Summary
Rekrutteringen av leukocytter og blodplater utgjør en viktig komponent som er nødvendig for effektiv vekst av sikkerhetsarterier under arteriogenese. Multifotonmikroskopi er et effektivt verktøy for sporing av celledynamikk med høy spatio-temporal oppløsning in vivo og mindre fototoksisitet for å studere leukocyttrekruttering og ekstravasasjon under arteriogenese.
Abstract
Arteriogenese er sterkt avhengig av leukocytt- og blodplaterekruttering til det perivaskulære rommet av voksende sikkerhetsfartøy. Standard tilnærming for analyse av kollaterale arterier og leukocytter i arteriogenese er ex vivo (immun-) histologisk metodikk. Denne teknikken tillater imidlertid ikke måling av dynamiske prosesser som blodstrøm, skjærspenning, celle-celle-interaksjoner og partikkelhastighet. Dette papiret presenterer en protokoll for å overvåke in vivo-prosesser i voksende sikkerhetsarterier under arteriogenese ved bruk av intravital bildebehandling. Metoden beskrevet her er et pålitelig verktøy for dynamisk måling og tilbyr en høykontrastanalyse med minimal fotocytotoksisitet, levert ved multifotoneksitasjonsmikroskopi. Før analyse av voksende kollaterale arterier ble arteriogenese indusert i adduktormuskelen hos mus ved ensidig ligering av lårarterien.
Etter ligeringen begynte de eksisterende sikkerhetsarteriene å vokse på grunn av økt skjærspenning. Tjuefire timer etter operasjonen ble huden og subkutant fett over kollaterale arterier fjernet, og konstruerte en lomme for videre analyser. For å visualisere blodstrøm og immunceller under in vivo-avbildning, ble CD41-fluoresceinisotiocyanat (FITC) (blodplater) og CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytter) antistoffer injisert intravenøst (i.v.) via et kateter plassert i halevenen til en mus. Denne artikkelen introduserer intravital multifotonavbildning som et alternativ eller in vivo komplement til de vanlige statiske ex vivo (immun-) histologiske analysene for å studere prosesser som er relevante for arteriogenese. Oppsummert beskriver dette papiret en ny og dynamisk in vivo-metode for å undersøke immuncellehandel, blodstrøm og skjærspenning i en bakkroppsmodell av arteriogenese, noe som forbedrer evalueringsmulighetene spesielt.
Introduction
Til tross for intensiv forskningsinteresse de siste årene, er kardiovaskulære sykdommer, for eksempel iskemisk hjertesykdom og hjerneslag, fortsatt den ledende globale dødsårsaken1. Nåværende behandlinger for disse sykdommene er svært invasive terapier som perkutan transluminal angioplastikk, perkutan transluminal koronar angioplastikk eller bypassoperasjon2. Derfor er det et presserende behov for utvikling av alternative, ikke-invasive terapeutiske alternativer. Kroppen kan skape naturlige bypass rundt et stenosert eller okkludert kar for å omdirigere den avbrutte blodstrømmen til den distale delen av stenose. Denne prosessen kalles arteriogenese2. Mange nyere studier har vist at økt væskeskjær påvirker leukocyttrekruttering, som spiller en viktig rolle under arteriogenese3. De viktigste nåværende alternativene for å analysere rekrutteringen av leukocytter under arteriogenese er ex vivo (immun-) histologiske analyser eller fluorescensaktivert cellesortering (FACS) metodikk4. For å muliggjøre vurdering av leukocyttdynamikk under arteriogenese, presenterer denne artikkelen en intravital avbildningsprotokoll med multifotonmikroskopi.
