Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח וחיסון של בלוטות הרוק של Larval מ אנופלס גמביה יתושים

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62989
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Department of Cell Biology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Tufts School of Medicine, 3Department of Biomedical Sciences, Idaho College of Osteopathic Medicine

Summary

בלוטת הרוק של היתושים הבוגרים (SG) נדרשת להעברת כל הפתוגנים המועברים על ידי יתושים למארחים האנושיים שלהם, כולל וירוסים וטפילים. וידאו זה מדגים בידוד יעיל של SGs מן הזחל (L4) שלב אנופלס גמביה יתושים והכנת L4 SGs לניתוח נוסף.

Abstract

בלוטות רוק יתושים (SGs) הן איבר שער נדרש להעברת פתוגנים המועברים על ידי חרקים. סוכנים הגורמים למחלות, כולל וירוסים וטפילי פלסמודיום הגורמים למלריה, מצטברים בחללי ההפרשה של תאי SG. כאן, הם מוכנים לשידור למארחים החולייתיים שלהם במהלך ארוחת דם לאחר מכן. כמו בלוטות למבוגרים טופס כמו פירוט של שאריות ניצן צינור SG זחלים הנמשכים מעבר היסטוליזה SG pupal מוקדם, זחל SG הוא יעד אידיאלי להתערבויות המגבילים את העברת המחלה. הבנת פיתוח הזחלים SG יכולה לעזור לפתח הבנה טובה יותר של המורפולוגיה וההתאמות התפקודיות שלה ולסייע בהערכת התערבויות חדשות המכוונות לאיבר זה. פרוטוקול וידאו זה מדגים טכניקה יעילה לבידוד, תיקון והכתמת SGs זחלים מיתושי אנופלס גמביה. בלוטות ניתחו מזחלים בתמיסת אתנול 25% קבועים בתערובת חומצה אצטית מתנול-קרחוני, ואחריה שטיפת אצטון קרה. לאחר כמה שטיפות מלוחות פוספט (PBS), SGs יכול להיות מוכתם עם מגוון רחב של צבעי סמן ו / או אנטיזרים נגד חלבונים מבוטאים SG. שיטה זו לבידוד זחל SG יכול לשמש גם כדי לאסוף רקמה עבור ניתוח הכלאה במקום, יישומים שעתוק אחרים, ומחקרים פרוטאומיים.

Introduction

מלריה היא איום גדול על בריאות הציבור הגורמת לכמעט 230 מיליון זיהומים וכ -409,000 מקרי מוות בשנת 20191. רוב מקרי המוות הם באפריקה שמדרום לסהרה והם נגרמים על ידי הטפיל פלסמודיום פאלציפארום, אשר וקטור החרקים שלו הוא אנופלס גמביה, הנושא של הדגמת וידאו זו. למרות שהמספרים מצביעים על ירידה משמעותית בשיעור התמותה השנתי מאז תחילת המאה (>300,000 פחות מקרי מוות שנתיים), הירידה המבטיחה בשיעורי המחלות שנצפו בין השנים 2000 ל -2015 מתחדדת, מה שמצביע על הצורך בגישות חדשות להגבלת העברת המחלה2. בין אסטרטגיות נוספות מבטיחות לשליטה ואולי חיסול מלריה הוא מיקוד קיבולת וקטור יתושים באמצעות CRISPR / Cas9 מבוסס עריכת גנים וכונןגנים 3,4,5. ואכן, זה מיקוד של וקטור יתוש (באמצעות שימוש מורחב של כילות הקשורות קוטלי חרקים לאורך זמן) כי יש את ההשפעה הגדולה ביותר על הפחתת העברת המחלה6.

