Summary
גיוס לויקוציטים וטסיות דם מהווה מרכיב חיוני הדרוש לצמיחה יעילה של עורקי בטחונות במהלך העורקים. מיקרוסקופ מולטיפוטון הוא כלי יעיל למעקב אחר דינמיקה של תאים עם רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה in vivo ופחות רעילות לאור לחקר גיוס לויקוציטים ואקסטרווסציה במהלך העורקים.
Abstract
Arteriogenesis תלוי מאוד לויקוציטים וגיוס טסיות לחלל perivascular של כלי בטחונות גדלים. הגישה הסטנדרטית לניתוח עורקים בטחוניים ולויקוציטים בארטריוגנזה היא מתודולוגיה היסטולוגית ex vivo (immuno-). עם זאת, טכניקה זו אינה מאפשרת מדידה של תהליכים דינמיים כגון זרימת דם, מתח גזירה, אינטראקציות בין תאים ומהירות חלקיקים. מאמר זה מציג פרוטוקול לניטור תהליכי in vivo בצמיחת עורקים בטחוניים במהלך ארטריוגנזה באמצעות הדמיה תוך חיונית. השיטה המתוארת כאן היא כלי אמין למדידת דינמיקה ומציעה ניתוח ניגודיות גבוהה עם ציטוטוקסיות פוטו מינימלית, המסופקת על ידי מיקרוסקופ עירור מולטיפוטונים. לפני ניתוח העורקים הבטחוניים הגדלים, הושרה ארטריוגנזה בשריר האדוקטור של עכברים על ידי קשירה חד צדדית של עורק הירך.
לאחר הקשירה, העורקים הקולטרליים הקיימים החלו לגדול עקב לחץ גזירה מוגבר. עשרים וארבע שעות לאחר הניתוח הוסרו העור והשומן התת עורי שמעל עורקי הצידית, ונוצר כיס לניתוחים נוספים. כדי להמחיש את זרימת הדם ואת תאי החיסון במהלך הדמיית in vivo , CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (טסיות) ונוגדנים CD45-phycoerythrin (PE) (לויקוציטים) הוזרקו תוך ורידי (i.v.) באמצעות קטטר שהונח בווריד הזנב של עכבר. מאמר זה מציג דימות מולטיפוטון תוך-חיוני כחלופה או כהשלמה in vivo לניתוחים ההיסטולוגיים הסטטיים הנפוצים ex vivo (immuno-) כדי לחקור תהליכים רלוונטיים לעורקים. לסיכום, מאמר זה מתאר שיטה חדשנית ודינמית in vivo לחקר סחר בתאי מערכת החיסון, זרימת הדם ולחץ גזירה במודל גפיים אחוריות של ארטריוגנזה, אשר משפר את אפשרויות ההערכה באופן משמעותי.
Introduction
למרות העניין המחקרי האינטנסיבי בשנים האחרונות, מחלות לב וכלי דם, כגון מחלות לב איסכמיות ושבץ, הן עדיין סיבת המוות העולמית המובילה1. הטיפולים הנוכחיים למחלות אלה הם טיפולים פולשניים ביותר כגון אנגיופלסטיקה טרנסלומינלית מלעורית, אנגיופלסטיקה כלילית טרנסלומינלית מלעורית, או ניתוח מעקפים2. לכן, יש צורך דחוף בפיתוח אפשרויות טיפוליות אלטרנטיביות, לא פולשניות. הגוף יכול ליצור מעקפים טבעיים סביב כלי דם היצרות או חסום כדי להפנות את זרימת הדם המופרעת לחלק הדיסטלי של ההיצרות. תהליך זה נקרא arteriogenesis2. מחקרים רבים שנערכו לאחרונה הראו כי גזירה מוגברת של נוזלים משפיעה על גיוס לויקוציטים, אשר ממלא תפקיד חשוב במהלך arteriogenesis3. האפשרויות הנוכחיות העיקריות לנתח את גיוס לויקוציטים במהלך arteriogenesis הן ex vivo (immuno-) ניתוחים היסטולוגיים או מתודולוגיית מיון תאים מופעל פלואורסצנטיות (FACS)4. כדי לאפשר הערכה של דינמיקה לויקוציטים במהלך ארטריוגנזה, מאמר זה מציג פרוטוקול הדמיה תוך חיוני עם מיקרוסקופ מולטיפוטון.