Leukocytter er de viktigste blodcellene som rekrutteres under prosessen med arteriogenese3. Denne protokollen bruker multifotonavbildning for å vise gjennomgang av adherente leukocytter merket med injiserte anti-CD45-PE-antistoffer i kollaterale arterier, 24 timer etter induksjon av arteriogenese ved femoral arterieligering (FAL) ved bruk av en murine baklemmeiskemi modell 5,6. Alternativt kan immunceller merkes ex vivo og injiseres forsiktig i mus, som vist i studier på angiogenese ved bruk av intravital mikroskopi7. Blodstrømmen i kar og arterier kan visualiseres av CD41-FITC (for å merke blodplater), dextran-FITC (plasma), eller ved den andre harmoniske generasjonen (SHG), som visualiserer kollagen type 1 tilstede i kjellermembranen til en del av det vaskulære treet. SHG er en unik gratis merkingseffekt av multifotoneksitasjonen. Multifotonavbildning tillater langsiktig cellesporing uten å skade vevet og aktivere cellene ved laserkrafteksitasjon. Multifotonmikroskopi er den valgte avbildningsmetoden for visualisering av fluorescerende merkede celler og strukturer i levende dyr på grunn av sin evne til å opphisse fluoroforene dypere inn i vevet / organene med minimal fototoksisitet8.
Bruken av innstilte infrarøde lasere med pulser levert innen femtosekundintervaller eksiterer fluorokromet bare ved fokalplanet, uten eksitasjon over og under fokalplanet8. Dermed tillater multifotonmikroskopi høy spatio-temporal oppløsning, mindre fotoskade og økt vevpenetrasjonsavbildning for å studere dynamiske biologiske hendelser inne i organene. Det er et ideelt mikroskopiverktøy for levende dyravbildning. Imidlertid er multifoton og annen kunst av intravital mikroskopi begrenset av vevsbevegelse på grunn av hjerteslag, respirasjon, peristaltiske bevegelser, muskeltonalitet og andre fysiologiske funksjoner, noe som forstyrrer bildeoppkjøp og analyse. Siden disse bevegelsene svekker tidsmessig og romlig oppløsning og noen ganger til og med forbyr etterfølgende analyse, må de adresseres på riktig måte for å muliggjøre nøyaktig dataanalyse og tolkning. Flere strategier har blitt utviklet for å senke eller forhindre gjenstander fra vevsbevegelse. Denne protokollen bruker en in situ drift korreksjon programvare kalt VivoFollow9 for å korrigere vev drift under bildeopptak. Denne tilnærmingen gir den nødvendige bildestabiliseringen, noe som muliggjør langsiktig bildebehandling og cellesporingsanalyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av den bayerske dyrepleie- og brukskomiteen (godkjent av etisk kode: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); Disse forsøkene ble utført i strengt samsvar med den tyske dyrelovgivningens retningslinjer.
1. Dyr og lårarterieligering (FAL)
MERK: For å indusere steril betennelse og arteriogenese ble 8-10 uker gamle mannlige C57BL/6J-mus brukt. Ingen av musene døde eller led av sårinfeksjon eller sårhelingsforstyrrelser under henholdsvis FAL eller skamoperasjon.
- Anestesi
MERK: Før injeksjon av MMF-blandingsanestesi, anbefales det å først bedøve med 5% isofluran til musen sover.- Vei musen og klargjør MMF bland med en dose midazolam 5,0 mg/kg, medetomidin 0,5 mg/kg og fentanyl 0,05 mg/kg.
- Fyll en 1 ml sprøyte med MMF-mix og injiser et endelig volum på 100 μL s.c. med en 30 G kanyle (etter anestesi med 5 % isofluran).
- Plasser musen på en varm pute og vent til musen er fullstendig bedøvet. Sett timeren til 35 min. Etter denne tiden, injiser s.c. halvparten av dosen (50 μL) av MMF-blandingen.
- Sjekk dybden av anestesi ved å teste pedalen og interdigitale reflekser (ved fast tåklemme) på musen.
MERK: Fravær av respons indikerer en tilstrekkelig dybde av analgesi.