נקבות יתושים רוכשות גמטוציטים מפלסמודיום מאדם נגוע במהלך ארוחת דם. לאחר הפריה, התבגרות, חציית אפיתל midgut, התרחבות האוכלוסייה, וניווט hemocoel המארחים יתושים מחויב שלהם, מאות עד עשרות אלפי sporozoites פלסמודיום לפלוש SGs יתוש ולמלא את חללי הפרשה של תאי הפרשה המרכיבים. ברגע שהם בתוך חללי ההפרשה, לטפילים יש גישה ישירה לצינור הרוק ולכן הם צפויים להעביר למארח בעל חוליות חדש על ארוחת הדם הבאה. מכיוון ש-SGs הם קריטיים להעברת ספורוזויטים הגורמים למלריה למארחים האנושיים שלהם, ומחקרי מעבדה מראים כי SGs אינם חיוניים להאכלת דם, הישרדות יתושים או פוריות7,8,9, הם מייצגים יעד אידיאלי לאמצעי חסימת שידור. SGs יתוש מבוגר טופס כהרחבה של "ניצן צינור" שרידים SGs זחל הנמשכים מעבר מוקדם SG היסטוליזה10, מה שהופך את זחל SG יעד אידיאלי להתערבויות כדי להגביל את העברת המחלה בשלב למבוגרים.

אפיון השלב הזחלי של פיתוח SG יכול לעזור לפתח לא רק הבנה טובה יותר של המורפולוגיה שלה והתאמות פונקציונליות, אלא גם יכול לסייע בהערכת התערבויות חדשות המכוונות לאיבר זה באמצעות עריכת גנים של רגולטורים מרכזיים של SG. כי כל המחקרים הקודמים של ארכיטקטורת בלוטת הרוק זחל קדמו חיסוני וטכניקות הדמיה מודרניות10,11, פיתחנו פרוטוקול לבידוד והכתמת בלוטות רוק עם מגוון של נוגדנים וסמני תאים12. וידאו זה מדגים גישה זו להפקה, קיבעון, והכתמה של SGs זחל מ זחלי אנופלס גמביה L4 עבור הדמיה קונפוקלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת פתרונות וכלים

  1. הכנת פתרון ניתוח
    1. כדי להכין פתרון לנתח, להוסיף 2.5 מ"ל של 100% אתנול ל 7.5 מ"ל של H2O מזוקק בצינור פלסטיק 15. הפוך את הצינור 3 פעמים לערבב.
      הערה: פתרון זה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר שבועות.
  2. הכנת מלאי תמיסת מלח (PBS) עם 10x חוצץ פוספט
    1. להכנת מלאי PBS 10x, הוסף 17.8 גרם Na2HPO4• 2H2O, 2.4 גרם KH2PO4, 80 גרם NaCl, ו 2 גרם KCl ל 800 מ"ל של מים דה-יוניים. מערבבים עם מוט ערבוב על צלחת ערבוב עד שהמוצקים נמסים לחלוטין. כוונן את עוצמת הקול הסופית ל- 1 ליטר עם מים מטוהרים.
      הערה: פתרון זה יכול להיות מאוחסן בטמפרטורת החדר במשך מספר חודשים.
  3. הכנת 1x PBS
    1. הוסף 10 מ"ל של PBS 10x ל 90 מ"ל של H2O בבקבוק זכוכית סטרילי. סוגרים את המכסה בחוזקה והוותים 3x לערבוב.
      הערה: הפתרון יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (75 °F) במשך מספר שבועות.
  4. הכנת קיבעון.
    1. הוסף 600 μL של מתנול ל 200 μL של חומצה אצטית קרחונית. הפוך את הפתרון טרי בכל פעם.
  5. בניית צלחת מרק (צלחת תרבית רקמות מלאה גומי סיליקון)
    1. מערבבים את הרכיבים (1:50) של אפוקסי (1 גרם) ומים (50 מ"ל) ויוצקים את התערובת לצלחת פטרי. המתן עד שהרכיבים יתייבשו לפני השימוש.
      הערה: לאחר שנבנה, צלחת מרק ניתן להשתמש במשך שנים.

2. ניתוח בלוטה (איור 1A)

