Summary
Этот протокол описывает минигенный репортерный анализ для мониторинга влияния мутаций 5-образного сайта сращивания на сплайсинг и разрабатывает супрессор U1 snRNA для спасения ингибирования сплайсинга, вызванного мутациями. Конструкции репортера и супрессора U1 snRNA экспрессируются в клетках HeLa, а сплайсинг анализируется путем праймерного расширения или ОТ-ПЦР.
Abstract
Во время экспрессии генов жизненно важный этап сплайсинга пре-мРНК включает в себя точное распознавание участков сращивания и эффективную сборку сплайсеосомальных комплексов для соединения экзонов и удаления интронов до цитоплазматического экспорта зрелой мРНК. Эффективность сплайсинга может быть изменена наличием мутаций в местах сращивания, влиянием транс-действующих факторов сплайсинга или активностью терапевтических средств. Здесь мы описываем протокол для клеточного анализа, который может быть применен для мониторинга эффективности сплайсинга любого данного экзона. В анализе используется адаптируемый плазмидный закодированный 3-экзон/2-интронный минигенный репортер, который может быть экспрессирован в клетках млекопитающих путем транзиторной трансфекции. После трансфекции выделяют общую клеточную РНК, а эффективность сплайсинга экзонов в репортерной мРНК определяют либо расширением праймера, либо полуколичественной обратной транскриптазно-полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Мы описываем, как влияние связанных с заболеванием 5' мутаций сращивания может быть определено путем введения их в репортер; и как подавление этих мутаций может быть достигнуто путем совместной трансфекции с конструкцией малой ядерной РНК (snRNA) U1, несущей компенсаторные мутации в ее 5'-области, которая базирует пары с 5'-сращивающимися участками на экзон-интронных переходах в премРНК. Таким образом, репортер может быть использован для проектирования терапевтических частиц U1 для улучшения распознавания мутантных 5' сращивающихся сайтов. Вставка цис-действующих регуляторных сайтов, таких как последовательности усилителя сращивания или глушителя, в репортер также может быть использована для изучения роли U1 snRNP в регулировании, опосредованном конкретным альтернативным фактором сплайсинга. Наконец, репортерные экспрессирующие клетки могут быть инкубированы с небольшими молекулами для определения влияния потенциальных терапевтических средств на конститутивное сплайсинг пре-мРНК или на экзоны, несущие мутантные 5' места сращивания. В целом, репортерный анализ может быть применен для мониторинга эффективности сплайсинга в различных условиях для изучения фундаментальных механизмов сплайсинга и заболеваний, связанных со сплайсингом.
Introduction
Сплайсинг пре-мРНК является важным этапом обработки, который удаляет некодирующие интроны и точно кодирует кодирующие экзоны для формирования зрелой мРНК. Распознавание консенсусных последовательностей на экзон-интронных переходах, называемых 5'-сращивающим участком и 3'-сращивающим участком, компонентами сращивающего механизма инициирует процесс сращивания. Малый ядерный рибонуклеопротеин U1 (snRNP) распознает сайт 5'-сращивания путем спаривания основания snRNA U1 с пре-mRNA1. Генетически унаследованные мутации, которые изменяют последовательности 5'-сращивания, связаны со многими заболеваниями2,3. Прогнозируется, что потеря парировки основания snRNA U1 с мутантными 5'-сращивающими сайтами вызывает аберрантное сплайсинг, что может поставить под угрозу трансляцию пораженного транскрипта. Потенциальный терапевтический подход к исправлению дефектов сплайсинга включает подавление мутаций модифицированной U1 snRNA, несущей компенсаторные нуклеотидные изменения в своей 5'-области, которая имеет основания с 5'-сращенным участком. Было обнаружено, что такие модифицированные U1 snRNAs, также называемые экзон-специфическими U1 snRNAs, эффективны в обращении вспять дефектов сплайсинга, что приводит к увеличению экспрессии белка из спасенной мРНК4,5,6,7,8.
Здесь мы описываем анализ комплементации U1 snRNP, основанный на репортерах клеточный сплайсинг, который позволяет оценить влияние мутаций 5'ss на сплайсинг экзона, а также может быть использован для разработки модифицированных U1 snRNAs для спасения включения экзонов. Мы также предоставляем протоколы для мониторинга сращенных репортерных транскриптов с помощью праймерного расширения и ОТ-ПЦР, а также для определения экспрессии модифицированных snRNAs U1 с помощью праймерного расширения и RT-qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Реагенты и буферы
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся стерилизация с использованием вакуумных фильтров должна выполняться с мембраной 0,2 мкм полиэфирсульфона (PES) в шкафу биобезопасности.
- Приготовьте воду без РНКазы, добавив 1,0 мл диэтилпирокарбоната (DEPC) к 1,0 л деионизированной воды, перемешайте в течение не менее 1 часа при комнатной температуре (RT), дважды автоклав, а затем охладите до RT перед использованием.
- Приготовьте модифицированную орлиную среду Dulbecco (DMEM), смешав один пакет порошка DMEM (13,4 г), 3,7 г бикарбоната натрия, 100 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS), пенициллин и стрептомицин с ~ 800 мл стерильной деионизированной воды. Конечная концентрация пенициллина и стрептомицина в ДМЭМ должна составлять 50 Ед/мл и 50 мкг/мл соответственно. Отрегулируйте pH до 7,4, а затем восполните объем до 1,0 л стерильной деионизированной водой. Стерилизуют путем фильтрации и хранят при температуре 4 °C.
- Приготовьте 10x фосфатного буферного физиологического раствора (10x PBS), добавив 25,6 г гептагидрата водорода динатрия (Na2HPO4· 7H2O), 2 г дигидрофосфата калия (KH2PO4), 2 г хлористого калия (KCl) и 80 г хлорида натрия (NaCl) до 800 мл деионизированной воды. Перемешать до растворения и восполнить объем до 1,0 л. Стерилизовать фильтрацией и хранить при 4 °C.
- Приготовьте 0,5 М этилендиамина тетра-уксусной кислоты (ЭДТА), растворив 186,1 г Na2•EDTA•2H2O в ~800 мл деионизированной воды. Отрегулируйте pH до 8,0, а затем увеличьте объем до 1,0 л стерильной деионизированной водой. Стерилизуют путем фильтрации и хранят при температуре 4 °C.
- Готовят 1-кратный раствор трипсина-ЭДТА, смешивая 100 мл 10-кратного трипсина (2,5%), 2 мл 0,5 М ЭДТА, и добавляют 1x PBS до 1,0 л. Стерилизуют фильтрацией и аликвотой в конические пробирки по 50 мл. Хранить при температуре 4 °C в течение 1-2 недель или заморозить при -20 °C для длительного использования.
- Получают 2-кратный формамидный краситель для загрузки ДНК/РНК путем смешивания 14,4 мл формамида и 0,6 мл 0,5 М ЭДТА для конечного объема 15 мл. Добавьте бромфеноловый синий и ксилол-цианоловый порошок до конечной концентрации 0,02% и храните при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Формамид токсичен и коррозионен. Ознакомьтесь с паспортами безопасности материалов для получения дополнительных рекомендаций по безопасности. - Приготовьте 5x буфер Tris/Borate/EDTA (5x TBE), смешивая 54,0 г основания tris, 27,5 г борной кислоты и 20 мл 0,5 M ЭДТА в ~800 мл деионизированной воды. Смешайте до растворения и восполните объем до 1,0 л с деионизированной водой.
- Готовят раствор мочевинно-полиакриламидного геля электрофореза (urea-PAGE), смешивая 200 мл 5x TBE, 250 мл 40% 19:1 бис/акриламид и 450,5 г мочевины. Затем добавляют деионизированную воду до 1,0 л. Смешивают до полного растворения ингредиентов, затем стерилизуют фильтрацией и хранят при 4 °C в янтарной стеклянной бутылке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бис/акриламид токсичен. Ознакомьтесь с паспортами безопасности материала для получения дополнительных процедур безопасности. - Готовят 10% персульфат аммония (АФС), растворяя 1 г АФС в 10 мл деионизированной воды и хранят при 4 °C.
2. Котрансфекция клеток HeLa с репортерными и U1 snRNA плазмидами
ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфекция клеток Hela должна выполняться в стерильных условиях в шкафу биологической безопасности. Наружная поверхность всех материалов должна быть опрыскана 70% этанолом перед введением в шкаф биологической безопасности.
- Поддерживайте клетки Hela в DMEM в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO2 путем пропускания каждые 2-3 дня, когда клетки составляют около 80-90% слива.
- Для пропускания клеток HeLa аспирируют отработанную среду, а затем инкубируют клетки с 3 мл 0,25% трипсина, содержащего 1 мМ ЭДТА при 37 °C в течение 3 мин.
- После инкубации добавить 7 мл свежего ДМЭМ. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 10 мл, центрифугу при 1000 х г в течение 5 мин.
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл свежего DMEM, а затем нанесите клетки на новую чашку для культуры тканей при 20% слиянии.
- Для переходных трансфекций подсчитайте клетки Hela с помощью чистого слайда гемоцитометра и подготовьте суспензию плотностью 2,5 х 105 клеток/мл.
- Посейте 1,0 мл 2,5 х 105 клеток/мл клеточной суспензии Hela в каждую лунку из 12-луночной пластины и инкубируют в течение ночи при 37 °C.
- На следующий день аспирировать отработанную среду и добавить 0,8 мл свежего ДМЭМ с сывороткой.
- Готовят раствор I, добавляя 0,2 мкг репортерной плазмиды Dup51 или Dup51p, 1,8 мкг pcDNA, pNS6U1 или pNS6U1-5a плазмиды и 100 мкл трансфекционной среды в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
- Приготовьте главную смесь раствора II для всех образцов, подлежащих трансфекции, добавив 100 мкл трансфекционной среды и 4,0 мкл трансфекционного реагента на образец.
- Приготовьте трансфекционную смесь, добавив 100 мкл раствора II в каждую микроцентрифужную трубку, содержащую раствор I.
- Вихревую трансфекцию смешивают в течение 15 с, центрифугу в настольной микроцентрифуге при 3000 х г в течение 10 с при РТ, а затем инкубируют при РТ в течение 5 мин.
- Добавьте все 200 мкл трансфекционной смеси в одну лунку 12-луночной клеточной пластины HeLa для достижения конечного объема 1,0 мл на лунку и инкубируйте пластину при 37 °C в течение 48 часов.
- После инкубации экстрагируют РНК из трансфектированных клеток HeLa коммерчески доступным раствором гуанидина тиоцианата и фенола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот реагент содержит фенол, и этот этап должен быть выполнен в вытяжном шкафу. Использование очищенной DEPC воды рекомендуется для повторного суспендирования экстрагированной РНК.- Аспирировать отработанную среду и добавить в каждую лунку по 500 мкл реагента. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
- Гомогенизация путем пипетки вверх и вниз. Затем переложите раствор в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
- Добавьте 100 мкл хлороформа и вихря в течение 15 с.
- Центрифуга при 12 000 х г в течение 15 мин при RT.
- Перенос 200 мкл РНК, содержащего верхний водный слой, в новую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
- Добавьте 2 мкг гликогена и 200 мкл изопропанола к каждому образцу РНК. Перемешайте, перевернув трубки.
- Собирают осадок РНК путем центрифугирования при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
- Удалите и выбросьте супернатант, не нарушая гранулу РНК.
- Промыть гранулу дважды, добавив 1,0 мл 70% этанола, перевернув трубки и центрифугируя, как описано на этапе 2.13.7.
- Гранулы сушат на воздухе в течение ~10-20 мин при РТ и повторно суспендируют РНК в 10-20 мкл воды, не содержащей РНКазы.
- Определение концентрации РНК путем измерения абсорбции при 260 нм, как описано Desjardins и Conklin9.
- Продолжайте удлинение праймера или храните образцы РНК при -20 °C. Изолированная РНК может храниться при -20 °C в течение 6-12 месяцев.
3. 32P-маркировка олигонуклеотидов
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы, связанные с использованием олигонуклеотидов , меченных 32P-АТФ и 32P, должны выполняться за акриловым щитом подготовленными лицами с разрешения уполномоченных учреждений. Протокол, описанный ниже, может быть использован для маркировки олигонуклеотидов, Dup3r и U17-26-R, а также маркеров для мочевины-PAGE. Использование очищенной DEPC воды рекомендуется для повторного суспензии олигонуклеотидов и исключения размеров шариков.
- К микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл добавляют олигонуклеотид, полинуклеотидкиназу Т4 (Т4 ПНК), буфер Т4 ПНК и 32P-АТФ, как описано в Таблице 1. В последнюю очередь добавить в смесь 32P-АТФ; это важно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для добавления радиоактивных растворов рекомендуется использовать наконечники фильтров. - Инкубировать на водяной бане при 37 °C в течение 30 мин.
- В то время как реакции маркировки инкубируются, повторно суспендируйте шарики исключения размера с молекулярной массой 25 кДа, отрезанными путем осторожного вихря в течение ~ 10 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шарики для исключения размеров должны быть приготовлены в соответствии с инструкциями завода-изготовителя и храниться в виде 50% суспензии в 25% этаноле при 4°C. - Подготовьте колонны, переместив 600 мкл повторно суспендированных шариков в одноразовый мини-столбец, помещенный в трубку для сбора 1,5 мл, и вернув булатный материал до 4 °C.
- Центрифуга при 2 000 х г в течение 1 мин при РТ и отбрасывает поток насквозь.
- Вымойте шарики, добавив в колонку 300 мкл воды без РНКазы.
- Повторите шаги 3.5. и 3.6. дважды и перенесите мини-колонку в новую центрифужную трубку объемом 1,5 мл.
- Добавляют реакционную смесь киназы в колонку шарика и центрифугу при 5000 х г в течение 1 мин при РТ.
- Соберите и сохраните поток, который имеет 32P-меченый олигонуклеотид, и выбросьте все наконечники и трубки в акриловый ящик для отходов.
- Добавьте 20 мкл войны без РНКазы, чтобы разбавить 32P-меченый олигонуклеотид до конечной концентрации 2,5 мкМ.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавьте маркированные маркеры по мере необходимости для загрузки на гели мочевины-PAGE. - Храните меченый олигонуклеотид в коробке из акриловых микротрубок при -20 °C или продолжайте анализ растяжения грунтовки.
4. Анализ сращенных репортерских расшифровок по праймерному расширению
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием рекомендуется очищать поверхности и оборудование реагентом, инактивирующим РНКазу.
- Добавьте 2,0 мкг РНК, извлеченной из клеток Hela, в отдельные микроцентрифужные трубки объемом 200 мкл и добавьте воду без РНКазы, чтобы составить объем до 6,55 мкл.
- Приготовьте Master Mix I с разбавленными 32P-Dup3r и dNTP, как показано в таблице 2, и добавьте 0,9 мкл смеси в каждую ПЦР-трубку, содержащую образцы РНК.
- Инкубируют пробирки, сначала при 65 °C в течение 5 мин, а затем на льду в течение 1 мин.
- Приготовьте Master Mix II с 5-кратным буфером первой нити, дитиотрейтолом (DTT), ингибитором РНКазы и обратной транскриптазой, как показано в таблице 2.
- Добавьте 2,55 мкл смеси в каждую трубку, содержащую РНК и Master Mix 1; общий объем реакции должен составлять 10 мкл. Держите пробирки при РТ в течение 10 мин.
- Переложите трубки в сухую ванну или термальный циклер и инкубируйте сначала при 50 °C в течение 60 мин, а затем при 70 °C в течение 15 мин.
- После инкубации добавьте 10 мкл 2-кратного формамидного РНК-нагрузочного красителя к каждому образцу и храните в акриловой коробке при -20 °C или приступайте к разделению фрагментов мочевиной-PAGE с использованием геля длиной 14 см и визуализации изображения геля, как описано ниже на этапе 8.
- Выполните денситометрическое сканирование гелевого изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений и используйте интенсивности полос включенных и пропущенных продуктов для расчета процента включения экзона 2, как показано ниже.
5. Анализ сращенных репортерских расшифровок флуоресцентной ОТ-ПЦР
ПРИМЕЧАНИЕ: В анализе ОТ-ПЦР, описанном ниже, используются случайные гексамеры для синтеза кДНК и комбинация немаркированных олигонуклеотидов Dup8f и Cy5-меченых Dup3r для амплификации ПЦР сращенных продуктов.
- Для синтеза кДНК добавьте 2,0 мкг РНК, извлеченной из трансфектированных клеток Hela, в отдельные микроцентрифужные трубки объемом 200 мкл и добавьте воду без РНКазы, чтобы составить объем до 11,0 мкл.
- Приготовьте Master Mix I, содержащий случайные гексамеры и dNTP, как показано в таблице 3 , и добавьте 2,0 мкл смеси к каждому образцу. Инкубировать, сначала при 65 °C в течение 5 мин, затем на льду в течение 1 мин.
- Приготовьте Master Mix II, содержащий буфер первой нити, ингибитор РНКАЗЫ, DTT и обратную транскриптазу, как показано в таблице 3 , и добавьте 7,0 мкл смеси в каждую трубку, содержащую РНК и Master Mix I.
- Держите пробирки при RT в течение 10 мин, а затем инкубируйте при 50 °C в течение 60 мин и 70 °C в течение 15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Завершенные реакции кДНК могут храниться при -20 °C. - Для ПЦР перенесите 1,0 мкл (100 нг/мкл) каждого образца кДНК в новые пробирки ПЦР.
- Приготовьте мастер-смесь, состоящую из Dup8f, Cy5-Dup3r, dNTPs, Taq-буфера, Taq-полимеразы и воды, как описано в таблице 4 , и добавьте 11,5 мкл смеси в каждую пробирку, содержащую кДНК.
- Выполняют ПЦР с помощью термоциклера с начальным шагом денатурации при 94 °C в течение 3 мин; затем 20 циклов денатурации (94 °C в течение 30 с), отжига (65 °C в течение 30 с) и удлинения (72 °C в течение 15 с), а также этап окончания при 72 °C в течение 5 мин.
- Добавьте 12,5 мкл 2-кратного формамидного ДНК-нагрузочного красителя в каждую трубку и нагревайте при 95 °C в течение 5 мин.
- Храните реакцию ПЦР при -20 °C или продолжайте с мочевиной-PAGE, как описано ниже на этапе 8.1-8.4.
- После электрофореза извлеките стеклянные пластины из аппарата электрофореза и просканируйте с помощью флуоресцентного тепловизора для визуализации геля.
- Выполните денситометрическое сканирование гелевого изображения и используйте интенсивность полосы входящих и пропущенных продуктов для расчета процента включения экзона 2, как описано в Шаге 4.8.
6. Анализ варианта экспрессии snRNA U1 по праймерному расширению
- Добавьте 2,0 мкг РНК, извлеченной из клеток Hela, в отдельные микроцентрифужные трубки объемом 200 мкл и добавьте воду без РНКазы, чтобы составить объем до 4,325 мкл, а затем добавьте dATP, как показано в таблице 5.
- Добавьте 10 000 CPM олигонуклеотида 32P-U17-26-R в каждую трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления 10 000 cpm/μl раствора 32P-U17-26-R (из этапа 3) разбавляют меченый олигонуклеотид (разбавление 1:20), определяют cpm в 1,0 мкл с помощью сцинтилляционного счетчика и далее разбавляют деионизированной водой для приготовления раствора 10 000 cpm/μL в новой микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл. - Инкубировать при 65 °С в течение 5 мин, а затем на льду в течение 1 мин.
- Приготовьте мастер-микс с 5-кратным буфером первой нити, ингибитором РНКАЗЫ, DTT и обратной транскриптазой, как показано в таблице 5 , и добавьте 1,8 мкл смеси к каждому образцу.
- Инкубировать, сначала при RT в течение 10 мин, а затем при 42 °C в течение 10 мин.
- После инкубации добавьте 10 мкл 2x формамидного РНК-нагрузочного красителя в каждый образец и храните в акриловой коробке при -20 °C или приступайте к разделению фрагментов мочевиной-PAGE с использованием геля длиной 38 см (см. Шаг 8).
7. Анализ экспрессии варианта snRNA U1 методом RT-qPCR
- Разбавить запас кДНК, приготовленный, как описано выше на этапах 5.1 - 5.4, до концентрации 0,2 нг/мкл.
- Пипетка 5,0 мкл разбавленной кДНК в отдельные скважины 96-луночной qPCR пластины в трех экземплярах. Добавьте деионизированную воду вместо кДНК для управления без шаблона (NTC).
- Приготовьте две отдельные грунтовочные смеси, состоящие из прямой и обратной грунтовок для snRNAs U1 и U2 и воды, как показано в таблице 6.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности для U1 и U2 snRNA-специфических праймеров приведены в таблице 7. - Добавьте 5,0 мкл грунтовочной смеси snRNA U1 и U2 к образцу и лункам NTC.
- Добавьте 10,0 мкл ПЦР-смеси в режиме реального времени в каждую лунку.
- Запечатайте пластины оптической пленкой, затем центрифугу при 1000 х г в течение 2 мин на РТ для сбора реакций на дно скважин.
- Выполняют qPCR с начальной стадией денатурации при 95 °C в течение 10 мин, за которой следуют 40 циклов 2-ступенчатого протокола, состоящего из денатурации (95 °C в течение 15 с) и отжига/расширения (62 °C в течение 60 с) при сборе значений порогового цикла количественной оценки (Cq) целевых ампликонов.
- Завершите реакцию qPCR, проверив наличие одного пика в кривой диссоциации для реакций snRNA U1 и U2.
- Из значений Cq рассчитайте дельта Cq (ΔCq) для snRNAs U1 и U2 по сравнению с контролем ПХДНК.
- Определите вариант выражения snRNA U1 как относительную величину (RQ) U1 по сравнению с U2, используя значение ΔΔCq, как показано ниже для всех образцов.
8. Настройка и запуск гелей Urea-PAGE
ПРИМЕЧАНИЕ: Сборка стеклянных пластин и гелевого рабочего аппарата должна производиться в соответствии с инструкциями завода-изготовителя. Литье 10% геля мочевины-PAGE может быть выполнено в соответствии с ранее описанным протоколом Summer et al.10. Этапы, связанные с подготовкой маркеров и образцов, а также запуском и визуализацией гелей, описаны ниже. Необязательно, чтобы предотвратить прилипание геля к стеклянным пластинам, внутренняя поверхность может быть покрыта силиконовым раствором путем добавления 1 мл раствора на поверхность и равномерного распределения по всей поверхности тканью. После высыхания пластины следует промыть деионизированной водой и снова высушить.
ВНИМАНИЕ: Неполимеризованный акриламид является нейротоксичным и должен обрабатываться с защитой, рекомендованной в паспорте безопасности материала.
- Подготовьте образцы и маркеры грунтовки путем нагревания при 95 °C в течение 5 мин, а затем центрифугирования в настольной микроцентрифуге при 3000 х г в течение 5 с при РТ.
- Перед загрузкой маркеров и образцов промывайте скважины 1x буфером TBE, чтобы удалить осевший мочевину.
- Загрузите 10 мкл / образец / скважину и запустите гель при 300-500 В в течение 2-3 часов или до тех пор, пока ксилол цианол не достигнет дна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Около 1000 копий в минуту маркера с маркировкой 32P могут быть загружены. - После электрофореза снимите стеклянные пластины с аппарата электрофореза.
- Тщательно разделите две пластины так, чтобы гель лежал ровно на любой стеклянной поверхности, перенесите гель на фильтровальную бумагу и накройте полиэтиленовой пленкой.
- Вакуумная сушка геля на фильтровальной бумаге при 80 °C в течение 30 мин с помощью гелевой сушилки.
- Поместите высушенный гель в люминофорную кассету и храните в RT на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Люминофорный экран должен быть стерт с помощью светового короба перед использованием. - Чтобы визуализировать изображение геля, снимите экран и отсканируйте с помощью люминофорного тепловизора.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сплайсинг-репортер Dup51, миниген из трех экзонов-двух интронов, был получен из гена β-глобина человека и был описан ранее (рисунок 1A)11,12. Мы создали мутантный репортер Dup51p, введя мутации сайта 5'-сращивания, связанные с синдромом Ашера, которые происходят в экзоне 3 гена протокадгерина 15 (PCDH15)13. Последовательность 5'-сращивания участка на экзонном 2-интронном 2-дюймовом переходе была изменена с CAG/GUUGGUAUC на AUG/GUGUGUAUC (/ является границей экзон-интрон) (рисунок 1B)14. Эти изменения последовательности изменяют предсказанную картину 5'-сращивания основания сайта с эндогенной snRNA U1, а также приводят к пропуску экзона 2 в зрелом транскрипте (рисунок 2). Эффект этих мутаций может быть подавлен компенсаторным изменением в 5'-области snRNA U1. Замена урацила аденином в 5-м положении snRNA U1 (U1-5a) обратила вспять эффект мутаций 5'-сращивания в Dup51p (рисунок 1B).
Сплайсинг транскриптов Dup51 и Dup51p можно контролировать с помощью расширения праймера с использованием 32P-Dup3r или полуколичественной ОТ-ПЦР с использованием олигонуклеотидов Dup8f и Dup3r (рисунок 1); последовательности приведены в таблице 7. При экспрессии в клетках HeLa миниген Dup51 экспрессирует зрелый полноразмерный транскрипт, в котором экзон 2 эффективно сращивается (рисунок 2A, B, полоса 1). Мутации 5'-образного участка сращивания в Dup51p уменьшают включение экзона 2 с ~95% до ~30%, что приводит к образованию более короткого транскрипта (полоса 5). Коэкспрессия Dup51p с U1-5a snRNA спасает сращивание экзона 2 и восстанавливает формирование полноразмерного транскрипта (полоса 8). Коэкспрессия с вариантом дикого типа U1 (U1-WT) или U1-5g не оказывает аналогичного влияния на сплайсинг Dup51p (полосы 6 и 7). Коэкспрессия U1-WT, U1-5g или U1-5a также не изменяет схему сращивания репортера Dup51 (полосы 2-4). В целом, эти результаты показывают, что спасение сплайсинга экзона 2 в транскриптах Dup51p происходит именно из-за мутации U>A в snRNA U1-5a.
Для мониторинга экспрессии трансфектированных U1 snRNAs может быть применено расширение праймера или RT-qPCR. Для обнаружения вариантов транскриптов U1-5a с помощью праймерного расширения используется олигонуклеотид U17-26 , который имеет длину 20 нуклеотидов и пары оснований вблизи аденина в 5-м положении snRNA U1 (рисунок 3A). В присутствии только dATP U17-26 позволяет включать 2-3 нуклеотида для эндогенной snRNA дикого типа U1, дающей 22 или 23 нуклеотидов длинного продукта (рисунок 3B, полосы 1, 2, 5 и 6). Для вариантов U1-5a и U1-5g расширение заканчивается после добавления одного аденозина, производящего 21 нуклеотид длинного продукта (полосы 3, 4, 7 и 8). Анализ методом RT-qPCR позволяет оценить кратное увеличение экспрессии варианта U1 над эндогенной snRNA дикого типа. Здесь пары специфических праймеров U1 спроектированы таким образом, что не существует перекрытия с мутациями, введенными в вариант snRNAs (рисунок 3A). После нормализации экспрессии snRNA U2 трансфектированные U1-WT, а также варианты U1-5g и U1-5a экспрессируются в 3-5 раз по сравнению с эндогенной snRNA (рисунок 3C). Эндогенный U1, по оценкам, присутствует в 106 копиях на клетку в клетках HeLa15. Таким образом, экзогенный вариант snRNAs экспрессируется в ~3-5 раз по сравнению с эндогенным U1. Способность snRNA U1-5a спасать включение экзона 2 до ~95% демонстрирует, что уровни экзогенных вариантов snRNAs достаточны для сплайсинга зарождающихся репортерных транскриптов.
| Ингредиенты | Количество за одну реакцию |
| Буфер PNK (10x) | 2.0 мкл |
| T4 Полинуклеотидкиназа (T4 PNK) (10 000 Ед/мл) | 1.0 мкл |
| Олигонуклеотид* (10 мкМ) | 10.0 мкл |
| 32 См. P-ATP (10 мМ) | 1.0 мкл |
| H2O (обработанный DEPC) | 6.0 мкл |
| *Для маркировки маркеров используется 0,5 мкл pBR322 DNA-MspI Digest или низкомолекулярный маркер. | |
Таблица 1: 32P-маркировка олигонуклеотидов. Реакция на получение 5'-32P-меченой грунтовки с использованием 32P-АТФ.
| Ингредиенты - Мастер Микс I | Количество за одну реакцию |
| РНК и H2O (обработанные DEPC) | 6.55 мкл |
| 32 См. P-Dup3r (2,5 мкМ) | 0.4 мкл |
| дНТП (10 мМ) | 0.5 мкл |
| Ингредиенты – Мастер Микс II | Количество за одну реакцию |
| Буфер первой пряди (5x) | 2.00 мкл |
| Ингибитор РНКАЗЫ (40 Ед/мкл) | 0.25 мкл |
| Диафрагма (0,1 м) | 0.05 мкл |
| Обратная транскриптаза (RT) (200U/μL) | 0.25 мкл |
Таблица 2: Удлинитель грунтовки 32P-Dup3r. Реакция на анализ сращенных репортерских расшифровок по праймерному расширению.
| Ингредиенты - Мастер Микс I | Количество за одну реакцию |
| РНК и ddH2O (обработанные DEPC) | 11.0 мкл |
| Случайный гексамер (50 нг/мкл) | 1.0 мкл |
| дНТП (10 мМ) | 1.0 мкл |
| Ингредиенты – Мастер Микс II | Количество за одну реакцию |
| Буфер первой пряди (5x) | 4.0 мкл |
| Ингибитор РНКАЗЫ (40 Ед/мкл) | 1.0 мкл |
| Диафрагма (0,1 м) | 1.0 мкл |
| Обратная транскриптаза (RT) (200U/μL) | 1.0 мкл |
Таблица 3: Синтез кДНК. Реакция на синтез кДНК из общей РНК.
| Ингредиенты | Количество за одну реакцию |
| Шаблон кДНК (100 нг/мкл) | 1.00 мкл |
| Грунтовка форвардная (Dup8f) (10 мкМ) | 0.25 мкл |
| Cy5 Обратная грунтовка (Cy5-Dup3r) (10 мкМ) | 0.25 мкл |
| дНТП (10 мкМ) | 0.25 мкл |
| Буфер Taq (10x) | 1.25 мкл |
| Taq ДНК-полимераза (5000 Ед/мл) | 0.25 мкл |
| H2O (обработанный DEPC) | 9.25 мкл |
Таблица 4: Флуоресцентная ОТ-ПЦР. Реакция на анализ сращенных репортерных транскриптов методом ОТ-ПЦР с использованием Cy5-меченого праймера.
| Ингредиенты | Количество за одну реакцию |
| РНК и H2O (обработанные DEPC) | 4.325 мкл |
| дАТП (10 мМ) | 0.375 мкл |
| 32 См. P-U17-26-R олигонуклеотид* | 1.000 мкл |
| Ингредиенты – Мастер Микс | Количество за одну реакцию |
| Буфер первой пряди (5x) | 1.5 мкл |
| Ингибитор РНКАЗЫ (40 Ед/мкл) | 0.1 мкл |
| Диафрагма (0,1 м) | 0.1 мкл |
| Обратная транскриптаза (RT) (200U/μL) | 0.1 мкл |
| *10 000 CPM олигонуклеотида 32P-U17-26-R следует добавить к разбавленной РНК (этап 6.2.). | |
Таблица 5: Расширение праймера 32P-U1-snRNA. Реакция на анализ варианта экспрессии снРНК U1 по праймерному расширению.
| Ингредиенты | Количество за одну реакцию |
| ПЦР-микс в реальном времени | 10.0 мкл |
| кДНК (0,2 нг/мкл) | 5.0 мкл |
| Прямая грунтовка (10 мкМ) | 0.2 мкл |
| Обратная грунтовка (10 мкМ) | 0.2 мкл |
| H2O (обработанный DEPC) | 4.6 мкл |
Таблица 6: Количественная ОТ-qPCR. Реакции на количественный анализ экспрессии варианта U1 snRNA методом RT-qPCR.
| Имя Олиго | Последовательность (от 5′ до 3′) | Техника |
| Дуп8ф | GACACCATGCATGGTGCACC | Флуоресцентный ОТ-ПЦР |
| Cy5-Dup3r | /5Cy5/AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC | Флуоресцентный ОТ-ПЦР |
| Дуп3р | AACAGCATCAGGAGTGGACAGATCCC | Расширение грунтовки |
| У17-26Р | TGGTATCTCCCCTGCCAGGT | Расширение грунтовки |
| У1/17-39Ф | GGAGATACCATGATCACGAAGG | РТ-кПЦР |
| У1/58-80Р | CATCCGGAGTGCAATGGATAAG | РТ-кПЦР |
| У2/8-19Ф | CTCGGCCTTTTGGCTAAGATCA | РТ-кПЦР |
| У2/62-84Р | TCCTCGGATAGAGGACGTATCA | РТ-кПЦР |
Таблица 7: Последовательность олигонуклеотидов праймеров. Список имен праймеров, последовательностей и техники, для которой использовались праймеры.
Рисунок 1: Минигенные репортеры Dup51 и Dup51p. (A) Схематическое представление трехэкзонных/двухинтронных минигенных репортеров Dup51 и Dup51p. Указаны местоположения Dup8f и Dup3r в экзонах 1 и 3 соответственно. (B) Предсказанное парение основания snRNA дикого типа U1 и варианта U1-5a с 5'-сращивающимися последовательностями репортерных транскриптов Dup51 и Dup51p. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ сращенных репортерских расшифровок. Клетки HeLa котрансфектировались минигенными плазмидами Dup51 или Dup51p и контрольными плазмидами pcDNA или pNS6U1 для snRNAs U1-WT, U1-5g или U1-5a. (A) Анализ расширения грунтовки с помощью 32P-маркированного букваря Dup3r, демонстрирующий сращивание расшифровок минигенов Dup51 и Dup51p. Продукты мРНК показаны слева от изображения геля. Процент полноразмерного произведения (± s.d., n = 3) был рассчитан из интенсивности полосы двух изоформ мРНК и представлен на графиках ниже. (B) Анализ ОТ-ПЦР с праймерами Dup8f и Cy5-Dup3r на кДНК, полученными из общей РНК, извлеченной из клеток HeLa, демонстрируя сплайсинг минигенных транскриптов Dup51 или Dup51p. Продукты мРНК показаны слева от изображения геля. Процент полноразмерного произведения (± s.d., n = 3) был рассчитан из интенсивности полосы двух изоформ мРНК и представлен на графиках ниже. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ варианта U1-5a snRNA. Клетки HeLa котрансфектировались минигенными плазмидами Dup51 или Dup51p и контрольными плазмидами pcDNA или pNS6U1 для snRNAs U1-WT, U1-5g или U1-5a. (A) Двумерное представление последовательности snRNA U1. Положение праймера U17-26R, используемого для анализа растяжения праймера snRNA U1, обозначено красной линией. Положение праймеров U1/17-39F и U1/58-80R, используемых для RT-qPCR snRNA U1, обозначено синими линиями. (B) Анализ расширения праймера с маркировкой 32P U17-26 для обнаружения экспрессии snRNA дикого типа U1 и вариантов U1-5g и U1-5a. Указаны позиции продуктов, сформированных из U1-WT, и варианты snRNAs. (C) Анализ RT-qPCR уровней экспрессии snRNA U1 в клетках Hela. Изменение складки в экспрессии U1-snRNA было рассчитано относительно отрицательного контроля pcDNA и нормализовано до U2-snRNA, изменение складки (± s.d.; n = 3) в U1 показано графиком. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализ может быть адаптирован для анализа сплайсинга в клеточных линиях, отличных от HeLa, однако факторы, влияющие на эффективность трансфекции, такие как клеточная конфузия и количество ДНК, возможно, потребуется оптимизировать. Отношение репортера к конструкции U1 является еще одним критическим параметром, который, возможно, потребуется определить в зависимости от уровней экспрессии, наблюдаемых в других типах клеток. Качество извлеченной РНК имеет решающее значение для анализа сплайсинга; поэтому настоятельно рекомендуется использование воды, не содержащей РНКазы, и обеззараживание поверхностей инактивирующими агентами РНКазы.
Анализ репортерных транскриптов либо с помощью праймерного расширения, либо флуоресцентной ОТ-ПЦР дает аналогичные результаты, поэтому любой метод может быть использован для мониторинга изменений во включении экзона 2 в зрелую расшифровку. Флуоресцентная реакция ПЦР должна быть остановлена и количественно определена в экспоненциальной фазе амплификации, которая зависит от исходной концентрации РНК. Таким образом, количество циклов усиления, возможно, придется определить для анализов с условиями трансфекции, отличными от описанных здесь. Простота использования благодаря нерадиоактивной природе является преимуществом анализа ОТ-ПЦР. Хотя расширение праймера с радиоактивно меченым праймером требует дополнительных мер предосторожности, он может обнаруживать сигналы от низкого количества РНК. Низкая пропускная способность удлинения праймера и ОТ-ПЦР является ограничением этого анализа.
Анализ комплементации U1 snRNP использовался для нескольких целей. В дополнение к обращению вспять эффектов мутаций 5'-сращивания, U1 snRNAs, несущие изменения в 5'-области, были применены для глушения генов и для изучения механизмов сплайсинга. Fortes et al. показали, что нацеливание snRNAs U1 на концевые экзоны эндогенных транскриптов может эффективно ингибировать экспрессию генов16. Roca et al. использовали комплементацию U1 для изучения неканонических механизмов распознавания сайтов 5'-сращивания и показали, что snRNA U1 может базироваться на 5'-сращенных участках в альтернативном регистре, где парное основание смещается одним нуклеотидом, а также в «булговых регистрах», где выпуклые нуклеотиды присутствуют либо в пре-мРНК, либо в snRNA17, 18. Эта репортерная система потенциально может быть использована для изучения роли U1 snRNP в сплайсинг-модуляции малыми молекулами и сплайсинге регуляторных белков. Заменив экзон 2 Dup51p целевым экзоном, анализ может быть применен для изучения механизма действия малых молекул, которые, как известно, усиливают или подавляют сплайсинг конкретных экзонов, как в случае соединения переключения сращивания19. Путем включения регуляторных последовательностей для альтернативных факторов сплайсинга в экзоны или интроны, должна быть возможность изучить зависимость U1 в регуляции сплайсинга. Эта концепция была применена Hamid et al. для демонстрации участия стволовой петли 4 snRNA U1 в регуляции сплайсинга белком 120, связывающим полипиримидиновый тракт. Мы использовали этот анализ для изучения функций стволовых петель 3 и 4 snRNA U1. Включив мутации в стволовую петлю супрессора U1-5a snRNA, которая активирует мутантный 5'-сращивающий сайт в репортере сплайсинга Dup51p, мы определили их критическую роль в формировании перекрестных интронных контактов с U2 snRNP специфическим белком SF3A1 на ранних этапах сборки сплайсеосом14,21. Таким образом, трехэкзонный двухинтронный репортер Dup51 служит адаптивным инструментом для мониторинга эффективности сплайсинга в исследованиях механизмов, лежащих в основе сборки сплайсеосом и сплайс-ассоциированного заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана фондами S.S. от Национальных институтов здравоохранения (R21CA170786 и R01GM127464) и Американского онкологического общества (грант на институциональные исследования 74-001-34-IRG), а также S.S. и W.M. от Valley Research Partnership Program (P1-4009 и VRP77). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent Grade Deionized Water | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder packet | Gibco | 12100-046 | |
| Sodium Bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Australian Source, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-22 | |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Sodium Hydroxide, Standard Solution 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus, 36.5 to 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| Disposable PES Bottle Top Filters | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA Disodium Salt Dihydrate | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% Trypsin (10x), no phenol red | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| Sodium Chloride | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| Potassium Chloride | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| Disodium Hydrogen Phosphate Heptahydrate | Fisher Bioreagent | BP332-1 | |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Fisher Bioreagent | BP362-1 | |
| Transfection medium - Opti-MEM™ I Reduced Serum Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection Reagent - Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ Reagent | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| Chloroform (Approx. 0.75% Ethanol as Preservative/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| Ethanol, Absolute (200 Proof), Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2818-4 | |
| Isopropanol, Molecular Biology Grade, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| Glycogen (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml Lead, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England Biolabs | M0201L | |
| Size exclusion beands - Sephadex® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| Size exclusion mini columns | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| Low Molecular Weight Marker, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase inactivating reagents - RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP Mix (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| Reverse Transcriptase - M-MLV Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 28025013 | used for primer extension |
| Taq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| Random Hexamers (50 µM) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| Real time PCR mix - SYBR™ Select Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III Reverse Transcriptase | ThermoFisher Scientific | 18080093 | used for cDNA preparation |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| Formamide (≥99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review Material Safety Data Sheets |
| Bromophenol Blue sodium salt | Sigma-Aldrich | 114405-5G | |
| Xylene Cyanol FF | Sigma-Aldrich | 2650-17-1 | |
| Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| Boric Acid (Crystalline/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| Acrylamide: Bis-Acrylamide 19:1 (40% Solution/Electrophoresis) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review Material Safety Data Sheets |
| Urea (Colorless-to-White Crystals or Crystalline Powder/Mol. Biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| Ammonium peroxodisulphate (APS) ≥98%, Pro-Pure, Proteomics Grade | VWR | M133-25G | |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) ≥99%, Ultrapure | VWR | 0761-25ML | Review Material Safety Data Sheets |
| Adjustable Slab Gel Systems, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| Vertical Gel Wrap™ Glass Plate Sets, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE Storage Phosphor Screens | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 Biomolecular Imager | GE Healthcare | 28-9610-73 AB | |
| Beckman Coulter LS6500 Liquid Scintillation Counter | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 Touch Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | ||
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR Systems | ThermoFisher Scientific |
References
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S.
- Ward, A. J., Cooper, T. A.
- Scalet, D., et al. Disease-causing variants of the conserved +2T of 5' splice sites can be rescued by engineered U1snRNAs. Human Mutatation. 40 (1), 48-52 (2019).
- Yamazaki, N., et al. Use of modified U1 small nuclear RNA for rescue from exon 7 skipping caused by 5'-splice site mutation of human cathepsin A gene. Gene. 677, 41-48 (2018).
- Yanaizu, M., Sakai, K., Tosaki, Y., Kino, Y., Satoh, J. I. Small nuclear RNA-mediated modulation of splicing reveals a therapeutic strategy for a TREM2 mutation and its post-transcriptional regulation. Science Reports. 8 (1), 6937 (2018).
- Balestra, D., et al. Splicing mutations impairing CDKL5 expression and activity can be efficiently rescued by U1snRNA-based therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 20174130 (2019).
- Donadon, I., et al. Exon-specific U1 snRNAs improve ELP1 exon 20 definition and rescue ELP1 protein expression in a familial dysautonomia mouse model. Human Molecular Genetics. 27 (14), 2466-2476 (2018).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Summer, H., Gramer, R., Droge, P. Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE). Journal of Visualized Experiments. (32), e1485 (2009).
- Dominski, Z., Kole, R. Selection of splice sites in pre-mRNAs with short internal exons. Molecular Cell Biology. 11 (12), 6075-6083 (1991).
- Amir-Ahmady, B., Boutz, P. L., Markovtsov, V., Phillips, M. L., Black, D. L. Exon repression by polypyrimidine tract binding protein. RNA. 11 (5), 699-716 (2005).
- Le Guedard-Mereuze, S., et al. Sequence contexts that determine the pathogenicity of base substitutions at position +3 of donor splice-sites. Human Mutation. 30 (9), 1329-1339 (2009).
- Sharma, S., Wongpalee, S. P., Vashisht, A., Wohlschlegel, J. A., Black, D. L. Stem-loop 4 of U1 snRNA is essential for splicing and interacts with the U2 snRNP-specific SF3A1 protein during spliceosome assembly. Genes and Development. 28 (22), 2518-2531 (2014).
- Steitz, J. A., et al. Functions of the abundant U-snRNPs. Structure and function of major and minor small nuclear ribonucleoprotein particles. , Springer Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. 115-154 (1988).
- Fortes, P., et al. Inhibiting expression of specific genes in mammalian cells with 5' end-mutated U1 small nuclear RNAs targeted to terminal exons of pre-mRNA. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 100 (14), 8264-8269 (2003).
- Roca, X., et al. Widespread recognition of 5' splice sites by noncanonical base-pairing to U1 snRNA involving bulged nucleotides. Genes and Development. 26 (10), 1098-1109 (2012).
- Roca, X., Krainer, A. R. Recognition of atypical 5' splice sites by shifted base-pairing to U1 snRNA. Nature Structural Molecular Biology. 16 (2), 176-182 (2009).
- Taladriz-Sender, A., Campbell, E., Burley, G. A. Splice-switching small molecules: A new therapeutic approach to modulate gene expression. Methods. 167, 134-142 (2019).
- Hamid, F. M., Makeyev, E. V. A mechanism underlying position-specific regulation of alternative splicing. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12455-12468 (2017).
- Martelly, W., et al. Synergistic roles for human U1 snRNA stem-loops in pre-mRNA splicing. RNA Biology. , 1-18 (2021).