לויקוציטים הם תאי הדם העיקריים שגויסו בתהליך של arteriogenesis3. פרוטוקול זה משתמש בהדמיית מולטיפוטונים כדי להראות את הזחילה של לויקוציטים דבקים המסומנים בנוגדנים מוזרקים נגד CD45-PE בעורקים בטחוניים, 24 שעות לאחר השראת העורקים על ידי קשירת עורק הירך (FAL) תוך שימוש באיסכמיה של גפיים אחוריות מוריןמודל 5,6. לחלופין, ניתן לתייג תאי חיסון ex vivo ולהזריק בזהירות לעכברים, כפי שהוכח במחקרים על אנגיוגנזה באמצעות מיקרוסקופ תוך חיוני7. זרימת הדם בתוך כלי דם ועורקים יכולה להיות דמיונית על ידי CD41-FITC (כדי לסמן טסיות), dextran-FITC (פלזמה), או על ידי הדור ההרמוני השני (SHG), אשר מדמה קולגן סוג 1 נוכח בקרום המרתף של חלק כלשהו של עץ כלי הדם. SHG הוא אפקט תיוג חופשי ייחודי של עירור מולטיפוטונים. דימות מולטיפוטונים מאפשר מעקב תאים ארוך טווח מבלי לפגוע ברקמה ולהפעיל את התאים על ידי עירור כוח לייזר. מיקרוסקופ מולטיפוטון הוא שיטת ההדמיה המועדפת להדמיית תאים ומבנים המסומנים באופן פלואורסצנטי בבעלי חיים בשל יכולתה לעורר את הפלואורופורים עמוק יותר לתוך הרקמה/איברים עם רעילות אור מינימלית8.
השימוש בלייזרים אינפרא אדום מכווננים עם פולסים המועברים במרווחי פמטו-שניות מעורר את הפלואורוכרום רק במישור המוקד, ללא עירור מעל ומתחת למישור המוקד8. לפיכך, מיקרוסקופ מולטיפוטונים מאפשר רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה, פחות נזקי אור והדמיית חדירה מוגברת של רקמות לחקר אירועים ביולוגיים דינמיים בתוך האיברים. זהו כלי מיקרוסקופיה אידיאלי להדמיית בעלי חיים חיים. עם זאת, מולטיפוטון וכל אמנות אחרת של מיקרוסקופיה תוך חיונית מוגבלת על ידי תנועת רקמות עקב פעימות לב, נשימה, תנועות פריסטלטיות, טונאליות שרירים ותפקודים פיזיולוגיים אחרים, מה שמפריע לרכישת הדימות ולניתוחו. מכיוון שתנועות אלה פוגעות ברזולוציה הזמנית והמרחבית ולעיתים אף אוסרות על ניתוח עוקב, יש להתייחס אליהן כראוי כדי לאפשר ניתוח ופרשנות מדויקים של נתונים. מספר אסטרטגיות פותחו כדי להוריד או למנוע ממצאים מתנועת רקמות. פרוטוקול זה מיישם תוכנה לתיקון סחף באתרו בשם VivoFollow9 כדי לתקן סחף רקמות במהלך רכישת תמונה. גישה זו מספקת את ייצוב התמונה הנדרש, ומאפשרת הדמיה ארוכת טווח וניתוח מעקב אחר תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר זה אושר על ידי הוועדה הבווארית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (אושר על ידי הקוד האתי: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); ניסויים אלה בוצעו בהתאמה קפדנית להנחיות החקיקה הגרמנית בנושא בעלי חיים.
1. בעלי חיים וקשירת עורק הירך (FAL)
הערה: כדי לגרום לדלקת סטרילית ולדלקת עורקים, נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים בני 8-10 שבועות. אף אחד מהעכברים לא מת או סבל מזיהום פצעים או מהפרעה בריפוי פצעים במהלך או אחרי ניתוח FAL או דמה, בהתאמה.
- הרדמה
הערה: לפני הזרקת הרדמה MMF-mix, מומלץ להרדים תחילה עם איזופלורן 5% עד שהעכבר ישן.- שקלו את העכבר והכינו תערובת MMF עם מינון של מידזולם 5.0 מ"ג/ק"ג, מדטומידין 0.5 מ"ג/ק"ג ופנטניל 0.05 מ"ג/ק"ג.
- ממלאים מזרק 1 מ"ל במיקס MMF ומזריקים נפח סופי של 100 μL s.c. באמצעות מחט 30 גרם (לאחר הרדמה עם 5% איזופלורן).
- הניחו את העכבר על כרית חמה והמתינו עד שהעכבר מורדם לחלוטין. כוונו את הטיימר ל-35 דקות. לאחר זמן זה, להזריק s.c. מחצית המינון (50 μL) של MMF-mix.
- בדוק את עומק ההרדמה על ידי בדיקת הדוושה והרפלקסים הבין-דיגיטליים (על ידי צביטת בוהן מוצקה) של העכבר.
הערה: היעדר תגובה מצביע על עומק מספיק של שיכוך כאבים.
- קשירת עורק הירך (FAL)
הערה: יש להשתמש בכלי ניתוח סטריליים ובתפרים. יש לחטא את העור בחומר חיטוי לפני הפתיחה ולאחר הסגירה.- הניחו את העכבר המרדים על פלטת חימום (35-37°C) כדי לשמור על טמפרטורת הגוף הפיזיולוגית. יש למרוח קרם עיניים (דקספנתנול) על כל עין כדי למנוע התייבשות של העיניים תחת הרדמה.
- העבירו את העכבר המרדים לתא דימות דופלר לייזר (LDI) לפני ואחרי FAL כדי לבדוק את זרימת הדם והזילוח (איור 1A-C).
- הסר שיער, חטא את העור ובצע חתך כדי לגשת לעורק הירך. תחת מיקרוסקופ כירורגי, יש לקשור את עורק הירך הימני של הגפה האחורית של העכבר באמצעות תפר משי קלוע (7-0) ולבצע ניתוח דמה בעורק הירך השמאלי כדי לשמש כבקרה פנימית כפי שתואר קודם לכן6 (איור 1D-K).
הערה: החתך בעור נעשה באמצעות מספריים קטנים כדי למנוע פגיעה ישירה בכלי הדם הקרובים לעור. - סוגרים את העור באמצעות תפר משי קלוע (6-0). יש לתת buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג) s.c. כל 12 שעות, החל 10 דקות לפני אנטגוניזם את ההרדמה להקלה על הכאב. התבונן בבעל החיים לאותות של כאב, כלומר, פעילות טיפוח מופחתת, חוסר רצון לזוז, או יציבה כפופה במשך 24 שעות לאחר הניתוח.
- הזריקו (s.c.) שילוב של נלוקסון (1.2 מ"ג/ק"ג), פלומזניל (0.5 מ"ג/ק"ג) ואטיפמזול (2.5 מ"ג/ק"ג) כדי לנטרל את ההרדמה לאחר סיום ה-FAL וסגירת העור.
- לאחר הניתוח, יש להשאיר את העכבר על הכרית החמה ולהשגיח ברציפות על בעל החיים עד שהוא יכול לשמור על יציבה זקופה ולהתחיל ללכת כרגיל סביב הכלוב.
- כאשר העכבר ער לחלוטין, החזירו אותו לכלוב יחד עם העכברים האחרים והחזירו את הכלוב לחדר המגורים של בעלי החיים.
2. הכנת רקמות להדמיה תוך-חיונית של מולטיפוטונים
- הזרקת ורידים בזנב
הערה: בעל החיים צריך להיות תחת הרדמה לפני תחילת ההכנה להדמיה תוך חיונית. לפני החדרת המחט של קטטר הווריד, מומלץ להחיל חומר חיטוי העור על הזנב. זה גם יעזור לדמיין את כלי.- הכינו צנתר הזרקת ורידים זנב באמצעות מחט 2 x 30 גרם, 10 ס"מ של צינור פוליתן דק (קוטר פנימי 0.28 מ"מ וקוטר חיצוני 0.61 מ"מ), מזרק 1 מ"ל ודבק היסטואקריל כדי לקבע את הצנתר על זנב העכבר להזרקות i.V נוספות במהלך הדמיה (איור 2A,B ואיור 2F).
- הכן את תמיסת הנוגדנים להזרקת i.v: CD45-PE ו- CD41-FITC (20 מיקרוגרם / עכבר) בנפח סופי של 100 μL.
- בדוק את הזנב עבור ורידי הזנב הממוקמים לרוחב וסכר את הווריד כדי לזהות את וריד הזנב. חיטאו את הזנב, הכניסו את צנתר הווריד וקבעו אותו באמצעות דבק היסטואקריל רקמתי (איור 2B).
- יש להזריק את הנוגדנים לפני ההדמיה (לפחות 15 דקות לפני) ולאחר סיום הכנת הרקמות.
- הכנת רקמות
הערה: יש להשתמש תמיד בפד חם ולתת טיפת קרם עיניים (דקספנתנול) בכל עין לפני הכנת הרקמות. השתמש בכלי ניתוח סטריליים ותפרים. יש לחטא את העור בחומר חיטוי לפני הפתיחה ולאחר הסגירה.- הניחו את העכבר המורדם על פד יציב ונייד. תקנו את העכבר במצב שכיבה עם קיבוע של 4 נקודות על הפד באמצעות סרט הדבקה (איור 2B).
- עצבו שתי חתיכות של חימר מידול והניחו את החתיכות מתחת לגפה האחורית העליונה של העכבר כדי להבטיח מיקום מישורי של שריר האדוקטור (איור 2B, מסומן על-ידי חיצים אדומים).
- כדי להבטיח טמפרטורת גוף יציבה של 37°C של העכבר, הניחו את הפד עם העכבר על פלטת חימום מתחת למיקרוסקופ כירורגי עם זום של פי 0.64-4.0 (איור 1L).