  1. לאסוף זחלי L4 בשלב מאוחר (~ 10 ימים לאחר הפתח; איור 2) ממגשי האכלה באמצעות פיפטה להעברת פלסטיק.
    הערה: ראה מדריך מקוון מועיל זה עבור גידול יתושים סטנדרטי ותרבות זחל13.
    1. מניחים צלחת מרק על הבמה של מיקרוסקופ מנתח ומעבירים זחלים על צלחת מרק.
      הערה: בעת aliquoting זחלים עבור ניתוח ראשוני, זה מועיל להעביר ~ 10 זחלים על השקופית בבת אחת באמצעות pipette העברת פלסטיק.
  2. הניחו טיפה של פתרון ביתור (1:3 EtOH:H2O) על צלחת מרק, בנפרד מ 10 זחלים.
  3. השתמש פיפטה העברת פלסטיק או פיפטה זכוכית חד פעמית למקם זחל L4 אחד לתוך 25% EtOH טיפה.
  4. קח מלקחיים (#5), אחד בכל יד, ועם היד הלא דומיננטית, לאחוז בראש הזחל. באמצעות היד הדומיננטית, לתפוס את הזחל עם מלקחיים ממש מתחת לראש ולמשוך בעדינות עם כוח קבוע מינימלי, כך שהראש מתנתק משאר הגוף ואת הבלוטות להישאר מחובר לראש. השליכו את חלק הגוף של פגר הזחל.
    הערה: בעת הניתוח, הגדר מגבת נייר בקרבת מקום כדי לאסוף את פגרי הזחלים.
  5. לאסוף את הראש / בלוטות לתוך 1 מ"ל של 1x PBS בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. השתמש 1 מ"ל של PBS עבור ~ 40 בלוטות ניתחו עם הראשים המצורפים שלהם. המתן שהראשים/אס.ג'י יטבעו לתחתית המאגר.

3. קיבעון להכתמת נוגדנים (איור 1B)

  1. לנקז את PBS החל מהחלק העליון של צינור microcentrifuge באמצעות pipette העברת זכוכית, הימנעות רקמות יתוש דביק והסרת כמה שיותר של פתרון PBS מבלי לפגוע ברקמות. החלף את הפתרון עם 800 μL של תערובת 3:1 של מתנול לחומצה אצטית קרחונית. מניחים את הצינור ב 4 °C (12-24 שעות מומלץ; 19 שעות מועדף).
  2. למחרת, לנקז את הפתרון ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של קר 100% אצטון. עזוב ל-90.
  3. הסר את האצטון בעדינות לשטוף את הרקמות שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1x PBS בכל פעם.
    הערה: הדגימות צריכות לצוף לאט למעלה עם הזרימה, ואז ליפול בחזרה לתחתית הצינור עד שכל תוספת PBS תושלם.

4. חיסונים (איור 1B)

  1. הוסף נוגדן ראשוני (למשל, Rab11) בדילול המתאים (1:100) ב 200 μL של הנפח הכולל של 1x PBS. מערבבים בעדינות את תכולת הצינור עם קצה פיפטה. דגירה לילה ב 4 °C (5 °F).
  2. הסר את פתרון הנוגדנים העיקרי ושטוף שלוש פעמים עם 1 מ"ל של 1x PBS (בעדינות pipetting את הפתרון פנימה והחוצה של pipette).
  3. הוסף נוגדן משני (אלכס פלור 488 עז אנטי ארנב) בדילול המתאים (1:200) ב 200 μL של נפח כולל. מערבבים בעדינות את תכולת הצינור עם קצה פיפטה. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות.
  4. הוסף צבעים, כגון אדום הנילוס (שומנים, 5 μL של 1 מיקרוגרם / μL) ו / או Hoechst (DNA, 3 μL של 1 מיקרוגרם / μL), לתוך 200 μL של PBS בשלב זה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות נוספות. יש לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם PBS 1x.

5. הרכבה של בלוטות מוכתמות למיקרוסקופיה (איור 1C)

