Summary
Den voksne myg spytkirtel (SG) er nødvendig for overførsel af alle mygbårne patogener til deres menneskelige værter, herunder vira og parasitter. Denne video viser effektiv isolering af verdensmålene fra larvestadiet Anopheles gambiae myg og forberedelse af L4-målene til yderligere analyse.
Abstract
Mosquito spytkirtler (SGs) er et nødvendigt gatewayorgan til overførsel af insektbårne patogener. Sygdomsfremkaldende stoffer, herunder vira og Plasmodium parasitter, der forårsager malaria, ophobes i sekretoriske hulrum af SG-celler. Her er de klar til at blive sendt til deres hvirveldyr værter under et efterfølgende blodmåltid. Som voksne kirtler form som en uddybning af larve SG kanal bud rester, der fortsætter ud over tidlig pupal SG histolyse, larven SG er et ideelt mål for interventioner, der begrænser sygdomsoverførsel. Forståelse af larval SG udvikling kan bidrage til at udvikle en bedre forståelse af dens morfologi og funktionelle tilpasninger og støtte i vurderingen af nye interventioner, der er rettet mod dette organ. Denne videoprotokol demonstrerer en effektiv teknik til isolering, fastgørelse og farvning af larval-SGs fra Anopheles gambiae myg. Kirtler dissekeret fra larver i en 25% ethanolopløsning er fastgjort i en metanol-glacial eddikesyreblanding efterfulgt af en kold acetonevask. Efter et par skylninger i fosfat-buffered saltvand (PBS), SGs kan farves med en bred vifte af markør farvestoffer og / eller antisera mod SG-udtrykte proteiner. Denne metode til larval SG isolation kunne også bruges til at indsamle væv til in situ hybridisering analyse, andre transskriptomiske applikationer, og proteomiske undersøgelser.
Introduction
Malaria er en stor trussel mod folkesundheden, der forårsager næsten 230 millioner infektioner og anslået 409.000 dødsfald i 20191. De fleste dødsfald er i Afrika syd for Sahara og er forårsaget af parasitten Plasmodium falciparum, hvis insekt vektor er Anopheles gambiae, emnet for denne video demonstration. Selv om tallene tyder på et betydeligt fald i den årlige dødelighed siden århundredeskiftet (> 300.000 færre årlige dødsfald), er de lovende fald i sygdomsraterne observeret fra 2000 til 2015 aftagende, hvilket tyder på behovet for nye tilgange til begrænsning af sygdomsoverførsel2. Blandt lovende yderligere strategier for kontrol og eventuelt eliminering af malaria er rettet mod myg vektor kapacitet ved hjælp af CRISPR / Cas9-baserede gen-redigering og gen-drev3,4,5. Faktisk er det målretningen af mygvektoren (gennem udvidet brug af langvarige insekticidbehandlede sengenet), der har haft den største indvirkning på reduktionen af sygdomsoverførsel6.
Kvindelige myg erhverver Plasmodium gametocytter fra et inficeret menneske under et blodmåltid. Efter befrugtning, modning, midgut epitel traversal, befolkning ekspansion, og hæmocoel navigation i deres obligatoriske myg værter, hundreder til titusinder af Plasmodium sporozoitter invadere myggsgs og fylde sekretoriske hulrum af de konstituerende sekretoriske celler. Når de er inde i sekretorhulerne, har parasitterne direkte adgang til spytkanalen og er således klar til overførsel til en ny hvirveldyr vært ved det næste blodmåltid. Fordi SGs er afgørende for overførsel af malaria-forårsager sporozoitter til deres menneskelige værter, og laboratorieundersøgelser tyder på, at SGs ikke er afgørende for blod-fodring, myg overlevelse, eller fecundity7,8,9, de repræsenterer et ideelt mål for transmission-blokering foranstaltninger. Voksne myggsgs danner som en uddybning af "kanalknoppe" rester i larvensgs, der fortsætter ud over tidlig pupal SG histolyse10, hvilket gør larven SG til et ideelt mål for interventioner for at begrænse overførsel af voksenstadiet sygdom.