- הסירו את השיער משתי הרגליים, חיטאו את העור וחתכו את העור במעגל סביב הצלקת של קשירת עורק הירך הקודמת של הגפה האחורית הימנית (איור 1M).
- הסירו את העור ואת שכבת השומן מהחלק העליון של הרגל (איור 1N,O), ומשכו הצידה את העור שנותר באמצעות תפרים כדי ליצור כיס סביב שריר ה-adductor (איור 1P,Q).
- הסירו שומן תת-עורי כדי לקבל ראייה ברורה של שריר האדוקטור והעורק/וריד העמוקים, כמו גם של כלי הדם הנלווים (איור 1Q,R).
- התחילו בזהירות להסיר את שכבת השריר השטחית שמעל כלי הדם הצדיים על-ידי חתכתם אותה בזהירות בעזרת מלקחיים עדינים (איור 1R).
הערה: העורק הקולטרלי והווריד הקולטרלי נראים בבירור ומוכנים להדמיה (איור 1S). - מלאו את הכיס המוכן במי מלח כדי למנוע התייבשות של הרקמה והמשיכו באותו הליך עבור הגפה האחורית השמאלית המופעלת בדמה. לפני ההדמיה, הוסיפו ג'ל על-קולי בשני הכיסים, שמונע התייבשות ומשמש כמדיום טבילה לצימוד אופטי עם המטרה (איור 2C ואיור 2F).
3. מיקרוסקופ מולטיפוטון תוך חיוני
- הכנה
הערה: שמור מזרק עם ג'ל קולי בתוך תא האינקובטור של המיקרוסקופ כדי לשמור על טמפרטורה חמה למילוי מחדש של הכיסים במהלך הדמיה לטווח ארוך.- הסירו את המלח משני הכיסים המוכנים והחליפו אותו בג'ל על-קולי כדי לכסות את כלי הדם הנלווים (איור 2C).
- להזריק את תמיסת הנוגדנים דרך קטטר וריד הזנב. 15 דקות לאחר הזרקת הנוגדנים, העבירו את הפד עם העכבר הקבוע לתוך תא הדמיה מולטיפוטון מחומם (איור 2F).
- לאחר השלמת רכישת התמונה, להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם תחת נרקוזיס עמוק.
- רכישת תמונה במיקרוסקופ מולטיפוטון
הערה: הפעל את המיקרוסקופ 30 דקות לפני ההדמיה כדי לאפשר ייצוב לייזר. לקבלת היציבות האופטית הטובה ביותר של המיקרוסקופ, מומלץ לשמור על תא המיקרוסקופ מחומם לצמיתות.- הפעילו את המפתח של קופסת הלייזר Ti:Sapphire, את קופסאות הממשקים האלקטרוניים, את יחידת החימום של תא הדגירה, את מנורת הפלואורסצנט ואת המחשב (איור 2D,E).
- הפעל את תוכנת הרכישה (תוכנת מפקח). כוונו את אורך הגל ל-800 ננומטר ופתחו את תריס המיקרוסקופ (איור 3A ii).
- בתיבת הדו-שיח 'אשף המדידה', בחרו 'מצב מכשיר' (אלומה יחידה) ו'מצב מדידה' (קיטועי זמן לסריקה תלת-ממדית) (איור 3A i).
- מעבירים את העכבר המרדים לתא הדגירה המחומם מראש של המיקרוסקופ. מקמו את האזור עם הג'ל העל-קולי (שלב 2.2.8) ישירות במגע עם העדשה הקדמית האובייקטיבית (איור 2F).
- פתח את תריס המיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי, בחר מסנן מתאים / הגדרה דיכרואית להדמיית FITC (4) כדי למצוא את אזור העניין על ידי מעקב אחר זרימת הדם תחת תאורה אפיפלואורסצנטית. לאחר הכנסת אזור העניין לשדה הראייה המרכזי, סגרו את תריס המיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי.
- בתיבת הדו-שיח xy-Scanner, הגדר את הפרמטרים הבאים: גודל תמונה (554x554), פיקסל (512x512), תדירות (400), ממוצע קו (1) (איור 3A iii). כוונן את עוצמת הלייזר (5%) (איור 3A iv), והגדר את רווח מכפיל האור (PMT) עבור הערוצים ירוק (66), אדום (66) וכחול (63) (איור 3A v).
- בחר יעד מתאים להגדרות הדמיה תוך-חיונית ותיקון סחף (ראה פירוט ב-3.2.11).
הערה: כאן, המטרה שנבחרה הייתה Nikon LWD 16x (איור 3A vi). - הגדירו את טווח אוסף התמונות באמצעות הפעלת מצב רכישת התצוגה המקדימה בלחיצה על הלחצן האדום בפינה השמאלית העליונה של חלון הדו-שיח 'אשף המדידות ' (איור 3A i).
