Summary
この方法論の記事では、マウス骨関節炎性膝関節および正常な膝関節における組織学的軟骨下骨厚さを対照として定量化するためのソフトウェア支援定量測定プロトコルを提示する。このプロトコルは、微妙な肥厚に対して非常に敏感であり、早期の骨関節炎性軟骨下骨変化を検出するのに適している。
Abstract
軟骨下骨肥厚および硬化症は、変形性関節症(OA)の主要な特徴であり、動物モデルおよびヒトの両方において存在する。現在、組織学的軟骨下骨肥厚の重症度は、ほとんどが視覚的推定ベースの半定量的グレーディングシステムによって決定される。この記事では、内側メニスカス(DMM)の不安定化によって誘発される膝OAのマウスモデルにおいて、軟骨下骨の厚さを定量的に測定するための再現可能で容易に実行されるプロトコルを提示する。このプロトコルは、DMM誘発性膝OAにおいて軟骨下骨肥厚が通常起こる内側大腿骨顆および医療用脛骨高原の関心領域を定義した後、組織学的画像上の軟骨下骨厚さを定量化するためにImageJソフトウェアを利用した。偽の手順を伴う膝関節からの組織学的画像を対照として使用した。統計分析の結果、新たに開発された定量的軟骨下骨測定システムは、観察者内および観察者間の変動が低く、再現性が高いことが示されました。この結果は、この新しいプロトコルが、広く使用されている視覚的グレーディングシステムよりも微妙または軽度の軟骨下骨肥厚に対してより敏感であることを示唆している。このプロトコルは、早期および進行する骨関節炎性軟骨下骨変化の両方を検出し、OA軟骨グレーディングと協調してOA治療の インビボ 有効性を評価するのに適しています。
Introduction
変形性関節症(OA)は、関節軟骨、骨棘、および軟骨下骨(SCB)硬化症の喪失による関節空間狭窄によってX線写真的に特徴付けられ、関節炎の最も一般的な形態である1,2。OAの病因における関節周囲骨の役割は完全には理解されていないが、骨棘形成およびSCB硬化症は、原因因子ではなく疾患プロセスの結果であると一般に考えられているが、関節周囲骨の構造/形状および生物学の変化がOAの発達および進行に寄与する可能性がある3,4.SCB測定を含む正確で容易に実行されるOAグレーディングシステムの開発は、研究所間の比較研究や、OAの進行を予防または減弱するように設計された治療薬の有効性を評価する上で重要です。
SCBは、薄いドーム状の骨板と骨梁骨の下層で構築されています。SCBプレートは皮質層状であり、石灰化した軟骨に平行に、そしてそのすぐ下に横たわっている。動脈および静脈血管の小さな枝、ならびに神経は、SCBプレートのチャネルを貫通し、石灰化した軟骨と線維柱帯骨との間を連通する。軟骨下骨骨は、血管、感覚神経、骨髄を含み、SCBプレートよりも多孔性で代謝的に活性である。したがって、SCBは衝撃吸収および支持機能を発揮し、正常な関節における軟骨栄養供給および代謝にとっても重要である5,6,7,8。
SCB肥厚(組織学における)および硬化症(X線撮影における)は、OAの主要な特徴であり、OA病態生理学の主要な研究分野である。SCB肥厚の測定は、OA重症度の組織学的評価の重要な要素である。OA10,11,12,13のげっ歯類モデルにおける齧歯類SCBミネラル密度を測定するための以前に報告されたデジタルマイクロラジオグラフィー9およびマイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)ベースの定量的SCB測定は、SCB構造およびOA病態生理学におけるSCB変化の役割についての理解を深めました。SCBの面積と厚さは、特異的で高価な骨組織形態測定ソフトウェアを備えた洗練されたコンピュータシステムを使用して、組織学的スライドでも定量化されています14。それにもかかわらず、SCB増粘グレーディングを含む視覚的推定ベースの半定量的OAグレーディングシステムは、グレーディングシステムが使いやすく、特に多数の組織学的画像をスクリーニングするために、現時点ではマイクロCTよりも広く使用されている。しかし、既存のOAグレーディングシステムのほとんどは、主に軟骨の変化に焦点を当てています15,16,17。SCBの肥厚を軽度、中等度、重症に分類する広く使用されている骨関節炎性SCB厚さグレーディング方法は、主に主観的であり、その信頼性は完全には検証されていません15。信頼性が高く、ステップバイステップで簡単に実行できる骨関節炎SCB厚さ測定プロトコルは、完全に開発されていないか、標準化されていません。
この研究は、OAのマウスモデルにおけるSCBの厚さを定量的に測定するための再現性があり、高感度で、容易に実行できるプロトコルを開発することを目的としていた。当社の厳格な測定テストと統計分析により、このImageJソフトウェア支援定量測定プロトコルが正常および骨関節炎性膝関節の両方のSCB厚さを定量化できることが実証されました。新しく開発されたプロトコルは再現性があり、広く使用されているビジュアルグレーディングシステムよりも軽度のSCB変化に対してより敏感です。これは、早期の骨関節炎性SCB変化を検出し、OA軟骨グレーディングと協調してOA治療の インビボ 有効性を評価するために使用することができる。
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Protocol
このプロトコルに含まれるすべての動物処置は、カンザス大学医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって、すべての連邦および州の法律および規制に準拠して承認されました。
1. マウスにおける膝OAの作成
- Glasson et al.18によって10〜11 週齢の22匹の野生型BALB/cマウスにおいて記載されているように、内側半月板(DMM)の外科的不安定化によって膝OAのマウスモデルを作成した。同じ背景と年齢の8匹のマウスに対照手順として偽の手術を行います。
注:両方の性別は、生物学的変数としての性別の考慮に関するNIHの要件を満たすために元のプロジェクトで使用されましたが、性差の調査はこのプロトコルの範囲ではありません。 - イソフルランの吸入によって動物を麻酔する。呼吸数/努力とつま先/尾のピンチに対する反応の欠如を監視することによって、麻酔の深さを確認してください。動物を仰臥位に置きます。
- 膝の領域の皮膚を剃り、ポビドン - ヨウ素+アルコール皮膚スクラブで皮膚をきれいにする。3つの交互のサイクル。
- 手術用顕微鏡下で右膝にDMM処置を行う。内側の副膝蓋骨切開部(長さ1.2〜1.5cm)を通して膝関節を露出させ、関節嚢を切開する。膝蓋骨と膝蓋骨腱はそのままにしておきます。内側半月板を脛骨プラトーに固定する内側半月板靭帯(MML)を注意深く暴露した後、内側半月板を不安定にするために微小外科的はさみでそれをトランセクトする。
- 対照処置として右膝に偽手術を行い、MMLは視覚化されたがトランスジェクトされなかった。
- 関節カプセルを8-0で閉じる治癒が起こった後に膝の適切な使用を保証するために、DMMおよび偽の手順の両方のための7-0非吸収性縫合糸による吸収性ポリグラクチン縫合糸および皮膚切開。
- 鎮痛の外科的処置の直前にSRブプレノルフィン(0.20-0.5mg / kg)を皮下(SC)注射し、単回注射後72時間まで疼痛緩和を提供する。手術後に手術を受けた動物を監視します。
- 術後2 、8、および16週間でCO2チャンバーを使用して動物を安楽死させる。意識不明の後、物理的な方法(胸腔を開く)によって動物の死を確認します。これらの安楽死の方法は、米国獣医師会(AVMA)の安楽死パネルの勧告と一致しています。
- DMM手術後2、8、および16週間後、およびシャム手術後2および16週間後に組織学的分析のために膝関節を採取し、OA重症度またはSCB肥厚の程度が異なるマウス膝関節を得る。
2. 組織切片および組織学的画像の作製
- マウス膝関節組織サンプルを2%パラホルムアルデヒドで固定し、25%ギ酸で脱灰し、パラフィンに埋め込み、冠状に切片化して内側および側方区画の両方を調べた。
- ミクロトームを用いて膝の後側から膝標本を切り出し、厚さ5μmの組織切片を70~80μm間隔で採取し、膝関節全体に約40枚の組織スライドを得た。マイクロメーター支援推定では、スライド番号1〜6は後方から、11〜18は後部中部から、23〜30は前部から、35〜40は膝関節の遠方前部からであることを示唆している。追加の汚れのために介在する部分を廃棄または収集します。
- 製造元の指示に従ってサフラニン-Oと高速グリーン染色を行い、5枚のスライドごとに軟骨細胞とマトリックスを具体的に識別します。製造元の指示に従ってヘマトキシリン - エオシン染色を行い、前述のように膝関節を細胞および組織レベルで検査する19、20、21、22。
- デジタルカメラを搭載した顕微鏡で組織画像を取得します。一般的な病理組織学的分析および組織学的OAグレーディングは、前述のように実施した15、19、20、21、22。
3. ImageJソフトウェアによる骨関節炎性軟骨下骨の定量測定
- ImageJソフトウェアをダウンロードし、目的の組織学的画像を開きます。
- Java 1.8.0_172 にバンドルされている ImageJ を https://imagej.nih.gov/ij/ からダウンロードします。
- ImageJ プログラムを開きます。リボンの [ ファイル ] タブをクリックし、[ 開く ] オプションをクリックして組織図を開きます。
- ファイルのディレクトリアドレスを見つけ、画像ファイルを選択して、[ 開く] をクリックします。
- 組織学的画像上のマイクロメータでImageJを較正する。
- 直線ツールを使用してマイクロメートルの長さの 1 単位をスケッチし、[> を解析] をクリックします (次に) スケールを設定。 「既知の距離 」と 「ピクセル縦横比 」を 1 に設定し、「 OK」をクリックします。ImageJは、ピクセル長をマイクロメートル上の単位長さに変換することができる。
- 測定係数を面積に設定します。「 分析」>「測定を設定」をクリックし、 新しいウィンドウの下にある「 面積 」ボックスと 「しきい値に制限」 ボックスにチェックを入れます。このステップでは、選択した「しきい値」内のパラメータ「面積」を測定するようにImageJを設定します。
- 関心のある軟骨下骨(SCB)の総面積を測定します。
- 図1Aのオレンジ色のボックスに示すように、SCB大腿骨顆(MFC)および内側脛骨台頭(MTP)の皮質プレートに隣接する基礎となる骨梁骨の一部を、各ROIに固有の寸法で覆うSCB関心領域(ROI)を定義します。骨関節炎性SCB肥厚は、通常、これらの領域で起こる。検査されたすべての関節について各MFCまたはMTPにおいて同じ形状および寸法を有するSCB ROIを定義し、すべての動物について同じサイズの特定のROIが測定されたことを確認する。
- ImageJ のメインウィンドウの下にあるポリゴン選択ツールを使用して、SCB 領域全体の輪郭をスケッチします。
メモ: 選択ツールは、測定領域を制限するしきい値をシステムに付与します。 - SCB 領域の合計を測定する: しきい値を選択したら、「 分析」>「測定」をクリックします。面積測定を含む「結果」ウィンドウが開きます。
- 骨髄を含まない固形骨を含む骨物質領域を測定する。
- 「 編集」>「外側を消去」 をクリックして、SCB 領域全体外の領域を除外します。
メモ: [ 外部からクリア ]オプションをクリックすると、SCB領域の合計のみが表示されます。SCB 領域全体外の画像が黒くなります。このステップにより、観察者は関心領域内の骨物質領域に集中することができる。 - [ 画像>色のしきい値>調整 ]をクリックして、[しきい値の色]ウィンドウを開きます。[しきい値の色] ウィンドウの下部にある [ オリジナル ] をクリックして、画像を元の状態に復元します。ステップ 3.3.2 の選択ツールを使用して、骨物質領域に小さなボックスを描画します。「しきい値の色」ウィンドウの下部にある サンプル オプションをクリックして、骨物質領域を定義します。
メモ:「しきい値の色」ウィンドウの「サンプル」オプションを使用すると、ImageJは骨物質サンプル領域としてSCB領域全体上のすべての同じピクセルを選択できます。選択した骨物質領域が赤色に変わります。 - しきい値カラーバランスウィンドウの下部にある 「選択 」をクリックして、面積測定しきい値を作成します。メインメニュー の「ImageJ」で「解析>測定 」をクリックすると、骨物質面積測定結果が「結果」ウィンドウに表示されます。
- SCB全面積と骨物質面積のデータを保存します。
- 「 編集」>「外側を消去」 をクリックして、SCB 領域全体外の領域を除外します。
- SCB総面積内の骨物質の厚さ(mm2/1.0mm2)を表す、目的のSCB総面積(mm2)に対する骨物質面積(mm2)の比率を計算します。
- DMM誘導OAの遠後、中後、中前、および遠前領域(ステップ2.2で説明)の組織学的切片/画像(ステップ3.1~3.5で説明)のSCB厚さを測定し、6つの膝関節の領域特異的SCB厚さを評価します(図1B)。
注:骨関節炎性SCBの変化が軟骨病変と共局在し、SCB肥厚を伴う骨関節炎性軟骨損傷がげっ歯類膝関節の体重含有領域(中央部)でより深刻であることが知られているため、この定量的測定プロトコルの信頼性を検証できます14,15。したがって、骨関節炎SCB肥厚の定量測定のために中間切片を使用することが適切である。
4. 統計
- SCB厚さの定量的測定と視覚的グレーディングからのデータを使用して統計分析を実行します。ピアソンの相関係数分析によって、観察者間および観察者内の変動性と再現性を決定します。
- スチューデン トのt検定または一元配置分散分析を使用して研究グループ間の差の有意性を決定し、続いて表計算ソフトウェアを使用したポストホック検定(Tukey)を決定します。p値が0.05未満の場合は統計的に有意であると考えてください。
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Representative Results
視覚的推定グレーディングとImageJ支援定量測定の再現性比較:
24匹の膝/動物からの各膝の中央部から定義された48の関心領域(ROI)(24MFCおよび24のMTP)におけるSCBの厚さは、文献15,23に記載されている既存の0〜3の視覚的スコアリングスキームを使用して、3人の独立した個人によってスコアリングされた。これらの画像は、DMMまたは偽処置の2、8、および16週間後の3つの異なる術後時点から選択した。通常、DMM処置を有するマウスは、手術後2週間で視覚的SCB肥厚スコア0、8週目でスコア1〜2、および16週目でスコア2〜3を示した。次に、これらの組織学的画像のSCB厚さを、ImageJソフトウェアを使用して他の3人の独立した観察者によって定量的に測定し、新しいスキームの再現性と感度を検証しました。視覚的グレーディングまたは定量的測定のためのMFCおよびMTPにおける概説されたROIの有無にかかわらず、代表的な組織学的画像を図2に提示し、その中で、検査画像を3つのグループに分けた:偽膝(視覚スコア0)、DMM膝(視覚スコア0)、およびDMM膝(視覚スコア1〜3)。
ImageJ支援定量測定とSCB厚さの視覚的推定グレーディングとの間の再現性の詳細な比較分析を 表1に示す。相関係数検定は、定量的測定が視覚的推定グレーディングシステムよりも比較的再現性が高いことを示唆している。
オブザーバー間およびオブザーバー内の再現性:
相関係数検定は、MTPおよびMFC領域における第1および第2の測定の平均について、観察者A、B、およびC間の観察者間相関係数が>0.93であるImageJ支援測定の高い再現性を示した(図3)。同じ組織学的画像のセットの観察者内変動性解析でも、すべての観察者について>0.95の観察者内相関係数を有する3人の観察者のそれぞれについて、第1および第2の測定スコア間の高い再現性を示した(図4)。
感度：
新しい定量的SCB測定システムが、広く使用されている視覚グレーディングシステムよりも骨関節炎性SCB肥厚変化に対してより敏感であるかどうかを評価するために、24匹の膝/動物からの組織学的画像の48の関心領域(24のMFCおよび24のMTP)を、OA組織病理学および既存のOAグレーディングシステムの経験を有する3人の独立した個人によって最初に評価した。SCB増粘は、上記のような0〜3の視覚的スコアリングスキームを用いて等級付けした。ImageJ支援定量的測定は、次いで、視覚的OAグレーディング結果に盲検化された別の3人の個人によって、視覚的にグレーディングされた組織学的画像の同じセットに対して実施された。各画像のMFCおよびMTPのSCB厚さは、プロトコルの項で説明したようにImageJで定量的に測定した。その結果、視覚的SCB肥厚スコア1~3のDMM画像の平均SCB厚さ(mm2/1.0mm2)は、視覚的厚膜スコアが「0」のSham画像よりも有意に高いことが実証された。さらに重要なことに、視覚的SCB厚膜スコアが「0」のDMM画像の平均SCB厚さも、視覚スコアが「0」のSham画像の平均SCB厚さよりも有意に高かった(図5)。このデータは、ImageJ支援定量的SCB測定が、視覚的グレーディング法よりも早期および軽度のSCB厚膜変化に対してより敏感であることを強く示唆している。
図1:ImageJ支援定量的SCB測定のためのSafranin-OおよびShamおよびDMM群からの高速緑色染色による組織学的画像 。 (A)黄色の点線で囲まれたボックスは、SCB関心領域(ROI)を定義します。ボックス内の骨物質の領域はオレンジ色で強調表示されます。内側大腿骨顆(MFC)および内側脛骨プラトー(MTP)のSCB厚さは、ImageJソフトウェアを使用して定量化することができる。MFC と MTP の ROI の正確な寸法は、可視性を高めるために拡大されます。(B)DMM後16週間におけるMTPの遠後部、中後部、中前部、および遠方前方領域からの組織学的画像のSCB厚さを定量化し、領域特異的SCB厚さを評価した。N = 6。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:視覚的SCBグレーディングおよび定量的SCB測定のためのShamおよびDMM群からのサフラニン-Oおよび高速緑色染色による代表的な組織学的画像。上部パネル: 視覚的なSCBグレーディングのためのシャムおよびDMMグループの顕微鏡写真。 下部パネル: ImageJ支援定量的SCB測定のためのシャムおよびDMM群の顕微鏡写真。MFC および MTP の黄色の点線で囲まれたボックス (Adobe イラストレーターで作成) は、SCB の関心領域を定義します。ボックス内の骨物質(骨髄を除く)の領域はオレンジ色で強調表示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:観測点間変動検定 相関係数分析は、MTPおよびMFCの関心領域における第1および第2の測定から平均化されたSCB厚さについて、3人の観察者(観察者A、BおよびC)間で高い再現性を示す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:オブザーバ内変動検定相関係数分析は、観測者A、B、およびCのそれぞれについて、関心のあるMTP領域およびMFC領域における第1および第2のSCB厚さ測定の間の高い再現性を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:MFCおよびMTPにおけるSCB厚さの視覚的グレーディングおよびImageJ支援定量測定の比較感度分析。 視覚的推定グレーディングのための組織学的画像を3つのグループ(SCB増粘スコア「0」を有するシャム、「0」SCB増粘スコアを有するDMM、およびSCB増粘スコア1〜3を有するDMM)に分けた。注: 視覚的SCB厚化スコアが「0」のDMM画像の3人の観察者全員からの定量的SCB厚さ値は、視覚的スコアが「0」のシャム画像のそれよりも有意に高く、定量的測定が視覚的グレーディングよりも軽度のSCB厚化に対してより敏感であることを示している。N = 6。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 方式 | オブザーバー/スコアラー | ティッカー | ティッカー |
| 観測者間相関係数(r) | |||
| 定量測定 | A vs.B | 0.9685 | 0.9421 |
| A vs.C | 0.9413 | 0.9427 | |
| B対C | 0.9109 | 0.9288 | |
| ビジュアルグレーディング | D 対 E | 0.6455 | 0.6031 |
| D 対 F | 0.6 | 0.7419 | |
| E 対 F | 0.6454 | 0.603 | |
| オブザーバー内相関係数(r) | |||
| 定量測定 | ある | 0.9818 | 0.9662 |
| B | 0.9361 | 0.9177 | |
| C | 0.9748 | 0.9357 | |
| ビジュアルグレーディング | D | 0.4286 | 0.6396 |
| E | 0.5 | 0.7746 | |
| F | 0.7071 | 0.6396 | |
表 1: SCB厚さのソフトウェア支援定量測定と視覚的推定グレーディングの再現性比較。
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Discussion
SCB肥厚の測定は、OA重症度の組織学的評価の重要な要素である。既存のOAグレーディングシステムのほとんどは、主に軟骨の変化に焦点を当てています15,16,17。SCBの肥厚を軽度、中等度、重症に分類する広く使用されているマウス骨関節炎SCB厚さグレーディング方法は、主に主観的であり、その信頼性は完全には検証されていません15。本研究では、マウスにおける膝OAの作成、組織切片および組織学的画像の調製、ImageJソフトウェアによる骨関節炎性軟骨下骨の定量的測定、およびプロトコルの感度および再現性を検証するための統計解析を含む、SCBの厚さを定量化するための新しい測定プロトコルを開発し、検証した。
このプロトコルの一般的な手法はImageJソフトウェアの指示に従っていますが、新規ユーザーが再現性を簡単に追跡して検証できるように、段階的な技術的詳細が含まれています。ImageJソフトウェアのプラグインであるBoneJプログラムは、2D白黒画像の測定には適していますが、骨髄とSCB物質の陰影が白黒で類似しているため、SCBの総面積から骨髄面積を除外するにはうまく機能しません。対照的に、現在のプロトコルに記載されている段階的な方法は、色閾値関数を使用してすべての色の組織学的画像に適用して、SCB物質を骨髄から自動的に分離し、それによって正味のSCB厚さを測定することができる。現在のプロトコルには、SCB 密度 (ROI の正味 SCB 面積 mm2/1.0 mm2) を計算するための新しい方法( ImageJ の一部ではない)が含まれています。
この記事で紹介するプロトコルには、いくつかの利点があります。第一に、ImageJはフリーソフトウェアシステムであり、NIHのウェブサイトですぐに入手できます。第二に、新しいシステムは習得と適用が簡単です。定量測定は、SCB ROIあたりわずか5〜6分かかります。第三に、新しいシステムの結果は、観察者間および観察者内の変動が非常に低く、再現性が高い。最後に、新しいシステムは、既存のビジュアルグレーディングシステムよりも軽度のSCB厚膜変化に対してより敏感です。
新しいシステムの小さな制限は、統計分析のための校正器として制御画像の必要性です。ただし、ほとんどのオープンアクセス プロジェクトでは、コントロール イメージがデータ分析にほとんど常に含まれているため、これは問題にはなりません。もう1つの潜在的な制限は、ImageJソフトウェアが、骨物質と骨髄の異なる色を示すために適切な染色方法に依存するカラーピクセルに基づいて、SCB物質を骨髄から分離できることである。
新しい定量SCB測定システムは、あらゆるレベルでSCB厚さを定量するのに適しています。SCBの肥厚が著しい組織学的画像の場合、新しいシステムは骨物質の正確な面積を正確に定量化し、それを単位面積あたりの骨厚を表す骨密度(ROIの正味SCB mm2/1.0mm2)に変換することができます。視覚的グレーディングでは検出できない目立たないSCB肥厚を伴う組織学的画像の場合、新しいシステムは、OAの初期段階でしばしば起こる微妙または軽度の肥厚を同定することができる。したがって、この新しいシステムは、OA軟骨グレーディングと協調して、OA療法のOA進行およびインビボ有効性をモニタリングするために使用することができる。さらに、このプロトコルは、SCB ROIのサイズを調整した後、他の種のSCB厚さを測定するためにも使用することができる。
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Disclosures
著者らは、競合する利益相反がないと宣言している。
Acknowledgments
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Safranin-O | Sigma-Aldrich | S8884 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | E4382 | |
| illustrator | Adobe | Not applicable |
References
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