- Lårarterieligering (FAL)
MERK: Bruk sterile kirurgiske instrumenter og suturer. Desinfiser huden med desinfeksjonsmiddel før åpning og etter lukking.- Plasser den bedøvede musen på en varmeplate (35-37 °C) for å opprettholde fysiologisk kroppstemperatur. Påfør øyekrem (dexpanthenol) på hvert øye for å forhindre tørking av øynene under anestesi.
- Overfør den bedøvede musen til et laserdopplerbildekammer (LDI) før og etter FAL for å kontrollere blodstrøm og perfusjon (figur 1A-C).
- Fjern hår, desinfiser huden og kutt for å få tilgang til lårarterien. Under et kirurgisk mikroskop, ligere høyre lårarterie i musebakbenet ved hjelp av en flettet silkesutur (7-0) og utfør en narreoperasjon på venstre lårarterie for å tjene som en internkontroll som tidligere beskrevet6 (figur 1D-K).
MERK: Snittet i huden ble gjort med liten saks for å unngå direkte skade på blodårene nær huden. - Lukk huden med en flettet silkessutur (6-0). Administrer buprenorfin (0,1 mg/kg) s.c. hver 12. time, starter 10 minutter før anestesien motvirker for smertelindring. Observer dyret for signaler om smerte, dvs. redusert pleieaktivitet, motvilje mot å bevege seg eller bøyd holdning i 24 timer etter operasjonen.
- Injiser en kombinasjon av nalokson (1,2 mg/kg), flumazenil (0,5 mg/kg) og atipamezol (2,5 mg/kg) for å motvirke anestesien etter avsluttet FAL og lukking av huden.
- Etter operasjonen, hold musen på den varme puten og overvåk dyret kontinuerlig til det kan opprettholde en oppreist holdning og begynne å gå normalt rundt buret.
- Når musen er helt våken, plasser den tilbake i buret sammen med de andre musene og returner buret til dyrerommet.
2. Vevsforberedelse for multifoton intravital avbildning
- Hale vene injeksjon
MERK: Dyret må være under anestesi før du starter forberedelsene til intravital avbildning. Før du innfører nålen til venekateteret, anbefales det å bruke et desinfeksjonsmiddel på halen. Dette vil også bidra til å visualisere fartøyene.- Klargjør et injeksjonskatetre i halevenen ved hjelp av en 2 x 30 G nål, 10 cm av en polyetenrør med fin boring (0,28 mm indre diameter og 0,61 mm ytre diameter), en 1 ml sprøyte og et histoakryllim for å feste kateteret på musehalen for ytterligere intravenøse injeksjoner under avbildning (figur 2A, B og figur 2F).
- Klargjør antistoffoppløsningen for intravenøs injeksjon: CD45-PE og CD41-FITC (20 μg/mus) ved et endelig volum på 100 μL.
- Kontroller halen for de lateralt plasserte haleårene og demm venen for å identifisere halvenen. Desinfiser halen, sett inn venekateteret og fest det med vevshistoakryllim (figur 2B).
- Injiser antistoffene før avbildning (minst 15 minutter før) og etter avsluttet vevspreparat.
- Vev forberedelse
MERK: Bruk alltid en varm pute og administrer en dråpe øyekrem (dexpanthenol) i hvert øye før vevspreparering. Bruk sterile kirurgiske instrumenter og suturer. Desinfiser huden med desinfeksjonsmiddel før åpning og etter lukking.- Plasser den bedøvede musen på en stabil og bærbar pute. Fest musen i liggende stilling med en 4-punkts fiksering på puten ved hjelp av tape (figur 2B).
- Støp to stykker modelleringsleire og plasser bitene under musens øvre baklem for å sikre en planposisjon av adduktormuskelen (figur 2B, indikert med røde piler).
- For å sikre en stabil kroppstemperatur på 37 °C på musen, plasser puten med musen på en varmeplate under et kirurgisk mikroskop med en zoom på 0,64-4,0 ganger (figur 1L).
