Sie das Rasterscreening nicht für jede neue Versuchsrunde.
Abbildung 2: Screening nach geeigneten Gittern mit REM und IB . (A) Orientierungsmarkierungen sollten senkrecht zur Fräsrichtung auf den AutoGrids angebracht werden, um das korrekte Laden in das TEM zu vereinfachen. Die Zellen werden mit der Vorderseite nach oben im montierten AutoGrid montiert. (B) Nach dem Einfrieren werden die Gitter im REM inspiziert, um die Eintauchbedingungen zu bewerten und zu optimieren: a) Es sollten nicht zu viele Zellen pro Gitter vorhanden sein. Verwenden Sie z.B. für HeLa-Zellen nicht mehr als 1-4 Zellen/Quadrat. Für kleinere Zellen wie Saccharomyces cerevisiae (hier gezeigt) haben sich Klumpen von 4-6 Zellen als nützlich erwiesen. b) Die Passermarken (weiße Pfeile) sollten deutlich sichtbar sein, und es sollte nicht zu viel Puffer um die Zellen herum sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
2. Kryo-Fluoreszenz-Lichtmikroskopie
- Verschaffen Sie sich für jedes Gitter einen Überblick im (Weitfeld-)Fluoreszenz- und differentiellen Interferenzkontrast (DIC) oder im reflektierten Modus und wählen Sie geeignete Gitterquadrate mit Fluoreszenzsignal aus. Wählen Sie Ansichtsfelder, die sowohl die relevanten Zellen als auch eine ausreichende Anzahl von Passermarken (6-12) enthalten.
- Achte darauf, dass die Zellen und Kügelchen gleichmäßig verteilt, nicht zu dicht und zur Mitte jedes Quadrats hin verteilt sind. Wählen Sie nur Quadrate, die sowohl für das FIB-REM als auch für das TEM-Instrument zugänglich sind, also solche, die mindestens drei Quadrate von der Gitterkante entfernt sind (Abbildung 3A, innerhalb des roten Kreises).
- Auf jedem der ausgewählten Gitterquadrate wird ein Fluoreszenzstapel mit einem Fokusschritt aufgenommen, der für die spätere Dekonvolution geeignet ist, d. h. <1/2 der axialen Auflösungsgrenze. Verwenden Sie nach Möglichkeit Objektive mit hoher numerischer Apertur (NA), um die Photonenzahl und die Lokalisierungsgenauigkeit zu erhöhen.
- In einem konfokalen Mikroskop mit NA 0,9-Objektiv werden Stapel mit einer Schrittweite von 300 nm erfasst, wobei der Nyquist-Wert überabgetastet wird. Zeichnen Sie bei Bedarf mehrere Farbstapel auf (Abbildung 2B). Gitter bis zur weiteren Verwendung unter lN2 lagern.
HINWEIS: Um die optimale Schrittweite zu bestimmen, wählen Sie die von der Mikroskopsteuerungssoftware berechneten Werte aus oder verwenden Sie Online-Tools9. Prüfen Sie, ob das Signal zwischen den Kanälen durchgesickert ist, da ein übermäßiges Durchbluten für Kolokalisierungsexperimente nachteilig ist. Einige können jedoch vorteilhaft sein, um chromatische Aberrationen in mehrfarbigen Stapeln zu korrigieren.
- In einem konfokalen Mikroskop mit NA 0,9-Objektiv werden Stapel mit einer Schrittweite von 300 nm erfasst, wobei der Nyquist-Wert überabgetastet wird. Zeichnen Sie bei Bedarf mehrere Farbstapel auf (Abbildung 2B). Gitter bis zur weiteren Verwendung unter lN2 lagern.
- Entfaltung von Stapeln mit geeigneter Software10,11 und erneutes Schneiden 7, wenn eine isotrope Pixelgröße erforderlich ist. Die Dekonvolution – genau wie bei Raumtemperatur – bereinigt das FLM-Signal und kann die Lokalisierungsgenauigkeit verbessern (Abbildung 3C).
Abbildung 3: Auswahl von Quadraten für die FLM-Stapelerfassung und Verbesserung der Daten durch Dekonvolution . (A) Überblick über ein Gitter mit Hefezellen, die eGFP-Ede1 (grün) und mCherry-Atg8 (magenta) exprimieren. Wählen Sie Positionen mit einer guten Verteilung von Perlen und Zellen, aber vermeiden Sie die Ränder des Rasters (rot schattiert). Die Kästchen zeigen Positionen mit guten Zellverteilungen an, an denen Fluoreszenzstapel entnommen wurden. (B) Projektion mit maximaler Intensität (MIP) des mehrfarbigen Stapels, der nach der Dekonvolution auf das gelb umrandete Quadrat (von A) genommen wurde. Die Dekonvolution der FLM-Stapel bereinigt unerwünschte Hintergrundsignale erheblich und hilft dabei, die Perlen in z genauer zu lokalisieren, wie aus den Gauß-Fits vor (C) und nach der Dekonvolution (D) hervorgeht (Fits wurden in 3DCT durchgeführt und sind für die mit 1 markierte Perle dargestellt). Die Bilder zeigen vergrößerte MIP-Ansichten des roten Kanals (Anregung: 552 nm, Emission: 585-650 nm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
3. Fokussiertes Ionenstrahlfräsen
- Laden Sie die Gitter in das Kryo-FIB-REM-Instrument und verwenden Sie entweder die Ausschnitt- und/oder Orientierungsmarkierungen, um die richtige Ausrichtung für die spätere Platzierung im TEM sicherzustellen (Abbildung 2A). Achten Sie darauf, dass die Fräsrichtung senkrecht zur Kippachse des TEM verläuft.
- Verwenden Sie ein Gasinjektionssystem (GIS; CpMePtMe3) an den durch den FIB-SEM-Aufbau vordefinierten Tischpositionen, um die Gitter mit einer metallorganischen Schutzschicht zu beschichten. Tragen Sie nicht zu viel auf, da dies später die Lokalisierung der Fiducial-Perlen im TEM beeinträchtigen könnte. Verwenden Sie eine Plasmabeschichtung, um metallisches Platin aufzutragen, um die Aufladung der Probe zu reduzieren.
HINWEIS: Wenn keine Einstellungen für die GIS-Beschichtung verfügbar sind, können sie leicht gefunden werden, indem Sie aufeinanderfolgende Runden der Kurzbeschichtung (~2 s) durchführen, gefolgt von FIB-Fräsen. Stellen Sie sicher, dass die Probe auch bei mittleren Strömen (~100 pA) noch erfolgreich geschnitten werden kann, ohne dass die metallorganische Schutzschicht um die Lamellenränder sichtbar ist. Sowohl die Zeit als auch der Abstand der GIS-Nadel (in Bezug auf die Probe) sind wichtige Parameter, die es zu berücksichtigen gilt. Betreiben Sie die GIS-Nadel nicht bei Raumtemperatur (z. B. 45 °C), sondern so kalt wie möglich, um noch eine gleichmäßige Beschichtung zu erzielen (25-27 °C). - Zeichnen Sie eine SEM-Gitterübersicht auf und führen Sie eine 2D-Korrelation mit FLM-Übersichten durch, um die Gitterquadrate zu finden, für die Fluoreszenzstapel aufgezeichnet wurden. Untersuchen Sie beide Ansichten manuell oder verwenden Sie verschiedene Softwarepakete 7,10,12, um die Gitterquadrate zu finden. Hier liegt der Fokus auf der 3D Correlation Toolbox (3DCT)7, die eine 3D-Starrkörpertransformation mit isotroper Skalierung zwischen Ansichten verwendet. Eine hervorragende Anleitung zu den Funktionen von 3DCTs ist online verfügbar13.
- Wählen und markieren Sie mindestens vier entsprechende Positionen, z.B. Landmarken wie Rasterstäbe oder Bohrungen in der Trägerfolie, sowohl in der FLM- als auch in der SEM-Rasterübersicht (Rechtsklick) und berechnen Sie die Transformation zwischen den markierten Punkten (korrelieren).
- Platzieren Sie dann die Marker in der Mitte der entsprechenden Rasterquadrate, für die FLM-Stapel erfasst wurden, und prognostizieren Sie deren Position in der SEM-Ansicht (korrelieren; Abbildung 4A).
- Nehmen Sie für jedes korrelierte Gitterquadrat ein Niedrigstrom-Ionenstrahlbild (≤10 pA) mit dem FIB-Fräswinkel Ihrer Wahl (10°-25° für 45° Pre-Tilt-Shuttle) auf. Wählen Sie ein Sichtfeld (d. h. Position und Vergrößerung), das mit den Fluoreszenzdaten übereinstimmt. Erfassen Sie für 200-Mesh-Gitter Fluoreszenz- und FIB/REM-Daten, die einzelne Gitterquadrate enthalten, einschließlich der Gitterstäbe (siehe Abbildung 3A und Abbildung 4A).
HINWEIS: Das Mahlen sollte in einem möglichst flachen Winkel erfolgen, um einen signifikanten Winkelbereich während der Kryo-ET zu vermeiden und eine ausreichende Anzahl von Passermarkenperlen zu identifizieren. Zum Beispiel: Bei einer Tischneigung von 17°, einer Shuttle-Vorneigung von 45° und einer FIB-Strahlneigung von 52° relativ zum Lot beträgt die Lamellenvorneigung 10°, was gerade noch den bevorzugten Winkelbereich von ±60° im TEM durch Neigung von -50° bis +70° erfüllt, das Maximum vieler TEM-Kryohalter. - Nehmen Sie ein REM-Bild desselben Quadrats auf, um die Identifizierung entsprechender Kügelchen in der Fluoreszenz- und Ionenstrahlansicht zu erleichtern.
- Führen Sie die Registrierung des dekonvolvierten 3D-FLM-Stapels und der 2D-Ionenstrahlansicht für jede Position mit dem 3DCT durch, wie in den folgenden Schritten (Abbildung 4B) beschrieben.
- Laden Sie den entsprechenden neu geschnittenen 3D-FLM-Stapel und die Ionenstrahlansicht (IB) in 3DCT.
HINWEIS: Mehrfarbige Fluoreszenzdaten können als bis zu drei separate Single-Channel-Stack-Dateien geladen werden. - Wählen Sie 4 Passermarkenperlen in den Fluoreszenzdaten aus und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Positionsliste, um ihre 3D-Position über die Gaußsche Anpassung des Signals in x, y und z zu bestimmen. Wählen Sie die entsprechenden Perlen im IB-Bild aus und führen Sie eine erste 3D-Korrelation durch (korrelieren).
- Fügen Sie iterativ weitere Perlen in das Fluoreszenzbild ein, verfeinern Sie ihre 3D-Position und prognostizieren Sie ihre Position in der IB-Ansicht, um der Registrierung schnell weitere Perlen hinzuzufügen und die Genauigkeit der Korrelation zu überprüfen. In 3DCT werden RMSE-Werte (Root-Mean-Square-Error) bereitgestellt, um die Korrelationskonsistenz zu bewerten7.
- Stellen Sie sicher, dass die RMSE-Werte klein sind und in der Größenordnung der Lokalisierungsgenauigkeit (~300 nm) liegen. Um die Genauigkeit der Korrelation zu bestimmen, lassen Sie während des Registrierungsschritts einige Passermarkenkügelchen aus, die sowohl in der Fluoreszenz als auch im Ionenstrahl eindeutig identifizierbar sind. Überprüfen Sie dazu die vorhergesagte und die tatsächliche Position im Ionenstrahlbild. Wenn die vorhergesagte Position erheblich von der realen Position abweicht, wiederholen Sie die anfängliche Korrelation mit einem neuen Satz von Rahmenmarken.
HINWEIS: Die Korrelation von 6-8 Perlen hat sich als ausreichend erwiesen, um die FLM-Stapel und die IB-Ansichten genau zu registrieren. Das Hinzufügen weiterer Kreismarken (bis zu 12-15) über einen weiten Bereich von Z-Werten (z. B. durch Auswahl von Perlen auf dem Gitterbalken oder in benachbarten Quadraten) kann jedoch die Genauigkeit der Korrelation verbessern.
- Stellen Sie sicher, dass die RMSE-Werte klein sind und in der Größenordnung der Lokalisierungsgenauigkeit (~300 nm) liegen. Um die Genauigkeit der Korrelation zu bestimmen, lassen Sie während des Registrierungsschritts einige Passermarkenkügelchen aus, die sowohl in der Fluoreszenz als auch im Ionenstrahl eindeutig identifizierbar sind. Überprüfen Sie dazu die vorhergesagte und die tatsächliche Position im Ionenstrahlbild. Wenn die vorhergesagte Position erheblich von der realen Position abweicht, wiederholen Sie die anfängliche Korrelation mit einem neuen Satz von Rahmenmarken.
- Wählen Sie die anvisierten Mobilfunksignale aus, passen Sie ihre 3D-Position im FLM-Stapel an und wenden Sie die Transformation an, um die Zielpositionen in der IB-Ansicht vorherzusagen (Abbildung 4B).
HINWEIS: Jeder Eintrag in der FLM-Positionsliste, der kein Gegenstück in der IB-Liste hat, wird als ein vorherzusagendes Signal behandelt.
- Laden Sie den entsprechenden neu geschnittenen 3D-FLM-Stapel und die Ionenstrahlansicht (IB) in 3DCT.
- Übertragen Sie für jedes korrelierte Quadrat die vorhergesagten Positionen der interessierenden Merkmale auf das FIB-REM-Instrument und platzieren Sie Lamellenfräsmuster (Abbildung 4C). Übertragen Sie Positionen manuell (z. B. durch Messen der Entfernung zu sichtbaren Landmarken, wie Zellen oder Passermarken) oder verwenden Sie Automatisierung und Scripting, wie sie z. B. in SerialFIB14 implementiert sind. Wenn mehrere Signale pro Zelle vorhanden sind, platzieren Sie die Muster so, dass sie so viele POIs (Points of Interest) wie möglich in derselben Lamelle enthalten, um den Durchsatz zu erhöhen.
- Zuerst werden die Lamellen grob und dann fein gefräst bis zu einer Enddicke von 150-250 nm. Vermeiden Sie Schritte (z. B. Spannungsentlastungsschnitte15), die ein Absacken der Lamelle verursachen und somit zu einer Bewegung des eigentlichen interessierenden Merkmals in Bezug auf die zuvor erfassten FLM-Stapel führen. Verwenden Sie entweder manuelle3 oder automatisierte14,16,17,18 FIB-Fräsverfahren. Stellen Sie bei beiden Methoden sicher, dass das interessierende Merkmal in der Mitte der Lamelle bleibt, indem Sie es symmetrisch von oben und unten ausdünnen.
- Um die Genauigkeit des Fräsens für jede Lamelle zu bewerten, führen Sie die gleiche Registrierung wie in Schritt 3.4 durch. Verwenden Sie dieses Mal jedoch das endgültige IB-Bild nach dem FIB-Fräsen und prüfen Sie, ob die vorhergesagten Positionen der interessierenden Merkmale in der endgültigen Lamelle enthalten sind. Alternativ können die gedrehten Projektionen der FLM-Stapel, die aus der Ausgabe von 3DCT und den benutzerdefinierten Skripten19 erhalten wurden, mit dem endgültigen IB-Bild überlagert werden (Abbildung 4C, kleiner Einschub).
Abbildung 4: 3D-korrelatives FIB-Fräsverfahren . (A) Die 2D-2D-Korrelation von FLM- (links) und REM-Übersichten (rechts) des Gitters wird verwendet, um die Gitterquadrate zu lokalisieren, auf denen zuvor fluoreszierende Stapel aufgenommen wurden. (B) Für jedes ausgewählte Quadrat werden nach der 3D-2D-Registrierung der entsprechenden Rahmenmarkenpositionen in 3DCT (farbige Kästchen) Positionen von biologischem Interesse in den FLM-Daten ausgewählt. Basierend auf der Vorhersage entsprechender Positionen im Ionenstrahlbild (rote Kreise) werden Stellen für die Lamellenpräparation ausgewählt. (C) Rasterelektronenmikroskopische (REM) und Ionenstrahlbilder (IB) werden verwendet, um das Messobjekt während des Fräsens zentriert zu halten. Enddicken von 150-250 nm wurden für die weitere Weiterverarbeitung als ausreichend befunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
4. Korrelative TEM
- Laden Sie die Gitter in das TEM und achten Sie darauf, dass die Lamellenausrichtung (wie aus Ausschnitt- oder Ausrichtungsmarkierungen ersichtlich) senkrecht zur Kippachse verläuft.
HINWEIS: Mikroskope verschiedener Hersteller können mit verschiedenen Softwares gesteuert werden, z. B. Tomo5, TOM oder SerialEM20. Hier liegt der Fokus auf Letzterem. - Erfassen Sie Rastermontagen und Übersichten für jedes Rasterquadrat, das Lamellen enthält. Stellen Sie sicher, dass die Vergrößerungs- und Belichtungszeit geeignet ist, um die Fiducial-Perlen in den TEM-Bildern zu visualisieren, ohne die Gesamtelektronendosis signifikant zu erhöhen. Erfassen Sie hochauflösende TEM-Karten (Montagen) von jeder Lamelle.
- Register und 3D-2D korrelieren den FLM-Stack mit dem TEM-Gitterquadrat und den Lamellenübersichten in 3DCT. Verwenden Sie die gleiche Vorgehensweise wie in Schritt 3.6 beschrieben, indem Sie die entsprechenden Bead-Positionen in den Bildern des Fluoreszenz- (x, y, z - Gauß-Passung) und des Transmissionselektronenmikroskops auswählen. Wählen Sie dann die interessanten Positionen in den FLM-Kanälen aus und übertragen Sie sie in die TEM-Übersichten. Falls erforderlich, verwenden Sie ein zweistufiges Verfahren, das eine erste Korrelation zwischen FLM und TEM mit niedriger Vergrößerung und eine zweite Korrelation zwischen TEM mit niedriger und hoher Vergrößerung umfasst (Abbildung 5).
- Übertragen Sie Positionen entweder manuell (durch Messen von Entfernungen zu Landmarken), mit den in SerialEM20 verfügbaren Registrierungs- und Kartenwerkzeugen oder externer Software wie CorRelator21.
- Richten Sie Neigungsreihen ein und führen Sie sie an korrelierten Positionen aus. Verwenden Sie eine geeignete Vergrößerung, Defokussierung und Gesamtdosis (siehe Materialtabelle und Tabelle 1 für Einzelheiten). Beginnen Sie die Erfassung bei der durch die Lamelle bestimmten Vorneigung (siehe auch den Hinweis in Schritt 3.4) und verwenden Sie ein dosissymmetrisches Neigungsschema22. Verwenden Sie entweder die manuelle Erfassung oder die Batch-Erfassung.
Abbildung 5: Lokalisierung korrelierter Positionen im TEM. Nach erfolgreichem 3D-korrelativem FIB-Fräsen und Transfer zum Transmissionselektronenmikroskop wird für jedes gefräste Quadrat zwischen Fiducial-Kügelchen (farbige Kästchen) in FLM-Stapeln und TEM-Übersichten eine 3D-2D-Registrierung durchgeführt, um potenzielle Stellen für Kryo-ET (rote Kreise) zu lokalisieren. Lamellenübersichten mit höherer Vergrößerung (Zoom-in) können dann aufgenommen werden, um Tomogramme präziser einzustellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Representative Results
Das Protokoll bietet einen Rundgang durch die Pipeline, die verwendet wird, um die EH-Domäne enthaltende und Endozytose-Protein 1 (Ede1)-abhängige endozytäre Proteinablagerung (END) und deren Abbau und Einfangen in autophagischen Körpernzu entdecken 8. Das END ist ein phasengetrenntes Flüssig-Flüssig-Kompartiment in S. cerevisiae, das eine Vielzahl von Proteinen puffert, die an der Clathrin-vermittelten Endozytose (CME) nach fehlgeschlagenen endozytären Ereignissen beteiligt sind. Einer seiner Hauptbestandteile ist Ede1, der sowohl als CME-Komponente als auch als selektiver Autophagierezeptor für den Abbau dieses neuen LLPS-Kompartiments fungiert. Dementsprechend wurde eine EGFP-Fusion von Ede1 (EGFP-Ede1) unter der Kontrolle des Alkoholdehydrogenase (ADH)-Promotors verwendet, um ENDs sichtbar zu machen, da die Überexpression von Ede1 die frühen Stadien der Endozytose stört und daher konstitutiv LLPS induziert.
Auf einem eintauchgefrorenen Gitter mit EGFP-Ede1-überexprimierenden Hefezellen und 1 μm Fiducialmarkern wurden fünf Positionen für die FLM-Stapelerfassung im GFP-Kanal ausgewählt (Abbildung 6A; TFS-Korrelation; Konfokaler Modus, 300 nm Fokusschrittweite, 10 μm Bereich). Das Gitter wurde auf das FIB-Instrument übertragen (Quanta 3D FEG), und die Gitterquadrate, für die FLM-Stapel erfasst worden waren, wurden durch eine 2D-2D-Korrelation der Fluoreszenz- und REM-Gitterübersichten identifiziert (vgl. Schritt 3.2).
Für jedes der ausgewählten Quadrate wurden Ionenstrahlbilder bei niedrigem Strom (10 pA, 1200-fache Vergrößerung) aufgenommen und entsprechende Passermarkenpositionen in 3DCT registriert. Nach der Auswahl der Positionen mit dem biologischen Merkmal von Interesse und der Anpassung ihrer 3D-Position innerhalb des FLM-Stapels wurde die gefundene Transformation auf mutmaßliche END-Positionen angewendet und die Stellen für die Lamellenpräparation ausgewählt (Abbildung 6B). In den hier gezeigten Beispielen wurde ein um 11° zur Rasteroberfläche geneigter FIB-Strahl verwendet (45° FIB-Shuttle-Vorneigung; 18° Tischneigung). Relevante Positionen wurden übertragen, und FIB-Muster wurden manuell gezeichnet (Abbildung 6D), indem der Abstand der vorhergesagten Positionen relativ zu markanten Landmarken im FIB-Bild (z. B. Löcher, Eiskontaminationen, Passermarken) gemessen wurde. Die Genauigkeit der Registrierung wurde bewertet, indem Kügelchen, die im FLM- und IB-Bild eindeutig identifiziert werden konnten, absichtlich weggelassen und dann ihre tatsächlichen und vorhergesagten Positionen in der Ionenstrahlansicht verglichen wurden (z. B. Diamant in Abbildung 6B,C). Die Korrelation für das in Abbildung 6C gezeigte Quadrat erwies sich als genau (d. h. die vorhergesagte Position der FLM-Perlenpositionen stimmte perfekt mit ihrer entsprechenden IB-Position überein und 3DCT meldete Subpixel-RMSE-Werte für die Registrierung). So wurden Lamellen an den vorhergesagten Positionen (Site B) geschnitten und auf eine Dicke von ~200 nm fein gefräst (finaler Musterversatz).
Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse für das 3D-korrelative Targeting von endozytären Proteinablagerungen (END) in Hefe. (A) REM-Übersicht des Gitters vor dem Fräsen. Die farbigen Kästchen zeigen Gitterquadrate an, für die zuvor Fluoreszenzstapel genommen wurden. (B-C) 3D-Korrelation in einem Gitterquadrat. Nach der Registrierung mehrerer korrespondierender Fiducialkügelchen (farbige Kästchen) in den FLM-Daten (B, hier als Maximalintensitätsprojektion dargestellt) und dem Ionenstrahlbild (C) wurde die Genauigkeit der 3D-Registrierung durch Vorhersage der Position der mit dem Diamanten angezeigten Perle überprüft. Als nächstes wurden die Positionen des Zielsignals (rote Kreise) in der Ionenstrahlansicht für zwei potentielle Frässtellen vorhergesagt. (D) Heranzoomen von Standort B mit den vorhergesagten Positionen von drei Zielpunkten (rote Kreise) und den anfänglichen Fräsmustern (gelbe Kästchen). Es wurde vorhergesagt, dass ein viertes Fluoreszenz-Punctum viel niedriger ist als die anderen Puncta und daher während des Mahlens nicht anvisiert wird (grauer Kreis). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Nach erfolgreichem FIB-Fräsen und Überführung des Gitters in das Kryo-Transmissionselektronenmikroskop (Titan Krios arbeitet bei 300 kV und ausgestattet mit einem Gatan K2 Direktelektronendetektor und Bioquanten-Energiefilter) wurde eine Gitterübersicht in SerialEM aufgezeichnet und zur Lokalisierung von Quadraten mit Lamellen verwendet. Für jede Lamelle wurden Übersichtsbilder aufgenommen, und die FLM-Daten wurden in 3DCT (3D-2D) mit entsprechenden Passermarkenperlen registriert. Die Positionen der interessierenden biologischen Merkmale (Abbildung 7A) wurden dann mit Hilfe der aus den Passermarkenperlen berechneten Transformation vorhergesagt. Lamellenübersichten, die bei höherer Vergrößerung aufgenommen wurden, wurden zusammengefügt und interessante Stellen mit deutlich sichtbaren Landmarken (z. B. Passermarken) korreliert. Alternativ können klassische CLEM-Übersichten in verschiedenen Softwares10,12 erstellt werden.
Basierend auf der Korrelation wurden vier potenzielle Stellen für die Tomogrammaufnahme für die in Abbildung 7A gezeigte Lamelle gefunden. Dazu gehören aber auch eine Position, die beim 3D-korrelierten FIB-Fräsen nicht anvisiert wurde (vgl. Abbildung 6D; grauer Kreis) und eine durch Eisverschmutzung blockierte Position (Abbildung 7; graue Kästchen). Dementsprechend konnten Tomogramme nur für zwei Positionen aufgezeichnet werden (Abbildung 7B). Insgesamt wurde ein Korrelationserfolg von ~75% erzielt, d.h. an den vorhergesagten Stellen wurden Lamellen gefunden, die den Transfer in die TEM- und END-Strukturen überlebten (12 korrelierte Stellen). Nach der Rekonstruktion des Tomogramms, der Segmentierung und dem Template-Matching können einzelne END-Strukturen in ihrem nativen Kontext visualisiert werden (Abbildung 7C,D). Dazu gehören das fenestrierte endoplasmatische Retikulum (ER), das das END umgibt, Lipidtröpfchen, die gelegentlich Kontakt aufnehmen, und Ribosomen, die aus dem LLPS-Kompartiment ausgeschlossen sind. Zusammengenommen zeigt dies, wie 3D-korrelatives FIB-Fräsen Informationen auf molekularer Ebene über seltene biologische Prozesse aus intakten Zellen liefern kann.