- הגדר את האזור ואת המבנה של עניין על ידי התמקדות כדי לקבל תמונה טובה. לאחר מכן, תוך כדי התבוננות במסך, שנו את המיקוד על ידי הזזת המטרה כלפי מעלה עד להיעלמות התמונה, והגדירו אותה כאפס (ראשון=0). שנו את המיקוד בכיוון ההפוך על-ידי הזזת המטרה כלפי מטה עד שהתמונה תיעלם שוב מהמסך, והגדירו אותה כמיקום האחרון (סוף=40 מיקרומטר) בכיוון הצירי (איור 3A vii).
- הגדר את גודל המדרגה ל- 2 מיקרומטר. לחצו על הלחצן האדום בפינה השמאלית העליונה של תיבת הדו-שיח 'אשף המדידות ' כדי להפסיק את סריקת התצוגה המקדימה.
הערה: מספר התמונות יחושב ויוגדר באופן אוטומטי (21 תמונות), כפי שמצוין באיור 3A vii. - אם המיקרוסקופ מצויד בתיקון סחף חי9, הפעל את תוכנת תיקון הסחף (לדוגמה, VivoFollow) ובצע את השלבים המתוארים להלן.
- בתיבת הדו-שיח אשף המדידה, בחרו בציר Python (Python Ax) (איור 3A viii) כהתקן הציר הראשון; אל תפעיל את מצב השמירה האוטומטי. סמן את תיבת השמירה האוטומטית (AS) רק בציר הזמן (Time Time). לחץ על סמל Python בחלון Available Devices (איור 3A ix) כדי לפתוח את חלון הדו-שיח Python.
- בהגדרות ציר הדו-שיח Python , הזן From (0 zero) ו- To ( - 40). הזן את מספר השלבים (21) כפי שמצוין באיור 3A x.
- עבור אל חלון הדו-שיח xyz שלב Z והגדל את טווח הסריקה ב- 200 מיקרומטר בשני הקצוות: בהתחל, הזן (200 מיקרומטר) ובסוף, הזן (-240 מיקרומטר), הטווח יוגדר אוטומטית (-440 מיקרומטר). שמור על גודל המדרגה (2 מיקרומטר) כפי שמוצג באיור 3A xi.
- פתחו את תיבת הדו-שיח VivoFollow Frontend ולחצו על התיבה Motion Profile (איור 3A xii).
- התחל רכישת תמונה על-ידי לחיצה על ראש החץ הירוק בפינה השמאלית העליונה של תיבת הדו-שיח אשף המדידה של תוכנת המפקח (איור 3A i).
- אם נעשה שימוש בתיקון סחף חי, חפש תיבת דו-שיח שבה תצורת תיקון הסחף תופיע כפי שמוצג באיור 3A xiii. הגדר את ערוץ הרכישה שישמש כהפניה לציון דרך לא נייד (עבור פרוטוקול זה, בחר ערוץ 2, שבו יש להקליט את אות נותב כלי הדם). הזינו את הסטת התיקון המרבית במיקרומטר שנוספה למיקום z הראשון והאחרון (כאן, 200 מיקרומטר) ולחצו על הלחצן ' אשר'.
- נטרו את הסטת הסחף הנוכחית ב-x, y ו-z בזמן אמת במהלך רכישת התמונה בחלון הדו-שיח הקדמי של VivoFollow איור 3A xiv.
- הפסק את רכישת ההדמיה לאחר ~ 35 דקות כאשר נדרש מחזור נוסף של הזרקה חוזרת של הרדמה. הזריקו חצי מנה של MMF-mix (50 μl s.c) והתחילו מחדש את רכישת ההדמיה על ידי לחיצה נוספת על ראש החץ הירוק (שלב 3.2.11.5).
- חזור על הליך זה עד לסיום הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מיקרוסקופ מולטיפוטונים מציע רזולוציה מרחבית-טמפורלית גבוהה למעקב אחר לויקוציטים, שבו ניתן לעקוב אחר שלבי נדידת תאים ומהירותם ולנטר אותם (איור 4A,B). עם זאת, התנועה הפיזיולוגית של הדגימה מהווה אתגר, במיוחד עבור רכישות ארוכות טווח של תמונות מיקרוסקופיה תוך חיונית. לכן, הכנה טובה של הרקמה ומחזיקי רקמה לתיקון הרקמה וכלים, כגון תיקון הדמיה בזמן אמת לסחף רקמות, נדרשים לרכישת הדמיה מוצלחת ויציבה. כאן, נעשה שימוש בכלי של סחף חי, VivoFollow, כדי לתקן את סחף הרקמה שנוצר במהלך רכישת הדמיה לטווח ארוך.
היישום של כלי זה מאפשר רכישת תמונה לטווח ארוך ומאפשר איסוף נתונים באיכות גבוהה, המתאימים למעקב אחר תאים למדידות מהירות. כפי שניתן לראות באיור 3B, ללא תיקון סחף, האזור המעניין מתרחק בהדרגה מתצוגת ההקלטה, מה שמשפיע על היכולת לעקוב אחר תאים לצורך ניתוח מהירות. אולם כפי שניתן לראות באיור 3C, בעזרת התוכנה לתיקון סחף ניתן להקליט סרטים יציבים, ולעקוב אחר תאים רבים יותר במשך תקופה ארוכה. התוכנה לתיקון סחף יכולה גם לספק תצוגה חזותית של הקיזוזים x, y ו-z לאורך זמן שהמערכת תיקנה, כפי שמוצג באיור 3D.
איור 1: הדמיית דופלר בלייזר הגדרה והכנה לקשירת עורק הירך והכנת רקמות להדמיה תוך-חיונית. (A) מערך הדמיית LDI. (B) העכבר ממוקם בתוך תא החימום LDI לצורך רכישת תמונה. (C) תמונות LDI של רגל ימין ורגל שמאל לפני (פאנל עליון) ואחרי FAL (פאנל תחתון) כדי לבדוק את זילוח הגפיים האחוריות לאחר הקשירה. עורק הירך הימני היה קשור/חסום, ואילו עורק הירך השמאלי הופעל על ידי דמה (Sham) ושימש כבקרה פנימית. בסרגל הצבעים, כחול מציין זילוח דם נמוך, ואדום מציין זילוח גבוה יותר. (ד-ק) התמונות מייצגות את שלבי הניתוח של קשירת עורק הירך. סרגל קנה מידה = 10 מ"מ. (L-S) הכנת רקמות להדמיה תוך חיונית לאחר FAL. האזור שיש לצלם מסומן על ידי העיגול השחור, שבו נמצאים כלי הבטחונות. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. קיצורים: LDI = הדמיית דופלר לייזר; FAL = קשירת עורק הירך; Occ = חסימה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנה להדמיה תוך-חיונית של מולטיפוטונים. (A) הכנת צנתר ורידים; 1-צינורות פוליתן דק של 10 ס"מ, 2: 2x 30 גרם מחט; 3: קטטר רכוב מחובר מזרק 1 מ"ל; 4: דבק היסטואקריל רקמות; 5: מחזיק מחט. (B) העכבר ממוקם במצב שכיבה כששתי הגפיים האחוריות מונחות על פיסות חימר מידול שחור (חיצים אדומים) שהוכנו להדמיה. (C) גפה אחורית ימנית חסומה (Occ) וגפה אחורית שמאלית, המופעלת על ידי דמה, מוכנות להדמיה. (D) מערך מיקרוסקופ מולטיפוטון המציג קופסאות לייזר, קופסת מנורת פלואורסצנטיות, צינורות לחימום תא האינקובטור. (E) תא האינקובטור של המיקרוסקופ הרב-פוטוני. (F) עכבר הממוקם בתוך תא המיקרוסקופ כאשר המטרה 16x נוגעת ברקמה המכוסה בג'ל על-קולי. פירוט המציג את קטטר הווריד המקובע על וריד הזנב להזרקת נוגדנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הגדרת תוכנת תיקון סחף VivoFollow. (A) (i-XIV) שלבי הגדרת תוכנה כמתואר בשלב הפרוטוקול 3.2.2-3.2.11.9. (B) תמונות מייצגות מסדרות זמן המציגות את ההדמיה נסחפת ללא הפעלת תוכנה לתיקון סחיפה. העורק הקולטרלי תחום על ידי הקווים הלבנים שהופסקו (וידאו 1 ווידאו 2). (C) תמונות מייצגות של סדרות זמן המציגות את סדרת הזמן היציבה כאשר תיקון הסחיפה החי מוחל במהלך רכישת ההדמיה. לויקוציטים סומנו עם נוגדני CD45-PE (אדום), טסיות סומנו על ידי נוגדני CD41-FITC (ירוק) וקולגן מסוג 1 עם SGH (כחול). העורק הקולטרלי תחום על ידי הקווים הלבנים שהופסקו. (D) תרשים קו המציג את התיקון החי לאורך הכיוונים x, y ו- z. קיצורים: PE = phycoerythrin; FITC = isothiocyanate fluorescein; SGH = דור הרמוני שני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות מייצגות. (A) מהירויות לויקוציטים שנמדדו בעורקים הצדיים של גפיים אחוריות המופעלות על ידי דמה (Sham) ועורק הירך. (B) תמונות מייצגות מציגות את התאים שנמצאים במעקב (מגנטה) כשהרצועות מסומנות בצבע. שורת קוד הצבע מייצגת את מהירות התא עם התאים האיטיים יותר המוצגים על-ידי רצועות כחולות ותאים מהירים יותר עם רצועות אדומות. לויקוציטים סומנו עם נוגדנים CD45-PE מוזרקים (אדום), טסיות סומנו על ידי נוגדנים CD41-FITC מוזרקים (ירוק), ואת סוג קולגן 1 עם SGH (כחול). תוצאות משלושה ניסויים בודדים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. ראה סרטון 3 וסרטון 4. קיצורים: Occ = חסום / עורק הירך קשור; PE = phycoerythrin; FITC = isothiocyanate fluorescein; SGH = דור הרמוני שני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: הדמיה תוך-חיונית מולטיפוטון של עורק בטחוני ללא תיקון סחף. תמונות ארבע-ממדיות הוקלטו בגודל פיקסלים של 554 x 554 מיקרומטר, תדר 600 הרץ, מרווח של 1100 מילישניות למסגרת, גודל צעד של 2 מיקרומטר וטווח של 40 מיקרומטר. הסרטון מראה את התמונה נסחפת ללא יישום של תוכנת תיקון הסחף VivoFollow. עורק הבטחונות מוצג בחלק התחתון של הסרטון, והווריד הקולטרלי מופיע לאחר 3 דקות בחלק העליון של הסרט. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.
וידאו 2: הדמיה תוך-חיונית מולטיפוטון של עורק בטחוני עם תיקון סחף מיושם. תמונות ארבע-ממדיות צולמו בגודל פיקסל של 554 x 554 מיקרומטר, תדר 600 הרץ, מרווח של 1100 מילישניות למסגרת, גודל צעד של 2 מיקרומטר וטווח של 40 מיקרומטר. הסרטון הוקלט באמצעות תוכנת תיקון הסחף החי, VivoFollow, ומראה את יציבות ההדמיה המקודמת על ידי יישום תוכנת תיקון הסחף. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.
וידאו 3: הדמיית מעקב אחר תאים בעורק בטחוני לאחר ניתוח דמה. לויקוציטים שסומנו עם נוגדנים מוזרקים נגד CD45-PE צולמו בעורק בטחוני מנוחה של הרגל המופעלת על ידי דמה ואותרו באמצעות תוכנת Imaris עם תוסף למעקב אחר תאים. תאים במעקב נבחרו ויוצגו על-ידי נקודות המג'נטה. המסלולים קודדו בצבע בהתאם למהירות התא. תאים איטיים יותר מיוצגים על-ידי מסלולים כחולים ותאים מהירים יותר על-ידי מסלולים אדומים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצור = PE = phycoerythrin. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
וידאו 4: הדמיית מעקב אחר תאים בעורק בטחוני לאחר FAL. לויקוציטים שסומנו עם נוגדנים נגד CD45-PE צולמו בעורק בטחוני גדל 24 שעות לאחר השראת העורקים על ידי FAL ואותרו באמצעות תוכנת Imaris עם התוסף למעקב אחר תאים. תאים במעקב נבחרו ויוצגו על-ידי נקודות המג'נטה. המסלולים קודדו בצבע בהתאם למהירות התא. תאים איטיים יותר מיוצגים על-ידי מסלולים כחולים ותאים מהירים יותר על-ידי מסלולים אדומים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: FAL = קשירת עורק הירך; PE = phycoerythrin. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
| בעיות טכניות | פתרונות מוצעים | |
| במקרה שכלי הזנב אינם גלויים להחדרת הצנתר | • השתמש בדחיסה חמה סביב זנב העכבר במשך 3-5 דקות כדי לקדם הרחבת כלי דם מקומית. זה יעזור להפוך את הווריד גלוי. | |
| במקרה שלא ניתן לקבע את קטטר הזנב להזרקת נוגדנים | • השתמש מזרק 1 מ"ל עם מחט 30 G כדי להחדיר לתוך הווריד להזריק ישירות את הנוגדנים והצבעים לפני ההדמיה. | |
| • במקרים מסוימים (תלוי בנוגדנים) ניתן לבצע את הזריקה כלומר שעה לפני ההדמיה. | ||
| כאשר תנועת הרקמה פוגעת ביציבות ההדמיה | • נסו למקם מחדש ולקבע מחדש את רגל הרמז העליונה של העכבר כדי להימנע מתנועות הבטן הפיזיולוגיות. | |
| • בדקו האם בשולחן המיקרוסקופ יש מספיק אוויר כדי לבטל רטט. | ||
| • יש לוודא שהעכבר נמצא בהרדמה עמוקה ואינו מתעורר. | ||
| • עקוב אחר נשימת העכבר. כאשר העכבר נושם מהר מדי, זה יכול להשפיע על תנועת ההדמיה. | ||
| כאשר איכות התמונה מתחילה לרדת | • יש לוודא שהג'ל האולטרסוני אינו מתייבש. | |
| • מלאו מחדש את הג'ל האולטרסוני. | ||
| • יש לוודא שהמטרה נקייה (נקו את הג'ל האולטרסוני המיובש על המטרה בכל פעם שנעשה מילוי מחדש). | ||
| כאשר העורקים נפגעים במהלך הכנה להדמיה | • במקרה זה, לא ניתן יהיה לרכוש תמונות. לא ניתן להריץ את הניסוי. | |
טבלה 1: פתרון בעיות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת של ניתוח multiphoton in vivo של גיוס לויקוציטים מייצגת תוספת לכלים נפוצים למחקרי גיוס לויקוציטים כגון ניתוחים היסטולוגיים (חיסוניים) או FACS. בשיטת הדמיה זו, ניתן לדמיין בפירוט רב יותר את התהליכים הדינמיים בהידבקות לויקוציטים ואקסטרווסציה במהלך ארטריוגנזה10. למרות הערך המוסף של שיטה זו, הפרוטוקול המוצע כולל כמה שלבים קריטיים ומגבלות. עיין בטבלה 1 לקבלת עצות נוספות לפתרון בעיות. במהלך הסרת שכבת השריר השטחית על העורקים הקולטרליים, עורקים אלה עלולים להיפגע ולא יועילו להדמיה תוך חיונית. הצנתר חייב להיות קבוע היטב להזרקת נוגדנים; אחרת, החלקה של צנתר וריד הזנב עלולה לגרום לאקסטרווזציה של הנוגדנים לחלל הפריווסקולרי של הזנב, מה שהופך את ההחלפה והתיקון הנוסף להזרקת הנוגדנים למשימה מאתגרת. זיהוי נכון של העורק הקולטרלי והווריד הקולטרלי במהלך מיקרוסקופ תוך חיוני מהווה שלב קריטי נוסף בפרוטוקול זה.
בהתחשב בכך שהעכבר אינו מאוורר מכנית במהלך מיקרוסקופיה תוך חיונית, זמן ההדמיה הדינמי מוגבל כדי למנוע פגיעה פיזית בעכבר כתוצאה מהרדמה ארוכה מדי. אחד החסרונות של מיקרוסקופ תוך חיוני הוא התנועה הפיזיולוגית של העכבר, הנוצרת על ידי נשימה, פעימות לב ותנועות פריסטלטיות, שיכולה להשפיע על רכישת התמונה ולכן, על איכות ניתוח הנתונים. שיפור מחזיקי רקמות, הרכבה וקיבוע הם צעדים המפחיתים עוד יותר את השפעות התנועה. בנוסף לתנועה הפיזיולוגית, הדמיה ארוכת טווח עשויה לתרום להיסחפות רקמות במהלך ההדמיה. כפי שמתואר בפרוטוקול זה, תוכנה לתיקון סחף רקמות בזמן אמת, VivoFollow, שימשה להשגת נתוני הדמיה המתאימים למעקב אחר תאים וניתוח מהירות התא. תוכנת VivoFollow זו מתקנת את תזוזת הדגימה ב- x, y ו- z ישירות במהלך רכישת תמונה. הוא מסתמך על מבנה אנטומי לא נייד, למשל, כאשר כלי הדם הם דמיינו עם עקבות כלי הדם המשמשים ציוני דרך התייחסות עבור הליך התיקון.
למרות שישנם כלים אחרים לתיקון סחף לאחר הרכישה, כגון אלה בתוך Bitplane Imaris או תוספים עבור ImageJ, הם מוגבלים מאוד ביכולת התיקון שלהם מכיוון שהם אינם מאפשרים שחזור של אזור העניין. באופן עקרוני, הם אינם יכולים לתקן קיזוז חמור כאשר אזור העניין יוצא משדה הראייה. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם כאשר תיקון סחף חי אינו זמין, ותיקון לאחר רכישה הופך להיות הכרחי. עם זאת, זה דורש הכשרה תכופה של כוח אדם הרכבה רקמות וקיבוע. לסיכום, מיקרוסקופיה תוך-חיונית של מולטיפוטונים היא שיטה דינמית שימושית שניתן ליישם במקביל לשיטות סטטיות מבוססות כגון ניתוחים היסטולוגיים (חיסוניים) כדי לקבל תמונה מפורטת יותר של המרכיבים הדינמיים של גיוס לויקוציטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.
Acknowledgments
המחקר מומן על ידי Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, פרויקט Z01). אנו מודים לד"ר סוזן שטוט על קריאת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (7-0) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- World Health Organization. The top 10 causes of death. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020).
- Deindl, E., Schaper, W.
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
- Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