- Fjern håret fra begge bena, desinfiser huden og klipp huden i en sirkel rundt arret etter den tidligere lårarterieligeringen av høyre baklem (figur 1M).
- Fjern hud- og fettlaget fra toppen av benet (figur 1N,O), og trekk til side den gjenværende huden ved hjelp av suturer for å lage en lomme rundt adduktormuskelen (figur 1P,Q).
- Fjern subkutant fett for å få et klart syn på adduktormuskelen og den dype arterien / venen samt sikkerhetskarene (figur 1Q, R).
- Begynn forsiktig å fjerne det overfladiske muskellaget på toppen av sikkerhetskarene ved å dissekere det forsiktig med fine tang (figur 1R).
MERK: Arteria collateral og vena collateral er godt synlige og klare for avbildning (figur 1S). - Fyll den forberedte lommen med saltvann for å unngå tørking av vevet og fortsett med samme prosedyre for den narre-opererte venstre bakre lem. Før avbildning, tilsett ultralydgel i begge lommer, som forhindrer tørking og fungerer som et nedsenkningsmedium for optisk kobling med målet (figur 2C og figur 2F).
3. Intravital multifotonmikroskopi
- Forberedelse
MERK: Hold en sprøyte med ultralydgel inne i mikroskopets inkubatorkammer for å opprettholde en varm temperatur for påfylling av lommene under langvarig avbildning.- Fjern saltvannet fra de to forberedte lommene og erstatt det med ultralydgel for å dekke sikkerhetskarene (figur 2C).
- Injiser antistoffoppløsningen gjennom halevenekateteret. 15 minutter etter antistoffinjeksjon, overfør puten med den faste musen inn i det oppvarmede multifotonavbildningskammeret (figur 2F).
- Etter ferdigstillelse av bildeoppkjøpet, avlive musen ved cervikal dislokasjon under dyp narkose.
- Multifoton mikroskopi bildeopptak
MERK: Slå på mikroskopet 30 minutter før avbildning for å tillate laserstabilisering. For den beste optiske stabiliteten til mikroskopet anbefales det å holde mikroskopkammeret permanent oppvarmet.- Slå på nøkkelen til Ti:Safir-laserboksen, de elektroniske grensesnittboksene, varmeenheten til inkubasjonskammeret, lysrøret og datamaskinen (figur 2D,E).
- Start anskaffelsesprogramvaren (Inspector software). Sett bølgelengden til 800 nm og åpne mikrosklukkeren (figur 3A ii).
- I dialogboksen Måleveiviser velger du Instrumentmodus (enkeltstråle) og i målemodus (tidsforløp for 3D-skanning) (figur 3A i).
- Overfør den bedøvede musen inn i mikroskopets forvarmede inkubasjonskammer. Plasser området med ultralydgelen (trinn 2.2.8) direkte i kontakt med den objektive frontlinsen (figur 2F).
- Åpne epifluorescensmikroskoplukkeren, velg en tilstrekkelig filter / dikroisk innstilling for FITC-visualisering (4) for å finne interesseområdet ved å følge blodstrømmen under epifluorescensbelysning. Etter å ha brakt interesseområdet inn i midtfeltet, lukker du epifluorescensmikroskoplukkeren.
- I dialogboksen xy-skanner angir du følgende parametere: Bildestørrelse (554 x 554), Bildepunkt (512 x 512), Frekvens (400), Linjegjennomsnitt (1) (figur 3A iii). Juster lasereffekten (5 %) (figur 3A iv), og still inn fotomultiplikatorforsterkningen (PMT) for kanalene grønn (66), rød (66) og blå (63) (figur 3A v).
- Velg et tilstrekkelig mål for intravital avbildning og drift korreksjon innstillinger (se detaljer i 3.2.11).
MERK: Her var det valgte målet Nikon LWD 16x (figur 3A vi). - Definer bildestakkområdet ved å starte modus for forhåndsanskaffelse ved å trykke på den røde knappen øverst til høyre i vinduet i måleveiviseren (figur 3A i).