Abbildung 7: Repräsentative Ergebnisse zur Visualisierung des END mit Kryo-ET. (A) Die in Abbildung 6 gezeigte TEM-Übersicht der Mühlenstelle mit geringer Vergrößerung kann leicht mit der FLM-Projektion der maximalen Intensität (Abbildung 6B) korreliert werden, um biologische Merkmale von Interesse (rote Kreuze) zu lokalisieren. (B) In einem zweiten Schritt kann eine höhere Vergrößerungsansicht (gestitcht) korreliert und Positionen für die Tomogrammerfassung (gelbe Kästchen) eingerichtet werden. Positionen, die sich aus dem Signal außerhalb der Ebene ergeben (grauer Kasten, vgl. Abbildung 6D), wurden ignoriert. (C-D) Mit diesem 3D-korrelativen FIB-Ansatz kann die endozytäre Proteinablagerung (END) in ihrer nativen Umgebung sichtbar gemacht werden. Strukturen wie das endoplasmatische Retikulum (ER), Ribosomen, Membranen und Lipidtröpfchen können identifiziert und sichtbar gemacht werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Plasmareiniger-Einstellungen | |||
| Harrick Plasmareiniger PDG-3XG : | Hochfrequenz-Setiing: "HI", 30 s; N2-Plasma | ||
| Plunger-Einstellungen | |||
| TFS Vitrobot Mk IV: | 100% Luftfeuchtigkeit; Löschkraft = 8; Löschzeit = 10 s; Wartezeit 0 s; (Dies sollte für die meisten Suspensions- und adhärenten Zellen funktionieren) | ||
| FIB-GIS-Positionen und -Zeitpläne | |||
| Quanta 3D FEG: | Neigung = 0, Drehung = -180, Z-Position = 13,5, Temperatursollwert = 26,15° , Zeit = 8 s | ||
| TFS Scios: | Neigung = 0, Drehung = -180, Z-Position = 9,8, Temperatursollwert = 28° C, Zeit = 7 s | ||
| TFS Aquilos 1: | Software vordefinierte Position, Temperatursollwert = 28° , Zeit = 7 s | ||
| TFS Aquilos 2: | Software vordefinierte Position, Temperatursollwert = 28°, Zeit = 7 s | ||
| FIB Sputter Coater Einstellungen | |||
| Beschlussfähigkeitssystem: | In der Quorum-Vorbereitungskammer: 10 mA, 40 s | ||
| TFS Scios: | 10 W, 500 V, 250 mA, 0,2 mbar, 15 s | ||
| TFS Aquilos 1: | 1 kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s | ||
| TFS Aquilos 2: | 1 kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s | ||
| Tomogramm-Akquisition | |||
| Titan Krios Gi2 | K2 Kamera, Gatan Bioquantum Energiefilter | ||
| 20 eV Spalt; dosissymmetrisches Kippschema (Hagen) mit 2°-Schritten; Start bei +10° (Lamellenvorneigung!) bis +70° und -50° | |||
| Titan Krios Gi4 | Falke 4; Selectris X Energiefilter | ||
| 10 eV Spalt; dosissymmetrisches Kippschema (Hagen) mit 2°-Schritten; Start bei +10° (Lamellenvorneigung!) bis +70° und -50° | |||
| FLM-Akquisition | |||
| Korrsight (konfokaler Modus) | Zielsetzung: Zeiss EC Plan-Neofluar 40×/0.9 NA Pol; Parameter für die Stapelerfassung: x-y-Pixelgröße = 161,25 nm, z-Schrittweite = 300 nm. | ||
| Leica SP8 Kryo-Konfokal | Objektiv: Leica HCX PL APO 50x / 0,90 CLEM; Parameter für die Stapelerfassung: x-y-Pixelgröße = 84 nm, z-Schrittweite = 300 nm. | ||
Tabelle 1: Liste der getesteten Geräte und vorgeschlagene Einstellungen.
Discussion
1. Kritische Schritte im Protokoll
Die Optimierung der Zellkultur- und Gittertauchparameter ist für diesen Arbeitsablauf von grundlegender Bedeutung. Zu Beginn eines Projekts lohnt es sich, Zeit zu investieren, um die Tagging-Strategien, die Verteilung von Zellen und Passermarken zu optimieren und verschiedene Gittervorbereitungs- und Blotting-Parameter zu testen. Die Arbeit mit einer optimal eintauchgefrorenen Probe erleichtert die nachgelagerte Verarbeitung erheblich.
Wie für jedes TEM-Experiment sind Glasproben erforderlich. Für große Säugetierzellen wie HeLa sind 1-2 Zellen pro Gitterquadrat vorzuziehen, aber die Zellen können auch bei höherer Dichte glasartig sein. Optional kann die Vitrifikation in Säugetierzellen (z. B. HEK293, HeLa) verbessert werden, indem sie 10 Minuten vor dem Eintauchen mit 2,5-10% (v/v) Glycerin, das dem Kulturmedium zugesetzt wird, inkubiertwerden 23. Falls verfügbar, kann eine Gitterstrukturierung verwendet werden, um eine perfekte Platzierung und Verteilung der Zellen zu gewährleisten, wodurch die Vitrifikation und spätere Korrelationverbessert wird 24.
Während des Arbeitsablaufs können zwar bestimmte Zellen ausgewählt werden, aber zu wenige Zellen, die das gewünschte biologische Merkmal aufweisen, verringern den Gesamtdurchsatz erheblich. Um die Korrelation in POI-positiven Zellen zu verbessern, sollten ausreichend helle Fluorophore verwendet werden. Dies ist besonders wichtig auf endogenen Expressionsebenen. Wir fanden heraus, dass mVenus unter Kryo-Bedingungen aufgrund seiner erhöhten Helligkeit25 und der hypsochromen Verschiebung oft besser abschneidet als EGFP, wodurch es für Standard-GFP-Filter-Setups unter Kryo-Bedingungen geeignet ist26. Bei nicht-punktförmigen Targetstrukturen sollte auch der Trade-off zwischen Wellenlänge und Lokalisierungsgenauigkeit (Abbe-Beugungsgrenze) berücksichtigt werden.
Eine effiziente 3D-Korrelation setzt auch voraus, dass die Gitter mechanisch stabil sind und mit großer Sorgfalt behandelt werden. Während Standard-Gold- oder Kupfergitter mit Kohlenstoffträger verwendet werden können, kann die Erfolgsrate je nach Projekt durch die Verwendung von steiferenSiO2-Schichten erheblich erhöht werden. Es ist jedoch noch nicht abschließend geklärt, ob (a) die mechanische Stabilität oder (b) die Anpassung der thermischen Ausdehnungskoeffizienten (Substrat vs. Folie) zur Reduzierung der Kryofaltenbildung27 der wichtigste Faktor für eine erfolgreiche 3D-Korrelation ist. Darüber hinaus können zum Aufnehmen von zerbrechlichen Au-Gittern mit Polydimethylsiloxan beschichtete Schalen verwendet werden5.
Neben der Gewährleistung der Probenstabilität ist eine sorgfältige Auswahl der FLM-Bildgebungsparameter erforderlich, um qualitativ hochwertige Fluoreszenzstapel zu erhalten, die für ein optimales Targeting beim FIB-Fräsen geeignet sind. In diesem Zusammenhang wird auch empfohlen, verschiedene Entrauschungs-28 - oder Dekonvolutionstechniken an den FLM-Daten zu testen, da dies die Lokalisierung von Fiducials und Mobilfunksignalen erheblich verbessern kann. Bei der Korrelation des Fluoreszenzsignals mit FIB-REM-Bildern ist eine gute Abtastung der Passermarkenperlen wichtig. Sie sollten gut um die Zellen verteilt sein und möglichst unterschiedliche z-Höhen aufweisen. Es empfiehlt sich auch, die Konsistenz der Korrelation zu validieren, indem die vorhergesagten und tatsächlichen Positionen von Perlen überprüft werden, die absichtlich aus dem Rahmenmarkenmodell ausgeschlossen wurden, aber eindeutig mit dem Auge korreliert werden können. Die RMSE-Werte von 3DCT sollten ebenfalls immer berücksichtigt werden, um die Registrierungskonsistenz zu überprüfen.
Da die Abscheidung von gemahlenem Material und Restwasser aus der FIB-REM-Kammer (d. h. Rekontamination) die effektive Lamellendicke durch Zugabe von amorphem Material auf beiden Seiten erhöht, verringert das Aufbewahren von fein gemahlenen Lamellen im Mikroskop über einen längeren Zeitraum im Allgemeinen die TEM-Datenqualität aufgrund zusätzlicher Elektronenstreuereignisse. Dementsprechend wird das Fräsen meist in zwei Schritten durchgeführt: Zuerst werden alle Positionen grob (d.h. bis ca. 800 nm) und dann fein (bis ~150-250 nm) gefräst und das Gitter sofort nach Fertigstellung der letzten Lamelle entlastet. Ein besserer Korrelationserfolg kann jedoch dadurch erzielt werden, dass die interessierenden Positionen ortsweise bearbeitet werden, d. h. Schrupp- und Feinfräsen an derselben Lamelle direkt hintereinander durchgeführt werden, da so keine Zeit für Biegung oder Verformung bleibt. Dadurch reduziert sich jedoch die maximale Anzahl an Lamellen, die pro Gitter produziert werden können, abhängig von der Rekontaminationsrate der Anlage. Bei einer Geschwindigkeit von 20 nm/h werden 4-6 Lamellen innerhalb von 1-1,5 h hergestellt.
Die Bewegung des gesamten Gitters oder der vorgefrästen Lamellen >300 nm führt zu einer schlechten oder misslungenen Korrelation (siehe auch unten diskutierte Einschränkungen). Sie sollte daher regelmäßig überprüft werden, z.B. durch den Vergleich von IB-Bildern vor, während und nach dem FIB-Fräsen. Stellen, die eine signifikante Bewegung (>300 nm) aufweisen, sollten verworfen werden. Optimieren Sie die Probenvorbereitung (d. h. die Wahl des Gittertyps, der Zelldichte und der Tauchparameter; siehe Protokollabschnitt 1) und die Mahlstrategie, um diese Bewegungen zu vermeiden. Die Lamellenbiegung kann durch baustellenweises Fräsen, wie in Schritt 3.6 beschrieben, und Reduzierung der Lamellenbreite deutlich reduziert werden. Wie bereits erwähnt, wurden Spannungsarmabbauschnitte15 zwar entwickelt, um die Biegung von Lamellen zu reduzieren, sie führen jedoch häufig zu einer konzertierten Bewegung der entkoppelten Lamellen, wodurch eine Korrelation wirksam verhindert wird. Zur Lösung dieses Problems können integrierte FLM-Systeme eingesetzt werden.
2. Modifikationen und Störungen des Verfahrens
Es wird dringend empfohlen, eine gründliche Charakterisierung der Probe in der Live-Cell-Bildgebung durchzuführen, bevor man zu Kryo-Bedingungen übergeht. Die Optimierung der zellulären Proben, der Behandlungsschemata und das Wissen, welche Art von Signal zu erwarten ist, bevor man in den Kryo-Workflow eintritt, kann die Erfolgsrate erheblich verbessern.
In dem hier vorgestellten Arbeitsablauf wird ein eigenständiges Fluoreszenzmikroskop mit Kryotisch verwendet, um die Proben abzubilden, gefolgt von einer Übertragung der Gitter in das fokussierte Ionenstrahlmikroskop. Es wurde jedoch auf Systemen getestet, bei denen ein Fluoreszenzmikroskop in die FIB-REM-Kammer integriert ist, so dass für die Aufnahme von Fluoreszenzbildern kein Probentransfer erforderlich ist 29,30,31. Mit solchen integrierten Systemen können interessante Positionen während und nach dem FIB-Fräsen abgebildet werden, um das Vorhandensein des Zielfluoreszenzsignals zu überprüfen, ohne das Risiko einer Kontamination der endgültigen Lamellen zu erhöhen. Es ist jedoch wichtig, die optischen Parameter der verwendeten Mikroskope im Auge zu behalten, da z.B. ein Objektiv mit niedriger NA die Präzision einschränkt, mit der Passermarkenperlen und Zielsignale lokalisiert werden können. Nichtsdestotrotz helfen integrierte FLM-Setups, auch mit leichten Verformungen von Gittern und Lamellen besser umzugehen, da FLM-Stacks kontinuierlich aktualisiert und mit aktuellen REM- und IB-Ansichten verglichen werden können.
Als Alternative zur Fluoreszenzbildgebung der Lamellen zwischen FIB-Fräsen und TEM-Datenerfassung kann die Post-TEM-Korrelation verwendet werden, um die korrekte Platzierung und das Fräsen der Lamellen zu überprüfen 5,6.
Während aller Schritte des korrelativen Workflows, insbesondere aber während der TEM, empfiehlt es sich, eine Überlagerung der projizierten Fluoreszenzdaten auf den FIB-REM/TEM-Bildern zu erstellen. Solche klassischen CLEM-Ansichten helfen intuitiver zu verstehen, welcher Teil der Zellen in den Lamellen enthalten ist. Dies dient auch als nützliche Plausibilitätsprüfung, um die Genauigkeit der Korrelation zu überprüfen.
3. Grenzen der Methode
Der 3D-korrelative FIB-Ansatz erfordert Proben, die mit Fiducial-Perlen versorgt werden können. Dementsprechend ist diese Methode derzeit auf eintauchgefrorene Gitter beschränkt. Für Hochdruckproben (HPF) können derzeit nur 2D-2D-Korrelationen durchgeführt werden. Möglicherweise könnten interne Fiducialmarker (z. B. Organellen, gefärbte Lipidtröpfchen) eine Lösung für dieses Problem sein32,33. Die endgültige Erfolgsrate der Korrelation hängt von vielen Faktoren ab, darunter die Probenqualität, der Aufbau der Fluoreszenzmikroskopie, die Lamellendicke und die Größe der Zielstruktur. Die Korrelationsgenauigkeit unter Verwendung des beschriebenen 3D-Registrierungsansatzes wird auf dem endgültigen IB-Bild auf 200-300 nm geschätzt, was in etwa der typischen Dicke von FIB-gefrästen Lamellenentspricht 7. Dementsprechend werden zelluläre Strukturen, die viel kleiner sind, derzeit schwer zu erreichen sein. Darüber hinaus verringert eine übermäßige Bewegung an der Frässtelle (>300 nm) auch die Genauigkeit der Korrelation, ein Problem, das möglicherweise mit FLM-Setups behoben werden kann, die in FIB/REM-Instrumente integriert sind. Lamellen, die beim Fräsen eine starke Verformung oder Biegung aufweisen, sollten in jedem Fall aus dem nachgelagerten Arbeitsablauf ausgeschlossen werden.
Insgesamt ist die Kryo-Fluoreszenz-Bildgebung derzeit durch das Abbe-Beugungskriterium eingeschränkt. Mit einer verstärkten routinemäßigen Anwendung (und Kommerzialisierung) von hochaufgelösten Kryo-FLM-Methoden könnte ein genaueres Targeting zellulärer Strukturen möglich werden, insbesondere wenn sie für den On-the-fly-Betrieb in das FIB/REM integriert werden.
4. Bedeutung der Methode
Insbesondere im Vergleich zu Non-Target- und Post-Korrelationstechniken ermöglicht der 3D-korrelierte FIB-Fräsansatz die Auswahl geeigneter Positionen vor dem zeit- und ressourcenaufwändigen TEM-Schritt. Dies ermöglicht eine effizientere Datenerfassung und Projektplanung. Darüber hinaus fügen die korrelierten Fluoreszenzdaten eine Informationsebene hinzu, die für die Interpretation der Tomogramme und für die Integration der Kryo-ET-Ergebnisse in Multiskalenprojekten entscheidend sein kann, insbesondere wenn es sich um unstrukturierte Proteinanordnungen oder solche handelt, die zu klein für den Template-Abgleich und die Subtomogramm-Mittelung sind.
5. Bedeutung und mögliche zukünftige Anwendungen
In Kombination mit fortschrittlichen Arbeitsabläufen wie dem Kryo-Lift aus HPF-Proben 34,35, dem Kryo-FIB-SEM-Volumen 36 und der hochauflösenden Fluoreszenzbildgebung26,37,38,39 bietet die 3D-gezielte Lamellenpräparation die Möglichkeit, nicht nur biologische Prozesse in isolierten Zellen zu sezieren, sondern auch Gewebe- und Patientenproben für FIB-Mahlen und Kryo-Elektronentomographie zugänglich zu machen. Als solches wird es die Dissektion pathologischer Prozesse mit hoher Auflösung ermöglichen und somit ein integraler Baustein für eine Biopsie auf der Nanoskala sein.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Acknowledgments
Wir danken Inga Wolf für die Unterstützung der IT-Infrastruktur, Florian Beck für die rechnerische Unterstützung und Oda H. Schiøtz für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Finanzierung erfolgte unter anderem durch ein Alexander von Humboldt-Rückkehrerstipendium für Philipp S. Erdmann und ein EMBO-Langzeitstipendium ALTF 764-2014 für Florian Wilfling. Anna Bieber wurde durch ein Ph.D.-Stipendium des Boehringer Ingelheim Fonds unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autogrids | Thermo Fisher Scientific / Homemade | 1036173 (no cutout), 1205101 (with cutout) | |
| C-rings | Thermo Fisher Scientific | 1036171 | |
| Corrsight with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 1 | |
| Dynabeads MyOne COOH | Thermo Fisher Scientific | 65011 | recommended 1 µm fiducial beads |
| EM Grids R1/4 SiO2 | Quantifoil | N1-S13nAu20-01 | |
| Falcon 4 camera w. post-column Selectris X energy filter | Thermo Fisher Scientific | Camera/Filter Alternative 1 | |
| FIB Aquilos 1 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 1 | |
| FIB Aquilos 2 | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 2 | |
| FIB Quanta 3D FEG | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 3 | |
| FIB Scios | Thermo Fisher Scientific | FIB Alternative 4 | |
| K2 summit camera w. post-column energy filter 968 Quantum K2 | Gatan | Camera/Filter Alternative 2 | |
| Leica TCS SP8 with cryo module | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 2 | |
| Plasma Cleaner PDC-3XG | Harrick | ||
| Teflon Sheet (0.25 mm) | plastx24.de | 11645 | Cut to same dimensions as filter paper |
| TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 1 | |
| TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4 | Thermo Fisher Scientific | TEM Alternative 2 | |
| THUNDER Imager EM Cryo CLEM | Thermo Fisher Scientific | FLM Alternative 3 | |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | alternativevly, use manaual plunger | |
| Whatman filter paper | Sigma Aldrich | 10311807 | 55 mm diamater; needs to be cut to fit the Vitrobot |
References
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