Summary
Dit protocol beschrijft een minigene reporter assay om de impact van 5'-splice site mutaties op splicing te monitoren en ontwikkelt suppressor U1 snRNA voor de redding van mutatie-geïnduceerde splicing remming. De reporter en suppressor U1 snRNA constructen worden uitgedrukt in HeLa cellen, en splicing wordt geanalyseerd door primer extensie of RT-PCR.
Abstract
Tijdens genexpressie omvat de vitale stap van pre-mRNA-splicing nauwkeurige herkenning van spliceplaatsen en efficiënte assemblage van spliceosomale complexen om exonen te verenigen en introns te verwijderen voorafgaand aan cytoplasmatische export van het volwassen mRNA. De splicingefficiëntie kan worden gewijzigd door de aanwezigheid van mutaties op spliceplaatsen, de invloed van trans-acterende splicingfactoren of de activiteit van therapeutica. Hier beschrijven we het protocol voor een cellulaire assay die kan worden toegepast voor het bewaken van de splicing-efficiëntie van een bepaald exon. De test maakt gebruik van een aanpasbare plasmide gecodeerde 3-exon / 2-intron minigene reporter, die kan worden uitgedrukt in zoogdiercellen door voorbijgaande transfectie. Posttransfectie wordt totaal cellulair RNA geïsoleerd en de efficiëntie van exon splicing in het reporter mRNA wordt bepaald door primer extension of semi-kwantitatieve reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). We beschrijven hoe de impact van ziekte geassocieerde 5′ splice-site mutaties kan worden bepaald door ze in de reporter te introduceren; en hoe de onderdrukking van deze mutaties kan worden bereikt door co-transfectie met U1 klein nucleair RNA (snRNA) construct met compenserende mutaties in zijn 5 ′-regio die basepairs met de 5′-splice sites op exon-intron juncties in pre-mRNA's. Zo kan de reporter worden gebruikt voor het ontwerpen van therapeutische U1-deeltjes om de herkenning van mutante 5′splice-sites te verbeteren. Het invoegen van cis-acterende regulerende sites, zoals splicing enhancer of silencer sequences, in de reporter kan ook worden gebruikt om de rol van U1 snRNP in regulatie te onderzoeken, gemedieerd door een specifieke alternatieve splicingfactor. Ten slotte kunnen reporter-expressiecellen worden geïncubeerd met kleine moleculen om het effect van potentiële therapieën op constitutieve pre-mRNA-splicing of op exonen met mutante 5′-spliceplaatsen te bepalen. Over het algemeen kan de reporter-test worden toegepast om de splicing-efficiëntie in verschillende omstandigheden te controleren om fundamentele splicing-mechanismen en splicing-geassocieerde ziekten te bestuderen.
Introduction
Pre-mRNA splicing is een essentiële verwerkingsstap die niet-coderende introns verwijdert en nauwkeurig coderende exonen bindt om volwassen mRNA te vormen. Herkenning van consensussequenties op exon-intron juncties, aangeduid als 5′-splice site en 3′-splice site, door componenten van de splicing machinerie initieert het splicing proces. Het U1 kleine nucleaire ribonucleoproteïne (snRNP) herkent de 5′-splice site door base paring van het U1 snRNA aan het pre-mRNA1. Genetisch overgeërfde mutaties die 5′-splice site sequences veranderen, zijn geassocieerd met vele ziekten2,3. Er wordt voorspeld dat het verlies van basepairing van U1-snRNA met de mutante 5′-splice-sites afwijkende splicing veroorzaakt, wat de vertaling van het aangetaste transcript in gevaar kan brengen. Een mogelijke therapeutische benadering om de splicingdefecten te corrigeren, omvat onderdrukking van mutaties door gemodificeerd U1-snRNA met compenserende nucleotideveranderingen in het 5′-gebied dat basepairs met de 5′-spliceplaats. Dergelijke gemodificeerde U1-snRNA's, ook wel exonspecifieke U1-snRNA's genoemd, zijn effectief gebleken bij het omkeren van splicingdefecten, wat resulteert in verhoogde eiwitexpressie van het geredde mRNA4,5,6,7,8.
Hier beschrijven we de U1 snRNP-complementatietest, een op reporter gebaseerde cellulaire splicing-assay die een beoordeling mogelijk maakt van het effect van 5′-ss-mutaties op splicing van een exon en ook kan worden gebruikt voor de ontwikkeling van gemodificeerde U1-snRNA's om de redding van exon-inclusie mogelijk te maken. We bieden ook protocollen voor het monitoren van de gesplitste reporter transcripties door primer extensie en RT-PCR, en voor het bepalen van de expressie van gemodificeerde U1 snRNA's door primer extensie en RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reagentia en buffers
OPMERKING: Alle sterilisatie met behulp van vacuümfilters moet worden uitgevoerd met 0,2 μm polyethersulfon (PES) membraan in een bioveiligheidskast.
- Bereid RNase-vrij water door 1,0 ml diethylpyrocarbonaat (DEPC) toe te voegen aan 1,0 l gedeïoniseerd water, meng gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur (RT), autoclaaf tweemaal en koel vervolgens af tot RT voor gebruik.
- Bereid Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) voor door één pak DMEM-poeder (13,4 g), 3,7 g natriumbicarbonaat, 100 ml foetaal runderserum (FBS), penicilline en streptomycine te mengen tot ~ 800 ml steriel gedeïoniseerd water. De uiteindelijke concentratie penicilline en streptomycine in DMEM moet respectievelijk 50 E/ml en 50 μg/ml zijn. Stel de pH in op 7,4 en vul het volume vervolgens aan tot 1,0 L met steriel gedeïoniseerd water. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C.
- Bereid 10x fosfaat gebufferde zoutoplossing (10x PBS) door toevoeging van 25,6 g dinatriumwaterstofheptahydraat (Na2HPO4· 7H2O), 2 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4), 2 g kaliumchloride (KCl) en 80 g natriumchloride (NaCl) tot 800 ml gedeïoniseerd water. Meng om op te lossen en vul het volume aan tot 1,0 L. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C.
- Bereid 0,5 M ethyleendiamine tetra-azijnzuur (EDTA) door 186,1 g Na2•EDTA•2H2O op te lossen in ~800 ml gedeïoniseerd water. Stel de pH in op 8,0 en vul het volume vervolgens aan tot 1,0 l met steriel gedeïoniseerd water. Steriliseer door filtratie en bewaar bij 4 °C.
- Bereid 1x trypsine-EDTA-oplossing door 100 ml 10x trypsine (2,5%), 2 ml 0,5 M EDTA te mengen en voeg 1x PBS toe tot 1,0 L. Steriliseer door filtratie en aliquot in conische buisjes van 50 ml. Bewaren bij 4 °C gedurende 1-2 weken of invriezen bij -20 °C voor langdurig gebruik.
- Bereid 2x formamide DNA/RNA-ladende kleurstof voor door 14,4 ml formamide en 0,6 ml 0,5 m EDTA te mengen voor een eindvolume van 15 ml. Voeg broomfenolblauw en xyleencylencylenpoeder toe tot een eindconcentratie van 0,02% en bewaar bij 4 °C.
OPMERKING: Formamide is giftig en corrosief. Lees de veiligheidsinformatiebladen voor aanvullende veiligheidsaanbevelingen. - Bereid 5x Tris / Boraat / EDTA (5x TBE) buffer door 54,0 g tris base, 27,5 g boorzuur en 20 ml 0,5 M EDTA te mengen in ~ 800 ml gedeïoniseerd water. Meng om op te lossen en vul het volume aan tot 1,0 L met gedeïoniseerd water.
- Bereid ureum-polyacrylamide gel elektroforese (ureum-PAGE) oplossing door 200 ml 5x TBE, 250 ml 40% 19:1 bis/acrylamide en 450,5 g ureum te mengen. Voeg vervolgens gedeïoniseerd water toe tot 1,0 L. Meng totdat de ingrediënten volledig zijn opgelost, steriliseer vervolgens door filtratie en bewaar bij 4 °C in een amberkleurige glazen fles.
OPMERKING: Bis/acrylamide is giftig. Lees de veiligheidsinformatiebladen voor aanvullende veiligheidsprocedures. - Bereid 10% ammoniumperssulfaat (APS) door 1 g APS op te lossen in 10 ml gedeïoniseerd water en bewaar bij 4 °C.
2. Cotransfectie van HeLa-cellen met de reporter en U1 snRNA-plasmiden
OPMERKING: De transfectie van Hela-cellen moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast. Het buitenoppervlak van alle materialen moet worden besproeid met 70% ethanol voordat het in de biologische veiligheidskast wordt ingebracht.
- Houd Hela-cellen in DMEM in een incubator van 37 °C met 5% CO2 door elke 2-3 dagen te passeren wanneer de cellen ongeveer 80-90% confluent zijn.
- Voor passerende HeLa-cellen, aspirateer het gebruikte medium en incubeer vervolgens cellen met 3 ml 0,25% trypsine met 1 mM EDTA bij 37 °C gedurende 3 minuten.
- Voeg na incubatie 7 ml verse DMEM toe. Breng de celsuspensie over in een buis van 10 ml, centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 5 minuten.
- Resuspend de celkorrel in 10 ml verse DMEM en plaats de cellen vervolgens op een nieuwe weefselkweekschaal met 20% confluentie.
- Voor voorbijgaande transfecties, tel Hela-cellen met een schone hemocytometerschuif en bereid een suspensie voor met een dichtheid van 2,5 x 105 cellen / ml.
- Zaad 1,0 ml van 2,5 x 105 cellen/ml Hela-celsuspensie in elke put van een plaat met 12 putten en incubeer gedurende een nacht bij 37 °C.
- Zuig de volgende dag het gebruikte medium op en voeg 0,8 ml verse DMEM toe met serum.
- Bereid oplossing I door 0,2 μg Dup51 of Dup51p reporter plasmide, 1,8 μg pcDNA, pNS6U1 of pNS6U1-5a plasmide en 100 μL transfectiemedium toe te voegen aan een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Bereid een hoofdmix van oplossing II voor alle te transfecteren monsters door toevoeging van 100 μl transfectiemedium en 4,0 μl transfectiereagentia per monster.
- Bereid het transfectiemengsel door 100 μL oplossing II toe te voegen aan elke microcentrifugebuis die oplossing I bevat.
- Vortex de transfectiemengsels gedurende 15 s, centrifugeer in een tafelmodelmicrocentrifuge bij 3.000 x g gedurende 10 s bij RT en incubeer vervolgens gedurende 5 minuten bij RT.