- Definer området og strukturen av interesse ved å fokusere for å få et godt bilde. Deretter, mens du observerer skjermen, endre fokus ved å flytte objektivet opp til bildet forsvinner, og sett det som null (første = 0). Endre fokus i motsatt retning ved å flytte objektivet nedover til bildet forsvinner fra skjermen igjen, og angi det som siste posisjon (end= 40 μm) i aksial retning (figur 3A vii).
- Sett trinnstørrelsen til 2 μm. Klikk på den røde knappen øverst til høyre i dialogboksen Måleveiviser for å stoppe skanningen av forhåndsvisningen.
MERK: Antall bilder beregnes og angis automatisk (21 bilder), som angitt i figur 3A vii. - Hvis mikroskopet er utstyrt med live-drift-korreksjon9, starter du avdriftkorreksjonsprogramvaren (f.eks. VivoFollow) og følger trinnene som er beskrevet nedenfor.
- I dialogboksen Måleveiviser velger du Python-aksen (Python-aksen) (figur 3A viii) som den første akseenheten. IKKE aktiver automatisk lagringsmodus. Merk av for automatisk lagring (AS) bare på tidsaksen (Tid). Trykk på Python-ikonet i vinduet Tilgjengelige enheter (figur 3A ix) for å åpne vinduet for dialogboksen Python.
- I Python-dialogboksen Akseinnstillinger skriver du inn Fra (0 null) og Til (-40). Angi antall trinn (21) som angitt i figur 3A x.
- Gå til xyz trinn Z-dialogvinduet og forstørr skanneområdet med 200 μm i begge ender: i Start, skriv inn (200 μm) og i Slutt, skriv inn (-240 μm), blir området automatisk satt (-440 μm). Behold trinnstørrelsen (2 μm) som vist i figur 3A xi.
- Åpne dialogboksen VivoFollow-frontend og klikk på Bevegelsesprofil-boksen (figur 3A xii).
- Start bildeopptaket ved å trykke på det grønne pilhodet øverst til venstre i dialogboksen Måleveiviser i inspektørprogramvaren (figur 3A i).
- Hvis live-drift-korreksjon brukes, ser du etter en dialogboks for at konfigurasjonen for avdriftkorreksjon vises som vist i figur 3A xiii. Angi innsamlingskanalen som skal brukes som en immobil landemerkereferanse (for denne protokollen velger du kanal 2, der det vaskulære sporingssignalet skal registreres). Skriv inn den maksimale korreksjonsforskyvningen i μm som ble lagt til den første og siste z-posisjonen (her 200 μm), og klikk OK.
- Overvåk gjeldende avdriftforskyvning i x, y og z i sanntid under bildeopptaket i VivoFollow-frontdialogvinduet Figur 3A xiv.
- Stopp bildeoppkjøpet etter ~ 35 min når en annen syklus med anestesi re-injeksjon er nødvendig. Injiser en halv dose av MMF-blandingen (50 μl s.c) og start bildeopptaket på nytt ved å trykke på den grønne pilspissen igjen (trinn 3.2.11.5).
- Gjenta denne fremgangsmåten til eksperimentet er fullført.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multifotonmikroskopi gir en høy spatio-temporal oppløsning for leukocyttsporing, hvor cellemigrasjonstrinn og hastighet kan spores og overvåkes (figur 4A, B). Prøvens fysiologiske bevegelse er imidlertid en utfordring, spesielt ved langvarige intravitale mikroskopibilder. Derfor er det nødvendig med et godt vevspreparat og holdere for å fikse vevet og verktøyene, for eksempel sanntids bildekorreksjon for vevsdrift, for vellykket og stabil bildebehandling. Her ble et live-drift-verktøy, VivoFollow, brukt til å korrigere for vevsdriften som ble generert under langsiktig bildeinnsamling.
Anvendelsen av dette verktøyet tillater langsiktig bildeoppkjøp og muliggjør innsamling av data av høy kvalitet, egnet for sporing av celler for hastighetsmålinger. Som vist i figur 3B, uten driftkorreksjon, driver interesseområdet gradvis bort fra opptaksvisningen, noe som påvirker muligheten til å spore celler for hastighetsanalyse. Imidlertid, som vist i figur 3C, med driftkorreksjonsprogramvaren, kan stabile filmer spilles inn, og flere celler kan spores over en lang periode. Programvaren for avdriftkorreksjon kan også gi en visualisering av x-, y- og z-forskyvningene over tid som systemet korrigerte for, som vist i figur 3D.
Figur 1: Laserdoppleravbildningsoppsett og forberedelse til ligering av lårarterien og vevspreparering for intravital avbildning. (A) LDI bildeoppsett. (B) Musen er plassert inne i LDI oppvarmingskammer for bildeopptak. (C) LDI-bilder av høyre og venstre ben før (øvre panel) og etter FAL (nedre panel) for å kontrollere bakbenets perfusjon etter ligering. Høyre lårarterie var ligert/okkludert, mens venstre lårarterie var narreoperert (Shumbug) og fungerte som internkontroll. I fargelinjen indikerer blått lav blodperfusjon, og rødt indikerer høyere perfusjon. (VG Nett) Bilder representerer operasjonstrinnene i lårarteriell ligering. Skalastang = 10 mm. (L-S) Vevspreparat for intravital avbildning etter FAL. Området som skal avbildes er indikert med den svarte sirkelen, der sikkerhetsfartøyene befinner seg. Skala bar = 5 mm. Forkortelser: LDI = Laser Doppler imaging; FAL = lårarterieligering; Okklusjon = okklusjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oppsett for multifoton intravital avbildning. (A) Venekateterpreparasjon; 1-Fin polyetylenslange på 10 cm, 2: 2x 30 G nål; 3: montert kateter koblet til 1 ml sprøyte; 4: vev histoacryl lim; 5: Kanyleholder. (B) Musen plassert i liggende stilling med begge baklemmene plassert på biter av svart modelleringsleire (røde piler) forberedt for avbildning. (C) Okkludert (Occ) høyre baklem og venstre, humbug-operert baklem klar for avbildning. (D) Multifotonmikroskopoppsett som viser laserbokser, fluorescenslampeboks, rør for oppvarming av inkubatorkammeret. (E) Inkubatorkammer i multifotonmikroskopet. (F) Mus plassert inne i mikroskopkammeret med 16x-objektivet som berører vevet dekket med ultralydgel. Detalj som viser venekateteret festet på halevenen for antistoffinjeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Konfigurering av programvare for driftkorrigering av VivoFollow. (A) (i-xiv) trinn for programvareoppsett som beskrevet i protokolltrinn 3.2.2-3.2.11.9. (B) Representative tidsseriebilder som viser avbildningen som driver uten programvare for drivkorreksjon slått på. Arteria kollateral er avgrenset av de hvite utgåtte linjene (Video 1 og Video 2). (C) Representative tidsseriebilder som viser den stabile tidsserien når korreksjonen av levende drift påføres under bildeinnsamlingen. Leukocytter ble merket med CD45-PE antistoffer (rød), blodplater ble merket med CD41-FITC antistoffer (grønn) og kollagen type 1 med SGH (blå). Arteria collateral er avgrenset av de hvite utgåtte linjene. (D) Linjediagram som viser direkte korreksjon langs x-, y- og z-retninger. Forkortelser: PE = phycoerythrin; FITC = fluoresceinisotiocyanat; SGH = andre harmoniske generasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater . (A) Leukocytthastigheter målt i kollaterale arterier av sham-opererte (Sham) og femorale arterie-ligerte baklemmer. (B) Representative bilder viser cellene sporet (magenta) med sporene fargekodet. Fargekodelinjen representerer cellehastigheten med de langsommere cellene vist av blå spor og raskere celler med røde spor. Leukocytter ble merket med injiserte CD45-PE-antistoffer (rød), blodplater ble merket med injiserte CD41-FITC-antistoffer (grønn), og kollagen type 1 med SGH (blå). Resultater fra tre individuelle eksperimenter. Skala bar = 20 μm. Se Video 3 og Video 4. Forkortelser: Occ= okkludert/femoralarterieligert; PE = phycoerythrin; FITC = fluoresceinisotiocyanat; SGH = andre harmoniske generasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Multifoton intravital avbildning av en kollateral arterie uten driftkorreksjon. Firedimensjonale bilder ble tatt med en pikselstørrelse på 554 x 554 μm, frekvens 600 Hz, et intervall på 1100 ms / ramme, trinnstørrelse på 2 μm og rekkevidde på 40 μm. Videoen viser bildet drivende uten bruk av VivoFollow drift korreksjon programvare. Sikkerhetsarterien vises i den nedre delen av videoen, og sikkerhetsvenen vises etter 3 minutter i den øvre delen av filmen. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Multifoton intravital avbildning av en a. collateral med anvendt driftkorreksjon. Firedimensjonale bilder ble tatt med en pikselstørrelse på 554 x 554 μm, frekvens 600 Hz, et intervall på 1100 ms / ramme, trinnstørrelse på 2 μm og rekkevidde på 40 μm. Videoen ble tatt opp med programvaren for korrigering av direktedrift, VivoFollow, og viser bildestabiliteten som fremmes ved å bruke programvaren for driftkorreksjon. Skala bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3: Cellesporende avbildning i en sikkerhetsarterie etter svindeloperasjon. Leukocytter merket med injiserte anti-CD45-PE-antistoffer ble avbildet i en hvilende sikkerhetsarterie i det skamopererte benet og sporet ved hjelp av Imaris-programvare med plugin for sporingsceller. Sporede celler ble valgt og representert av de magenta prikkene. Sporene ble fargekodet i henhold til cellehastigheten. Langsommere celler er representert av blå spor og raskere celler av røde spor. Skala bar = 50 μm. Forkortelse = PE = phycoerythrin. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 4: Cellesporende avbildning i en sikkerhetsarterie etter FAL. Leukocytter merket med anti-CD45-PE antistoffer ble avbildet i en voksende kollateral arterie 24 timer etter induksjon av arteriogenese av FAL og spores ved hjelp av Imaris programvare med plugin for sporing av celler. Sporede celler ble valgt og representert av de magenta prikkene. Sporene ble fargekodet i henhold til cellehastigheten. Langsommere celler er representert av blå spor og raskere celler av røde spor. Skala bar = 50 μm. Forkortelser: FAL = femoral arterie ligering; PE = phycoerythrin. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.
| Tekniske problemer | Forslag til løsninger | |
| I tilfelle halekarene ikke er synlige for innføring av kateteret | • Bruk en varm komprimering rundt musehalen i 3-5 minutter for å fremme lokal vasodilatasjon. Det vil bidra til å gjøre venen synlig. | |
| I tilfelle halekateteret ikke kan fikseres for antistoffinjeksjon | Bruk en 1 ml sprøyte med 30 G kanyle til å føres inn i blodåren og injisere antistoffene og fargestoffene direkte før avbildning. | |
| I noen tilfeller (avhengig av antistoffene) kan injeksjonen påføres i.p. 1 time før avbildning. | ||
| Når bevegelsen av vev hindrer bildestabilitet | • Prøv å re-posisjonere og re-fix musen øvre hint ben for å unngå fysiologiske abdominal bevegelser. | |
| • Kontroller om mikroskopbordet har nok luft til å avbryte vibrasjoner. | ||
| • Pass på at musen er i dyp anestesi og ikke våkner. | ||
| • Overvåk musens pust. Når musen puster for fort, kan det ha innvirkning på bildebevegelsen. | ||
| Når bildekvaliteten begynner å synke | • Forsikre deg om at ultralydgelen ikke tørker ut. | |
| • Fyll ultralydgelen på nytt. | ||
| • Forsikre deg om at målet er rent (rengjør den tørkede ultralydgelen på målet når en ny påfylling er ferdig). | ||