Karakterisering af larvestadiet for udvikling af bæredygtig udvikling kan hjælpe med at udvikle ikke kun en bedre forståelse af dets morfologi og funktionelle tilpasninger, men kan også hjælpe med at vurdere nye interventioner, der målretter dette organ gennem genredigering af vigtige SG-tilsynsmyndigheder. Fordi alle tidligere undersøgelser af larve spytkirt arkitektur forud for immunstaining og moderne billeddannelse teknikker10,11, vi har udviklet en protokol for isolering og farvning spytkirtler med en række antistoffer og celle markører12. Denne video viser denne tilgang til udvinding, fiksering og farvning af larvensgs fra Anopheles gambiae L4 larver til konfokal billeddannelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af løsninger og værktøjer
- Forberedelse af dissektionsopløsning
- For at forberede dissekeringsopløsningen tilsættes 2,5 mL 100% ethanol til 7,5 mL destilleret H2O i et 15 plastrør. Vend røret 3 gange for at blande.
BEMÆRK: Denne løsning kan opbevares ved stuetemperatur i flere uger.
- For at forberede dissekeringsopløsningen tilsættes 2,5 mL 100% ethanol til 7,5 mL destilleret H2O i et 15 plastrør. Vend røret 3 gange for at blande.
- Fremstilling af 10x fosfat-buffered saltvand (PBS) lager
- For at forberede 10x PBS lager, tilføje 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4,80 g NaCl, og 2 g KCl til 800 mL deioniseret vand. Bland med en rørstang på en rørplade, indtil faste stofferne er helt opløst. Juster det endelige volumen til 1 L med renset vand.
BEMÆRK: Denne løsning kan opbevares ved stuetemperatur i flere måneder.
- For at forberede 10x PBS lager, tilføje 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4,80 g NaCl, og 2 g KCl til 800 mL deioniseret vand. Bland med en rørstang på en rørplade, indtil faste stofferne er helt opløst. Juster det endelige volumen til 1 L med renset vand.
- Forberedelse af 1x PBS
- Der tilsættes 10 mL 10x PBS til 90 mL H2O i en steril glasflaske. Luk låget tæt og vend 3x for at blande.
BEMÆRK: Opløsningen kan opbevares ved 4 °C i flere uger.
- Der tilsættes 10 mL 10x PBS til 90 mL H2O i en steril glasflaske. Luk låget tæt og vend 3x for at blande.
- Forberedelse af fiksativ.
- Der tilsættes 600 μL methanol til 200 μL istidseddikesyre. Gør opløsningen frisk hver gang.
- Opførelse af kitplade (en vævskulturskål fyldt med silikonegummi)
- Bland komponenterne (1:50) epoxy (1 g) og vand (50 mL) og hæld blandingen i en petriskål. Vent på, at komponenterne tørrer, før du bruger dem.
BEMÆRK: Når kitpladen er konstrueret, kan den bruges i årevis.
- Bland komponenterne (1:50) epoxy (1 g) og vand (50 mL) og hæld blandingen i en petriskål. Vent på, at komponenterne tørrer, før du bruger dem.
2. Kirtel dissektion (Figur 1A)
- Saml sene L4 larver (~ 10 dage efter luge; Figur 2) fra foderbakker ved hjælp af en plastoverførselspipette.
BEMÆRK: Se denne nyttige online manual til standard myghold og larvekultur13.- Placer en kitplade på scenen af et dissekeringmikroskop og overfør larver på kitpladen.
BEMÆRK: Når larver aliquoting larver til indledende dissektion, er det nyttigt at overføre ~ 10 larver på diaset på én gang ved hjælp af en plastoverførselspipette.
- Placer en kitplade på scenen af et dissekeringmikroskop og overfør larver på kitpladen.
- Anbring en dråbe dissektionsopløsning (1:3 EtOH:H2O) på kitpladen, adskilt fra de 10 larver.
- Brug en plastoverførselspipette eller engangsglaspipette til at placere en L4 larve i 25% EtOH-dråben.
- Tag sammenkrump (# 5), en i hver hånd, og med den ikke-dominerende hånd, greb larvens hoved. Brug den dominerende hånd til at gribe larven med sammentrækninger lige under hovedet og træk forsigtigt med minimal konstant kraft, så hovedet løsner sig fra resten af kroppen, og kirtlerne forbliver fastgjort til hovedet. Kassér karrosseridelen af larvekroppen.
BEMÆRK: Ved dissekering skal du indstille et køkkenrulle i nærheden for at samle larverkroppene. - Hoved/kirtlerne opsamles i 1 mL 1x PBS i et 1,5 mL mikrocentrifugerør. Brug 1 mL PBS til ~ 40 dissekerede kirtler med deres vedhæftede hoveder. Vent på, at hovederne/SG'erne synker til bunden af bufferen.
3. Fiksering for antistoffarvning (Figur 1B)
- Dræn PBS startende fra toppen af mikrocentrifugerøret ved hjælp af en glasoverførselspipette, undgå det klæbrige myggevæv og fjerne så meget af PBS-opløsningen som muligt uden at beskadige vævene. Opløsningen erstattes med 800 μL af en 3:1 blanding af methanol til istidseddike. Placer røret ved 4 °C natten over (12-24 timer anbefales; 19 timer foretrukket).
- Den følgende dag skal opløsningen tømmes og erstattes med 1 ml kold 100% acetone. Lad i 90'erne.
- Fjern acetone og forsigtigt skylle væv tre gange med 1 ML 1x PBS hver gang.
BEMÆRK: Prøverne skal flyde langsomt op med strømmen og derefter falde tilbage til bunden af røret, når hver PBS-tilføjelse er færdig.
4. Immunstaining (figur 1B)
- Der tilsættes primært antistof (f.eks. Rab11) ved den relevante fortynding (1:100) i 200 μL af den samlede mængde 1x PBS. Hvirvle rørindholdet forsigtigt med en pipettespids. Inkuberes natten over ved 4 °C.
- Fjern den primære antistofopløsning, og vask tre gange med 1 mL 1x PBS (forsigtigt pipettering af opløsningen ind og ud af pipetten).
- Tilsættes sekundært antistof (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) ved den relevante fortynding (1:200) i 200 μL af det samlede volumen. Hvirvle rørindholdet forsigtigt med en pipettespids. Inkuber ved stuetemperatur i 90 min.
- Der tilsættes farvestoffer, såsom Nile Red (lipider, 5 μL på 1 μg/μL) og/eller Hoechst (DNA, 3 μL på 1 μg/μL), i 200 μL PBS på dette stadium. Inkuber ved stuetemperatur i yderligere 60 min. Vask forsigtigt tre gange med 1x PBS.
5. Montering af farvede kirtler til mikroskopi (Figur 1C)
- Pipette 200 μL på 100% glycerol på et mikroskop dias.
BEMÆRK: Da glycerol er tyktflydende, skal pipettespidsen efterlades i væsken, indtil den når det rette volumen. Ingen væv krympning blev observeret, når de går lige ind i 100% glycerol. Men, forskere kan gå gennem 30% og 50% glycerol vasker i rørene, før du flytter prøverne i 100% glycerol. - Overfør de farvede hoveder (op til 20 pr. dias) med de tilknyttede kirtler (sammen med andre interne strukturer) til mikroskopdiaset ved hjælp af en blød børste (Figur 3A). Spred prøverne ud, så de er jævnt fordelt langs glasrutschebanen.
BEMÆRK: Ved aflejring af kirtler på en dækselsrutsjebane med en børste kan sammentrækninger bruges til forsigtigt at orienteregs' erne, så de alle er orienteret i samme retning. - Visning under et dissekeringmikroskop, adskille larvehovedet fra kirtlerne ved hjælp af to par sammentrækninger og forsigtigt trække de to væv i modsatte retninger.
BEMÆRK: Da det er udfordrende helt at isolere målene, skal du blot fjerne hovederne og efterlade målene og de tilhørende interne strukturer. Selv om målene for bæredygtig udvikling forbliver forbundet med andet væv, genkendes de let, når de farves med Hoechst og andre markører (Figur 3B, C). - Fjern og kassér hovederne, og gentag separationsprocessen for hvert SG.
BEMÆRK: Når du fjerner hoveder, skal du indstille et køkkenrulle i nærheden for at samle dem. - Placer forsigtigt en 1,5 mm tyk coverlip på toppen (undgå luftbobler) og forsegle med klar neglelak.
- Opbevares ved 4 °C i en lyssikker beholder.
BEMÆRK: Forberedte rutsjebaner af farvede kirtler kan holdes ved 4 °C i mørke i op til seks måneder til et år uden bemærkelsesværdige ændringer i kvaliteten. Hvis glycerol begynder at lække som månederne går, forsigtigt løfte coverlip og pipette i mere glycerol at fylde huller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spytkirtler er relativt nemme at dissekere fra alle fase 4 larver. Mandlige og kvindelige larver kan skelnes i slutningen af L4 larvestadiet af en rød stribe langs kvindens dorsale brystkasse, men ikke mænd (Figur 2). Vi bemærker også, at antennal morfologi er meget mere udførlig hos mænd end hos kvindelige L4 larver (Figur 2), svarende til de forskelle, der observeres i denne struktur hos voksne myg. Sammen med den betydelige samlede vækst i L4-fasen danner spytkirtlerne også en lumen under L412. Spytkirtler isoleret fra tidlige L4 fase larver farves med Hoechst afslører de proksimale og distale lapper adskilt af en smal indsnævring (Figur 3B,C). De danner lumen vil strække sig hele vejen fra spytkanalen i den proksimale-mest ende (ikke vist) gennem den distale lap. De danner lumen kan ses i immunstained distal spytkirtel af en midten til slutningen af L4 larve (Figur 4). De apikale domæner af sekretoriske celler omkring danner lumen har intens Nile Red farvning (Figur 4B, C) tyder på mikrovilli-lignende strukturer. Også observeret tæt på den apikale overflade er Rab11 farvning(Figur 4C,D, pile). Rab11 lokaliserer til apikale genbrug endosomes. Rab11 farvningen, der også akkumuleres langs kirtlens basale overflade, er en artefakt på grund af basalmembranens klæbrighed. Lignende baggrund farvning er almindelig med immunstainning af både larve og voksne spytkirtler og er blevet forvekslet med bona fide signal.
Figur 1: Tegneserievisualisering af immunstainningsprocessen fra kirtel dissektion gennem diasforberedelse. Forkortelser: SGs = spytkirtler; PBS = fosfatbufferet saltvand; MeOH = methanol; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; Abs = antistoffer; LH = venstre hånd; RH = højre hånd. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Mandlige og kvindelige L4 fase Anopheles gambaie larver. (A, B) Tidlige L4 larver. (C, D) Sene L4 Larver. Der er betydelig vækst i L4-fasen. Hunner (A, C) er blevet beskrevet som havende en skelnende rød stribe ned ad ryg thorax (C; sort pil), der ikke er til stede hos mænd(B, D), men også deres antenner er langt mindre omfattende (frilly) end for mandlige larver fra både tidlig og sen L4 (hvide pile i forstørrede billeder). Skalalinjer = 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Tidlige L4 spytkirtler. (A) TidligT L4 kvindeligt larvehoved med spytkirtler og andre indre organer, der stadig er fastgjort. Spytkirtel er skitseret. Skalastang = 50 μm. (B, C) Isolerede larvekirtler farves med Hoechst. (B) Sammensmeltning af fluorescerende og Nomarski billeder, der viser formen af de proksimale og distale lapper og den blå Hoechst farvning i kerner. (C) Hoechst fluorescerende billede fremhæver kun kerner. Skalastang i bundpaneler = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Immunplettet distal L4 spytkirtel. (A) Kirtel er blevet plettet med Hoechst (nukleart DNA, blå) og (B) Nile Red (membranmarkør, rød); immunplettede til Rab11 (apikale genbrugs vesikler, grøn) (C). (D) Det flettede billede. Bemærk, at en lumen er til stede på det viste stadium (B-D). Pilene i C og D peger på den forventede Rab11 farvning af vesikler nær den apikale overflade, der overlapper Nilen Rød-positive køretøj farvning i fletningen (hvide pile). Ikke-specifik baggrund farvning omkring basal overflade (stjerner) er også observeret, en fælles type baggrund observeret i larve og voksne spytkirtler. Skalalinjer = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet heri blev tilpasset fra en Drosophila SG dissektion protokol og en voksen myg dissektion protokol14,15,16. De fleste markører trængte dog ikke ind i kældermembranen (data, der ikke blev vist), når de brugte metoderne til farvning af voksne dissektioner og SG-farvninger. Tilpasninger af den voksne protokol omfattede dissekering af kirtlerne i en 25% EtOH-opløsning, vask af kirtlerne med en kombination af MeOH og istidseddikesyre og en 90 s acetonevask. I den oprindelige voksenprotokol blev voksne SGs dissekeret i 1x PBS14,15,16. Dissekering i en 25% EtOH-løsning hjalp med at bevare målene og forhindrede skader i farvningsperioderne. Ved udførelsen af den oprindelige dissektion var det nemmest at orientere larvensgs med hovedet mod den ikke-dominerende hånd og have den dominerende hånd til forsigtigt at trække udad (fordi larverne er meget aktivt bevægende). Den forbedrede vævspenetration opnået ved at vaske kirtlerne med en MeOH: istidseddikeopløsning tyder på, at lipidindholdet i larvens SG-kældermembraner og/ eller cellulære plasmamembraner adskiller sig fra den voksne SG. 90 s acetone vask forbedret klarheden af kirtler til billeddannelse. Selv om fikseringsperioden blev anbefalet at være mindst 19 timer (natten over), fungerede længere perioder lige så effektivt.
SG'ernes morfologi kan variere meget afhængigt af, hvornår larverne dissekeres i det 2-dages lange L4-stadium. I begyndelsen af L4 dissektioner (dag 1), lumen synes meget mindre12. I slutningen af L4 dissektioner (anden halvdel af dag 2) er lumen store, og cellerne er aflange. Vi fandt ud af, at den optimale periode for at arbejde med larver var L4; L1-L3 SGs er simpelthen for små til manuelle dissektioner. I billeddannelsesresultater viste kirtler dissekeret ved midten til slutningen af L4 mindre celler blandet med større, sideværts aflange celler, især i distal sac.
Tidligere rapporter om Udvikling af SG for bæredygtig udvikling i Anopheles har givet mange retningslinjer for de aktuelle undersøgelser. Disse rapporter har inkluderet illustrationer af dissekerede embryonale og larves-SGs17,18, detaljeret mikroskopisk analyse af dissekeredekirtler 19,20og transskriptomiske undersøgelser20,21,22. Funktionerne i Anopheles stephensi SG blev rapporteret i løbet af 1950'erne af to forskellige grupper10,11. Mange af de morfologiske træk ved larvekirtlerne blev beskrevet, herunder den overordnede organisering af SG, de relative positioner af forskellige celletyper i organet (kanalen, voksne SG-prækursorer og larveproksimale og distale sekretoriske sække)10,11. Begge grupper rapporterede også yderligere morfometriske data, herunder antallet og fordelingen af sekretoriske celler i hver sæk og deres nukleare størrelse10,11. Rishikesh viste, at ligesom Drosophila larval SGs, larval SG-kromosomer fra Anopheles stephensi er polyteniseret10. Disse vigtige grundlæggende oversigter beskrev brede biologiske aspekter af larven Anopheles SGs.
Den metode, der er beskrevet heri, bør være nyttig til at studere ikke kun larval-SGs af An. gambiae, men kan også gælde for dem, der studerer andre arter af myg. Faktisk er den samme protokol med succes blevet udnyttet (ikke-offentliggjort) med An. stephensi, en art, der ofte studeres i laboratoriet. En begrænsning af protokollen er det begrænsede antal antistoffer, der er blevet specifikt genereret mod myg proteiner. Selv om brugen af Drosophila antistoffer til stærkt bevarede proteiner har circumnavigated denne begrænsning12, feltet kunne drage fordel af mere myg protein-specifikke antistoffer. Forståelse af larval SG cellulære og molekylær biologi kan bidrage til nye kontrol eller mål strategier og giver mulighed for opdagelsen af nye kandidat mål gener for SG forstyrrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Johns Hopkins Malaria Research Institute for adgang til og opdræt af An. gambiae larver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals - Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
References
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672 (2015).
- Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).
- Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
- Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).
- Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
- Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).
- Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
- Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf (2015).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617 (2015).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
- Clements, A. N. The physiology of mosquitoes. , Pergamon Press. Paris. (1963).
- Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
- Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
- Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
- Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
- Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).