- Voeg alle 200 μL van het transfectiemengsel toe in één put van de 12-well HeLa-celplaat om een eindvolume van 1,0 ml per put te bereiken en incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 48 uur.
- Na incubatie, extract RNA uit de getransfecteerde HeLa cellen met commercieel verkrijgbare guanidine thiocyanaat en fenol oplossing.
OPMERKING: Dit reagens bevat fenol en deze stap moet worden uitgevoerd in een zuurkast. Het gebruik van met DEPC behandeld water wordt aanbevolen voor resuspensie van geëxtraheerd RNA.- Zuig het gebruikte medium op en voeg 500 μL van het reagens toe aan elke put. Incubeer bij RT gedurende 5 min.
- Homogeniseren door op en neer te pipetteren. Breng vervolgens de oplossing over in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 100 μL chloroform en vortex toe gedurende 15 s.
- Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij RT.
- Breng 200 μL van het RNA bevattende bovenste waterige laag over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg 2 μg glycogeen en 200 μL isopropanol toe aan elk RNA-monster. Meng door de buizen om te keren.
- Verzamel het RNA-neerslag door centrifugatie bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Verwijder en gooi het supernatant weg zonder de RNA-pellet te verstoren.
- Was de pellet tweemaal door 1,0 ml 70% ethanol toe te voegen, de buizen om te keren en te centrifugeren zoals beschreven in stap 2.13.7.
- Droog de pellet aan de lucht gedurende ~ 10-20 minuten bij RT en resuspend het RNA in 10-20 μL RNase-vrij water.
- Bepaal de RNA-concentratie door de absorptie bij 260 nm te meten zoals beschreven door Desjardins en Conklin9.
- Ga verder met primerverlenging of bewaar RNA-monsters in -20 °C. Geïsoleerd RNA kan gedurende 6-12 maanden worden opgeslagen bij -20 °C.
3. 32P-etikettering van oligonucleotiden
OPMERKING: Stappen met betrekking tot het gebruik van 32P-ATP en 32P-gelabelde oligonucleotiden moeten achter een acrylschild worden uitgevoerd door getrainde personen met goedkeuring van geautoriseerde institutionele entiteiten. Het hieronder beschreven protocol kan worden gebruikt voor het labelen van oligonucleotiden, Dup3r en U17-26-R, en markers voor ureum-PAGE. Het gebruik van met DEPC behandeld water wordt aanbevolen voor resuspensie van oligonucleotiden en grootte-uitsluitingsparels.
- Voeg aan een microcentrifugebuis van 1,5 ml oligonucleotide, T4 polynucleotidekinase (T4 PNK), T4 PNK-buffer en 32P-ATP toe zoals beschreven in tabel 1. Voeg 32P-ATP als laatste toe aan het mengsel; dat is belangrijk.
OPMERKING: Voor de toevoeging van radioactieve oplossingen wordt het gebruik van filtertips aanbevolen. - Incubeer in een waterbad bij 37 °C gedurende 30 min.
- Terwijl de etiketteringsreacties broeden, resuspendeert u de grootte-uitsluitingsparels met een molecuulgewicht van 25 kDa afgesneden door zachtjes vortexing gedurende ~ 10 s.
OPMERKING: De maatuitsluitingsparels moeten worden bereid volgens de instructies van de fabrikant en worden bewaard als een 50% suspensie in 25% ethanol bij 4 °C. - Bereid kolommen voor door 600 μL van de geresuspendeerde kralen over te brengen naar een wegwerpminikolom die in een opvangbuis van 1,5 ml wordt geplaatst en de kralenbouillon terugbrengt naar 4 °C.
- Centrifugeer bij 2.000 x g gedurende 1 minuut bij RT en gooi de doorstroming weg.
- Was de kralen door 300 μL RNase-vrij water aan de kolom toe te voegen.
- Herhaal stap 3.5. en 3.6. tweemaal en breng de minikolom over naar een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml.
- Voeg het kinasereactiemengsel toe aan de maat-uitsluitingskraalkolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 5000 x g bij RT.
- Verzamel en bewaar de doorstroming, die het 32P-gelabelde oligonucleotide heeft, en gooi alle tips en buizen weg in een acrylafvaldoos.
- Voeg 20 μL RNase-vrij water toe om oligonucleotide met 32P-label te verdunnen tot een eindconcentratie van 2,5 μM.
OPMERKING: Verdun de gelabelde markers indien nodig voor het laden op ureum-PAGE gels. - Bewaar het gelabelde oligonucleotide in een acryl microbuisdoos bij -20 °C of ga verder met de primerverlengingsanalyse.
4. Analyse van de gesplitste reporter transcripties door primer extensie
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om oppervlakken en apparatuur voor gebruik te reinigen met een RNase-inactiverend reagens.
- Voeg 2,0 μg RNA geëxtraheerd uit de Hela-cellen toe aan afzonderlijke microcentrifugebuizen van 200 μL en voeg RNase-vrij water toe om het volume op 6,55 μL te brengen.
- Bereid Master Mix I met de verdunde 32P-Dup3r en dNTP's zoals weergegeven in tabel 2 en voeg 0,9 μL van het mengsel toe aan elke PCR-buis die RNA-monsters bevat.
- Incubeer de buizen, eerst bij 65 °C gedurende 5 min en vervolgens 1 min op ijs.