  1. Pipette 200 μL של 100% גליסול על שקופית מיקרוסקופ.
    הערה: כמו גליצרל הוא צמיג, להשאיר את קצה pipette בנוזל עד שהוא מגיע לנפח המתאים. לא התכווצות רקמות נצפתה כאשר הולכים ישר לתוך 100% גליסול. עם זאת, חוקרים יכולים לעבור 30% ו 50% גליסrol שוטף בצינורות לפני העברת הדגימות לתוך 100% גליסול.
  2. העבר את הראשים המוכתמים (עד 20 לשקופית) עם הבלוטות המצורפות (יחד עם מבנים פנימיים אחרים) לשקופית המיקרוסקופ באמצעות מברשת רכה (איור 3A). פזירו את הדגימות כך שהן יופצו באופן שווה לאורך מגלשת הזכוכית.
    הערה: בעת הפקדת בלוטות על שקופית כיסוי עם מברשת, מלקחיים יכולים לשמש בעדינות לכוון את SGs, כך שהם כולם מכוונים באותו כיוון.
  3. צפייה תחת מיקרוסקופ מנתח, להפריד את ראש הזחל מן הבלוטות באמצעות שני זוגות של מלקחיים בזהירות מושך את שתי הרקמות בכיוונים מנוגדים.
    הערה: כפי שהוא מאתגר לבודד לחלוטין את SGs, פשוט להסיר את הראשים, עוזב את SGs ומבנים פנימיים הקשורים. גם אם ה-SGs יישארו קשורים לרקמות אחרות, הם מזוהים בקלות כאשר הם מוכתמים בהוכשט וסמנים אחרים(איור 3B,C).
  4. הסר והשלך את הראשים וחזר על תהליך ההפרדה עבור כל ס"ג.
    הערה: בעת הסרת ראשים, הגדר מגבת נייר בקרבת מקום כדי לאסוף אותם.
  5. מניחים בעדינות כיסוי בעובי 1.5 מ"מ בחלק העליון (הימנעות מבועות אוויר) וחותמים עם לק ברור.
  6. יש לאחסן ב-4 °C (75°F) במיכל חסין אור.
    הערה: שקופיות מוכנות של בלוטות מוכתמות ניתן לשמור על 4 °C (5 °F) בחושך עד שישה חודשים עד שנה ללא כל שינויים בולטים באיכות. אם גליצריל מתחיל לדלוף ככל שהחודשים עוברים, הרם בעדינות את כיסוי ואת pipette בגליצריל יותר כדי למלא חורים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בלוטות הרוק קלות יחסית לניתוח מכל הזחלים בשלב 4. ניתן להבחין בין זחלים זכרים ונקביים בשלב הזחל L4 המאוחר על ידי פס אדום לאורך בית החזה בגב של נקבות אך לא זכרים(איור 2). אנו גם מבחינים כי מורפולוגיה אנטנה היא הרבה יותר משוכללת אצל זכר מאשר זחלי L4 נקבה(איור 2),בדומה להבדלים שנצפו במבנה זה יתושים בוגרים. יחד עם הצמיחה הכוללת ניכרת במהלך שלב L4, בלוטות הרוק גם ליצור לומן במהלך L412. בלוטות הרוק המבודדות מזחלי שלב L4 מוקדמים מוכתמים בהוכסט חושפות את האונות הפרוקסימליות והדיסטליות המופרדות על ידי התכווצות צרה(איור 3B,C). הלומן המתגבש יתרחב כל הדרך מצינור הרוק בקצה הפרוקסימלי ביותר (לא מוצג) דרך האונה הדיסטלית. את הלומן המתגבש ניתן לראות בבלוטת הרוק הדיסטלית החיסונית של זחל L4 מאמצע עד סוף היום(איור 4). התחומים האפיליים של תאי ההפרשה המקיפים את הלומן המתגבש הם כתמים אדומים עזים של הנילוס (איור 4B, C) המרמזים על מבנים דמויי מיקרובילי. כמו כן נצפתה קרוב לפני השטח האפיריים מכתימה את Rab11(איור 4C,D,חצים). Rab11 ממקם למיחזור אפיקלי אנדוזומים. הכתם Rab11 המצטבר גם לאורך פני השטח הבזל של הבלוטה הוא חפץ בשל הדביקות של קרום הבזל. כתמי רקע דומים נפוצים עם חיסון של בלוטות הרוק הזחליות והמבוגרות, והוא טעה לאות בתום לב.

