Summary
Le recrutement des leucocytes et des plaquettes constitue un composant essentiel nécessaire à la croissance efficace des artères collatérales au cours de l’artériogenèse. La microscopie multiphotonique est un outil efficace pour suivre la dynamique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée in vivo et moins photo-toxicité pour étudier le recrutement et l’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse.
Abstract
L’artériogenèse dépend fortement du recrutement des leucocytes et des plaquettes dans l’espace périvasculaire des vaisseaux collatéraux en croissance. L’approche standard pour l’analyse des artères collatérales et des leucocytes dans l’artériogenèse est la méthodologie histologique ex vivo . Cependant, cette technique ne permet pas de mesurer des processus dynamiques tels que le flux sanguin, la contrainte de cisaillement, les interactions cellule-cellule et la vitesse des particules. Cet article présente un protocole pour surveiller les processus in vivo dans les artères collatérales en croissance au cours de l’artériogenèse en utilisant l’imagerie intravitale. La méthode décrite ici est un outil fiable pour la mesure dynamique et offre une analyse à contraste élevé avec une photocytotoxicité minimale, fournie par microscopie d’excitation multiphotonique. Avant d’analyser les artères collatérales en croissance, l’artériogenèse a été induite dans le muscle adducteur de souris par ligature unilatérale de l’artère fémorale.
Après la ligature, les artères collatérales préexistantes ont commencé à se développer en raison de l’augmentation de la contrainte de cisaillement. Vingt-quatre heures après la chirurgie, la peau et la graisse sous-cutanée au-dessus des artères collatérales ont été enlevées, construisant une poche pour d’autres analyses. Pour visualiser le flux sanguin et les cellules immunitaires pendant l’imagerie in vivo , des anticorps à base d’isothiocyanate de fluorescéine CD41 (FITC) (plaquettes) et de CD45-phycoérythrine (PE) (leucocytes) ont été injectés par voie intraveineuse (i.v.) via un cathéter placé dans la veine de la queue d’une souris. Cet article présente l’imagerie multiphotonique intravitale comme alternative ou complément in vivo aux analyses histologiques statiques ex vivo (immuno-) couramment utilisées pour étudier les processus pertinents pour l’artériogenèse. En résumé, cet article décrit une méthode in vivo nouvelle et dynamique pour étudier le trafic de cellules immunitaires, le flux sanguin et le stress de cisaillement dans un modèle d’artériogenèse des membres postérieurs, ce qui améliore considérablement les possibilités d’évaluation.
Introduction
Malgré l’intérêt intensif de la recherche au cours des dernières années, les maladies cardiovasculaires, par exemple les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux, demeurent la principale cause mondiale de décès1. Les traitements actuels de ces maladies sont des thérapies hautement invasives telles que l’angioplastie transluminale percutanée, l’angioplastie coronaire transluminale percutanée ou le pontagecoronarien 2. Par conséquent, le développement d’options thérapeutiques alternatives et non invasives est nécessaire de toute urgence. Le corps peut créer des pontages naturels autour d’un vaisseau sténosé ou obstrué pour rediriger le flux sanguin interrompu vers la partie distale de la sténose. Ce processus est appelé artériogenèse2. De nombreuses études récentes ont montré que l’augmentation du cisaillement des fluides a un impact sur le recrutement des leucocytes, qui joue un rôle important lors de l’artériogenèse3. Les principales options actuelles pour analyser le recrutement des leucocytes au cours de l’artériogenèse sont les analyses histologiques ex vivo ou la méthodologie de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)4. Pour permettre l’évaluation de la dynamique des leucocytes au cours de l’artériogenèse, cet article présente un protocole d’imagerie intravitale avec microscopie multiphotonique.
Les leucocytes sont les principales cellules sanguines recrutées au cours du processus d’artériogenèse3. Ce protocole utilise l’imagerie multiphotonique pour montrer le rampement des leucocytes adhérents marqués avec des anticorps anti-CD45-PE injectés dans les artères collatérales, 24 h après l’induction de l’artériogenèse par ligature de l’artère fémorale (LAF) utilisant une ischémie des membres postérieurs murins modèle 5,6. Alternativement, les cellules immunitaires peuvent être marquées ex vivo et soigneusement injectées à la souris, comme le montrent les études sur l’angiogenèse utilisant la microscopie intravitale7. Le flux sanguin à l’intérieur des vaisseaux et des artères peut être visualisé par CD41-FITC (pour marquer les plaquettes), dextran-FITC (plasma), ou par la deuxième génération harmonique (SHG), qui visualise le collagène de type 1 présent dans la membrane basale d’une partie de l’arbre vasculaire. SHG est un effet d’étiquetage libre unique de l’excitation multiphotonique. L’imagerie multiphotonique permet un suivi cellulaire à long terme sans endommager le tissu et activer les cellules par excitation de puissance laser. La microscopie multiphotonique est la méthode d’imagerie de choix pour visualiser les cellules et les structures marquées par fluorescence chez les animaux vivants en raison de sa capacité à exciter les fluorophores plus profondément dans les tissus / organes avec une phototoxicité minimale8.
L’utilisation de lasers infrarouges accordés avec des impulsions délivrées à intervalles femtosecondes excite le fluorochrome uniquement au plan focal, sans excitation au-dessus et au-dessous du plan focal8. Ainsi, la microscopie multiphotonique permet une résolution spatio-temporelle élevée, moins de photo-dommages et une imagerie de pénétration tissulaire accrue pour étudier les événements biologiques dynamiques à l’intérieur des organes. C’est un outil de microscopie idéal pour l’imagerie d’animaux vivants. Cependant, le multiphoton et tout autre art de la microscopie intravitale est limité par le mouvement des tissus dû au rythme cardiaque, à la respiration, aux mouvements péristaltiques, à la tonalité musculaire et à d’autres fonctions physiologiques, ce qui perturbe l’acquisition et l’analyse de l’imagerie. Comme ces mouvements nuisent à la résolution temporelle et spatiale et parfois même à l’analyse ultérieure, ils doivent être traités de manière appropriée pour permettre une analyse et une interprétation précises des données. Plusieurs stratégies ont été développées pour réduire ou prévenir les artefacts du mouvement des tissus. Ce protocole applique un logiciel de correction de la dérive in situ appelé VivoFollow9 pour corriger la dérive tissulaire lors de l’acquisition d’images. Cette approche fournit la stabilisation d’image requise, permettant l’imagerie à long terme et l’analyse du suivi cellulaire.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le Comité bavarois de soin et d’utilisation des animaux (approuvé par le code d’éthique : ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99) ; ces expériences ont été réalisées en stricte conformité avec les directives de la législation animale allemande.
1. Animaux et ligature de l’artère fémorale (LAF)
REMARQUE: Pour induire une inflammation stérile et l’artériogenèse, des souris C57BL / 6J mâles âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées. Aucune des souris n’est morte ou n’a souffert d’une infection de la plaie ou d’une perturbation de la cicatrisation pendant ou après une chirurgie FAL ou simulée, respectivement.
- Anesthésie
REMARQUE: Avant l’injection de l’anesthésie MMF-mix, il est recommandé d’anesthésier d’abord avec 5% d’isoflurane jusqu’à ce que la souris dorme.- Peser la souris et préparer le mélange MMF avec une dose de midazolam 5,0 mg/kg, de médétomidine 0,5 mg/kg et de fentanyl 0,05 mg/kg.
- Remplir une seringue de 1 mL avec le mélange MMF et injecter un volume final de 100 μL s.c. à l’aide d’une aiguille de 30 G (après anesthésie avec 5% d’isoflurane).
- Placez la souris sur un coussin chaud et attendez que la souris soit complètement anesthésiée. Réglez la minuterie sur 35 min. Après ce temps, injecter la moitié de la dose (50 μL) du mélange MMF.
- Vérifiez la profondeur de l’anesthésie en testant la pédale et les réflexes interdigitaux (par pincement ferme des orteils) de la souris.
REMARQUE : L’absence de réponse indique une profondeur d’analgésie adéquate.
- Ligature de l’artère fémorale (LAF)
REMARQUE: Utilisez des instruments chirurgicaux et des sutures stériles. Désinfectez la peau avec un désinfectant avant l’ouverture et après la fermeture.- Placez la souris anesthésiée sur une plaque chauffante (35-37 °C) pour maintenir la température corporelle physiologique. Appliquez une crème pour les yeux (dexpanthénol) sur chaque œil pour éviter le dessèchement des yeux sous anesthésie.
- Transférer la souris anesthésiée dans une chambre d’imagerie Doppler laser (LDI) avant et après FAL pour vérifier le flux sanguin et la perfusion (Figure 1A-C).
- Enlevez les poils, désinfectez la peau et faites une coupe pour accéder à l’artère fémorale. Au microscope chirurgical, ligaturer l’artère fémorale droite du membre postérieur de la souris à l’aide d’une suture de soie tressée (7-0) et effectuer une opération fictive sur l’artère fémorale gauche pour servir de contrôle interne comme décrit précédemment6 (Figure 1D-K).
REMARQUE: L’incision dans la peau a été faite avec de petits ciseaux pour éviter les blessures directes aux vaisseaux sanguins proches de la peau. - Fermez la peau à l’aide d’une suture en soie tressée (6-0). Administrer de la buprénorphine (0,1 mg/kg) s.c. toutes les 12 h, en commençant 10 minutes avant de contrarier l’anesthésie pour soulager la douleur. Observez l’animal pour détecter tout signe de douleur, c.-à-d. activité de toilettage réduite, réticence à bouger ou posture voûtée pendant 24 heures après la chirurgie.
- Injectez (s.c.) une combinaison de naloxone (1,2 mg/kg), de flumazénile (0,5 mg/kg) et d’atipamézole (2,5 mg/kg) pour antagoniser l’anesthésie après avoir terminé le FAL et fermé la peau.
- Après la chirurgie, gardez la souris sur le coussin chaud et surveillez continuellement l’animal jusqu’à ce qu’il puisse maintenir une posture verticale et commencer à marcher normalement autour de la cage.
- Lorsque la souris est complètement réveillée, replacez-la dans la cage avec les autres souris et ramenez la cage dans la salle de logement des animaux.
2. Préparation tissulaire pour l’imagerie intravitale multiphotonique
- Injection veineuse de la queue
REMARQUE: L’animal doit être sous anesthésie avant de commencer la préparation pour l’imagerie intravitale. Avant d’introduire l’aiguille du cathéter veineux, il est recommandé d’appliquer un désinfectant pour la peau sur la queue. Cela aidera également à visualiser les vaisseaux.- Préparer un cathéter d’injection veineuse de queue à l’aide d’une aiguille de 2 x 30 G, d’un tube en polyéthylène de 10 cm de calibre fin (diamètre interne de 0,28 mm et diamètre extérieur de 0,61 mm), d’une seringue de 1 ml et d’une colle histoacrylique pour fixer le cathéter sur la queue de la souris en vue d’autres injections intraveineuses pendant l’imagerie (figures 2A, B et 2F).
- Préparer la solution d’anticorps pour injection intraveineuse : CD45-PE et CD41-FITC (20 μg/souris) à un volume final de 100 μL.
- Vérifiez la queue pour les nervures de la queue situées latéralement et endiguez la veine pour identifier la veine de la queue. Désinfectez la queue, insérez le cathéter veineux et fixez-le à l’aide de colle histoacrylique tissulaire (figure 2B).
- Injecter les anticorps avant l’imagerie (au moins 15 minutes avant) et après avoir terminé la préparation tissulaire.
- Préparation des tissus
REMARQUE: Utilisez toujours un tampon chaud et administrez une goutte de crème pour les yeux (dexpanthénol) dans chaque œil avant la préparation des tissus. Utilisez des instruments chirurgicaux et des sutures stériles. Désinfectez la peau avec un désinfectant avant l’ouverture et après la fermeture.- Placez la souris anesthésiée sur un coussinet stable et portable. Fixez la souris en décubitus dorsal avec une fixation à 4 points sur le tampon à l’aide de ruban adhésif (Figure 2B).
- Mouler deux morceaux de pâte à modeler et placer les morceaux sous le membre postérieur supérieur de la souris pour assurer une position plane du muscle adducteur (Figure 2B, indiquée par des flèches rouges).
- Pour assurer une température corporelle stable de 37 °C de la souris, placez le tampon avec la souris sur une plaque chauffante sous un microscope chirurgical avec un zoom de 0,64 à 4,0 fois (Figure 1L).
- Enlevez les poils des deux jambes, désinfectez la peau et coupez la peau en cercle autour de la cicatrice de la ligature antérieure de l’artère fémorale du membre postérieur droit (Figure 1M).
- Retirez la couche de peau et de graisse du haut de la jambe (Figure 1N,O) et écartez la peau restante à l’aide de sutures pour créer une poche autour du muscle adducteur (Figure 1P,Q).
- Retirez la graisse sous-cutanée pour obtenir une vision claire du muscle adducteur et de l’artère/veine profonde ainsi que des vaisseaux collatéraux (Figure 1Q,R).
- Commencez soigneusement à enlever la couche musculaire superficielle au-dessus des vaisseaux collatéraux en la disséquant soigneusement à l’aide d’une pince fine (Figure 1R).
REMARQUE : L’artère collatérale et la veine collatérale sont clairement visibles et prêtes pour l’imagerie (Figure 1S). - Remplissez la poche préparée avec une solution saline pour éviter le dessèchement du tissu et continuez avec la même procédure pour le membre postérieur gauche opéré fictif. Avant l’imagerie, ajouter du gel ultrasonique dans les deux poches, ce qui empêche le séchage et sert de milieu d’immersion pour le couplage optique avec l’objectif (Figure 2C et Figure 2F).
3. Microscopie multiphotonique intravitale
- Préparation
REMARQUE: Gardez une seringue avec du gel à ultrasons à l’intérieur de la chambre de l’incubateur du microscope pour maintenir une température chaude pour remplir les poches pendant l’imagerie à long terme.- Retirez la solution saline des deux poches préparées et remplacez-la par du gel à ultrasons pour couvrir les vaisseaux collatéraux (figure 2C).
- Injectez la solution d’anticorps à travers le cathéter de la veine de la queue. 15 min après l’injection d’anticorps, transférer le tampon avec la souris fixe dans la chambre d’imagerie multiphotonique chauffée (Figure 2F).
- Une fois l’acquisition de l’image terminée, euthanasier la souris par luxation cervicale sous narcose profonde.
- Acquisition d’images en microscopie multiphotonique
REMARQUE: Allumez le microscope 30 minutes avant l’imagerie pour permettre la stabilisation du laser. Pour la meilleure stabilité optique du microscope, il est recommandé de maintenir la chambre du microscope chauffée en permanence.- Allumez la clé du boîtier laser Ti:Sapphire, les boîtiers d’interfaces électroniques, l’unité de chauffage de la chambre d’incubation, la lampe fluorescente et l’ordinateur (Figure 2D,E).
- Lancez le logiciel d’acquisition (logiciel Inspector). Réglez la longueur d’onde sur 800 nm et ouvrez l’obturateur du microscope (Figure 3A ii).
- Dans la boîte de dialogue Assistant de mesure, choisissez le mode Instrument (faisceau unique) et le mode Mesure (Time lapse de balayage 3D) (Figure 3A i).
- Transférer la souris anesthésiée dans la chambre d’incubation préchauffée du microscope. Positionnez la zone avec le gel à ultrasons (étape 2.2.8) directement en contact avec la lentille frontale de l’objectif (Figure 2F).
- Ouvrez l’obturateur du microscope à épifluorescence, choisissez un réglage filtre / dichroïque adéquat pour la visualisation FITC (4) pour trouver la zone d’intérêt en suivant le flux sanguin sous l’éclairage par épifluorescence. Après avoir placé la zone d’intérêt dans le champ de vision central, fermez l’obturateur du microscope à épifluorescence.
- Dans la boîte de dialogue xy-Scanner, définissez les paramètres suivants : Taille de l’image (554x554), Pixel (512x512), Fréquence (400), Moyenne des lignes (1) (Figure 3A iii). Ajustez la puissance laser (5%) (Figure 3A iv) et réglez le gain du photomultiplicateur (PMT) pour les canaux vert (66), rouge (66) et bleu (63) (Figure 3A v).
- Sélectionner un objectif adéquat pour les paramètres d’imagerie intravitale et de correction de la dérive (voir détails au point 3.2.11).
REMARQUE : Ici, l’objectif sélectionné était le Nikon LWD 16x (Figure 3A vi). - Définissez la plage de piles d’images en démarrant le mode d’acquisition de l’aperçu en appuyant sur le bouton rouge situé dans le coin supérieur droit de la boîte de dialogue Assistant de mesure (Figure 3A i).
- Définissez la zone et la structure d’intérêt en effectuant la mise au point pour obtenir une bonne image. Ensuite, tout en observant l’écran, changez de focus en déplaçant l’objectif vers le haut jusqu’à ce que l’image disparaisse, et réglez-le sur zéro (first = 0). Changez la mise au point dans la direction opposée en déplaçant l’objectif vers le bas jusqu’à ce que l’image disparaisse à nouveau de l’écran et définissez-la comme dernière position (extrémité = 40 μm) dans la direction axiale (Figure 3A vii).
- Définissez la taille du pas sur 2 μm. Cliquez sur le bouton rouge dans le coin supérieur droit de la boîte de dialogue Assistant de mesure pour arrêter l’analyse d’aperçu.
REMARQUE : Le nombre d’images sera calculé et réglé automatiquement (21 images), comme indiqué à la figure 3A vii. - Si le microscope est équipé d’une correction de dérive en direct9, démarrez le logiciel de correction de dérive (par exemple, VivoFollow) et suivez les étapes décrites ci-dessous.
- Dans la boîte de dialogue Assistant de mesure, choisissez l’axe Python (Python Ax) (Figure 3A viii) comme périphérique du premier axe ; N’activez PAS le mode d’enregistrement automatique. Cochez la case d’enregistrement automatique (AS) uniquement sur l’axe temporel ( Heure de temps). Appuyez sur l’icône Python de la fenêtre Available Devices (Figure 3A ix) pour ouvrir la boîte de dialogue Python .
- Dans les paramètres de l’axe de la boîte de dialogue Python , entrez From (0 zéro) et To (-40). Entrez le nombre d’étapes (21) comme indiqué à la figure 3A x.
- Accédez à la fenêtre de dialogue xyz Stage Z et agrandissez la plage de balayage de 200 μm aux deux extrémités : dans Start, entrez (200 μm) et dans End, entrez (-240 μm), la plage sera automatiquement définie (-440 μm). Conservez la taille du pas (2 μm) comme indiqué à la figure 3A xi.
- Ouvrez la boîte de dialogue VivoFollow Frontend et cliquez sur la case Motion Profile (Profil de mouvement ) (Figure 3A xii).
- Démarrez l’acquisition d’images en appuyant sur la pointe de flèche verte dans le coin supérieur gauche de la boîte de dialogue Assistant de mesure du logiciel Inspector (Figure 3A i).
- Si la correction de dérive sous tension est utilisée, recherchez une boîte de dialogue pour la configuration de correction de dérive à afficher comme illustré à la figure 3A xiii. Définissez le canal d’acquisition qui sera utilisé comme référence de repère immobile (pour ce protocole, choisissez le canal 2, où le signal du traceur vasculaire doit être enregistré). Entrez le décalage de correction maximal en μm qui a été ajouté aux première et dernière positions z (ici, 200 μm) et cliquez sur OK.
- Surveillez le décalage de dérive actuel en x, y et z en temps réel pendant l’acquisition de l’image dans la fenêtre de dialogue frontale de VivoFollow Figure 3A xiv.
- Arrêtez l’acquisition d’imagerie après ~35 min lorsqu’un autre cycle de réinjection d’anesthésie est nécessaire. Injecter une demi-dose du mélange MMF (50 μl s.c) et recommencer l’acquisition par imagerie en appuyant à nouveau sur la pointe de flèche verte (étape 3.2.11.5).
- Répétez cette procédure jusqu’à ce que l’expérience soit terminée.
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Representative Results
La microscopie multiphotonique offre une résolution spatio-temporelle élevée pour le suivi des leucocytes, dans laquelle les étapes et la vitesse de migration cellulaire peuvent être suivies et surveillées (Figure 4A,B). Cependant, le mouvement physiologique de l’échantillon pose un défi, en particulier pour les acquisitions d’images de microscopie intravitale à long terme. Par conséquent, une bonne préparation tissulaire et des supports pour fixer le tissu et des outils, tels que la correction d’imagerie en temps réel pour la dérive tissulaire, sont nécessaires pour une acquisition d’imagerie réussie et stable. Ici, un outil de dérive en direct, VivoFollow, a été utilisé pour corriger la dérive tissulaire générée lors de l’acquisition d’imagerie à long terme.
L’application de cet outil permet l’acquisition d’images à long terme et permet la collecte de données de haute qualité, adaptées au suivi des cellules pour les mesures de vitesse. Comme le montre la figure 3B, sans correction de la dérive, la région d’intérêt s’éloigne progressivement de la vue d’enregistrement, ce qui a un impact sur la capacité de suivre les cellules pour l’analyse de la vitesse. Cependant, comme le montre la figure 3C, avec le logiciel de correction de la dérive, des films stables peuvent être enregistrés et plus de cellules peuvent être suivies sur une longue période. Le logiciel de correction de dérive peut également fournir une visualisation des décalages x, y et z au fil du temps que le système a corrigés, comme illustré à la figure 3D.
Figure 1 : Configuration et préparation de l’imagerie Doppler laser pour la ligature de l’artère fémorale et préparation tissulaire pour l’imagerie intravitale. (A) Configuration de l’imagerie LDI. (B) La souris est placée à l’intérieur de la chambre de réchauffement LDI pour l’acquisition d’images. (C) Images LDI des jambes droite et gauche avant (panneau supérieur) et après FAL (panneau inférieur) pour vérifier la perfusion des membres postérieurs après la ligature. L’artère fémorale droite a été ligaturée / obstruée, tandis que l’artère fémorale gauche a été opérée de manière simulée (simulée) et a servi de contrôle interne. Dans la barre de couleur, le bleu indique une faible perfusion sanguine et le rouge indique une perfusion plus élevée. (D-K) Les images représentent les étapes chirurgicales de la ligature artérielle fémorale. Barre d’échelle = 10 mm. (L-S) Préparation tissulaire pour l’imagerie intravitale après FAL. La zone à imager est indiquée par le cercle noir, où se trouvent les vaisseaux collatéraux. Barre d’échelle = 5 mm. Abréviations : LDI = imagerie Doppler laser; FAL = ligature de l’artère fémorale; Occ = occlusion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Configuration pour l’imagerie intravitale multiphotonique. (A) Préparation du cathéter veineux; 1-Tube en polyéthylène fin de 10 cm, 2: aiguille 2x 30 G; 3: cathéter monté connecté avec une seringue de 1 mL; 4: colle histoacrylique tissulaire; 5: porte-aiguille. (B) La souris positionnée en décubitus dorsal avec les deux membres postérieurs placés sur des morceaux de pâte à modeler noire (flèches rouges) préparés pour l’imagerie. (C) Membre postérieur droit obstrué (Occ) et membre postérieur gauche, opéré par simulacre, prêt pour l’imagerie. (D) Installation de microscope multiphotonique montrant des boîtes laser, une boîte de lampe à fluorescence, des tubes pour chauffer la chambre de l’incubateur. E) Chambre d’incubation du microscope multiphotonique. (F) Souris placée à l’intérieur de la chambre du microscope avec l’objectif 16x touchant le tissu recouvert de gel à ultrasons. Détail montrant le cathéter veineux fixé sur la veine de la queue pour l’injection d’anticorps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Configuration du logiciel de correction de dérive VivoFollow. (A) (i-xiv) Étapes de configuration du logiciel décrites dans l’étape de protocole 3.2.2-3.2.11.9. (B) Images de séries chronologiques représentatives montrant l’imagerie dérive sans logiciel de correction de la dérive activé. L’artère collatérale est délimitée par les lignes blanches abandonnées (Vidéo 1 et Vidéo 2). (C) Images de séries chronologiques représentatives montrant la série chronologique stable lorsque la correction de la dérive en direct est appliquée pendant l’acquisition par imagerie. Les leucocytes ont été marqués avec des anticorps CD45-PE (rouge), les plaquettes ont été marquées par des anticorps CD41-FITC (vert) et le collagène de type 1 avec le SGH (bleu). L’artère collatérale est délimitée par les lignes blanches abandonnées. (D) Graphique linéaire montrant la correction en direct le long des directions x, y et z. Abréviations : PE = phycoérythrine; FITC = isothiocyanate de fluorescéine; SGH = seconde génération harmonique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats représentatifs. (A) Vitesses leucocytaires mesurées dans les artères collatérales des membres postérieurs monopolisés (Sham) et ligaturés par l’artère fémorale. (B) Des images représentatives montrent les cellules suivies (magenta) avec les pistes codées par couleur. La barre de code couleur représente la vitesse de la cellule avec les cellules plus lentes indiquées par des pistes bleues et des cellules plus rapides avec des pistes rouges. Les leucocytes ont été marqués avec des anticorps CD45-PE injectés (rouge), les plaquettes ont été marquées par des anticorps CD41-FITC injectés (vert) et le collagène de type 1 avec le SGH (bleu). Résultats de trois expériences individuelles. Barre d’échelle = 20 μm. Voir la vidéo 3 et la vidéo 4. Abréviations : Occ = obstrué/ligaturé de l’artère fémorale; PE = phycoérythrine; FITC = isothiocyanate de fluorescéine; SGH = seconde génération harmonique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : Imagerie intravitale multiphotonique d’une artère collatérale sans correction de la dérive. Des images en quatre dimensions ont été enregistrées avec une taille de pixel de 554 x 554 μm, une fréquence de 600 Hz, un intervalle de 1100 ms / image, une taille de pas de 2 μm et une plage de 40 μm. La vidéo montre l’image à la dérive sans l’application du logiciel de correction de dérive VivoFollow. L’artère collatérale est montrée dans la partie inférieure de la vidéo, et la veine collatérale apparaît après 3 minutes dans la partie supérieure du film. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 2 : Imagerie intravitale multiphotonique d’une artère collatérale avec correction de dérive appliquée. Les images en quatre dimensions ont été prises avec une taille de pixel de 554 x 554 μm, une fréquence de 600 Hz, un intervalle de 1100 ms / image, une taille de pas de 2 μm et une plage de 40 μm. La vidéo a été enregistrée avec le logiciel de correction de dérive en direct, VivoFollow, et montre la stabilité d’imagerie favorisée par l’application du logiciel de correction de dérive. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 3 : Imagerie de suivi cellulaire dans une artère collatérale après une opération fictive. Les leucocytes marqués avec des anticorps anti-CD45-PE injectés ont été imagés dans une artère collatérale au repos de la jambe opérée fictivement et suivis à l’aide du logiciel Imaris avec le plugin pour le suivi des cellules. Les cellules suivies ont été sélectionnées et représentées par les points magenta. Les pistes ont été codées par couleur en fonction de la vitesse de la cellule. Les cellules plus lentes sont représentées par des pistes bleues et les cellules plus rapides par des pistes rouges. Barre d’échelle = 50 μm. Abréviation = PE = phycoérythrine. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Vidéo 4 : Imagerie de suivi cellulaire dans une artère collatérale après FAL. Les leucocytes marqués avec des anticorps anti-CD45-PE ont été imagés dans une artère collatérale en croissance 24 h après l’induction de l’artériogenèse par FAL et suivis à l’aide du logiciel Imaris avec le plugin pour le suivi des cellules. Les cellules suivies ont été sélectionnées et représentées par les points magenta. Les pistes ont été codées par couleur en fonction de la vitesse de la cellule. Les cellules plus lentes sont représentées par des pistes bleues et les cellules plus rapides par des pistes rouges. Barre d’échelle = 50 μm. Abréviations : FAL = ligature de l’artère fémorale; PE = phycoérythrine. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
| Problèmes techniques | Solutions proposées | |
| Dans le cas où les vaisseaux de la queue ne sont pas visibles pour introduire le cathéter | • Utilisez une compresse chaude entourant la queue de la souris pendant 3-5 minutes pour favoriser la vasodilatation locale. Cela aidera à rendre la veine visible. | |
| Dans le cas où le cathéter de queue ne peut pas être fixé pour l’injection d’anticorps | • Utilisez une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30 G pour introduire dans la veine et injectez directement les anticorps et les colorants avant l’imagerie. | |
| • Dans certains cas (en fonction des anticorps) l’injection peut être appliquée i.p. 1 h avant l’imagerie. | ||
| Lorsque le mouvement du tissu entrave la stabilité de l’imagerie | • Essayez de repositionner et de refixer la jambe supérieure de la souris pour éviter les mouvements abdominaux physiologiques. | |
| • Vérifiez si la table de microscope a suffisamment d’air pour annuler les vibrations. | ||
| • Assurez-vous que la souris est en anesthésie profonde et ne se réveille pas. | ||
| • Surveillez la respiration de la souris. Lorsque la souris respire trop vite, cela peut avoir un impact sur le mouvement d’imagerie. | ||
| Lorsque la qualité de l’image commence à diminuer | • Assurez-vous que le gel à ultrasons ne sèche pas. | |
| • Remplissez à nouveau le gel à ultrasons. | ||
| • Assurez-vous que l’objectif est propre (nettoyez le gel à ultrasons séché sur l’objectif chaque fois qu’un nouveau remplissage est effectué). | ||
| Lorsque les artères sont endommagées pendant la préparation à l’imagerie | • Dans ce cas, il ne sera pas possible d’acquérir des images. Il n’est pas possible d’exécuter l’expérience. | |
Tableau 1 : dépannage.
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Discussion
La méthode décrite d’analyse multiphotonique in vivo du recrutement leucocytaire représente un complément aux outils couramment utilisés pour les études de recrutement leucocytaire telles que les analyses (immuno-) histologiques ou FACS. Avec cette méthode d’imagerie, il est possible de visualiser plus en détail les processus dynamiques d’adhérence et d’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse10. Malgré la valeur ajoutée de cette méthode, le protocole proposé comprend certaines étapes critiques et limites. Consultez le Tableau 1 pour obtenir d’autres conseils de dépannage. Lors de l’ablation de la couche musculaire superficielle sur les artères collatérales, ces artères pourraient être endommagées et ne seront pas utiles pour l’imagerie intravitale. Le cathéter doit être bien fixé pour l’injection d’anticorps; Sinon, le glissement du cathéter de la veine de la queue peut provoquer l’extravasation des anticorps dans l’espace périvasculaire de la queue, ce qui rend le remplacement et la correction supplémentaire pour l’injection des anticorps une tâche difficile. L’identification correcte de l’artère collatérale et de la veine collatérale lors de la microscopie intravitale représente une autre étape critique de ce protocole.
Étant donné que la souris n’est pas ventilée mécaniquement pendant la microscopie intravitale, le temps d’imagerie dynamique est limité pour éviter des blessures physiques à la souris à la suite d’une anesthésie excessivement longue. L’une des lacunes de la microscopie intravitale est le mouvement physiologique de la souris, généré par la respiration, les battements cardiaques et les mouvements péristaltiques, qui peut avoir un impact sur l’acquisition d’images et, par conséquent, sur la qualité des analyses de données. L’amélioration des porte-tissus, du montage et de la fixation sont des étapes qui réduisent davantage les effets du mouvement. En plus du mouvement physiologique, l’imagerie à long terme peut contribuer à la dérive des tissus pendant l’imagerie. Comme décrit dans ce protocole, un logiciel de correction de la dérive tissulaire en temps réel, VivoFollow, a été utilisé pour obtenir des données d’imagerie adaptées au suivi cellulaire ultérieur et à l’analyse de la vitesse cellulaire. Ce logiciel VivoFollow corrige le déplacement de l’échantillon en x, y et z directement lors de l’acquisition d’images. Il repose sur une structure anatomique immobile, par exemple, lorsque les vaisseaux sont visualisés avec des traceurs vasculaires qui servent de repères de référence pour la procédure de correction.
Bien qu’il existe d’autres outils de correction de dérive post-acquisition disponibles, tels que ceux de Bitplane Imaris ou des plugins pour ImageJ, ils sont très limités dans leur capacité de correction car ils ne permettent pas la restauration de la région d’intérêt. En principe, ils ne peuvent pas corriger les décalages sévères lorsque la région d’intérêt sort du champ de vision. Cependant, ce protocole peut être appliqué même lorsque la correction de la dérive sous tension n’est pas disponible et que la correction post-acquisition devient nécessaire. Cependant, cela nécessite une formation fréquente du personnel au montage et à la fixation des tissus. En conclusion, la microscopie intravitale multiphotonique est une méthode dynamique utile qui peut être appliquée parallèlement à des méthodes statiques établies telles que les analyses (immuno-) histologiques pour obtenir une image plus détaillée des composants dynamiques du recrutement des leucocytes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
L’étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, projet Z01). Nous remercions la Dre Susanne Stutte d’avoir lu le manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (7-0) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
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