Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering av større bakteriell biofilm biomasse ved hjelp av PCR-plate dyp brønn mikroplateenheter

Published: April 22, 2022 doi: 10.3791/63069
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2, 1
1Department of Medical Microbiology and Infectious Diseases, University of Manitoba, 2National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada

Summary

Denne protokollen presenterer metodikk for å utføre biofilmvekst og biomassemålinger ved hjelp av selvmonterte PCR-plateenheter med dyp brønn for 96-brønns lokk statisk biofilmscreening.

Abstract

Bakterielle biofilmer er vanskelige å utrydde fra overflater ved hjelp av konvensjonelle antimikrobielle inngrep. Mikroplatemetoder med høy gjennomstrømning på 96 brønner brukes ofte til å dyrke bakterielle biofilmer for rask antimikrobiell følsomhetstesting for å beregne minimale VERDIER for biofilmutryddelseskonsentrasjon (MBEC). Standard biofilmenheter består av polystyrenpinnede lokk montert på 96-brønns mikroplater og er ideelle for måling av biofilmbiomasse og MBEC-verdier, men disse enhetene er begrenset av tilgjengelig pluggoverflate for biomasseakkumulering og kostnad. Her skisserer vi en protokoll for å bruke selvmontert polypropylen 96-brønns dyp brønn PCR-plate festet lokkenhet for å vokse Escherichia coli BW25113 og Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilmer. En sammenligning av 24-timers biofilmer dannet på standard og dype brønninnretninger av hver art ved hjelp av krystallfiolett biomassefarging og MBEC-bestemmelsesanalyser er beskrevet. Det større overflatearealet av dypbrønninnretninger økte forventet generell biofilmdannelse med begge artene 2-4 ganger. P. aeruginosa dannet betydelig større biomasse /mm2 på dype brønnpinner sammenlignet med standardenheten. E. coli hadde større biomasse/mm2 på standard polystyreninnretninger sammenlignet med dypbrønnanordningen. Biofilm utryddelsesanalyser med desinfeksjonsmidler som natriumhypokloritt (blekemiddel) eller benzalkoniumklorid (BZK) viste at begge forbindelsene kunne eliminere E. coli og P. aeruginosa biofilmer fra begge enhetene, men ved forskjellige MBEC-verdier. Utryddelse av BZK biofilm resulterte i variable E. coli MBEC-verdier mellom enheter, men blekemiddel demonstrerte reproduserbare MBEC-verdier for både arter og enheter. Denne studien gir en dyp brønnmetode med høy gjennomstrømning for å dyrke større mengder biofilmer på polypropylenenheter for nedstrømsstudier som krever høyere mengder statisk biofilm.

Introduction

Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli er Gram-negative proteobakterier som ofte studeres for deres evne til å danne sessile, overflatetilknyttede cellesamfunn kjent som biofilmer1. Begge artene, når de vokser som biofilmer, kan utskille en matrise av ekstracellulære polymere stoffer (EPS) som hovedsakelig består av forskjellige polysakkarider og proteiner, som også kan inkludere ekstracellulært DNA og / eller lipider, noe som gir ekstra cellulær beskyttelse og forbedret overlevelse i tøffe, næringsbegrensede miljøer2,3. Biofilmfysiologi og dannelse av begge arter er av klinisk relevans, da de representerer de fem mest isolerte antimikrobielle resistente patogenene fra sykehuspasientblod, urinveier og lungeinfeksjoner i Canada4,5. Det er også viktig å merke seg at biofilmer anslås å utgjøre nesten 80% av alle kroniske og tilbakevendende infeksjoner forårsaket av disse bakterielle artene6. På grunn av de utskilte EPS-stoffene og langsommere metabolsk aktivitet7,8, blir etablerte biofilmer vanskeligere å utrydde når de dannes på overflater som implantert medisinsk utstyr, arrvev og i lungene til cystiske fibrosepasienter9,10, og legger til deres antimikrobielle resistens.

De tilbakevendende vekstegenskapene til bakterielle biofilmer gjør dem ofte mer motstandsdyktige mot antimikrobiell hemming og/eller utryddelse2,9. Dermed er etablering av in vitro-metoder for å studere bakteriell biofilm antimikrobiell utryddelse avgjørende for å velge effektive forbindelser for å utrydde infeksjoner når de dannes på medisinsk plast (f.eks. in-dwelling katetre) og medisinske implantater. De raskeste in vitro biofilm antimikrobielle utryddelseskulturene undersøker biofilmvekst som en "statisk" biofilmkultur i stedet for "kontinuerlige" kulturer, der statisk bakterievekst overvåkes tidlig til sent i biofilmdannelse over en kort (24-96 t) tidsramme i samme vekstmedium. Kontinuerlige biofilmmetoder er tungvint for rask analyse, da de krever biofilmvekst vurdert over lengre tidsrammer dyrket i kamre som tillater kontinuerlig strømning og utskifting av vekstmedier med færre replikeringer11. På grunn av tiden og innsatsen som kreves for å opprettholde og etablere kontinuerlige biofilmer, er statiske in vitro biofilmer de mest populære, da de lett tilpasses for antimikrobielle følsomhetstester med høy gjennomstrømning i plast 96-brønns mikrotiterplater i stedet for forseggjorte strømningskammersystemer som begrenser antall kulturer samtidig testet 12,13 . De enkleste statiske "in-well" biofilmmikroplateanalysene bruker standard polystyren eller vinyl (300 μL kapasitet) mikrotiterplater for å måle biofilmdannelse på sidene og bunnen av hver brønn og ofte som ringer i luften til flytende overflategrensesnitt. Bakteriell biofilmdannelse måles ved å fargelegge de avsatte biomassene som følges av brønnene etter at vekstmediumvæsken er fjernet og biofilmene vaskes12,13. Disse analysene er økonomisk populære, men har ofte reproduserbarhetsproblemer på grunn av deres iboende design, da avsatte biofilmer er utsatt for skade eller tap under skylling for cellegjenoppretting og biomassefargingsprosedyrer11,14.

For å redusere biofilmtap har standard kommersielle biofilmenheter forbedret biofilmmikroplatedesignene i brønnen ved å legge til et innsettingsbart 96-brønns polystyrenlokk til standard 96-tommers platedesign, referert til som "standard biofilmenhet" heri. Tilsetningen av et festet lokk utvider det tilgjengelige overflatearealet i hver mikroplatebrønn, noe som gir forbedret overflatetilslutning og biofilmbiomassedannelse15,16. Standard biofilm-tilkoblede lokkenheter gir mulighet for større biofilmgjenvinning, fjerning og skylling for påfølgende antimikrobiell biofilmfølsomhet og utryddelsestesting når festede lokk settes inn i nye mikrotiterplater som inneholder utfordringer knyttet til stoff eller veksttilstand. I likhet med biofilmmikroplateteknikker i brønnen, gir de gjenvunne materialene fra de fjernede og vaskede lokkenhetene mulighet for celleoverlevelsestesting og biofilmbiomassefarging, vanligvis med krystallfiolett (CV) fargeformuleringer 17,18,19. Standard biofilmenheter er også optimale for screening av biofilm antimikrobielle følsomheter. Disse analysene overvåker biofilmvekstinhibering på to måter: 1) Når antimikrobielle midler legges til celler ved starten av veksten, kan det bestemme minimum biofilmhemmingskonsentrasjon (MBIC) verdi. 2) Når etablerte biofilmer dannes på pinnene etter 24 timer og deretter utsettes for antimikrobielle midler, kan den bestemme minimum biofilm utryddelse konsentrasjon (MBEC) verdi 17,20. I likhet med in-well biofilm mikroplateenheter har standard biofilmenheter noen bemerkelsesverdige begrensninger, for eksempel deres høye kostnader per enhet, de er ikke-autoklaverbare og mindre holdbare for kjemiske løsningsmidler på grunn av polystyrenplaten som brukes. Standard biofilmenheter har også et lavt overflateareal til pluggforhold, noe som begrenser de maksimale arbeidsvolumene i hver brønn til 200 μL. Disse faktorene kan gjøre standard biofilmenheter mer utfordrende å bruke til studier som krever større mengder biofilm i et høygjennomstrømningsformat.

Her beskriver vi en statisk biofilm pegged-lid 96-brønns metode utviklet i laboratoriet vårt ved hjelp av kommersielt tilgjengelige polypropylen halvskjørte 0,5 ml 96-brønns PCR-plater montert på 96-brønns mikrotiterplater som har brønner dypere enn standardplaten (Materialbord). Disse monterte enhetene har et maksimalt arbeidsvolum på 750 μL når de brukes til voksende biofilm (heri kjent som "dyp brønn biofilmenhet"). Fordelene ved å bruke disse biofilmenhetene med dyp brønn er deres lavere kostnader sammenlignet med standard biofilmenheter, de kan steriliseres ved autoklavering, og de øker overflatearealet for biofilmdannelse på den større eksterne PCR-platen "rør / pinner". Med denne metoden viser vi anvendelsene av disse enhetene for dyrking og karakterisering av biofilmbiomasse dannet av Escherichia coli BW25113 og P. aeruginosa PAO1. Metoder for å bestemme MBEC-verdier ved hjelp av biofilm utryddelsesanalyser er beskrevet ved hjelp av kvartær ammoniumforbindelsesdesinfeksjonsmiddel benzalkoniumklorid (BZK) og natriumhypokloritt (blekemiddel) antimikrobielle midler. Det antiseptiske/desinfeksjonsmiddelet BZK ble valgt da denne forbindelsen ofte brukes til å hemme biofilmer fra forurensede overflater, men det er angivelig mindre effektivt til å utrydde veletablerte biofilmer21. Blekemiddel er et svært effektivt kjemikalie for utryddelse av etablerte biofilmer og er en bærebjelke i kjemisk desinfeksjon 22. Begge desinfeksjonsmidler gir en nyttig sammenligning av MBEC-verdier for hver biofilmenhet21. En protokoll for denne biofilmenhetsvurderingen ved hjelp av CV-farging og biofilmutryddelsesanalyser for MBEC-bestemmelse er oppsummert i denne artikkelen. Et protokollflytskjema er inkludert for en forenklet oversikt over arbeidsflyten for disse metodene (figur 1).

Protocol

1. Aseptisk kulturforberedelse for biofilmvekst (Dager 0-1)

  1. På dag 0 strekker du de ønskede bakteriestammene for testing fra en kryokonservert bestand (i glyserol eller dimetylsulfoksid (DMSO)) direkte på en næringsagarplate med antimikrobiell seleksjon som stammen krever. Inkuber agarplater ved optimal temperatur (37 °C) og tid (18-22 t) for belastningsvekst.
  2. Neste dag (dag 1) inokulerer en koloni fra agarplaten i 5 ml vekstmedier ved optimale vekstforhold. Disse kulturene vil bli brukt som dag 2 som starter inokulerer for biofilmenheter (se trinn 2.2; Figur 1).
    MERK: For denne studien ble E. coli K-12 BW21153 og P. aeruginosa PAO1 dyrket i Luria-Bertani (LB) medium ved 37 °C i 18 timer med risting ved 160 omdreininger per minutt (rpm).
    1. Forbered minst 3 uavhengig dyrkede stammer for å generere biologiske repliker for biofilmmåling på grunn av den statistiske variasjonen av biofilmbiomassedannelse på de tilknyttede lokkenhetene.

2. Tilberedning og inokulering av plater (dag 2)

  1. Fyll de ytre brønnene på en autoklavert 96-brønns, 1,1 ml/brønnpolypropylenplate med 750 μL/godt sterilt vann (figur 2A). Fyll de negative kontrollbrønnene (uinokulerte mediebrønner; kolonne B) med 750 μL vekstmedier og de resterende brønnene med 675 μL vekstmedier.
    MERK: Trinn 2.1 ovenfor og trinnene nedenfor viser passende volumer for biofilmenheten med dyp brønn. Ved bruk av standard biofilmenhet skal volumene endres som følger: 75 μL inokulumkultur til 20 μL; 675 μL vekstmedier til 180 μL; 750 μL sterilt vann / vekstmedier til 200 μL; 800 μL CV-flekk/eddiksyre/skylleløsninger til 210 μL. I tillegg, for trinn 3.6 nedenfor, kan Absorbansen ved 500nm (A550 nm) leses direkte i polystyrenmikroplaten etter blanding når du bruker standard mikroplate for biofilmenheter.
  2. Bruk dag 1 over natten kulturer, standardisere kulturer til en optisk tetthet på 600 nm (OD600nm) = 1.0 eller til en McFarland standard på 0.5-1 enheter.
  3. Lag en 10 ganger seriell fortynning av hver standardiserte kultur i reagensrør eller en 96-brønns dyp brønnmikrotiterplate til en 10-3 fortynning er nådd.
  4. Inokuler mediene som inneholder brønner som vist i figur 2B med 75 μL av den 1 x 10-3 fortynnede kulturen, for en endelig bakteriefortynning i brønnen på 10-4.
  5. Sett forsiktig inn en autoklavert PCR-plate (festet lokk) i den inokulerte dype brønnplaten. Inkuber plater ved optimale belastningsforhold (37 °C) med risting (maksimalt 160 o/min) i en inkubator med 50-60% fuktighet i 24 timer.

3. Biofilm biomassebestemmelse fra enheter som bruker CV-farging (dag 3)

  1. Fjern det biofilmtilklipte lokket fra hver enhet og skyll ved å sette det inn i en autoklavert dyp brønnplate tilberedt med 800 μL steril fosfatbufret saltvann (PBS) / brønn i 30 s for å fjerne planktoniske celler.
  2. For biomasse CV-farging, overfør det festede PCR-platelokket til en ny plate tilberedt med 800 μL / brønn 0,1% (w / v) CV i dH2O og flekk i 5 minutter.
  3. Fjern overflødig flekk ved å skylle det festede lokket i en dyp brønnplate tilberedt med 800 μL/godt steril PBS. La platene tørke i 10 minutter i et biosikkerhetsskap med plugger vendt oppover.
  4. Overfør det tørkede PCR-platelokket til en plate som inneholder 800 μL/brønn 30 % (v/v) eddiksyre og la lokket flekke i 5 minutter.
  5. Fjern det avsatte PCR-plugglokket og bland oppløsningen grundig ved å pipettere. Overfør 200 μL fra de dype brønnplatene til en standard 96 brønnmikroplate og mål absorbansen av av-fargingsløsningen ved en bølgelengde på 550 nm (A550nm) i en ultrafiolett (UV)/ synlig (Vis) rekkevidde mikroplateleser.
  6. Bruk de målte A550nm-verdiene til å trekke den gjennomsnittlige tomme verdien (negativ kontroll) A550nm fra hver biofilmprøveverdi. Gjennomsnittlig hver blank-trukket A550nm biofilm prøveverdi som representerer prøve biologiske replikerer.

4. Utfordrende biofilmer med antimikrobielle midler for å beregne deres 24 timers antimikrobielle MBEC-verdi (dag 3)

  1. Forbered en antimikrobiell lagerløsning i vann som er to ganger (2x) konsentrasjonen av ønsket høyeste antimikrobielle konsentrasjon som skal testes.
  2. Lag en todelt fortynningsserie av den antimikrobielle lagerløsningen i 2x konsentrerte vekstmedier slik at det er 8 antimikrobielle konsentrasjoner.
  3. Som vist i figur 2B, fyll de ytre brønnene på en autoklavert dyp brønnplate med 750 μL/godt sterilt vann. Fyll kolonne B (negativ kontroll, ingen bakterier) og C (positiv kontroll, ingen antimikrobiell eksponering) av platen med 750 μL / brønnvekstmedier. Fyll de resterende brønnene med 750 μL/brønn i den antimikrobielle fortynningsserien som vist i figur 2B.
  4. Fjern og skyll det festede lokket som beskrevet i trinn 3.1, og overfør dem til den antimikrobielle utfordringsplaten.
  5. Inkuber plater med risting (maks. 160 o/min) under passende belastningsforhold og for ønsket eksponeringstidsramme.

5. Gjenvinning av biofilmbiomasse fra festede lokk (dag 4)

  1. Fjern antimikrobielle eksponerte lokk og skyll som beskrevet i trinn 3.1. Overfør det festede lokket til en dyp brønnplate med 750 μL/brønngjenvinningsmedier i de indre brønnene og 750 μL/godt steril dH2O i de ytre brønnene.
    1. For å forberede 70 ml gjenopprettingsmedier, kombiner 35 ml 2x konsentrert LB, 0,7 ml 100% tween-20, 3,5 ml 20x universell nøytraliseringsløsning og 30,8 ml steril dH2O i en steril flaske.
    2. For å forberede 20x konsentrert universell nøytraliseringsløsning, tilsett 1,0 g L-histidin, 1,0 g L-cystein og 2,0 g redusert glutathione til et sluttvolum på 20 ml dH2O. Filtrer steriliser løsningen gjennom et 0,2 μm filter og lagre ved 4 °C.
  2. Sett enheten fra trinn 5.1 i en sekundær beholder montert inne i et sonikerende vannbad. Soniker enhetene i 30 minutter for å løsne biofilmen fra pinner til gjenopprettingsmediet.
  3. Etter sonikering, fjern det festede lokket og legg et sterilt flatt platedeksellokk på medieplaten for dyp brønngjenvinning. Det festede lokket kan kastes.
  4. Inkuber plater med gjenopprettingsmedier fra trinn 5.3 ved de optimale belastningsvekstforholdene over natten (16-18 timer).

6. Bestemmelse av MBEC-verdier for enhet (dag 5)

  1. Neste dag overfører du 200 μL fra hver brønn av den inkuberte dype brønnplaten fra trinn 5.4 til en ny 96-brønns mikrotiterplate. Les OD600nm for hver brønn ved hjelp av en UV/Vis-områdemikroplateleser.
  2. Trekk negative kontrollverdier (uninoculated blank) OD600nm fra hver biofilm som inneholder prøvebrønn.
  3. Beregn MBEC-verdien for hver prøve ved hjelp av OD600nm-verdier , der MBEC-verdien er den laveste antimikrobielle konsentrasjonen som resulterte i den laveste OD600nm-verdien (kan ikke skilles fra den uinokulerte kontrollen) for en bestemt antimikrobiell behandlet art/stammeprøve.

Representative Results

Målet med denne studien var å gi en metode for å gjennomføre større volum, høy gjennomstrømning (96-brønn), statiske biofilmenhetsmålinger ved hjelp av dyp brønn biofilmenheter. Her sammenlignet vi en selvmontert halvskjørt PCR-plate satt inn i en dyp brønnmikroplate, kjent som deep well-enheten, med en ofte brukt standard biofilm-festet lokkenhet for å undersøke deres evner til å danne statiske biofilmer. CV-farget biomasse og biofilmutryddelsesanalyser (MBEC) ble brukt til å vurdere biofilmdannelse av begge enhetene.

For å sammenligne biofilmdannelse etter ulike arter på hver enhet, vurderte vi biofilmbiomasser dannet av E. coli BW25113 og P. aeruginosa PAO1 ved hjelp av biofilm CV-fargingsprotokollen17. Selv om CV-farging generelt rapporteres som A550nm-verdier, på grunn av forskjellene i vekstvolumer på hver enhet og deres tilgjengelige overflateområder, konverterte vi CV-flekkverdier A550nm til molar CV-konsentrasjoner i løsningen. Molar CV-konsentrasjoner utgjorde volumforskjeller for hver enhet og tillot en sammenligning av CV-konsentrasjoner som representerer biomasser gjenvunnet fra hver enhet. Resultatene viste at begge artene produserte betydelig mer biomasse på biofilmenheter med dyp brønn (2,1 ganger E. coli; 4,1 ganger P. aeruginosa) sammenlignet med standard biofilmenhet (figur 3A-B). Dette utfallet var forventet gitt det større overflatearealet til den dype brønnen PCR peg (320,4 mm2) sammenlignet med standard enhet peg overflateareal (108,9 mm2). Dette funnet er også i samsvar med de økte volumene (750 μL) som brukes i biofilmenheten med dyp brønn sammenlignet med standard enhetsbrønner (200 μL). Derfor økte dype brønninnretninger biofilmbiomasseakkumulering på PCR-rørpinner sammenlignet med mindre pinner med standard biofilmenheter.

Begge biofilmenhetene dannet reproduserbare biofilmer da vi sammenlignet biologisk replikerte biofilmer dannet av E. coli og P. aeruginosa (figur 3A-B). Til tross for at vi observerte større variasjon i tekniske replikerte CV-fargede M A550nm-verdier for enten stamme dyrket på dypbrønnenheten, var det ingen statistisk signifikante forskjeller da vi sammenlignet median CV M-verdiene for hver arts biologiske replikeringer på den dype brønnen eller standardinnretningene ved hjelp av parvis toveis variansanalyse (ANOVA) eller Student's T-tester (begge p-tester > 0,05). Dette funnet viser at biofilmdannelse med dyp brønn og standardinnretninger danner reproduserbare biofilmer. CV-fargingsresultatene viste imidlertid også at når vi redegjorde for forskjeller i pegoverflate på hver enhet, viste biofilmbiomassedannelsen ved E. coli og P. aeruginosa statistisk signifikante forskjeller i biomasseakkumulering (tabell 1). Beregning av gjennomsnittlig CV-farget biomasse (M) per pluggoverflateareal i mm2 (CV M/mm2) for E. coli viste at biofilmformasjonen var 1,5 ganger lavere på polypropylen dype brønninnretninger sammenlignet med standard biofilmenhet (tabell 1). Det motsatte resultatet ble imidlertid oppnådd for P. aeruginosa, som viste 1,4 ganger høyere CV M/mm2 på polypropylen dype brønnenheter sammenlignet med standard biofilmenheter (tabell 1). Til tross for de observerte artsspesifikke forskjellene i biofilmbiomasseakkumulering med hver enhet, viste den dype brønnenheten fortsatt større generelle (2-4 ganger øker) biofilmbiomassedannelse av hver art (figur 3).

For å bestemme de antimikrobielle følsomhetstestingsapplikasjonene til biofilmenheten med dyp brønn sammenlignet vi to ofte brukte desinfeksjonsmidler, BZK og blekemiddel, for deres biofilm utryddende potensial. Begge kjemikaliene brukes ofte til å forebygge (BZK) og/eller utrydde (blekemiddel) bakterielle biofilmer i kliniske og industrielle applikasjoner21,22,23. Hver forbindelse ble tilsatt i økende 2 ganger konsentrasjoner til biofilmer dannet av E. coli og P. aeruginosa på standard og dyp brønn biofilm enheter22,23(Figur 1, 2B). Den laveste konsentrasjonen av BZK eller blekemiddel som resulterte i OD600nm-verdier som ikke kunne skilles fra negative kontrollbrønner, ble definert som MBEC-verdien. Behandling av biofilmer dannet på standard biofilmenheter med blekemiddel resulterte i de samme blekemiddel MBEC-verdiene på 0,625% for E. coli og P. aeruginosa (tabell 1, figur 4A-B). Blekemiddel MBEC verdier bestemt for E. coli og P. aeruginosa biofilm dannet på dyp brønn enheter viste 2-4 ganger lavere MBEC verdier av begge arter (E. coli; 0,156%; P. aeruginosa 0,313 %) sammenlignet med standardenheter (tabell 1). En 2 ganger forskjell i blekemiddel MBEC-verdier mellom arter ble notert for dypbrønnenheten, der P. aeruginosa krevde en 2 ganger høyere konsentrasjon av blekemiddel for å utrydde biofilmer sammenlignet med E. coli (figur 4A-B, tabell 1). 2-fold blekemiddel MBEC forskjellen mellom P. aeruginosa og E. coli i dyp brønn enhet synes å omvendt korrelere med 1,5 ganger økt CV-farget biomasse formasjon av P. aeruginosa sammenlignet med E. coli (Figur 3A-B). Den større mengden biomasse dannet av P. aeruginosa på dype brønner kan også forklare hvorfor en høyere blekemiddelkonsentrasjon var nødvendig for å utrydde P. aeruginosa biofilmer sammenlignet med E. coli på dype brønner (figur 3A-B, tabell 1). Derfor viser dyp brønninnretning biofilm utryddelsesanalyser at begge artene var utsatt for blekemiddel, men ved lavere (2-4 ganger) blekemiddelkonsentrasjoner sammenlignet med standardenheter. Dette korrelerer omvendt med det 3 ganger større pluggoverflatearealet og volumene til PCR-platepinnene i dyp brønnenheten. Dette antyder at for blekemiddeleksponering kan større biomasseoverflate kan senke blekemiddelkonsentrasjonene som er nødvendige for biofilmutryddelse.

BZK biofilm utryddelse testing viste større variasjon i gjenvunnet vekst (OD600nm verdier) og MBEC verdier av hver art sammenlignet med blekemiddel resultater (Figur 4C-D). Denne variasjonen er ikke uventet basert på tidligere studier som viser at BZK var mer effektiv til å forebygge biofilmdannelse enn å utrydde veletablerte biofilmer24,25,26. Ved hjelp av standard biofilmenhet viste bare P. aeruginosa biofilmer behandlet med BZK en konsistent MBEC-verdi (2560 μg/ml) som var 8 ganger lavere enn MBEC-verdien (20480 μg/ml) oppnådd for denne belastningen i dypbrønnenheten (tabell 1, figur 4C). Disse resultatene kan gjenspeile forskjeller i mengdene P. aeruginosa biomasse dannet på dype godt tilknyttede overflater og plastsammensetninger sammenlignet med standardenhetspinner. BZK-utryddelse av biofilmer dannet av E. coli på både den dype brønnen og standardinnretningene var like dårlig, noe som resulterte i et bredt spekter av BZK MBEC-verdier fra 2560-40960 μg/ml for dypbrønnenheten og 320-10240 μg/ml på standardenheten (figur 4D). For E. coli ble denne variasjonen forklart av sporadiske tilfeller der 1-2 replikeringsbrønner viste lav, men statistisk signifikant vekst i utvinningsmedier, som økte feilen og reduserte BZK MBEC-bestemmelsesnøyaktighet med begge enhetene (figur 4D, tabell 1). Denne variasjonen fremhever ineffektiviteten ved å bruke BZK til å utrydde E. coli biofilmer som tidligere nevnt i studier24,25,26. I kontrast kan P. aeruginosa biofilmer på en pålitelig måte utryddes av BZK ved en definert konsentrasjon med begge enhetene, men med en 8 ganger BZK konsentrasjonsforskjell (figur 4C). Oppsummert viser BZK utryddelse MBEC-verdier av biofilmer dannet av P. aeruginosa distinkte MBEC-verdier med hver enhet, men begge enhetene er like dårlige til å skille E. coli presise BZK utryddelse fenotyper.

Derfor er den dype brønnbiofilmenhetsmetoden som er beskrevet her, tilsvarende effektiv for å danne reproduserbare biofilmer sammenlignet med en standard biofilmenhet.

Figure 1
Figur 1. Skjematisk oversikt over eksperiment. Dag 0 isolering av enkeltkolonier fra kryopreservert lager; Dag 1 inokulering av vekstmedier med enkeltkolonier; Dag 2 inokulering av biofilmplate; Dag 3 CV farging eller antimikrobiell utfordring; Dag 4 biofilm sonikering i gjenopprettingsmedier; og dag 5 lesing OD600nm av utvinning plate for å bestemme MBEC verdier. Noen bilder i figur levert av Servier Medical Art (smart.servier.com). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Eksempel på plateoppsett som vises for ulike trinn i protokollen. A) Det endelige plateoppsettet for den første 24 h biofilmveksten ved hjelp av dag 1 bakteriekulturer fra to bakteriestammer (E. coli og P. aeruginosa), hver med tre biologiske repliker. Negative kontrollbrønner (grå) brukes som sterilitetskontroller (ingen bakterier tilsettet). B) Plateoppsett for antimikrobiell utfordring av biofilmer. Mørkere farger indikerer økende antimikrobiell konsentrasjon. Negativ kontroll er brønner uten bakterier tilsatt (Grå) og positive kontroller er biofilmer uten antimikrobiell eksponering (oransje). Biofilmplugglokk tatt fra panel A overføres til denne dype brønnplaten for antimikrobiell eksponering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Molarkonsentrasjonen (M) av CV-farget E. coli BW25113. (A) og P. aeruginosa PAO1 (B) biofilmbiomasse gjenvunnet fra standard (sirkler) og dype brønnenheter (trekanter). CV-farging ble målt ved å lese absorbansen av CV ved 550 nm (A550nm), og dyp brønn A550nm avlesninger ble justert med en faktor på 3.809 (800 μL / 210 μL) for å ta hensyn til volumforskjellene mellom enhetene. CV molar konsentrasjon (M) ble bestemt av Beer-Lambert loven (CV Konsentrasjon = A550nm / εl); hvor banelengden (l) på 210 μL i den 96 brønn flate bunnmikrotitreplaten ble fastslått å være 0,56 cm og utryddelseskoeffisienten (ε) av CV i vann ved A550nm av 251500 cm-1M-139. Resultatene representerer 9 tekniske replikeringer fra tre biologiske replikeringer av hver stamme dyrket som en biofilm, og hver biologiske replikerings medianverdi vises som en horisontal stang i hver tomt. Statistisk signifikante forskjeller i biomasse mellom enhetene ble bestemt mellom biologiske replikeringsmedianverdier ved hjelp av en tosidet parret t-test (E. coli p = 0,008-0,018 (*); P. aeruginosa p = 0,002-0,009 (**)) vist som stenger med stjerner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. 

Figure 4
Figur 4. Bestemmelse av antimikrobiell MBEC-konsentrasjon. Bestemmelse av antimikrobiell MBEC-konsentrasjon for blekemiddel (A, B) og BZK (C,D) for P. aeruginosa PAO1 (A, C) og E. coli BW25113 (B,D) når de dyrkes på standard (hvite stenger) og dyp brønn (grå barer) biofilm pegged enheter. Resultatene ble bestemt ved lesing av OD600nm biofilm gjenvunnet etter sonikering i gjenopprettingsmedier og overnatting inkubasjon. Dyp brønn OD600nm ble justert med en faktor på 3,75 (750 μL /210 μL) for å ta høyde for volumforskjeller mellom enhetene. Resultatene er representative for tre biologiske replikeringer, og feilfelt viser standardavviket mellom replikeringer ved hver antimikrobielle konsentrasjon39. Stjerner (*) over hvert stolpetegning indikerer statistisk signifikante forskjeller i OD600nm-verdier fra tomme kontroller med p-verdier < 0,05 ved hjelp av tosidige Student T-testberegninger. Sirkelsymboler (o) over hvert stolpetegning angir målinger der bare 1 eller 2 replikeringer hadde statistisk signifikante OD600nm-verdier fra tomme kontroller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

BZK MBEC (μg/ml) Blekemiddel MBEC (% v/v)
Belastning testet Dyp brønn Enhet Standard enhet Dyp brønn Enhet Standard enhet
E. coli BW25113 2560-40960 320-10240 0.156 0.625
P. aeruginosa PAO1 20480 2560 0.313 0.625
Dyp brønn Enhet Standard enhet p-verdi** Fold endring (Dyp brønn / Standard)
Belastning testet Gjennomsnittlig CV M*/ mm2 ± SD Gjennomsnittlig CV M*/ mm2 ± SD
E. coli BW25113 1,99 x 10–8 ± 3,25 x 10–9 3,03 x 10-8 ± 3,31 x 10-9 0.0176 -1.52
P. aeruginosa PAO1 8,01 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 5,72 x 10-8 ± 9,42 x 10-9 0.034 1.4

Tabell 1. En oppsummering av E. coli BW25113 og P. aeruginosa PAO1 betyr CV-farget biomasse M/ mm2 verdier og biofilm utryddelse MBEC verdier for BZK og blekemiddel på ulike enheter.
*Gjennomsnittlige CV M/mm2-verdier beregnet ved hjelp av median biologiske repliker CV M-verdier (figur 3).
**p-verdier bestemt ved hjelp av Tosidige Student T-test.

Discussion

Denne studien beskriver metoder for bruk av et større volum 96-brønns statisk biofilmvekstenhet med høy gjennomstrømning som involverer en polypropylen dyp brønnmikroplate utstyrt med et halvskjørt PCR-platelokk for biofilmdannelse (dyp brønnbiofilmenhet; Tabell over materialer). Vi sammenlignet biofilmer generert med denne enheten med en kommersielt tilgjengelig biofilmenhet av polystyrenstandard (Materialfortegnelse). Den dype brønnenhetsmetoden bruker de samme metodologiske trinnene og løsningene som standardenheten17 ved justerte volumer modifisert for de dype brønninnretningene, noe som gjør denne enheten ideell for storskala biofilmdannelse og eksperimentell analyse. Veksten av E. coli BW25113 og P. aeruginosa PAO1, to Gram-negative arter som er kjent for å danne biofilmer, ble undersøkt for deres biomassedannelse og desinfeksjonsmiddel (BZK / blekemiddel) MBEC-verdier ved bruk på begge enhetene. Sammenligning av CV-farget biomasse dannet på pinner fra hver enhet viste at både E. coli og P. aeruginosa dannet biofilmer med høyere biomasse på dypbrønnbiofilmenheten sammenlignet med standardenheten (figur 3A-B). Økt biofilmbiomasse reflekterte det større overflatearealet av dype brønnpinner sammenlignet med standard overflateareal for enhetspinne. Når vi redegjorde for forskjeller i pluggoverflateområder (mm2) med begge enhetene, ble det notert forskjeller i biomassedannelse, der E. coli dannet betydelig større CV-biomasse per mm2 på polystyrenstandard enhetspinner enn med den dype brønnenhetens PCR-rørpinner (tabell 1). P. aeruginosa dannet større CV-farget biomasse/peg mm2 sammenlignet med standardinnretninger (tabell 1). Disse funnene kan fremheve artsspesifikke forskjeller i biofilmbiomassedannelse på de ulike enhetene.

Det skal bemerkes at blekemiddelutryddelse av E. coli og P. aeruginosa biofilmer på dyp brønninnretninger oppstod ved 2-4 ganger lavere konsentrasjoner enn standardenheten (figur 4A-B, tabell 1). Forskjellene i blekemiddel MBEC-verdier identifisert fra hver enhet påvirkes sannsynligvis av forskjeller i enhetspinneformer (dype brønnpinner" er koniske rør og standardpinner er sylindriske), plastsammensetningsforskjeller (polypropylen versus polystyren) og volumforskjeller (750 μL versus 200 μL). For eksempel hadde P. aeruginosa større CV M biomasse/ mm2 på dyp brønnenhetspinner sammenlignet med standardinnretninger, men E. coli hadde mindre biomasse på dype brønnpinner (figur 3). Dette antyder at desinfeksjonskonsentrasjoner som kreves for biofilmutryddelse, kan påvirkes av biomassen dannet av hver art så vel som det tilgjengelige overflatearealet. I tillegg kan forskjeller i enhetspinneform påvirke ulike vekstforhold for bestemte arter. I vår studie kan P. aeruginosa danne større biomasse på dype brønnpinner på grunn av deres større overflateareal og lufting, da denne arten er en obligatorisk aerobe i motsetning til E. coli, som er en fakultetsanaerobe. Til dags dato har vi ikke identifisert noen publiserte studier som direkte har sammenlignet E. coli og P. aeruginosa biofilmdannelse sammen på både polypropylen27,28,29 og polystyren30,31 materialer. Imidlertid har rapporter om robust E. coli og P. aeruginosa biofilmdannelse blitt notert i uavhengige studier som undersøker enten polypropylen eller polystyrenmaterialer. Når det gjelder Pseudomonader, kan mange Pseudomonas spp. bruke plast som polypropylen som potensielle karbonkilder32. Derfor er tilgjengeligheten av denne polypropylen dype brønnbiofilmenheten et nyttig fremskritt i statiske biofilmstudier. Polypropylen er kjemisk mer holdbar enn polystyren og er et klinisk relevant materiale, da det ofte brukes i medisinske implantater, suturer og masker for brokk eller bekkenoperasjoner33,34.

Selv om biofilmbiomasse ble dannet av begge enhetene, hadde den dype brønnenheten litt høyere variasjon i biomasse basert på CV-fargingsmetoden og OD600nm biofilmutryddelse MBEC-verdier for blekemiddel og BZK. Dette kan forklares med 3 hovedfaktorer: 1) Dyp brønninnretninger har større pluggoverflateområde enn standardinnretninger som ble vinklet sammenlignet med standard enhetspinner. 2) Begge de testede artene kan ha forskjellige evner til å holde seg til polypropylen- og polystyrenmaterialer fra hver enhet. 3) Volumene av vekstmedier som brukes i hver enhet (750 μL dyp brønn, 200 μL standard) og avstanden mellom den innsatte pinnen til brønnsideveggene varierer. Disse problemene er ikke et problem hvis bare en type enhet brukes til alle biofilmeksperimenter, men hvis begge enhetene er valgt, bør sammenligningene vi utførte her, utføres for å identifisere forskjeller36,37. På grunn av forskjellene i plastmateriale som brukes i hver enhet, bør CV-farget biofilmbiomasse og MBEC-verdier ikke sammenlignes direkte mellom forskjellige enheter. Men hvis metoder og eksperimenter utføres på samme enhet (dyp brønn eller standard), er resultatene oppnådd for arter og antimikrobielle midler testet sammenlignbare.

Denne protokollen viser at selvmonterte PCR-plateenheter med dyp brønn er større volumbiofilmenhet for måling av biofilmdannelse og utryddelse som også er kostnadseffektiv. Fra et kostnadsperspektiv varierer standard biofilmenheter med en 96 godt festet lokk detaljhandel til $ 29-36 amerikanske dollar (USD) per enhet (Materialfortegnelser). Polystyren standard biofilm enheter er ikke autoklaverbare og er mindre tolerante for løsemidler / syrer på grunn av sine plast kjemiske egenskaper. De selvmonterte polypropylen dype brønnplatene som er beskrevet her, utstyrt med en separat halvskjørt 96 brønn PCR-plate (Materialbord) koster totalt $ 14 USD per montert enhet, som er halvparten av standard biofilmenhetskostnad. Det skal bemerkes at prisene kan variere avhengig av region, distributør og tilgjengelighet, og våre kostnader etter institusjonelle rabatter fungerte til $ 9 USD / dyp brønnenhet. Disse selvmonterte pcR-plateenhetene med dyp brønn har den ekstra fordelen av å være autoklaverbare for sterilisering og tilbyr 2-4 ganger mer biofilmbiomasse enn standardenheter.

Til slutt viser denne protokollen og de representative funnene fra biofilmvekstsammenligninger av de dype brønn- og standard biofilmenhetene at begge enhetene er i stand til å dyrke bakterielle biofilmer, men dype brønnenheter danner 2-4 ganger mer biofilm. Biofilmenheten med dyp brønn tilbyr et levedyktig og rimelig alternativ for større biofilmdannelseseksperimenter med høy gjennomstrømning, for eksempel screeningstudier av legemiddelfølsomhet. Denne teknikken kan generere biofilmer som er nyttige for nedstrøms '-omics' ekstraksjoner (proteomiske, metabolomiske, transkripsjonsemiske) eller eksperimentelle analyser (enzymatiske, fluorescerende) som kan kreve større mengder biofilmmaterialer for analyser. Biofilmenheten med dyp brønn anbefales for laboratorier som ønsker å studere biofilmer i en 96-brønns analyse med høy gjennomstrømning ved hjelp av rimeligere, større volum, kjemisk holdbare plastmaterialer som er klinisk relevante.

Disclosures

Forfatterne har ingen avsløringer å komme med.

Acknowledgments

Støtten til dette arbeidet ble gitt ved driftstilskudd til DCB fra Natural Science and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN- 2016-05891) og til MRM og GRG fra regjeringen i Canadian Genomics Research and Development Initiative Grant (GRDI) program (GRDI7 2254557).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic (200/CS) Fisher Scientific 13-678-11F disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
2 mL serological pipets, individ wrap paper/plastic, 500/CS Fisher Scientific 13-678-11C disposable serological pipettes for aseptic media/ culture transfer
Axygen Aerosol Filter Tips, Sterile, 5 racks/ PK, 1000 tips/rack Fisher Scientific 14-222-766 sterile pipettor tips for media aliquoting
Axygen deep well storage microplates, round wells, 1.1 mL cap, 5/PK, P-DW-11-C Fisher Scientific P-DW-11-C microplate for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Axygen Filter tips, 350 µL tips racked, 96/rack, 10 racks, low retention barrier tips Fisher Scientific TF-350-L-R-S sterile pipettor tips for media aliquoting
Basin/reservoir natural PS 50 mL, Sterile, 5/bag, 40 bags, CS200 Avantor/ VWR 89094-676 sterile basins/ reservoirs for microplate preparation
BD Difco Dehydrated Culture Media: Granulated Agar, 500 g Fisher Scientific DF0145-17-0 materials for LB agar preparation
Biotek Synergy Neo2 multimode plate reader Biotek NEO2MB microplate UV/Vis region plate reader
Branson M3800 Ultrasonic Bath, 117 V Avantor/ VWR CPX-952-316R sonicating water bath
crystal violet (CV), ACS grade, 100 g Fisher Scientific C581-100 biofilm biomass stain
Dimethyl sulfoxide (DMSO), 1 L, ACS grade 99.9%, poly bottle, BDH Avantor/ VWR CABDH1115-1LP media components for cryopreservation
Easypet 3, pipet controller Avantor/ VWR CA11027-980 serological pipettor for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 10-100 µL Avantor/ VWR CA89125-338 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Eppendorf Research Plus 8 multi-channel pipettor , 30-300 µL Avantor/ VWR CA89125-340 multichannel pipettes for aseptic media/ culture transfer
Glacial acetic acid, CAS 64-19-7, 2.5L, ACS grade Fisher Scientific A38-212 CV destain
Glass test tubes, 150 mm x 18 mm, 72/Pack, PYREX Fisher Scientific 14957H/ 9820-18 materials for cell culturing
Glycerol, 4 L glass bottle ACS Fisher Scientific BP229-4 media components for cryopreservation
L-Cysteine, 98%, 250 g Avantor/ VWR 97061-204 universal neutralizing solution
L-glutathione reduced, 98%, 25 g Fisher Scientific AAJ6216614 universal neutralizing solution
L-Hisitidine, 98%, 100 g Avantor/ VWR CA97062-598 universal neutralizing solution
MBEC Assay Inoculator with 96 well tray, 100/CS Innovotech 19112 material for 96 well MBEC device biofilm cultivation
McFarland Standard, 0.5 EA Fisher Scientific R20410 cell culture standardization
McFarland Standard, 1.0 EA Fisher Scientific R20411 cell culture standardization
NUNC 96-well microtiter plates, w/lid, 50/CS Fisher Scientific 167008 microplate for 96 well MBEC device biofilm cultivation and OD measurements
PCR plate, semi-skirted 96 well, fast PCR, polypropylene, 25ea/PK Sarstedt 72.1981.202 pegged lid for 96 well deepwell device biofilm cultivation
Petri dish, 100 mm x 15 mm, semi-TK CS/500 Fisher Scientific FB0875712 materials for LB agar preparation
Potassium phosphate dibasic, ACS 500 g Fisher Scientific P288-500 PBS component/ buffer
Sodium chloride, ACS grade, 3 kg Fisher Scientific S2713 media components for LB broth and PBS
sodium phosphate monobasic, 1 kg Fisher Scientific S369-1 PBS component/ buffer
Syringe filters, Sterile, PES 0.45 um, 25 mm, PK50 Avantor/ VWR 28145-505 non-autoclavable solution sterilization
Tin foil, heavy duty, 50 feet Grocery store --- materials for deepwell device sterilization
Tryptone (peptone from casein), 2.2 kg/EA Fisher Scientific B11922 media components for LB broth
Tween-20, 100 mL Fisher Scientific BP337-100 recovery media solution
Ultra-deepwell, 2.5 mL deep well plates (square well), with lid, polypropylene, 10/CS Avantor/ VWR 37001-520 materials for biofilm dilution preparation
Yeast Extract, Fisher Bioreagents, 500 g Fisher Scientific BP1422-500 media components for LB broth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verderosa, A. D., Totsika, M., Fairfull-Smith, K. E. Bacterial Biofilm Eradication Agents: A Current Review. Frontiers in Chemistry. 7, 1-17 (2019).
  2. Sharma, D., Misba, L., Khan, A. U. Antibiotics versus biofilm: An emerging battleground in microbial communities. Antimicrobial Resistance and Infection Control. 8 (1), 1-10 (2019).
  3. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  4. Lagacé-Wiens, P. R. S., et al. Trends in antimicrobial resistance over 10 years among key bacterial pathogens from Canadian hospitals: results of the CANWARD study 2007-16. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74, Suppl 4 22-31 (2019).
  5. Karlowsky, J. A., et al. In vitro susceptibility of urinary Escherichia coli isolates to first- and second-line empirically prescribed oral antimicrobials: CANWARD surveillance study results for Canadian outpatients, 2007-2016. International Journal of Antimicrobial Agents. 54 (1), 62-68 (2019).
  6. Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiology. 7 (9), 1061-1072 (2012).
  7. Amato, S. M., et al. The role of metabolism in bacterial persistence. Frontiers in Microbiology. 5, 1-9 (2014).
  8. Flemming, H. -C., Neu, T. R., Wozniak, D. J. The EPS matrix: The "house of biofilm cells.". Journal of Bacteriology. 189 (22), 7945-7947 (2007).
  9. Dela Fuente-Núñez, C., Reffuveille, F., Fernández, L., Hancock, R. E. W. Bacterial biofilm development as a multicellular adaptation: Antibiotic resistance and new therapeutic strategies. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 580-589 (2013).
  10. Høiby, N., et al. The clinical impact of bacterial biofilms. International Journal of Oral Science. 3 (2), 55-65 (2011).
  11. Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. 01, Unit 1B.1 (2005).
  12. Coffey, B. M., Anderson, G. G. Biofilm formation in the 96-well microtiter plate. Methods in Molecular Biology. 1149, 631-641 (2014).
  13. O'Toole, G. A. Microtiter dish Biofilm formation assay. Journal of Visualized Experiments. (47), e2437 (2010).
  14. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  15. Harrison, J. J., Turner, R. J., Ceri, H. High-throughput metal susceptibility testing of microbial biofilms. BMC Microbiology. 5 (53), (2005).
  16. Ceri, H., et al. The MBEC Assay System: Multiple Equivalent Bioffims for Antibiotic and Biocide Susceptibility Testing. Methods in Enzymology. 337, 377-385 (2001).
  17. Harrison, J. J., et al. Microtiter susceptibility testing of microbes growing on peg lids: a miniaturized biofilm model for high-throughput screening. Nature Protocols. 5 (7), 1236-1254 (2010).
  18. vanden Driessche, F., Rigole, P., Brackman, G., Coenye, T. Optimization of resazurin-based viability staining for quantification of microbial biofilms. Journal of Microbiological Methods. 98, (2014).
  19. Sabaeifard, P., Abdi-Ali, A., Gamazo, C., Irache, J. M., Soudi, M. R. Improved effect of amikacin-loaded poly(D,L-lactide-co-glycolide) nanoparticles against planktonic and biofilm cells of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Medical Microbiology. 66 (2), 137-148 (2017).
  20. Thieme, L., et al. MBEC Versus MBIC: the Lack of Differentiation between Biofilm Reducing and Inhibitory Effects as a Current Problem in Biofilm Methodology. Biological Procedures Online. 21 (1), 18 (2019).
  21. Jennings, M. C., Ator, L. E., Paniak, T. J., Minbiole, K. P. C., Wuest, W. M. Biofilm-eradicating properties of quaternary ammonium amphiphiles: Simple mimics of antimicrobial peptides. Chembiochem. 15 (15), 2211-2215 (2014).
  22. Lineback, C. B., et al. Hydrogen peroxide and sodium hypochlorite disinfectants are more effective against Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms than quaternary ammonium compounds. Antimicrobial Resistance & Infection Control. 7 (1), 154 (2018).
  23. Minbiole, K. P. C., et al. From antimicrobial activity to mechanism of resistance: The multifaceted role of simple quaternary ammonium compounds in bacterial eradication. Tetrahedron. 72 (25), 3559-3566 (2016).
  24. Mangalappalli-Illathu, A. K., Korber, D. R. Adaptive resistance and differential protein expression of Salmonella enterica serovar enteritidis biofilms exposed to benzalkonium chloride. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 50 (11), 3588-3596 (2006).
  25. El-Banna, T., Abd El-Aziz, A., Sonbol, F., El-Ekhnawy, E. Adaptation of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates to benzalkonium chloride retards its growth and enhances biofilm production. Molecular Biology Reports. 46, 3437-3443 (2019).
  26. Ebrahimi, A., et al. Effects of benzalkonium Chloride on planktonic growth and biofilm formation by animal bacterial pathogens. Jundishapur Journal of Microbiology. 8 (2), 59764 (2015).
  27. Reśliński, A., et al. Evaluation of Staphylococcus aureus and Escherichia coli biofilm formation on the surface of polypropylene mesh. Medycyna doświadczalna i mikrobiologia. 63 (1), 21-27 (2011).
  28. Verhorstert, K. W. J., et al. In vitro bacterial adhesion and biofilm formation on fully absorbable poly-4-hydroxybutyrate and nonabsorbable polypropylene pelvic floor implants. Cite This: ACS Applied Materials & Interfaces. 12, 53646-53653 (2020).
  29. Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration & Biodegradation. 64 (6), (2010).
  30. Jones, J. F., et al. Oriented adhesion of Escherichia coli to polystyrene particles. Applied and Environmental Microbiology. 69 (11), 6515-6519 (2003).
  31. Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
  32. Arkatkar, A., Juwarkar, A. A., Bhaduri, S., Uppara, P. V., Doble, M. Growth of Pseudomonas and Bacillus biofilms on pretreated polypropylene surface. International Biodeterioration and Biodegradation. 64 (6), 530-536 (2010).
  33. Dieterich, M., et al. Implant-Based Breast Reconstruction Using a Titanium-Coated Polypropylene Mesh (TiLOOP Bra). Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 8-19 (2013).
  34. Clavé, A., et al. Polypropylene as a reinforcement in pelvic surgery is not inert: comparative analysis of 100 explants. International Urogynecology Journal. 21 (3), 261-270 (2010).
  35. Zameer, F., et al. Evaluation of adhesive and anti-adhesive properties of Pseudomonas aeruginosa biofilms and their inhibition by herbal plants. Iranian Journal of Microbiology. 8 (2), 108-119 (2016).
  36. Chen, R., Liu, X., Han, L., Zhang, Z., Li, Y. Morphology, thermal behavior, rheological, and mechanical properties of polypropylene/polystyrene blends based on elongation flow. Polymers for Advanced Technologies. 31 (11), 2722-2732 (2020).
  37. Vial Loading Trays Polystyrene vs. polypropylene: Which tubes are best for your research. ChemTech International. , Available from: https://chemtech-us.com/polystyrene-vs-polypropylene-which-tubes-are-best-for-your-research/ (2020).
  38. Bock, L. J., Hind, C. K., Sutton, J. M., Wand, M. E. Growth media and assay plate material can impact on the effectiveness of cationic biocides and antibiotics against different bacterial species. Letters in Applied Microbiology. 66 (5), 368-377 (2018).
  39. Prahl, S. Crystal violet. , Available from: https://omic.org/spectra/PhotochemCAD/html/048.html (2017).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 182 biofilm MBEC biofilmbiomasse biofilmutryddelsesanalyse Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli krystallfiolett farging polystyren polypropylen blekemiddel
Generering av større bakteriell biofilm biomasse ved hjelp av PCR-plate dyp brønn mikroplateenheter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Doucet, A. N., Slipski, C. J.,… More

Doucet, A. N., Slipski, C. J., Golding, G. R., Mulvey, M. R., Bay, D. C. Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices. J. Vis. Exp. (182), e63069, doi:10.3791/63069 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter