Summary
Dit protocol presenteert methodologie om biofilmgroei- en biomassametingen uit te voeren met behulp van zelfgeassembleerde pcr-plaatapparaten met diepe put voor statische biofilmscreening met hoge doorvoer en 96-well gekoppelde deksels.
Abstract
Bacteriële biofilms zijn moeilijk uit te roeien van oppervlakken met behulp van conventionele antimicrobiële interventies. High-throughput 96-well microplate-methoden worden vaak gebruikt om bacteriële biofilms te kweken voor snelle antimicrobiële gevoeligheidstests om minimale biofilmuitroeiingsconcentratie (MBEC) -waarden te berekenen. Standaard biofilmapparaten bestaan uit polystyreen gekoppelde deksels gemonteerd op 96-well microplaten en zijn ideaal voor het meten van biofilmbiomassa en MBEC-waarden, maar deze apparaten worden beperkt door het beschikbare peg-oppervlak voor biomassaaccumulatie en kosten. Hier schetsen we een protocol om zelfgeassembleerd polypropyleen 96-well deep well PCR-plate pegged-dekselapparaat te gebruiken om Escherichia coli BW25113 en Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilms te laten groeien. Een vergelijking van 24-uurs biofilms gevormd op standaard en diepe putapparaten door elke soort met behulp van kristalviolette biomassakleuring en MBEC-bepalingstests worden beschreven. Het grotere oppervlak van diepe putapparaten verhoogde naar verwachting de algehele biofilmvorming met beide soorten 2-4-voudig. P. aeruginosa vormde een significant grotere biomassa/mm2 op diepe putpennen in vergelijking met het standaardapparaat. E. coli had een grotere biomassa/mm2 op standaard polystyreenapparaten in vergelijking met het diepe putapparaat. Biofilmuitroeiingstests met desinfectiemiddelen zoals natriumhypochloriet (bleekmiddel) of benzalkoniumchloride (BZK) toonden aan dat beide verbindingen E. coli - en P. aeruginosa-biofilms uit beide apparaten konden elimineren, maar bij verschillende MBEC-waarden. BZK-biofilmuitroeiing resulteerde in variabele E. coli MBEC-waarden tussen apparaten, maar bleekmiddel toonde reproduceerbare MBEC-waarden voor zowel soorten als apparaten. Deze studie biedt een high throughput deep well-methode voor het kweken van grotere hoeveelheden biofilms op polypropyleenapparaten voor downstream-studies die grotere hoeveelheden statische biofilm vereisen.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa en Escherichia coli zijn Gram-negatieve proteobacteriën die vaak worden bestudeerd op hun vermogen om sessiele, aan het oppervlak gehechte celgemeenschappen te vormen die bekend staan als biofilms1. Beide soorten kunnen, wanneer ze als biofilms groeien, een matrix van extracellulaire polymere stoffen (EPS) afscheiden die voornamelijk bestaat uit verschillende polysacchariden en eiwitten, die ook extracellulair DNA en / of lipiden kunnen bevatten, wat extra cellulaire bescherming en verbeterde overleving biedt in ruwe, voedingsbeperkte omgevingen2,3. Biofilmfysiologie en -vorming door beide soorten is van klinisch belang, omdat ze de top vijf vertegenwoordigen van meest geïsoleerde antimicrobieel resistente pathogenen uit bloed-, urineweg- en longinfecties van ziekenhuispatiënten in Canada4,5. Het is ook belangrijk op te merken dat biofilms naar schatting bijna 80% uitmaken van alle chronische en terugkerende infecties veroorzaakt door deze bacteriesoorten6. Vanwege de uitgescheiden EPS-stoffen en langzamere metabole activiteit7,8, worden gevestigde biofilms moeilijker uit te roeien wanneer ze zich vormen op oppervlakken zoals geïmplanteerde medische hulpmiddelen, littekenweefsels en in de longen van cystische fibrosepatiënten9,10, wat bijdraagt aan hun antimicrobiële resistentie.
De recalcitrante groei-eigenschappen van bacteriële biofilms maken ze vaak resistenter tegen antimicrobiële remming en/of uitroeiing2,9. Het vaststellen van in vitro methoden om bacteriële biofilm antimicrobiële uitroeiing te bestuderen is dus van het grootste belang voor het selecteren van effectieve verbindingen om infecties uit te roeien wanneer ze zich vormen op medische kunststoffen (bijv. In-dwelling katheters) en medische implantaten. De meeste snelle in vitro biofilm antimicrobiële uitroeiingsmethoden onderzoeken biofilmgroei als een "statische" biofilmcultuur in plaats van "continue" culturen, waarbij statische bacteriegroei wordt gemonitord in vroege tot late stadia van biofilmvorming gedurende een kort (24-96 uur) tijdsbestek in hetzelfde groeimedium. Continue biofilmmethoden zijn omslachtig voor snelle analyse omdat ze biofilmgroei vereisen die wordt beoordeeld over langere tijdframes die worden gekweekt in kamers die de continue stroom en vervanging van groeimedia met minder replicaties mogelijk maken11. Vanwege de tijd en moeite die nodig is om continue biofilms te onderhouden en tot stand te brengen, zijn statische in vitro biofilms het populairst, omdat ze gemakkelijk kunnen worden aangepast voor antimicrobiële gevoeligheidstests met hoge doorvoer in plastic 96-well microtiterplaten in plaats van uitgebreide stroomkamersystemen die het aantal gelijktijdig geteste culturen beperken 12,13 . De eenvoudigste statische "in-well" biofilm microplaattests gebruiken standaard polystyreen of vinyl (300 μL capaciteit) microtiterplaten om biofilmvorming aan de zijkanten en bodems van elke put te meten en vaak als ringen op de lucht-vloeistof oppervlakte interface. Bacteriële in-well biofilmvorming wordt gemeten door de afgezette biomassa die aan de putten is gehecht te kleuren nadat de groeimediumvloeistof is verwijderd en de biofilms zijn gewassen12,13. Deze testen zijn economisch populair, maar hebben vaak reproduceerbaarheidsproblemen vanwege hun inherente ontwerp, omdat gedeponeerde biofilms gevoelig zijn voor schade of verlies tijdens het spoelen voor celherstel en biomassakleuringsprocedures11,14.
Om biofilmverliezen te verminderen, hebben standaard commerciële biofilmapparaten de in-well biofilmmicroplaatontwerpen verbeterd door een insteekbaar 96-well gekoppeld polystyreendeksel toe te voegen aan het standaard 96 in-well plaatontwerp, hierin aangeduid als het "standaard biofilmapparaat". De toevoeging van een gekoppeld deksel breidt het beschikbare oppervlak in elke microplaatput uit, waardoor een verbeterde oppervlaktehechting en biofilmbiomassavorming mogelijk is15,16. Standaard biofilm gekoppelde dekselapparaten maken een grotere biofilmterugwinning, -verwijdering en -spoeling mogelijk voor daaropvolgende antimicrobiële biofilmgevoeligheids- en uitroeiingstests wanneer gekoppelde deksels worden ingebracht in nieuwe microtiterplaten die uitdagingen voor geneesmiddelen of groeicondities bevatten. Vergelijkbaar met in-well biofilm microplaattechnieken, maken de teruggewonnen materialen van de verwijderde en gewassen gekoppelde dekselapparaten celoverlevingstests en biofilmbiomassakleuring mogelijk, meestal met kristalviolet (CV) kleurstofformuleringen 17,18,19. Standaard biofilmapparaten zijn ook optimaal voor het screenen van antimicrobiële gevoeligheden van biofilms. Deze testen monitoren de remming van de biofilmgroei op twee manieren: 1) Wanneer antimicrobiële stoffen aan het begin van de groei aan cellen worden toegevoegd, kan dit de minimale biofilmremmingsconcentratie (MBIC) bepalen. 2) Wanneer gevestigde biofilms na 24 uur op de haringen worden gevormd en vervolgens worden blootgesteld aan antimicrobiële stoffen, kan het de minimale biofilmuitroeiingsconcentratie (MBEC) -waarde 17,20 bepalen. Net als in-well biofilm microplaatapparaten hebben standaard biofilmapparaten enkele opmerkelijke beperkingen, zoals hun hoge kosten per apparaat, ze zijn niet-autoclaveerbaar en minder duurzaam voor chemische oplosmiddelen vanwege het gebruikte polystyreenplaatmateriaal. Standaard biofilmapparaten hebben ook een lage verhouding tussen oppervlakte en koppeling, waardoor de maximale werkvolumes in elke put beperkt blijven tot 200 μL. Deze factoren kunnen standaard biofilmapparaten uitdagender maken om te gebruiken voor studies die grotere hoeveelheden biofilm in een formaat met hoge doorvoer vereisen.
Hier beschrijven we een statische biofilm pegged-deksel 96-well methode ontwikkeld in ons laboratorium met behulp van in de handel verkrijgbare polypropyleen semi-skirted 0,5 ml 96-well PCR-platen gemonteerd op 96-well microtiter platen met putten dieper dan de standaardplaat (Tabel met materialen). Deze geassembleerde apparaten hebben een maximaal werkvolume van 750 μL bij gebruik voor het kweken van biofilm (hierin bekend als "deep well biofilm device"). De voordelen van het gebruik van deze deep well biofilm-apparaten zijn hun lagere kosten in vergelijking met standaard biofilmapparaten, ze kunnen worden gesteriliseerd door autoclaveren en ze vergroten het oppervlak voor biofilmvorming op de grotere externe PCR-plaat "buis / haringen". Met deze methode tonen we de toepassingen van deze apparaten voor het kweken en karakteriseren van biofilmbiomassa gevormd door Escherichia coli BW25113 en P. aeruginosa PAO1. Methoden om MBEC-waarden te bepalen met behulp van biofilmuitroeiingstests worden beschreven met behulp van de quaternaire ammoniumverbinding desinfectiemiddel benzalkoniumchloride (BZK) en natriumhypochloriet (bleekmiddel) antimicrobiële stoffen. Het antiseptische/desinfecterende middel BZK werd geselecteerd omdat deze verbinding vaak wordt gebruikt om biofilms van verontreinigde oppervlakken te remmen, maar het is naar verluidt minder effectief in het uitroeien van gevestigde biofilms21. Bleekmiddel is een zeer effectieve chemische stof voor de uitroeiing van gevestigde biofilms en is een steunpilaar in chemische desinfectie 22. Beide desinfectiemiddelen bieden een nuttige vergelijking van MBEC-waarden voor elk biofilmapparaat21. Een protocol voor deze beoordeling van biofilmapparaten met behulp van CV-kleuring en biofilmuitroeiingstests voor MBEC-bepaling wordt samengevat in dit artikel. Er is een protocolstroomdiagram opgenomen voor een vereenvoudigd overzicht van de workflow voor deze methoden (figuur 1).
Protocol
1. Aseptische kweekvoorbereiding voor biofilmgroei (dag 0-1)
- Streep op dag 0 de gewenste bacteriestam(en) voor het testen van een cryo-geconserveerde stam (in glycerol of dimethylsulfoxide (DMSO)) rechtstreeks op een voedingsagarplaat met antimicrobiële selectie als de stam dat vereist. Incubeer agarplaten op de optimale temperatuur (37 °C) en tijd (18-22 uur) voor de groei van de soort.
- Ent de volgende dag (dag 1) een kolonie uit de agarplaat in 5 ml groeimedia bij optimale groeiomstandigheden. Deze culturen zullen worden gebruikt als dag 2 beginnende ent voor biofilmapparaten (zie stap 2.2; Figuur 1).
OPMERKING: Voor deze studie werden E. coli K-12 BW21153 en P. aeruginosa PAO1 gekweekt in Luria-Bertani (LB) medium bij 37 °C gedurende 18 uur met schudden bij 160 omwentelingen per minuut (rpm).- Bereid ten minste 3 onafhankelijk gekweekte stammen voor om biologische replicaties te genereren voor biofilmmeting vanwege de statistische variabiliteit van de vorming van biofilmbiomassa op de gekoppelde dekselapparaten.
2. Bereiding en inenting van platen (dag 2)
- Vul de buitenputten van een geautoclaveerde 96-well, 1,1 ml/put polypropyleenplaat met 750 μL/put steriel water (figuur 2A). Vul de negatieve controleputten (niet-geïmpculeerde mediaputten; kolom B) met groeimedia van 750 μL en de overige putten met groeimedia van 675 μL.
OPMERKING: Stap 2.1 hierboven en stappen hieronder vermelden de juiste volumes voor het biofilmapparaat met diepe put. Bij gebruik van de standaard biofilminrichting moeten de volumes als volgt worden gewijzigd: 75 μL entcultuur tot 20 μL; 675 μL groeimedia tot 180 μL; 750 μL steriel water/groeimedia tot 200 μL; 800 μL CV-vlek/azijnzuur-/spoeloplossingen tot 210 μL. Bovendien kan voor stap 3.6 hieronder de absorptie bij 500 nm (A550 nm) direct in de polystyreenmicroplaat worden afgelezen na menging bij gebruik van de standaard microplaat van het biofilmapparaat. - Met behulp van dag 1 nachtculturen, standaardiseer de culturen naar een optische dichtheid bij 600 nm (OD600nm) = 1,0 of naar een McFarland-standaard van 0,5-1 eenheden.
- Maak een 10-voudige seriële verdunning van elke gestandaardiseerde cultuur in reageerbuizen of een 96-well diepe put microtiterplaat totdat een 10-3 verdunning is bereikt.
- Ent de media die putjes bevatten zoals weergegeven in figuur 2B met 75 μL van de 1 x 10-3 verdunde cultuur, voor een laatste bacteriële verdunning in de put van 10-4.
- Plaats voorzichtig een geautoclaveerde PCR-plaat (gekoppeld deksel) in de ingeënte diepe putplaat. Incubeer platen onder optimale rekomstandigheden (37 °C) met schudden (maximaal 160 rpm) in een incubator met 50-60% vochtigheid gedurende 24 uur.
3. Biofilm biomassa bepaling van apparaten met behulp van CV-kleuring (dag 3)
- Verwijder aseptisch het biofilm gekoppelde deksel van elk apparaat en spoel door het in te brengen in een geautoclaveerde diepe putplaat bereid met 800 μL steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) / put gedurende 30 s om planktoncellen te verwijderen.
- Voor biomassa CV-kleuring, breng het gekoppelde PCR-plaatdeksel over in een nieuwe plaat bereid met 800 μL / well 0,1% (w / v) CV in dH2O en beits gedurende 5 minuten.
- Verwijder overtollige vlekken door het gekoppelde deksel af te spoelen in een diepe putplaat bereid met 800 μL /put steriel PBS. Laat de platen 10 minuten drogen in een bioveiligheidskast met naar boven gerichte haringen.
- Breng het gedroogde PCR-plaatdeksel over op een plaat met 800 μL/well 30% (v/v) azijnzuur en laat het deksel gedurende 5 minuten ontkleuren.
- Verwijder het gedevlekte PCR-pegdeksel en meng de oplossing grondig door te pipetteren. Breng 200 μL over van de diepe putplaten naar een standaard 96 putmicroplaat en meet de absorptie van de ontkleuringsoplossing bij een golflengte van 550 nm (A550nm) in een microplaatlezer met ultraviolet (UV) / zichtbaar (Vis) bereik.
- Trek met behulp van de gemeten A550nm-waarden de gemiddelde blanco (negatieve controle) A550nm-waarde af van elke biofilmmonsterwaarde. Gemiddelde van elke blanco-afgetrokken A550nm biofilmmonsterwaarde die biologische replicaties van het monster vertegenwoordigt.
4. Biofilms met antimicrobiële stoffen uitdagen om hun 24-uurs antimicrobiële MBEC-waarde te berekenen (dag 3)
- Bereid een antimicrobiële voorraadoplossing in water die twee keer (2x) de concentratie van de gewenste hoogste antimicrobiële concentratie is die moet worden getest.
- Maak een tweevoudige verdunningsreeks van de antimicrobiële stamoplossing in 2x geconcentreerde groeimedia, zodat er 8 antimicrobiële concentraties zijn.
- Zoals weergegeven in figuur 2B, vult u de buitenputten van een geautoclaveerde diepe putplaat met 750 μL/putsteriel water. Vul kolommen B (negatieve controle; geen bacteriën) en C (positieve controle; geen antimicrobiële blootstelling) van de plaat met 750 μL/putgroeimedia. Vul de resterende putten met 750 μL/put van de antimicrobiële verdunningsreeks zoals weergegeven in figuur 2B.
- Verwijder en spoel het gekoppelde deksel zoals beschreven in stap 3.1 en breng ze over in de antimicrobiële uitdagingsplaat.
- Incubeer platen met schudden (max. 160 rpm) in geschikte spanningsomstandigheden en voor de gewenste belichtingstijd.
5. Terugwinning van biofilmbiomassa uit gekoppelde deksels (dag 4)
- Verwijder antimicrobiële blootgestelde gekoppelde deksels en spoel af zoals beschreven in stap 3.1. Breng het gekoppelde deksel over naar een diepe putplaat met 750 μL/putterugwinningsmedia in de binnenputten en 750 μL/put steriel dH2O in de buitenputten.
- Om 70 ml herstelmedia te bereiden, combineert u 35 ml 2x geconcentreerde LB, 0,7 ml 100% tween-20, 3,5 ml 20x universele neutraliserende oplossing en 30,8 ml steriele dH2O in een steriele fles.
- Om 20x geconcentreerde universele neutraliserende oplossing te bereiden, voegt u 1,0 g L-histidine, 1,0 g L-cysteïne en 2,0 g gereduceerd glutathion toe aan een eindvolume van 20 ml dH2O. Filter steriliseer de oplossing door een filter van 0,2 μm en bewaar bij 4 °C.
- Plaats het apparaat vanaf stap 5.1 in een secundaire bak die in een ultrasoonmakend waterbad is gemonteerd. Soniceer de apparaten gedurende 30 minuten om de biofilm los te maken van pinnen in het herstelmedium.
- Verwijder na het ultrasoonapparaat het gekoppelde deksel en plaats een steriel plat deksel op de diepe bronherstelmediaplaat. Het gekoppelde deksel kan worden weggegooid.
- Incubeer platen met herstelmedia vanaf stap 5.3 bij de optimale spanningsgroeiomstandigheden gedurende de nacht (16-18 uur).
6. Bepaling van de MBEC-waarden van het apparaat (dag 5)
- Breng de volgende dag 200 μL over van elke put van de geïncubeerde diepe putplaat van stap 5.4 naar een nieuwe 96-well microtiterplaat. Lees de OD600nm van elke put met behulp van een UV / Vis-microplaatlezer.
- Trek negatieve controle (niet-geïmculeerde blanco) OD600nm-waarden af van elke biofilm die het monsterput bevat.
- Bereken de MBEC-waarde voor elk monster met behulp van OD600nm-waarden , waarbij de MBEC-waarde de laagste antimicrobiële concentratie is die resulteerde in de laagste OD600nm-waarde (niet te onderscheiden van de niet-geïmponeerde controle) voor een specifiek antimicrobieel behandeld soort/stammonster.
Representative Results
Het doel van deze studie was om een methode te bieden voor het uitvoeren van grotere volume, high-throughput (96-well), statische biofilm apparaatmetingen met behulp van deep well biofilm apparaten. Hier vergeleken we een zelfgeassembleerde semi-rok PCR-plaat die in een diepe putmicroplaat werd geplaatst, bekend als het diepe putapparaat, met een veelgebruikt standaard biofilm gekoppeld dekselapparaat om hun mogelijkheden te onderzoeken om statische biofilms te vormen. CV-gekleurde biomassa en biofilmuitroeiingstests (MBEC) werden gebruikt om de vorming van biofilm door beide apparaten te beoordelen.
Om de vorming van biofilms door verschillende soorten op elk apparaat te vergelijken, hebben we biofilmbiomassa's gevormd door E. coli BW25113 en P. aeruginosa PAO1 beoordeeld met behulp van het biofilm CV-kleuringsprotocol17. Hoewel CV-kleuring over het algemeen wordt gerapporteerd als A550nm-waarden, hebben we vanwege de verschillen in groeivolumes van elk apparaat en hun beschikbare oppervlakten CV-kleuring A550nm-waarden omgezet in molaire CV-concentraties in oplossing. Molaire CV-concentraties hielden rekening met volumeverschillen van elk apparaat en maakten een vergelijking mogelijk van CV-concentraties die biomassa's vertegenwoordigen die uit elk apparaat werden teruggewonnen. De resultaten toonden aan dat beide soorten significant meer biomassa produceerden op biofilmapparaten met diepe putten (2,1-voudige E. coli; 4,1-voudige P. aeruginosa) in vergelijking met het standaard biofilmapparaat (figuur 3A-B). Dit resultaat werd verwacht gezien het grotere oppervlak van de diepe put PCR-pen (320,4 mm2) in vergelijking met het standaard peg-oppervlak van het apparaat (108,9 mm2). Deze bevinding komt ook overeen met de toegenomen verhoogde volumes (750 μL) die worden gebruikt in het biofilmapparaat van de diepe put in vergelijking met de standaard apparaatputten (200 μL). Vandaar dat deep well-apparaten de accumulatie van biofilmbiomassa op PCR-buispennen verhoogden in vergelijking met kleinere pinnen met standaard biofilmapparaten.
Beide biofilmapparaten vormden reproduceerbare biofilms toen we biologisch gerepliceerde biofilms van E. coli en P. aeruginosa vergeleken (figuur 3A-B). Ondanks het observeren van een grotere variabiliteit in technische replicaat CV-gekleurde M A550nm-waarden voor beide soorten die op het deep well-apparaat werden gekweekt, waren er geen statistisch significante verschillen toen we de mediane CV M-waarden vergeleken voor de biologische replicaties van elke soort op de diepe put of standaardapparaten met behulp van paarsgewijze tweerichtingsanalyse van variantie (ANOVA) of Student's T-tests (beide p > 0,05). Deze bevinding toont aan dat biofilmvorming door diepe put en standaardapparaten reproduceerbare biofilms vormen. De CV-kleuringsresultaten toonden echter ook aan dat wanneer we rekening hielden met verschillen in het peg-oppervlak op elk apparaat, de biofilmbiomassavorming door E. coli en P. aeruginosa statistisch significante verschillen in biomassaaccumulatie vertoonde (tabel 1). Berekening van de gemiddelde CV-gebeitste biomassa (M) per peg-oppervlak in mm2 (CV M/mm2) voor E. coli toonde aan dat de biofilmvorming 1,5-voudig lager was op polypropyleen diepe putapparaten in vergelijking met de standaard biofilminrichting (tabel 1). Het tegenovergestelde resultaat werd echter verkregen voor P. aeruginosa, die 1,4-voudig hogere CV M / mm2 aantoonde op polypropyleen diepe putapparaten in vergelijking met standaard biofilmapparaten (tabel 1). Ondanks de waargenomen soortspecifieke verschillen in biofilmbiomassaaccumulatie met elk apparaat, vertoonde het deep well-apparaat nog steeds een grotere algemene (2-4-voudige toename) biofilmbiomassavorming door elke soort (figuur 3).
Om de antimicrobiële gevoeligheidstesttoepassingen van het biofilmapparaat met diepe put te bepalen, vergeleken we twee veelgebruikte desinfectiemiddelen, BZK en bleekmiddel, voor hun biofilmuitroeiingspotentieel. Beide chemicaliën worden vaak gebruikt om bacteriële biofilms in klinische en industriële toepassingen te voorkomen (BZK) en/of uit te roeien (bleken).21,22,23. Elke verbinding werd in toenemende 2-voudige concentraties toegevoegd aan biofilms gevormd door E. coli en P. aeruginosa op de standaard en diepe bron biofilmapparaten22,23(figuren 1, 2B). De laagste concentratie BZK of bleekmiddel die resulteerde in OD600nm-waarden die niet te onderscheiden waren van negatieve controleputten, werd gedefinieerd als de MBEC-waarde. Behandeling van biofilms gevormd op standaard biofilmapparaten met bleekmiddel resulteerde in dezelfde bleek-MBEC-waarden van 0,625% voor E. coli en P. aeruginosa (tabel 1, figuur 4A-B). Bleek MBEC-waarden bepaald voor E. coli en P. aeruginosa biofilm gevormd op diepe putapparaten vertoonden 2-4 keer lagere MBEC-waarden door beide soorten (E. coli; 0,156%; P. aeruginosa 0,313%) in vergelijking met standaardapparaten (tabel 1). Een 2-voudig verschil in bleek-MBEC-waarden tussen soorten werd opgemerkt voor het diepe putapparaat, waarbij P. aeruginosa een 2-voudig hogere concentratie bleekmiddel nodig had om biofilms uit te roeien in vergelijking met E. coli (figuur 4A-B, tabel 1). Het 2-voudige bleek-MBEC-verschil tussen P. aeruginosa en E. coli in een diep putapparaat lijkt omgekeerd te correleren met 1,5-voudig verhoogde CV-gekleurde biomassavorming door P. aeruginosa in vergelijking met E. coli (figuur 3A-B). De grotere hoeveelheid biomassa gevormd door P. aeruginosa op diepe putinrichtingen kan ook verklaren waarom een hogere bleekconcentratie nodig was om P. aeruginosa-biofilms uit te roeien in vergelijking met E. coli op diepe putten (figuur 3A-B, tabel 1). Vandaar dat biofilm-uitroeiingstests voor diepe putapparaten aantonen dat beide soorten gevoelig waren voor bleekmiddel, maar bij lagere (2-4-voudige) bleekconcentraties in vergelijking met standaardapparaten. Dit correleert omgekeerd evenredig met het 3-voudig grotere peg-oppervlak en de volumes van de PCR-plaatpennen van het deep well-apparaat. Dit suggereert dat voor blootstelling aan bleekmiddel een groter biomassaoppervlak de bleekconcentraties kan verlagen die nodig zijn voor de uitroeiing van biofilm.
BZK-biofilmuitroeiingstests toonden een grotere variabiliteit in herstelde groei (OD600nm-waarden) en MBEC-waarden per soort in vergelijking met bleekresultaten (figuur 4C-D). Deze variabiliteit is niet onverwacht op basis van eerdere studies die aantonen dat BZK effectiever was in het voorkomen van biofilmvorming dan het uitroeien van gevestigde biofilms24,25,26. Met behulp van het standaard biofilmapparaat vertoonden alleen P. aeruginosa-biofilms behandeld met BZK een consistente MBEC-waarde (2560 μg / ml) die 8 keer lager was dan de MBEC-waarde (20480 μg / ml) verkregen voor deze stam in het diepe putapparaat (tabel 1, figuur 4C). Deze resultaten kunnen verschillen weerspiegelen in de hoeveelheden P. aeruginosa-biomassa gevormd op diepe goed gekoppelde oppervlakken en plastic samenstellingen in vergelijking met de standaard apparaatpennen. BZK-uitroeiing van biofilms gevormd door E. coli op zowel de diepe put als standaardapparaten waren even slecht, wat resulteerde in een breed scala aan BZK MBEC-waarden van 2560-40960 μg / ml voor het diepe putapparaat en 320-10240 μg / ml op het standaardapparaat (figuur 4D). Voor E. coli werd deze variabiliteit verklaard door het incidentele geval waarin 1-2 replicatieputten een lage maar statistisch significante groei in herstelmedia vertoonden, die de fout verhoogde en de nauwkeurigheid van de BZK MBEC-bepaling met beide apparaten verminderde (figuur 4D, tabel 1). Deze variabiliteit benadrukt de ineffectiviteit van het gebruik van BZK bij het uitroeien van E. coli-biofilms zoals eerder opgemerkt in studies24,25,26. P. aeruginosa-biofilms kunnen daarentegen betrouwbaar worden uitgeroeid door BZK in een gedefinieerde concentratie met beide apparaten, maar met een 8-voudig BZK-concentratieverschil (figuur 4C). Samenvattend, BZK-uitroeiing MBEC-waarden van biofilms gevormd door P. aeruginosa vertonen verschillende MBEC-waarden bij elk apparaat, maar beide apparaten zijn even slecht in het onderscheiden van E. coli precieze BZK-uitroeiingsfenotypen.
Vandaar dat de hierin beschreven methode voor het biofilmapparaat met diepe put even effectief is voor het vormen van reproduceerbare biofilms in vergelijking met een standaard biofilmapparaat.
Figuur 1. Schematisch overzicht van het experiment. Dag 0 isolatie van enkele kolonies van gecryopreserveerd bestand; Dag 1 inenting van groeimedia met enkele kolonies; Dag 2 inenting van biofilmplaat; Dag 3 CV kleuring of antimicrobiële uitdaging; Dag 4 biofilm sonicatie in herstelmedia; en dag 5 lezen OD600nm van herstelplaat om MBEC-waarden te bepalen. Enkele afbeeldingen in figuur aangeleverd door Servier Medical Art (smart.servier.com). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Voorbeeldplaatlay-outs voor verschillende stappen van het protocol. A) De uiteindelijke plaatopstelling voor de initiële 24-uurs biofilmgroei met behulp van dag 1 bacteriële culturen van twee bacteriestammen (E. coli en P. aeruginosa), elk met drie biologische replicaties. Negatieve controleputten (grijs) worden gebruikt als steriliteitscontroles (geen bacteriën toegevoegd). B) Plaatopstelling voor antimicrobiële uitdaging van biofilms. Donker wordende kleuren duiden op een toenemende antimicrobiële concentratie. Negatieve controle zijn putten zonder toegevoegde bacteriën (grijs) en positieve controles zijn biofilms zonder antimicrobiële blootstelling (oranje). Biofilm peg deksels genomen van paneel A worden overgebracht naar deze diepe putplaat voor antimicrobiële blootstelling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De molaire concentratie (M) van CV-gekleurde E. coli BW25113. (A) en P. aeruginosa PAO1 (B) biofilmbiomassa teruggewonnen uit standaard (cirkels) en diepe put (driehoeken) apparaten. CV-kleuring werd gemeten door de absorptie van CV bij 550 nm (A550nm) af te lezen, en diepe put A550nm-metingen werden aangepast met een factor 3.809 (800 μL / 210 μL) om rekening te houden met de volumeverschillen tussen de apparaten. CV molaire concentratie (M) werd bepaald door de Wet van Beer-Lambert (CV Concentratie = A550nm/εl); waarbij de pathlengte (l) van 210 μL in de microtiterplaat met 96 putvlakbodem werd bepaald op 0,56 cm en de extinctiecoëfficiënt (ε) van CV in water bij A550nm van 251500 cm-1M-139. De resultaten vertegenwoordigen 9 technische replicaties van drie biologische replicaties van elke stam gekweekt als een biofilm en de mediane waarde van elke biologische replicaat wordt weergegeven als een horizontale balk in elke plot. Statistisch significante verschillen in biomassa tussen de apparaten werden bepaald tussen biologische replicatiemediaanwaarden met behulp van een tweezijdige gepaarde t-test (E. coli p = 0,008-0,018 (*); P. aeruginosa p= 0,002-0,009 (**)) weergegeven als balken met sterretjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Bepaling van antimicrobiële MBEC-concentratie. Bepaling van antimicrobiële MBEC-concentratie voor bleekmiddel (A,B) en BZK (C,D) voor P. aeruginosa PAO1 (A, C) en E. coli BW25113 (B,D) indien gekweekt op standaard (witte staven) en diepe put (grijze staven) biofilm gekoppelde apparaten. De resultaten werden bepaald door het aflezen van de OD600nm van biofilm die werd teruggevonden na ultrasoonapparaat in herstelmedia en nachtelijke incubatie. Diepe put OD600nm werd aangepast met een factor 3,75 (750 μL / 210 μL) om rekening te houden met volumeverschillen tussen de apparaten. De resultaten zijn representatief voor drie biologische replicaties en foutbalken tonen de standaardafwijking tussen de replicaties bij elke antimicrobiële concentratie39. Sterretjes (*) boven elke staafplot geven statistisch significante verschillen aan in OD600nm-waarden van lege besturingselementen met p-waarden < 0,05 met behulp van tweezijdige T-testberekeningen van studenten. Cirkelsymbolen (o) boven elke staafplot geven metingen aan waarbij slechts 1 of 2 replicaties statistisch significante OD600nm-waarden van lege besturingselementen hadden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| BZK MBEC (μg/ml) | Bleek MBEC (% v/v) | |||
| Spanning getest | Diepe put Apparaat | Standaard apparaat | Diepe put Apparaat | Standaard apparaat |
| E. coli BW25113 | 2560-40960 | 320-10240 | 0.156 | 0.625 |
| P. aeruginosa Pao1 | 20480 | 2560 | 0.313 | 0.625 |
| Diepe put Apparaat | Standaard apparaat | p-waarde** | Vouwwissel (diepe put / standaard) | |
| Spanning getest | Gemiddelde CV M*/ mm2 ± SD | Gemiddelde CV M*/ mm2 ± SD | ||
| E. coli BW25113 | 1,99 x 10-8 ± 3,25 x10-9 | 3,03 x 10-8 ± 3,31 x 10-9 | 0.0176 | -1.52 |
| P. aeruginosa Pao1 | 8,01 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 | 5,72 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 | 0.034 | 1.4 |
Tabel 1. Een samenvatting van E. coli BW25113 en P. aeruginosa PAO1 gemiddelde CV-gekleurde biomassa M/ mm2 waarden en biofilm uitroeiing MBEC waarden voor BZK en bleekmiddel op verschillende apparaten.
*Gemiddelde CV M/mm2-waarden berekend met behulp van mediane biologische replicaat-CV M-waarden (figuur 3).
**p-waarden bepaald met behulp van two-tailed student's T-test.
Discussion
Deze studie beschrijft methoden voor het gebruik van een groter volume 96-well high throughput statische biofilm groei-apparaat met een polypropyleen diepe put microplaat uitgerust met een semi-rok PCR-plaat deksel voor biofilmvorming (deep well biofilm apparaat; Tabel met materialen). We vergeleken biofilms die met dit apparaat werden gegenereerd met een in de handel verkrijgbaar polystyreen standaard biofilmapparaat (Table of Materials). De deep well device-methode maakt gebruik van dezelfde methodologische stappen en oplossingen als het standaardapparaat17 bij aangepaste volumes die zijn aangepast voor de deep well-apparaten, waardoor dit apparaat ideaal is voor grootschalige biofilmvorming en experimentele analyse. De groei van E. coli BW25113 en P. aeruginosa PAO1, twee Gram-negatieve soorten waarvan bekend is dat ze biofilms vormen, werden onderzocht op hun biomassavorming en desinfecterende (BZK / bleekmiddel) MBEC-waarden met behulp van beide apparaten. Vergelijking van CV-gekleurde biomassa gevormd op haringen van elk apparaat toonde aan dat zowel E. coli als P. aeruginosa biofilms vormden met een hogere biomassa op het biofilmapparaat van de diepe put in vergelijking met het standaardapparaat (figuur 3A-B). Verhoogde biofilmbiomassa weerspiegelde het grotere oppervlak van diepe putpennen in vergelijking met het standaard peg-oppervlak van het apparaat. Toen we rekening hielden met verschillen in peg-oppervlak (mm2) met beide apparaten, werden verschillen in biomassavorming opgemerkt, waarbij E. coli significant grotere CV-biomassa per mm2 vormde op polystyreen standaard apparaatpennen dan met de PCR-buispennen van het deep well-apparaat (tabel 1). P. aeruginosa vormde een grotere CV-gekleurde biomassa/ peg mm2 in vergelijking met standaardapparaten (tabel 1). Deze bevindingen kunnen soortspecifieke verschillen in biofilmbiomassavorming op de verschillende apparaten benadrukken.
Opgemerkt moet worden dat bleekuitroeiing van E. coli en P. aeruginosa biofilms op apparaten met diepe putten plaatsvond in 2-4-voudig lagere concentraties dan standaardapparatuur (figuur 4A-B, tabel 1). De verschillen in bleek-MBEC-waarden die van elk apparaat zijn geïdentificeerd, worden waarschijnlijk beïnvloed door verschillen in peg-vormen van het apparaat (diepe put "pinnen" zijn taps toelopende buizen en standaardpennen zijn cilindrisch), verschillen in plastic samenstelling (polypropyleen versus polystyreen) en volumeverschillen (750 μL versus 200 μL). P. aeruginosa had bijvoorbeeld een grotere CV M-biomassa / mm2 op diepe putapparaatpennen in vergelijking met standaardapparaten, maar E. coli had minder biomassa op diepe putkoppelingen (figuur 3). Dit suggereert dat de desinfectiemiddelconcentraties die nodig zijn voor de uitroeiing van biofilms kunnen worden beïnvloed door de biomassa die door elke soort wordt gevormd en het beschikbare oppervlak. Bovendien kunnen verschillen in de vorm van de koppeling van het apparaat verschillende groeiomstandigheden voor bepaalde soorten beïnvloeden. In onze studie kan P. aeruginosa een grotere biomassa vormen op diepe putpennen vanwege hun grotere oppervlakte en beluchting, omdat deze soort een obligate aerobe is in tegenstelling tot E. coli, een facultatieve anaërobe. Tot op heden hebben we geen gepubliceerde studies geïdentificeerd die de biofilmvorming van E. coli en P. aeruginosa rechtstreeks met elkaar hebben vergeleken op zowel polypropyleen27,28,29 als polystyreen30,31 materialen. Er zijn echter meldingen van robuuste E. coli- en P. aeruginosa-biofilmvorming opgemerkt in onafhankelijke onderzoeken naar polypropyleen- of polystyreenmaterialen. Met betrekking tot Pseudomonaden kunnen veel Pseudomonas spp. kunststoffen zoals polypropyleen gebruiken als potentiële koolstofbronnen32. Vandaar dat de beschikbaarheid van dit polypropyleen diepe bron biofilmapparaat een nuttige vooruitgang is in statische biofilmstudies. Polypropyleen is chemisch duurzamer dan polystyreen en is een klinisch relevant materiaal, omdat het vaak wordt gebruikt in medische implantaten, hechtingen en mazen voor hernia- of bekkenoperaties33,34.
Hoewel biofilmbiomassa door beide apparaten werd gevormd, had het deep well-apparaat een iets hogere variabiliteit in biomassa op basis van de CV-kleuringsmethode en OD600nm biofilmuitroeiing MBEC-waarden voor bleekmiddel en BZK. Dit kan worden verklaard door 3 belangrijke factoren: 1) Deep well-apparaten hebben een groter peg-oppervlak dan standaardapparaten die onder een hoek stonden in vergelijking met standaard apparaatpennen. 2) Beide geteste soorten kunnen verschillende mogelijkheden hebben om zich te hechten aan polypropyleen- en polystyreenmaterialen van elk apparaat. 3) De volumes groeimedia die in elk apparaat worden gebruikt (750 μL diepe put, 200 μL standaard) en afstand tussen de ingebrachte pen aan de zijwanden van de put verschillen. Deze problemen zijn geen probleem als slechts één type apparaat wordt gebruikt voor alle biofilmexperimenten, maar als beide apparaten zijn geselecteerd, moeten de vergelijkingen die we hierin hebben uitgevoerd, worden uitgevoerd om verschillen te identificeren36,37. Vanwege de verschillen in kunststofmateriaal dat in elk apparaat wordt gebruikt, mogen de cv-gekleurde biofilmbiomassa en MBEC-waarden niet rechtstreeks tussen verschillende apparaten worden vergeleken. Als methoden en experimenten echter op hetzelfde apparaat (diepe put of standaard) worden uitgevoerd, zijn de resultaten die worden verkregen voor geteste soorten en antimicrobiële stoffen vergelijkbaar.
Dit protocol laat zien dat zelfgeassembleerde pcr-plaatapparaten met een groter volume biofilmapparaten zijn voor het meten van biofilmvorming en -uitroeiing die ook kosteneffectief is. Vanuit een kostenperspectief variëren standaard biofilmapparaten met een 96 goed gekoppelde deksels voor $ 29-36 AMERIKAANSE dollars (USD) per apparaat (Tabel met materialen). Polystyreen standaard biofilm apparaten zijn niet autoclaveerbaar en zijn minder tolerant voor oplosmiddelen /zuren vanwege de plastic chemische eigenschappen. De zelfgeassembleerde polypropyleen diepe putplaten die hierin worden beschreven, uitgerust met een afzonderlijke semi-omrande 96-put PCR-plaat (Table of Materials) kosten in totaal $ 14 USD per geassembleerd apparaat, wat de helft is van de standaard biofilmapparaatkosten. Opgemerkt moet worden dat de prijzen kunnen variëren afhankelijk van regio, distributeur en beschikbaarheid, en onze kosten nadat institutionele kortingen uitkwamen op $ 9 USD / deep well-apparaat. Deze zelfgeassembleerde deep well polypropyleen PCR-plaat apparaten hebben het extra voordeel dat ze autoclaveerbaar zijn voor sterilisatie en bieden 2-4 keer meer biofilmbiomassa dan standaard apparaten.
Kortom, dit protocol en de representatieve bevindingen van biofilmgroeivergelijkingen van de diepe put en standaard biofilmapparaten laten zien dat beide apparaten in staat zijn om bacteriële biofilms te kweken, maar diepe putapparaten vormen 2-4 keer meer biofilm. Het deep well biofilm-apparaat biedt een levensvatbaar en betaalbaar alternatief voor grotere volume high-throughput biofilmvormingsexperimenten zoals screeningstudies naar gevoeligheid van geneesmiddelen. Deze techniek kan biofilms genereren die nuttig zijn voor downstream '-omics'-extracties (proteomisch, metabolomisch, transcriptomisch) of experimentele assays (enzymatisch, fluorescerend) die grotere hoeveelheden biofilmmaterialen nodig kunnen hebben voor analyses. Het deep well biofilmapparaat wordt aanbevolen voor laboratoria die biofilms willen bestuderen in een high-throughput 96-well assay met behulp van goedkopere, grotere volumes, chemisch duurzame plastic materialen die klinisch relevant zijn.
Disclosures
De auteurs hebben geen onthullingen te doen.
Acknowledgments
Financiering voor dit werk werd verstrekt door operationele subsidies aan DCB van de Natural Science and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN- 2016-05891) en aan MRM en GRG van het Government of Canadian Genomics Research and Development Initiative Grant (GRDI) -programma (GRDI7 2254557).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) | Fisher Scientific | 13-678-11F | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| 2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS | Fisher Scientific | 13-678-11C | disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack | Fisher Scientific | 14-222-766 | sterile pipettor tips for media aliquoting |
| Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C | Fisher Scientific | P-DW-11-C | microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
| Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips | Fisher Scientific | TF-350-L-R-S | sterile pipettor tips for media aliquoting |
| Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 | Avantor/ VWR | 89094-676 | sterile basins/ reservoirs for microplate preparation |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | materials for LB agar preparation |
| Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader | Biotek | NEO2MB | microplate UV/Vis region plate reader |
| Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V | Avantor/ VWR | CPX-952-316R | sonicating water bath |
| crystal violet (CV), ACS grade, 100 g | Fisher Scientific | C581-100 | biofilm biomass stain |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH | Avantor/ VWR | CABDH1115-1LP | media components for cryopreservation |
| Easypet 3, pipet controller | Avantor/ VWR | CA11027-980 | serological pipettor for aseptic media/ culture transfer |
| Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL | Avantor/ VWR | CA89125-338 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL | Avantor/ VWR | CA89125-340 | multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer |
| Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade | Fisher Scientific | A38-212 | CV destain |
| Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX | Fisher Scientific | 14957H/ 9820-18 | materials for cell culturing |
| Glycerol, 4 L glass bottle ACS | Fisher Scientific | BP229-4 | media components for cryopreservation |
| L-Cysteine, 98%, 250 g | Avantor/ VWR | 97061-204 | universal neutralizing solution |
| L-glutathione reduced, 98%, 25 g | Fisher Scientific | AAJ6216614 | universal neutralizing solution |
| L-Hisitidine, 98%, 100 g | Avantor/ VWR | CA97062-598 | universal neutralizing solution |
| MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS | Innovotech | 19112 | material for 96 well MBEC device biofilm cultivation |
| McFarland Standard, 0.5 EA | Fisher Scientific | R20410 | cell culture standardization |
| McFarland Standard, 1.0 EA | Fisher Scientific | R20411 | cell culture standardization |
| NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS | Fisher Scientific | 167008 | microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements |
| PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK | Sarstedt | 72.1981.202 | pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation |
| Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 | Fisher Scientific | FB0875712 | materials for LB agar preparation |
| Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g | Fisher Scientific | P288-500 | PBS component/ buffer |
| Sodium chloride, ACS grade, 3 kg | Fisher Scientific | S2713 | media components for LB broth and PBS |
| sodium phosphate monobasic, 1 kg | Fisher Scientific | S369-1 | PBS component/ buffer |
| Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 | Avantor/ VWR | 28145-505 | non-autoclavable solution sterilization |
| Tin foil, heavy duty, 50 feet | Grocery store | --- | materials for deepwell device sterilization |
| Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA | Fisher Scientific | B11922 | media components for LB broth |
| Tween-20, 100 mL | Fisher Scientific | BP337-100 | recovery media solution |
| Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS | Avantor/ VWR | 37001-520 | materials for biofilm dilution preparation |
| Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g | Fisher Scientific | BP1422-500 | media components for LB broth |
References
- Verderosa, A. D., Totsika, M., Fairfull-Smith, K. E. Bacterial Biofilm Eradication Agents: A Current Review. Frontiers in Chemistry. 7, 1-17 (2019).
- Sharma, D., Misba, L., Khan, A. U. Antibiotics versus biofilm: An emerging battleground in microbial communities. Antimicrobial Resistance and Infection Control. 8 (1), 1-10 (2019).
- Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P.
- Lagacé-Wiens, P. R. S., et al. Trends in antimicrobial resistance over 10 years among key bacterial pathogens from Canadian hospitals: results of the CANWARD study 2007-16. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74, Suppl 4 22-31 (2019).
- Karlowsky, J. A., et al. In vitro susceptibility of urinary Escherichia coli isolates to first- and second-line empirically prescribed oral antimicrobials: CANWARD surveillance study results for Canadian outpatients, 2007-2016. International Journal of Antimicrobial Agents. 54 (1), 62-68 (2019).
- Mah, T. F.
- Amato, S. M., et al. The role of metabolism in bacterial persistence. Frontiers in Microbiology. 5, 1-9 (2014).
- Flemming, H. -C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS matrix: The "house of biofilm cells.". Journal of Bacteriology. 189 (22), 7945-7947 (2007).
- Dela Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., Hancock, R. E. W. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: Antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 580-589 (2013).
- Høiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. International Journal of Oral Science. 3 (2), 55-65 (2011).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. 01, Unit 1B.1 (2005).
- Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Methods in Molecular Biology. 1149, 631-641 (2014).
- O'Toole, G. A. Microtiter dish Biofilm formation assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2437 (2010).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Harrison, J. J., Turner, R. J., Ceri, H. High-throughput metal susceptibility testing of microbial biofilms. BMC Microbiology. 5 (53), (2005).
- Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: Multiple Equivalent Bioffims for Antibiotic and Biocide Susceptibility Testing. Methods in Enzymology. 337, 377-385 (2001).
- Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nature Protocols. 5 (7), 1236-1254 (2010).
- vanden Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. Journal of Microbiological Methods. 98, (2014).
- Sabaeifard, P., Abdi-Ali, A., Gamazo, C., Irache, J. M., Soudi, M. R. Improved effect of amikacin-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles against planktonic and biofilm cells of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Medical Microbiology. 66 (2), 137-148 (2017).
- Thieme, L., et al. MBEC Versus MBIC: the Lack of Differentiation between Biofilm Reducing and Inhibitory Effects as a Current Problem in Biofilm Methodology. Biological Procedures Online. 21 (1), 18 (2019).
- Jennings, M. C., Ator, L. E., Paniak, T. J., Minbiole, K. P. C., Wuest, W. M. Biofilm-eradicating properties of quaternary ammonium amphiphiles: Simple mimics of antimicrobial peptides. Chembiochem. 15 (15), 2211-2215 (2014).
- Lineback, C. B., et al. Hydrogen peroxide and sodium hypochlorite disinfectants are more effective against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms than quaternary ammonium compounds. Antimicrobial Resistance & Infection Control. 7 (1), 154 (2018).
- Minbiole, K. P. C., et al. From antimicrobial activity to mechanism of resistance: The multifaceted role of simple quaternary ammonium compounds in bacterial eradication. Tetrahedron. 72 (25), 3559-3566 (2016).
- Mangalappalli-Illathu, A. K., Korber, D. R. Adaptive resistance and differential protein expression of Salmonella enterica serovar enteritidis biofilms exposed to benzalkonium chloride. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3588-3596 (2006).
- El-Banna, T., Abd El-Aziz, A., Sonbol, F., El-Ekhnawy, E. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates to benzalkonium chloride retards its growth and enhances biofilm production. Molecular Biology Reports. 46, 3437-3443 (2019).
- Ebrahimi, A., et al. Effects of benzalkonium Chloride on planktonic growth and biofilm formation by animal bacterial pathogens. Jundishapur Journal of Microbiology. 8 (2), 59764 (2015).
- Reśliński, A., et al. Evaluation of Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilm formation on the surface of polypropylene mesh. Medycyna doświadczalna i mikrobiologia. 63 (1), 21-27 (2011).
- Verhorstert, K. W. J., et al. In vitro bacterial adhesion and biofilm formation on fully absorbable poly-4-hydroxybutyrate and nonabsorbable polypropylene pelvic floor implants. Cite This: ACS Applied Materials & Interfaces. 12, 53646-53653 (2020).
- Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration & Biodegradation. 64 (6), (2010).
- Jones, J. F., et al. Oriented adhesion of Escherichia coli to polystyrene particles. Applied and Environmental Microbiology. 69 (11), 6515-6519 (2003).
- Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
- Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration and Biodegradation. 64 (6), 530-536 (2010).
- Dieterich, M., et al. Implant-Based Breast Reconstruction Using a Titanium-Coated Polypropylene Mesh (TiLOOP Bra). Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 8-19 (2013).
- Clavé, A., et al. Polypropylene as a reinforcement in pelvic surgery is not inert: comparative analysis of 100 explants. International Urogynecology Journal. 21 (3), 261-270 (2010).
- Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
- Chen, R., Liu, X., Han, L., Zhang, Z., Li, Y. Morphology, thermal behavior, rheological, and mechanical properties of polypropylene/polystyrene blends based on elongation flow. Polymers for Advanced Technologies. 31 (11), 2722-2732 (2020).
- Vial Loading Trays Polystyrene vs. polypropylene: Which tubes are best for your research. ChemTech International. , Available from: https://chemtech-us.com/polystyrene-vs-polypropylene-which-tubes-are-best-for-your-research/ (2020).
- Bock, L. J., Hind, C. K., Sutton, J. M., Wand, M. E. Growth media and assay plate material can impact on the effectiveness of cationic biocides and antibiotics against different bacterial species. Letters in Applied Microbiology. 66 (5), 368-377 (2018).
- Prahl, S. Crystal violet. , Available from: https://omic.org/spectra/PhotochemCAD/html/048.html (2017).