- Bereid Master Mix II voor met 5x First Strand Buffer, dithiothreitol (DTT), RNase-remmer en reverse transcriptase zoals weergegeven in tabel 2.
- Voeg 2,55 μL van het mengsel toe aan elke buis die RNA en Master Mix 1 bevat; het totale volume van de reactie moet 10 μL zijn. Houd de buizen gedurende 10 minuten op RT.
- Breng de buizen over in een droog bad of een thermische cycler en incubeer, eerst bij 50 °C gedurende 60 minuten en vervolgens bij 70 °C gedurende 15 minuten.
- Voeg na incubatie 10 μL 2x formamide RNA-ladende kleurstof toe aan elk monster en bewaar in een acryldoos bij -20 °C of ga verder met de scheiding van fragmenten door ureum-PAGE met behulp van een 14 cm lange gel en visualisatie van gelafbeelding zoals hieronder beschreven in stap 8.
- Voer densitometrische scan van het gelbeeld uit met een beeldanalysesoftware en gebruik de bandintensiteiten van opgenomen en overgeslagen producten om het percentage exon 2-inclusie te berekenen, zoals hieronder weergegeven.
5. Analyse van de gesplitste reporter transcripties door fluorescerende RT-PCR
OPMERKING: De hieronder beschreven RT-PCR-analyse maakt gebruik van willekeurige hexameren voor cDNA-synthese en een combinatie van ongelabelde Dup8f en Cy5-gelabelde Dup3r oligonucleotiden voor PCR-versterking van de gesplitste producten.
- Voeg voor cDNA-synthese 2,0 μg RNA geëxtraheerd uit de getransfecteerde Hela-cellen toe aan afzonderlijke microcentrifugebuizen van 200 μL en voeg RNase-vrij water toe om het volume op te maken tot 11,0 μL.
- Bereid Master Mix I, met willekeurige hexameren en dNTP zoals weergegeven in tabel 3 , en voeg 2,0 μL van het mengsel toe aan elk monster. Incubeer, eerst bij 65 °C gedurende 5 min en dan 1 min op ijs.
- Bereid Master Mix II, met First Strand Buffer, RNase-remmer, DTT en reverse transcriptase zoals weergegeven in tabel 3 en voeg 7,0 μL van het mengsel toe aan elke buis die RNA en Master Mix I bevat.
- Houd de buizen gedurende 10 minuten bij RT en incubeer vervolgens bij 50 °C gedurende 60 minuten en 70 °C gedurende 15 minuten.
OPMERKING: Voltooide cDNA-reacties kunnen worden bewaard bij -20 °C. - Breng voor PCR 1,0 μL (100 ng/μL) van elk cDNA-monster over naar nieuwe PCR-buizen.
- Bereid een hoofdmengsel bestaande uit Dup8f, Cy5-Dup3r, dNTPs, Taq-buffer, Taq-polymerase en water zoals beschreven in tabel 4 en voeg 11,5 μL van het mengsel toe aan elke buis die cDNA bevat.
- Voer PCR uit met behulp van een thermische cycler met een initiële denaturatiestap bij 94 °C gedurende 3 minuten; gevolgd door 20 cycli denaturatie (94 °C gedurende 30 s), gloeien (65 °C gedurende 30 s) en verlenging (72 °C gedurende 15 s), en een eindstap bij 72 °C gedurende 5 minuten.
- Voeg 12,5 μL 2x formamide DNA-ladende kleurstof toe aan elke buis en verwarm gedurende 5 minuten bij 95 °C.
- Bewaar de PCR-reactie bij -20 °C of ga verder met ureum-PAGE zoals hieronder beschreven in stap 8.1-8.4.
- Verwijder na de elektroforese de glasplaten uit het elektroforeseapparaat en scan met behulp van een fluorescentiebeeldcamera om de gel te visualiseren.
- Voer densitometrische scan van het gelbeeld uit en gebruik de bandintensiteit van de opgenomen en de overgeslagen producten om het percentage exon 2-inclusie te berekenen zoals beschreven in stap 4.8.
6. Analyse van variant U1 snRNA expressie door primer extensie
- Voeg 2,0 μg RNA geëxtraheerd uit de Hela-cellen toe aan afzonderlijke microcentrifugebuizen van 200 μL en voeg RNase-vrij water toe om het volume op te maken tot 4,325 μL en voeg vervolgens dATP toe, zoals weergegeven in tabel 5.
- Voeg 10.000 CPM van het 32P-U17-26-R oligonucleotide toe aan elke buis.
OPMERKING: Om een 10.000 cpm/μL oplossing van 32P-U17-26-R (uit stap 3) te bereiden, verdunt u het gelabelde oligonucleotide (1:20 verdunning), bepaalt u cpm in 1,0 μL met behulp van een scintillatieteller en verdunt u verder met gedeïoniseerd water om een oplossing van 10.000 cpm/μL te bereiden in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. - Incubeer bij 65 °C gedurende 5 min en vervolgens 1 min op ijs.
- Bereid een mastermix met 5x First Strand Buffer, RNase-remmer, DTT en reverse transcriptase zoals weergegeven in tabel 5 en voeg 1,8 μL van de mix toe aan elk monster.
- Incubeer, eerst bij RT gedurende 10 min en vervolgens bij 42 °C gedurende 10 min.
- Voeg na incubatie 10 μL 2x formamide RNA-ladende kleurstof toe aan elk monster en bewaar in een acryldoos bij -20 °C of ga verder met het scheiden van fragmenten door ureum-PAGE met behulp van een 38 cm lange gel (zie stap 8).
7. Analyse van variant U1 snRNA expressie door RT-qPCR
- Verdun de cDNA-voorraad bereid zoals hierboven beschreven in stappen 5.1 - 5.4 tot een concentratie van 0,2 ng/μL.
- Pipetteer 5,0 μL verdund cDNA in afzonderlijke putten van een 96-well qPCR-plaat in drievoud. Voeg gedeïoniseerd water toe in plaats van cDNA voor no-template control (NTC).
- Bereid twee afzonderlijke primermengsels bestaande uit de voorwaartse en omgekeerde primers voor U1 en U2 snRNA's en water zoals weergegeven in tabel 6.
OPMERKING: Sequenties voor U1- en U2-snRNA-specifieke primers zijn opgenomen in tabel 7. - Voeg 5,0 μL van de U1 en U2 snRNA primer mix toe aan het monster en de NTC-putjes.
- Voeg 10,0 μL real-time PCR-mix toe aan elke put.
- Sluit de platen af met een optische film en centrifugeer vervolgens gedurende 2 minuten bij RT bij 1.000 x g om de reacties op de bodem van de putten te verzamelen.
- Voer qPCR uit met een initiële denaturatiestap bij 95 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door 40 cycli van een 2-stapsprotocol bestaande uit denaturatie (95 °C voor 15 s) en gloeien/verlengen (62 °C voor 60 s) terwijl de drempelwaardekwantificeringscyclus (Cq) waarden van doelampliconen worden verzameld.
- Voltooi de qPCR-reactie door te controleren op een enkele piek in de dissociatiecurve voor U1- en U2-snRNA-reacties.
- Bereken uit de Cq-waarden delta Cq (ΔCq) voor U1- en U2-snRNA's in vergelijking met de pcDNA-controle.
- Bepaal variant U1 snRNA-expressie als relatieve hoeveelheid (RQ) van U1 in vergelijking met U2 met behulp van de ΔΔCq-waarde zoals hieronder weergegeven voor alle monsters.
8. Instellen en uitvoeren van Urea-PAGE gels
OPMERKING: De montage van glasplaten en het gelloopapparaat moet worden uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant. Het gieten van de 10% ureum-PAGE gel kan worden uitgevoerd volgens een eerder beschreven protocol van Summer et al.10. Stappen met betrekking tot de voorbereiding van markers en monsters, en van het uitvoeren en visualiseren van gels worden hieronder beschreven. Optioneel, om te voorkomen dat de gel aan glasplaten blijft plakken, kan het binnenoppervlak worden bedekt met siliconenoplossing door 1 ml van de oplossing op het oppervlak toe te voegen en gelijkmatig over het hele oppervlak met weefsel te verspreiden. Eenmaal droog, moeten de platen worden gewassen met gedeïoniseerd water en opnieuw worden gedroogd.
LET OP: Ongepolymeriseerd acrylamide is neurotoxisch en moet worden behandeld met de bescherming die wordt aanbevolen in het veiligheidsinformatieblad.
- Bereid de primerverlengingsmonsters en -markers voor door ze gedurende 5 minuten bij 95 °C te verhitten en vervolgens gedurende 5 s in een tafelmodelmicrocentrifuge bij 3.000 x g bij RT te centrifugeren.
- Voordat u de markers en monsters laadt, spoelt u de putten weg met 1x TBE-buffer om het bezonken ureum te verwijderen.
- Laad 10 μL / monster / put en laat de gel 2-3 uur op 300-500V lopen of totdat het xyleen cyanol de bodem bereikt.
OPMERKING: Ongeveer 1.000 cpm van de 32P-gelabelde marker kan worden geladen. - Verwijder na de elektroforese de glasplaten uit het elektroforeseapparaat.
- Scheid de twee platen zorgvuldig zodat de gel plat op een glasoppervlak ligt en breng de gel over op een filterpapier en bedek het met plasticfolie.
- Droog de gel vacuüm op het filtreerpapier bij 80 °C gedurende 30 minuten met behulp van een geldroger.
- Plaats de gedroogde gel in een fosforbeeldcassette en bewaar deze een nacht bij RT.
OPMERKING: Het fosforscherm moet vóór gebruik worden gewist met behulp van een lichtbak. - Om het gelbeeld te visualiseren, verwijdert u het scherm en scant u met een fosforbeeldcamera.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De splicing reporter Dup51, een drie exon-twee intron minigen, is afgeleid van het menselijke β-globine gen en is eerder beschreven (Figuur 1A)11,12 . We creëerden een mutante reporter, Dup51p, door ushersyndroom geassocieerde 5'-splice site mutaties te introduceren die voorkomen in exon 3 van het protocadherine 15 (PCDH15) gen13. De 5'-splice site sequence op de exon 2-intron 2 junctie werd veranderd van CAG/GUUGGUAUC naar AUG/GUGUGUAUC (/ is de exon-intron grens) (Figuur 1B)14. Deze sequentieveranderingen veranderen het voorspelde patroon van 5'-splice site basepairing met het endogene U1-snRNA en resulteren ook in het overslaan van exon 2 in het volwassen transcript (figuur 2). Het effect van deze mutaties zou onderdrukt kunnen worden door een compenserende verandering in het 5'-gebied van het U1-snRNA. Substitutie van het uracil door adenine op de 5e positie van het U1-snRNA (U1-5a) keerde het effect van 5'-spliceplaatsmutaties in Dup51p om (figuur 1B).
De splicing van de Dup51- en Dup51p-transcripten kan worden gecontroleerd door primeruitbreiding met behulp van 32P-Dup3r of door semi-kwantitatieve RT-PCR met Dup8f en Dup3r oligonucleotiden (figuur 1); de volgordes zijn weergegeven in tabel 7. Uitgedrukt in HeLa-cellen drukt het Dup51-minigen het volwassen transcript over de volledige lengte uit waarin exon 2 efficiënt wordt gesplitst (figuur 2A,B, baan 1). De 5'-splice site mutaties in Dup51p verminderen exon 2 inclusie van ~95% tot ~30%, wat leidt tot de vorming van het kortere transcript (lane 5). Coexpressie van Dup51p met U1-5a snRNA redt exon 2 splicing en herstelt de vorming van transcriptie over de volledige lengte (lane 8). Coexpressie met wildtype U1 (U1-WT) of U1-5g variant heeft geen vergelijkbaar effect op Dup51p splicing (lanes 6 en 7). U1-WT, U1-5g of U1-5a coexpressie verandert ook niets aan het splicingpatroon van de Dup51-verslaggever (lanes 2-4). Over het algemeen geven deze resultaten aan dat de redding van exon 2-splicing in Dup51p-transcripten specifiek te wijten is aan de U>A-mutatie in het U1-5a-snRNA.
Om de expressie van getransfecteerde U1 snRNA's te controleren, kan primer extension of RT-qPCR worden toegepast. Detectie van U1-5a-variant transcripten door primer extensie maakt gebruik van de U17-26 oligonucleotide, die 20 nucleotiden lang is en basepairs in de buurt van de adenine op de 5e positie van U1 snRNA (Figuur 3A). In aanwezigheid van alleen dATP maakt U17-26 de opname van 2-3 nucleotiden mogelijk voor het endogene wildtype U1-snRNA dat 22 of 23 nucleotiden lang product oplevert (figuur 3B, rijstroken 1, 2, 5 en 6). Voor de U1-5a- en U1-5g-varianten eindigt de uitbreiding na toevoeging van een enkel adenosine dat een 21-nucleotiden lang product produceert (rijstroken 3, 4, 7 en 8). Analyse door RT-qPCR maakt het mogelijk om de toename van de vouw in expressie van de variant U1 over het endogene wildtype snRNA te schatten. Hier zijn U1-specifieke primerparen zo ontworpen dat er geen overlap bestaat met de mutaties die in de variant snRNA's zijn geïntroduceerd (figuur 3A). Na normalisatie naar U2-snRNA-expressie bleken de getransfecteerde U1-WT en de U1-5g- en U1-5a-varianten tot expressie te komen met 3-5 vouwen over het endogene snRNA (figuur 3C). Endogene U1 wordt geschat op 106 kopieën per cel in HeLa-cellen15. Zo worden de exogene variant snRNA's uitgedrukt op ~3-5 maal over de endogene U1. Het vermogen van het U1-5a snRNA om exon 2-inclusie tot ~ 95% te redden, toont aan dat niveaus van de exogene variant snRNA's voldoende zijn voor het splitsen van de ontluikende transcripties van de verslaggever.
| Ingrediënten | Bedrag voor één reactie |
| PNK Buffer (10x) | 2,0 μL |
| T4 Polynucleotide Kinase (T4 PNK) (10.000 U/ml) | 1,0 μL |
| Oligonucleotide* (10 μM) | 10,0 μL |
| 32 P-ATP (10 mM) | 1,0 μL |
| H2O (DEPC behandeld) | 6,0 μL |
| *Voor het labelen van markers wordt 0,5 μL van de pBR322 DNA-MspI Digest of de Low Molecular Weight Marker gebruikt. | |
Tabel 1: 32P-etikettering van oligonucleotiden. Reactie voor de bereiding van een 5′-32P-gelabelde primer met behulp van 32P-ATP.
| Ingrediënten - Master Mix I | Bedrag voor één reactie |
| RNA en H2O (DEPC behandeld) | 6,55 μL |
| 32 P-Dup3r (2,5 μM) | 0,4 μL |
| dNTP (10 mM) | 0,5 μL |
| Ingrediënten – Master Mix II | Bedrag voor één reactie |
| Eerste-streng buffer (5x) | 2,00 μL |
| RNase-remmer (40 U/μL) | 0,25 μL |
| DTT (0,1 m) | 0,05 μL |
| Reverse Transcriptase (RT) (200U/μL) | 0,25 μL |
Tabel 2: 32P-Dup3r primer extensie. Reactie voor de analyse van gesplitste reporter transcripties door primer extensie.
| Ingrediënten - Master Mix I | Bedrag voor één reactie |
| Behandeld met RNA en ddH2O (DEPC) | 11,0 μL |
| Willekeurig hexameer (50 ng/μL) | 1,0 μL |
| dNTP (10 mM) | 1,0 μL |
| Ingrediënten – Master Mix II | Bedrag voor één reactie |
| Eerste-streng buffer (5x) | 4,0 μL |
| RNase-remmer (40 U/μL) | 1,0 μL |
| DTT (0,1 m) | 1,0 μL |
| Reverse Transcriptase (RT) (200U/μL) | 1,0 μL |
Tabel 3: cDNA-synthese. Reactie voor de synthese van cDNA uit totaal RNA.
| Ingrediënten | Bedrag voor één reactie |
| cDNA-sjabloon (100 ng/μL) | 1,00 μL |
| Voorwaartse primer (Dup8f) (10 μM) | 0,25 μL |
| Cy5 Reverse Primer (Cy5-Dup3r) (10 μM) | 0,25 μL |
| dNTP (10 μM) | 0,25 μL |
| Taq Buffer (10x) | 1,25 μL |
| Taq DNA Polymerase (5000 U/mL) | 0,25 μL |
| H2O (DEPC behandeld) | 9,25 μL |
Tabel 4: Fluorescerende RT-PCR. Reactie voor de analyse van de gesplitste reporter transcripties door RT-PCR met behulp van Cy5-gelabelde primer.
| Ingrediënten | Bedrag voor één reactie |
| RNA en H2O (DEPC behandeld) | 4,325 μL |
| dATP (10 mM) | 0,375 μL |
| 32 P-U17-26-R oligo nucleotide* | 1,000 μL |
| Ingrediënten – Master Mix | Bedrag voor één reactie |
| Eerste-streng buffer (5x) | 1,5 μL |
| RNase-remmer (40 U/μL) | 0,1 μL |
| DTT (0,1 m) | 0,1 μL |
| Reverse Transcriptase (RT) (200U/μL) | 0,1 μL |
| *10.000 CPM van het 32P-U17-26-R oligonucleotide moet worden toegevoegd aan het verdunde RNA (stap 6.2.). | |
Tabel 5: 32P-U1-snRNA primer extensie. Reactie voor de analyse van variant U1 snRNA expressie door primer extensie.
| Ingrediënten | Bedrag voor één reactie |
| Real-time PCR-mix | 10,0 μL |
| cDNA (0,2 ng/μL) | 5,0 μL |
| Voorwaartse primer (10 μM) | 0,2 μL |
| Omgekeerde primer (10 μM) | 0,2 μL |
| H2O (DEPC behandeld) | 4,6 μL |
Tabel 6: Kwantitatieve RT-qPCR. Reacties voor kwantitatieve analyse van variant U1 snRNA expressie door RT-qPCR.
| Oligo Naam | Volgorde (5′ tot 3′) | Techniek |
| Dup8f | GACACCATGCATGGTGCACC | Fluorescerende RT-PCR |
| Cy5-Dup3r | /5Cy5/AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC | Fluorescerende RT-PCR |
| Dup3r | AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC | Primer-extensie |
| U17-26r | TGGTATCTCCCCTGCCAGGT | Primer-extensie |
| U1/17-39F | GGAGATACCATGATCACGAAGG | RT-qPCR |
| U1/58-80r | CATCCGGAGTGCAATGGATAAG | RT-qPCR |
| U2/8-19F | CTCGGCCTTTTGGCTAAGATCA | RT-qPCR |
| U2/62-84r | TCCTCGGATAGAGGACGTATCA | RT-qPCR |
Tabel 7: Sequentie van oligonucleotidenprimers. Lijst met primernamen, sequenties en de techniek waarvoor de primers werden gebruikt.
Figuur 1: Dup51 en Dup51p Minigene Reporters. (A) Schematische weergave van de drie-exon/twee-intron minigene reporters, Dup51 en Dup51p. Locaties van de Dup8f en Dup3r in respectievelijk exonen 1 en 3 zijn aangegeven. (B) Voorspelde basepairing van het wildtype U1 snRNA en de U1-5a variant met de 5'splice site sequences van Dup51 en Dup51p reporter transcripties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Analyse van Spliced Reporter Transcripts. HeLa-cellen werden gecotransfecteerd met de Dup51- of Dup51p-minigenplasmiden en pcDNA-controle- of pNS6U1-plasmiden voor U1-WT, U1-5g of U1-5a snRNA's. (A) Primer extensie analyse met 32P-gelabelde Dup3r primer die de splicing van de Dup51 en Dup51p minigene transcripten aantoont. De mRNA-producten worden links van het gelbeeld aangegeven. Het percentage van het volledige product (± s.d., n = 3) werd berekend uit bandintensiteiten van de twee mRNA-isovormen en is weergegeven in de onderstaande grafieken. (B) RT-PCR-analyse met Dup8f- en Cy5-Dup3r-primers op cDNA, bereid uit totaal RNA geëxtraheerd uit HeLa-cellen, waaruit splicing van de Dup51- of Dup51p-minigen-transcripten blijkt. De mRNA-producten worden links van het gelbeeld aangegeven. Het percentage van het volledige product (± s.d., n = 3) werd berekend uit bandintensiteiten van de twee mRNA-isovormen en is weergegeven in de onderstaande grafieken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Analyse van de variant U1-5a snRNA. HeLa-cellen werden gecotransfecteerd met de Dup51- of Dup51p-minigenplasmiden en pcDNA-controle- of pNS6U1-plasmiden voor U1-WT, U1-5g of U1-5a snRNA's. (A) Een tweedimensionale weergave van de U1-snRNA-sequentie. Positie van de U17-26R primer, gebruikt voor primer extensie analyse van U1 snRNA, wordt aangegeven door de rode lijn. Positie van U1/17-39F en U1/58-80R primers, gebruikt voor RT-qPCR van U1 snRNA, wordt aangegeven door de blauwe lijnen. (B) Primer extensie analyse met 32P-gelabelde U17-26 om de expressie van het wildtype U1 snRNA en de U1-5g en U1-5a varianten te detecteren. Posities van de producten gevormd uit U1-WT en de varianten snRNA's worden aangegeven. (C) RT-qPCR-analyse van de niveaus van U1-snRNA-expressie in Hela-cellen. De vouwverandering in U1-snRNA-expressie werd berekend ten opzichte van de pcDNA-negatieve controle en genormaliseerd tot U2-snRNA, vouwverandering (± s.d.; n = 3) in U1 is in een grafiek weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De test kan worden aangepast voor splicinganalyse in andere cellijnen dan HeLa, maar factoren die van invloed zijn op de transfectie-efficiëntie, zoals celconfluentie en hoeveelheid DNA, moeten mogelijk worden geoptimaliseerd. De reporter-U1-constructverhouding is een andere kritische parameter die mogelijk moet worden bepaald, afhankelijk van de expressieniveaus die in andere celtypen worden waargenomen. De kwaliteit van geëxtraheerd RNA is van cruciaal belang voor splicinganalyse; daarom wordt het gebruik van RNase-vrij water en het ontsmetten van oppervlakken met RNase-inactiverende middelen ten zeerste aanbevolen.
Analyse van reporter transcripties door middel van primer extensie of fluorescerende RT-PCR leveren vergelijkbare resultaten op, vandaar dat beide technieken kunnen worden gebruikt voor het monitoren van veranderingen in de opname van exon 2 in het volwassen transcript. De fluorescerende PCR-reactie moet worden gestopt en gekwantificeerd in de exponentiële fase van amplificatie, die afhankelijk is van de initiële RNA-concentratie. Het aantal amplificatiecycli moet dus mogelijk worden bepaald voor assays met andere transfectieomstandigheden dan die hier worden beschreven. Het gebruiksgemak door het niet-radioactieve karakter is een voordeel van de RT-PCR assay. Hoewel primerverlenging met radioactief gelabelde primer extra veiligheidsmaatregelen vereist, kan het signalen van een lage hoeveelheid RNA detecteren. De lage doorvoer van primer extension en RT-PCR is een beperking van deze assay.
De U1 snRNP-complementatietest is voor meerdere doeleinden gebruikt. Naast het omkeren van de effecten van mutaties op de 5'-spliceplaats, zijn U1-snRNA's met veranderingen in het 5'-gebied toegepast voor gen-uitschakeling en voor het bestuderen van splicingmechanismen. Fortes et al. toonden aan dat het richten van U1 snRNA's op terminale exonen van endogene transcripten genexpressie efficiënt kan remmen16. Roca et al. gebruikten de U1-complementatie om de niet-canonieke mechanismen van 5'-splice site herkenning te bestuderen en toonden aan dat het U1 snRNA kan basepair naar 5's-splice sites in een alternatief register waar basepairing wordt verschoven door één nucleotide en ook in "bulge registers" waar uitpuilende nucleotiden aanwezig zijn in het pre-mRNA of het snRNA17, 18. Dit reportersysteem kan mogelijk worden gebruikt om de rol van U1 snRNP te bestuderen bij het splitsen van modulatie door kleine moleculen en het splitsen van regulerende eiwitten. Door exon 2 van Dup51p te vervangen door een doelexon, kan de test worden toegepast voor het onderzoeken van het werkingsmechanisme van kleine moleculen waarvan bekend is dat ze de splicing van specifieke exonen verbeteren of onderdrukken, zoals in het geval van splice switching compounds19. Door regulerende sequenties voor alternatieve splicingfactoren in de exonen of introns op te nemen, zou het mogelijk moeten zijn om U1-afhankelijkheid bij splicingregulatie te onderzoeken. Dit concept werd door Hamid et al. toegepast om de betrokkenheid van de stamlus 4 van het U1-snRNA bij splicingregulatie door het polypyrimidinekanaalbindend eiwit 120 aan te tonen. We hebben deze test gebruikt om de functies van stamlussen 3 en 4 van het U1-snRNA te bestuderen. Door mutaties op te nemen in de stamlus van de suppressor U1-5a snRNA die een mutante 5'-splice site activeert in de Dup51p splicing reporter, hebben we hun cruciale rol geïdentificeerd in de vorming van kruisintroncontacten met het U2 snRNP-specifieke eiwit SF3A1 in de vroege stappen van spliceosoomassemblage14,21. Zo dient de drie-exon twee-intron Dup51-reporter als een adaptief hulpmiddel voor het monitoren van splicing-efficiëntie in studies naar mechanismen die ten grondslag liggen aan spliceosoomassemblage en splicing-geassocieerde ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door fondsen aan S.S. van de National Institutes of Health (R21CA170786 en R01GM127464) en de American Cancer Society (de Institutional Research Grant 74-001-34-IRG) en aan S.S. en W.M. van het Valley Research Partnership Program (P1-4009 en VRP77). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium - Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent - Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands - Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents - RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix - SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S.
- Ward, A. J., Cooper, T. A.
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