| Når arteriene er skadet under forberedelse til avbildning | • I dette tilfellet vil det ikke være mulig å skaffe bilder. Det er ikke mulig å kjøre eksperimentet. | |
Tabell 1: Feilsøking.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrevne metoden for multifoton in vivo-analyse av leukocyttrekruttering representerer et tillegg til vanlige verktøy for leukocyttrekrutteringsstudier som (immun-) histologiske eller FACS-analyser. Med denne avbildningsmetoden er det mulig å visualisere i større detalj de dynamiske prosessene i leukocyttadherens og ekstravasasjon under arteriogenese10. Til tross for merverdien av denne metoden, inneholder den tilbudte protokollen noen kritiske trinn og begrensninger. Se tabell 1 for flere feilsøkingstips. Under fjerning av det overfladiske muskellaget på sikkerhetsarterier, kan disse arteriene bli skadet og vil ikke være nyttige for intravital avbildning. Kateteret må være godt fiksert for antistoffinjeksjon; Ellers kan glidning av halevenekateteret føre til ekstravasasjon av antistoffene inn i halens perivaskulære rom, noe som gjør erstatning og ytterligere korreksjon for injeksjon av antistoffene til en utfordrende oppgave. Korrekt identifisering av sikkerhetsarterien og sikkerhetsvenen under intravital mikroskopi representerer et annet kritisk trinn i denne protokollen.
Gitt at musen ikke er mekanisk ventilert under intravital mikroskopi, er den dynamiske avbildningstiden begrenset for å unngå fysisk skade på musen som følge av overdreven lang anestesi. En av manglene ved intravital mikroskopi er musens fysiologiske bevegelse, generert av respirasjon, hjerteslag og peristaltiske bevegelser, som kan påvirke bildeinnsamling og dermed kvaliteten på dataanalyser. Forbedring av vevsholdere, montering og fiksering er trinn som ytterligere reduserer effekten av bevegelse. I tillegg til den fysiologiske bevegelsen kan langsiktig avbildning bidra til vevsdrift under avbildning. Som beskrevet i denne protokollen, ble en sanntids programvare for vevsdriftkorreksjon, VivoFollow, ansatt for å skaffe bildedata egnet for påfølgende cellesporing og cellehastighetsanalyse. Denne VivoFollow-programvaren korrigerer for prøveforskyvningen i x, y og z direkte under bildeopptak. Den er avhengig av immobil anatomisk struktur, for eksempel når fartøy visualiseres med vaskulære sporstoffer som tjener som referanselandemerker for korreksjonsprosedyren.
Selv om det finnes andre etteranskaffelseskorreksjonsverktøy tilgjengelig, for eksempel de i Bitplane Imaris eller plugins for ImageJ, er de svært begrenset i sin evne til korreksjon, da de ikke tillater gjenoppretting av interesseområdet. I prinsippet kan de ikke korrigere for alvorlige forskyvninger når interesseområdet beveger seg ut av synsfeltet. Denne protokollen kan imidlertid brukes selv når live-drift-korreksjonen ikke er tilgjengelig, og korreksjon etter anskaffelse blir nødvendig. Dette krever imidlertid hyppig opplæring av personell i vevsmontering og fiksering. Avslutningsvis er multifoton intravital mikroskopi en nyttig dynamisk metode som kan brukes parallelt med statiske etablerte metoder som (immun-) histologiske analyser for å få et mer detaljert bilde av de dynamiske komponentene i leukocyttrekruttering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Studien ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, prosjekt Z01). Vi takker Dr. Susanne Stutte for å ha lest manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (7-0) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- World Health Organization. The top 10 causes of death. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020).
- Deindl, E., Schaper, W.
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
- Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