Figure 1
איור 1: הדמיה מצוירת של תהליך החיסון מפירוק בלוטה דרך הכנת שקופיות. קיצורים: SGs = בלוטות רוק; PBS = תמיסת מלח עם אגירה בפוספט; MeOH = מתנול; DAPI = 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול; שרירי בטן = נוגדנים; LH = יד שמאל; RH = יד ימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2:זכר ונקבה L4 שלב אנופלס זחלי גמביי. (A, B)זחלי L4 מוקדמים. (ג, ד) זחלי אל-4 מאוחרים. יש צמיחה ניכרת בשלב L4. נקבות(A, C)תוארו כבעלות פס אדום בולט במורד בית החזה בגב(C;חץ שחור) שאינו קיים אצל זכרים (B, D),אך גם האנטנות שלהן הרבה פחות משוכללות (מסולסל) מאלה של זחלים זכריים מ- L4 המוקדמים והמאוחרים (חצים לבנים בתמונות מוגדלות). מוטות קנה מידה = 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: בלוטות רוק L4 מוקדמות. (A)ראש זחל נקבה L4 מוקדם עם בלוטות רוק ואיברים פנימיים אחרים עדיין מחוברים. בלוטת הרוק היא המתוארת. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (B, C)בלוטות זחל מבודדות מוכתמות בהוהצ'סט. (B)מיזוג של תמונות פלואורסצנטיות ונומרסקי המציגות את צורת האונות הפרוקסימליות והדיסטליות ואת ההוקסט הכחול מכתים בגרעינים. (C)תמונת הפלואורסצנטית של הוצ'סט מדגישה גרעינים בלבד. סרגל קנה מידה בחלוניות התחתונות = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: בלוטת הרוק L4 דיסטלית מחוסנת. (A)בלוטה הוכתמה בהוכסט (DNA גרעיני, כחול) ו-(B)אדום הנילוס (סמן ממברנה, אדום); חיסון עבור Rab11 (שלל מיחזור אפיקלי, ירוק)(C). (D)התמונה הממוזגת. שים לב כי לומן נוכח בשלב המוצג (B-D). החצים ב- C ו- D מצביעים על הכתמת Rab11 הצפויה של שלל ליד המשטח האפירי החופף להכתמת כלי הרכב האדומים-חיוביים של הנילוס במיזוג (חצים לבנים). כתמי רקע לא ספציפיים סביב פני השטח של הבזל (כוכביות) הוא ציין גם, סוג נפוץ של רקע נצפה זחל ובלוטות רוק למבוגרים. סרגלי קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן הותאם מפרוטוקול ניתוח Drosophila SG ופרוטוקול ניתוח יתושיםלמבוגרים 14,15,16. עם זאת, רוב הסמנים לא חדרו את קרום המרתף (נתונים לא הראו) בעת שימוש בשיטות הניתוח למבוגרים והכתמת SG. התאמות של הפרוטוקול למבוגרים כללו לנתח את הבלוטות בתמיסת EtOH של 25%, שטיפת הבלוטות בשילוב של MeOH וחומצה אצטית קרחונית, ושטיפת אצטון של 90. בפרוטוקול המבוגר המקורי, SGs למבוגרים נותחו ב 1x PBS14,15,16. הניתוח בפתרון של 25% EtOH עזר לשמר את ה-SGs ומנע נזק בתקופות הכתמים. בעת ביצוע הניתוח הראשוני, היה קל יותר לכוון את הזחל SGs עם הראש מול היד הלא דומיננטית ויש את היד הדומיננטית בעדינות למשוך החוצה (כי הזחלים נעים מאוד פעיל). חדירת הרקמה המשופרת שהושגה על ידי שטיפת הבלוטות עם MeOH: פתרון חומצה אצטית קרחונית מציע כי תכולת השומנים בקרום המרתף זחל SG ו / או פלזמה הסלולר נבדל מזה של SG הבוגר. שטיפת אצטון של 90 שיפרה את הבהירות של בלוטות להדמיה. למרות שתקופת הקיבעון הומלצה להיות לפחות 19 שעות (לילה), תקופות ארוכות יותר עבדו באותה יעילות.

המורפולוגיה של SGs יכול להשתנות במידה רבה בהתאם כאשר הזחלים נותחו בשלב L4 ארוך 2 ימים. בנתחי L4 מוקדמים (יום 1), הלומן נראה הרבה יותר קטן12. בסוף ניתוחי L4 (המחצית השנייה של היום השני), הלומן גדול, והתאים מוארכים. מצאנו כי התקופה האופטימלית לעבודה עם זחלים הייתה L4; L1-L3 SGs הם פשוט קטנים מדי עבור ניתוחים ידניים. בתוצאות ההדמיה, בלוטות נותחו באמצע עד מאוחר L4 הראו תאים קטנים יותר מעורבבים עם תאים גדולים יותר, מוארך לרוחב, במיוחד ב שק דיסטלי.

דיווחים קודמים על פיתוח Anopheles SG סיפקו הדרכה רבה למחקרים הנוכחיים. דוחות אלה כללו איורים של עוברים וניתחו וזחל SGs17,18, ניתוח מיקרוסקופי מפורט של בלוטות ניתחו19,20, ומחקרים transcriptomic20,21,22. המאפיינים של Anopheles stephensi SG דווחו במהלך שנות החמישים על ידי שתי קבוצות שונות10,11. רבים מהמאפיינים המורפולוגיים של בלוטות הזחל תוארו, כולל הארגון הכולל של ה- SG, העמדות היחסיות של סוגי תאים נפרדים בתוך האיבר (צינור, מבשרי SG בוגרים, ושקי הפרשה פרוקסימליים ודיסטליים בזחלים)10,11. שתי הקבוצות דיווחו גם על נתונים מורפומטריים נוספים, כולל מספר והפצה של תאים הפרשה בתוך כל שק וגודלם הגרעיני10,11. רישיש הראה כי, כמו SGs זחל Drosophila, כרומוזומי SG זחל מאנופלס stephensi הם רביטו10. סקירות יסוד חשובות אלה תיארו היבטים ביולוגיים רחבים של זחל אנופלס SGs.

השיטה המתוארת כאן צריכה להיות שימושית לחקר לא רק זחל SGs של An. gambiae, אלא יכול גם לחול על אלה הלומדים מינים אחרים של יתושים. ואכן, אותו פרוטוקול נוצל בהצלחה (שלא פורסם) עם א. סטפנסי, מין הנחקר לעתים קרובות במעבדה. מגבלה אחת לפרוטוקול היא המספר המוגבל של נוגדנים שנוצרו במיוחד נגד חלבוני יתושים. למרות שהשימוש בנוגדנים Drosophila עבור חלבונים שמורים מאוד הקיף מגבלה זו12, השדה יכול להפיק תועלת נוגדנים ספציפיים יותר חלבון יתוש. הבנת הביולוגיה התאית והמולקולרית של זחלי הזחל יכולה לתרום לאסטרטגיות בקרה או יעד חדשות ולאפשר גילוי של גנים חדשים המיועדים לשיבוש SG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות למכון ג'ונס הופקינס לחקר המלריה על הגישה והגידול של זחלי א. גמביה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 KH2PO4 Millipore Sigma P9791
 Na2HPO4 • 2H2O Millipore Sigma 71643
 NaCl Millipore Sigma S7653
Acetone Millipore Sigma 179124
Brush with soft bristles Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set B08LH63D89
Cover slips (22 x 50 mm) VWR 48393-195
DAPI (DNA) ThermoFisher Scientific D1306
Ethyl alcohol 200 proof Millipore Sigma EX0276
Gilson Pipetman P200 Pipette Gilson P200
Glacial Acetic Acid Sigma Aldrich 695092
Jewelers forceps, Dumont No. 5 Millipore Sigma F6521
KCl Millipore Sigma 58221
Methanol Millipore Sigma 1414209
Nail polish Amazon (Sally Hansen) B08148YH9M
Nile Red (lipid) ThermoFisher Scientific N1142
Paper towels/wipes ULINE S-7128
Petri plate (to make putty plate) ThermoFisher Scientific FB0875712
Pipette Tips Gilson Tips E200ST
Plastic Transfer Pipette Fisher Scientific S304671
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) ThermoFisher Scientific A11008
Silicone resin and curing agent for putty plate Dow Chemicals - Ximeter Silicone PMX-200
Slides, frosted on one end for labelling VWR  20 X 50 mm 48393-195
Wheat Germ Agglutinin ThermoFisher Scientific W834

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
  2. Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
  3. Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
  4. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  5. Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).
  6. Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672 (2015).
  7. Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).
  8. Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
  9. Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).
  10. Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
  11. Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).
  12. Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
  13. Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf (2015).
  14. Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617 (2015).
  15. Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
  16. Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
  17. Clements, A. N. The physiology of mosquitoes. , Pergamon Press. Paris. (1963).
  18. Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
  19. Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
  20. Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
  21. Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
  22. Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).

Tags

ביולוגיה גיליון 175
ניתוח וחיסון של בלוטות הרוק של Larval מ <em>אנופלס גמביה</em> יתושים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiu, M. Z., Lannon, S., Luchetti,… More

Chiu, M. Z., Lannon, S., Luchetti, M., Wells, M. B., Andrew, D. J. Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes. J. Vis. Exp. (175), e62989, doi:10.3791/62989 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter