Summary
Denne studien rapporterer en ny tilnærming til å måle flere mitokondrielle funksjonelle parametere basert på flowcytometri og dobbeltfarging med to fluorescerende reportere eller antistoffer for å oppdage endringer i mitokondrielt volum, mitokondrielt membranpotensial, reaktivt oksygenartsnivå, mitokondriell respiratorisk kjedesammensetning og mitokondrielt DNA.
Abstract
Mitokondrier er viktige i patofysiologien til mange nevrodegenerative sykdommer. Endringer i mitokondriell volum, mitokondriell membranpotensial (MMP), mitokondriell produksjon av reaktive oksygenarter (ROS) og mitokondrielt DNA (mtDNA) kopinummer er ofte funksjoner i disse prosessene. Denne rapporten beskriver en ny flowcytometribasert tilnærming for å måle flere mitokondrielle parametere i forskjellige celletyper, inkludert humaninduserte pluripotente stamceller (iPSCs) og iPSC-avledede nevrale og gliaceller. Denne flytbaserte strategien bruker levende celler til å måle mitokondrielt volum, MMP og ROS-nivåer, samt faste celler for å estimere komponenter i mitokondriell respiratorisk kjede (MRC) og mtDNA-assosierte proteiner som mitokondriell transkripsjonsfaktor A (TFAM).
Ved samfarging med fluorescerende reportere, inkludert MitoTracker Green (MTG), tetrametylrhodamin etylester (TMRE) og MitoSox Red, kan endringer i mitokondriell volum, MMP og mitokondriell ROS kvantifiseres og relateres til mitokondrielt innhold. Dobbeltfarging med antistoffer mot MRC-komplekse underenheter og translocase av ytre mitokondriell membran 20 (TOMM20) gjør det mulig å vurdere MRC-subenhetsuttrykk. Siden mengden TFAM er proporsjonal med mtDNA-kopinummer, gir måling av TFAM per TOMM20 en indirekte måling av mtDNA per mitokondriell volum. Hele protokollen kan utføres innen 2-3 timer. Det er viktig at disse protokollene tillater måling av mitokondrielle parametere, både på totalnivå og det spesifikke nivået per mitokondrielt volum, ved bruk av flowcytometri.
Introduction
Mitokondrier er essensielle organeller som finnes i nesten alle eukaryote celler. Mitokondrier er ansvarlige for energiforsyningen ved å produsere adenosintrifosfat (ATP) via oksidativ fosforylering og fungerer som metabolske mellomledd for biosyntese og metabolisme. Mitokondrier er dypt involvert i mange andre viktige cellulære prosesser, som ROS-generasjon, celledød og intracellulær Ca2+ regulering. Mitokondriell dysfunksjon har vært assosiert med ulike nevrodegenerative sykdommer, inkludert Parkinsons sykdom (PD), Alzheimers sykdom (AD), Huntingtons sykdom (HS), Friedreichs ataksi (FRDA) og amyotrofisk lateralsklerose (ALS)1. Økt mitokondriell dysfunksjon og mtDNA-abnormitet antas også å bidra til menneskelig aldring 2,3.
Ulike typer mitokondriell dysfunksjon forekommer i nevrodegenerative sykdommer, og endringer i mitokondriell volum, MMP-depolarisering, produksjon av ROS og endringer i mtDNA-kopinummer er vanlige 4,5,6,7. Derfor er evnen til å måle disse og andre mitokondrielle funksjoner av stor betydning når man studerer sykdomsmekanismer og tester potensielle terapeutiske midler. Videre, i lys av mangelen på dyremodeller som trofast replikerer menneskelige neurodegenerative sykdommer, er etablering av egnede in vitro-modellsystemer som rekapitulerer den menneskelige sykdommen i hjerneceller et viktig skritt mot en større forståelse av disse sykdommene og utviklingen av nye terapier 2,3,8,9.
Humane iPSCer kan brukes til å generere forskjellige hjerneceller, inkludert nevronale og ikke-nevronale celler (dvs. gliaceller), og mitokondriell skade assosiert med nevrodegenerativ sykdom er funnet i begge celletyper 3,10,11,12,13. Passende metoder for iPSC-differensiering i nevrale og glialinjer er tilgjengelige14,15,16. Disse cellene gir en unik menneskelig / pasient plattform for in vitro sykdom modellering og narkotika screening. Videre, da disse er avledet fra pasienter, gir iPSC-avledede nevroner og gliaceller sykdomsmodeller som gjenspeiler hva som skjer hos mennesker mer nøyaktig.
Til dags dato er få praktiske og pålitelige metoder for å måle flere mitokondrielle funksjonelle parametere i iPSCs, spesielt levende nevroner og gliaceller, tilgjengelige. Bruken av flowcytometri gir forskeren et kraftig verktøy for å måle biologiske parametere, inkludert mitokondriell funksjon, i enkeltceller. Denne protokollen gir detaljer for generering av forskjellige typer hjerneceller, inkludert nevrale stamceller (NSC), nevroner og gliaastrocytter fra iPSCs, samt nye flowcytometribaserte tilnærminger for å måle flere mitokondrielle parametere i forskjellige celletyper, inkludert iPSCs og iPSC-avledede nevrale og glialceller. Protokollen gir også en samfargingsstrategi for bruk av flowcytometri for å måle mitokondrielt volum, MMP, mitokondrielt ROS-nivå, MRC-komplekser og TFAM. Ved å inkorporere målinger av mitokondrielt volum eller masse, tillater disse protokollene også måling av både totalt nivå og spesifikt nivå per mitokondriell enhet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Se materialtabellen og tilleggstabellen S1 for oppskrifter av alle medier og løsninger som brukes i denne protokollen.
1. Differensiering av humane iPSC-er i NCSer, dopaminerge (DA) nevroner og astrocytter
- Forbered matrisebelagte plater.
- Tine et hetteglass med 5 ml matriks på is over natten. Fortynn 1 ml matriks med 99 ml kald Advanced Dulbeccos Modified Eagle Medium/Hams F-12 (Advanced DMEM/F12) (1 % sluttkonsentrasjon). Lag 1 ml aliquots og oppbevar dem ved -20 °C.
- Tin matriksløsningen ved 4 °C (hold den kald) og belegg 6 brønner (1 ml per brønn i en 6-brønns plate).
- Plasser den matriksbelagte platen i en fuktet 5 % CO2/95 % luftinkubator ved 37 °C i 1 time. Ta platen ut av inkubatoren og la den balansere til romtemperatur (RT).
MERK: Det anbefales å bruke platen innen 3 dager etter belegg. Den belagte platen kan imidlertid oppbevares i opptil 2 uker ved 4 °C. Bare husk å ta den ut og la den varme opp til RT før bruk. For langtidslagring, tilsett 1 ml iPSC-kulturmedium til den belagte platen for å unngå tørking av matrisen.
- Tine iPSC-er
- Forvarm de matriksbelagte platene ved RT eller i inkubatoren ved 37 °C i 20-30 min. Forvarm den nødvendige mengden iPSC-kulturmedium ved RT.
- Bland 6 ml forvarmet iPSC-kulturmedium med 12 μL Y-27632 ROCK-hemmer for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10 μM.
- Tine det frosne hetteglasset med iPSC-er ved 37 °C delvis i et vannbad til et lite isstykke er igjen.
- Tilsett sakte 1 ml forvarmet iPSC-kulturmedium med 12 μL ROCK-hemmer dråpevis til cellene. Overfør væskeinnholdet i hetteglasset med iPSC dråpevis i en brønn på en 6-brønns forhåndsbelagt plate ved hjelp av en 5 ml pipette.
- Flytt platen i vinkelrette retninger for å blande brønninnholdet og returner platen til inkubatoren. Bytt iPSC-kulturmedium etter 24 timer etter vask med Dulbeccos fosfatbufrede saltvann (DPBS) (1x) (Ca 2+/Mg2+-fri) (4 ml per brønn i en 6-brønns plate).
MERK: Ikke tilsett ROCK-hemmer i påfølgende tilførsler. Endre iPSC-kulturmediet daglig.
- Subkulturering av iPSC-er
- Forvarm de matriksbelagte platene ved RT eller i inkubatoren ved 37 °C i 20-30 min. Forvarm den nødvendige mengden iPSC-kulturmedium ved RT.
- Aspirer kulturmediet fra platene som inneholder cellene. Skyll iPSC-ene med DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-fri) (4 ml per brønn i en 6-brønns plate).
- Tilsett EDTA (0,5 mM) (1 ml per brønn i en 6-brønns plate). Inkuber platene ved 37 °C til kantene på koloniene begynner å løfte seg fra brønnen (vanligvis 3-5 min). Aspirate the EDTA.
- Tilsett forvarmet iPSC-kulturmedium (4 ml per brønn i en 6-brønns plate) og løsne iPSC-koloniene kraftig ved hjelp av en 10 ml steril pipette én gang. Ikke pipette opp og ned, da dette kan bryte celleklumper i enkeltceller.
- Overfør innholdet i hver brønn i to individuelle brønner i en matrisebelagt 6-brønnsplate (2 ml per brønn i en 6-brønnsplate) og inkuber ved 37 °C. Ikke generer bobler i suspensjonen under pipettering.
MERK: Rist tallerkenen forsiktig før du holder den i inkubatoren. Delingsforholdet kan være 1:2 (en brønn i 2 nye brønner) til 1:4 (en brønn i 4 nye brønner). - Bytt ut mediet daglig til koloniene når 60% sammenløp med god størrelse og forbindelser.
- Nevral induksjon og nevral stamfar generasjon
- Forbered 500 ml kjemisk definert medium (CDM), 500 ml nevral induksjonsmedium (NIM) og 500 ml nevral stamcelle serumfritt (NSC SF) medium.
- Skyll cellene med DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-fri) (4 ml per brønn i en 6-brønns plate) og tilsett NIM (3 ml per brønn i en 6-brønns plate). Sett opp som dag 0.
- Bytt ut NIM (3 ml per brønn i en 6-brønns plate) på dag 1, dag 3 og dag 4 og observer under mikroskopi daglig.
- På dag 5 løsner du nevrale rosetter i suspensjonskultur som beskrevet nedenfor.
- Vask en gang forsiktig med DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-fri) (4 ml per brønn i en 6-brønns plate). Tilsett kollagenase IV (1 ml per brønn i en 6-brønns plate) og hold i en inkubator i 1 min. Aspirer kollagenase IV og vask en gang med DPBS (1x) (4 ml per brønn i en 6-brønns plate) forsiktig.
- Tilsett 2 ml NSC SF Medium per brønn til en 6-brønns plate. Løsne cellene ved å skrape bunnen av brønnene ved å tegne rutenett ved hjelp av en 200 μL pipettespiss.
- Samle cellesuspensjonen fra 6-brønnsplaten i en 10 cm ikke-klebende tallerken. Gjør opp volumet til 12 ml med NSC SF Medium.
- Rist den ikke-adherente parabolen ved 65-85 o / min på en orbital shaker i en inkubator for å forhindre aggregering.
- DA-nevrondifferensiering
- På dag 7, legg til 12 ml CDM supplert med 100 ng / ml fibroblast vekstfaktor-8b (FGF-8b) og legg parabolen på orbital shaker i inkubatoren.
- På dag 8-13, bytt medium hver 2. dag og observer under mikroskopi daglig.
- På dag 14, legg til 12 ml CDM supplert med 100 ng / ml FGF-8b og 1 μM purmorphamine (PM). Plasser parabolen på orbital shaker i inkubatoren.
- På dag 15-20, bytt medium hver 2. dag og observer cellene under mikroskopien daglig.
- Passasjer kulene mekanisk ved å bruke 1000 μL-spisser for å bryte opp de større sfærene.
MERK: Forholdet kan være 1: 2 (en tallerken til 2 nye retter).
- Oppsigelse av differensiering
- Belegge en 6-brønns plate eller deksler med Poly-L-Ornithine (PLO) og laminin som beskrevet nedenfor.
- Belegg en 6-brønns plate med 1 ml PLO per brønn, og inkuber platen ved 37 °C i 20 minutter. Aspirer PLO-løsningen.
- Steriliser platen under UV i 20 minutter. Skyll brønnene to ganger med DPBS (1x) (4 ml per brønn i en 6-brønns plate).
- Tilsett 5 μg/ml lamininoppløsning (1 ml per brønn i en 6-brønnsplate) til brønnen og inkuber ved 37 °C i 2 timer. Aspirer lamininet og vask brønnene kort med DPBS (1x) (4 ml per brønn i en 6-brønns plate) en gang før plettering.
- Samle alle kuler (fra trinn 1.5.5) i 50 ml rør og fyll på med DPBS (1x). Spinn ved 300 × g i 5 min. Aspirer supernatanten.
- Inkuber med 2 ml celledissosiasjonsreagens (se materialtabellen) i 10 minutter ved 37 °C i et vannbad etterfulgt av skånsom triturasjon med en 200 μL pipette (20-50 ganger avhengig av størrelsen på kulene, unngå bobledannelse).
- Nøytraliser celledissosiasjonsreagenset med 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS) og sentrifuger 50 ml konisk rør som inneholder cellene ved 300 × g i 5 minutter ved RT. Aspirer supernatanten.
- Tilsett 1 ml CDM supplert med 10 ng / ml hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF) og 10 ng / ml glialcellelinjeavledet nevrotrofisk faktor (GDNF) for å resuspendere cellepellets ved forsiktig pipettering opp og ned for å oppnå enkeltcellesuspensjoner.
- Aspirer lamininoppløsningen fra platen (trinn 1.6.1.3), vask kort med DPBS (1x) (4 ml per brønn i en 6-brønnsplate), og frø cellene (fra trinn 1.6.5) i de forhåndsbelagte platene eller dekslene i 3 ml CDM supplert med 10 ng / ml BDNF og 10 ng / ml GDNF. Fôr cellene hver 4.
MERK: Differensierende kulturer kan opprettholdes i mange uker opptil 3 måneder. Den nevrale morfologien vises vanligvis etter 2 ukers avslutning og kan brukes til nedstrømsanalyser fra det tidspunktet. BDNF og GDNF er ikke nødvendig for dyrking for lengre vedlikehold (opptil 2 måneder).
- Belegge en 6-brønns plate eller deksler med Poly-L-Ornithine (PLO) og laminin som beskrevet nedenfor.
- NSC-generasjon
- Frakkmatriseplater.
- Samle alle nevrale sfærer (generert fra trinn 1.4) i 50 ml rør og fyll på med DPBS (1x) (Ca 2 + / Mg2 + -fri). Spinn ved 300 × g i 5 min. Aspirer supernatantene.
- Inkuber pellets med 2 ml celledissosiasjonsreagens i 10 minutter ved 37 ° C i et vannbad, etterfulgt av mild triturasjon med en 200 μL pipette (20-50 ganger avhengig av størrelsen på kulene, unngå bobledannelse).
- Nøytraliser med 2 ml DMEM med 10% FBS og sentrifuger de 50 ml koniske rørene som inneholder cellene ved 300 × g i 5 minutter ved RT. Aspirer supernatantene. Resuspender cellepellets ved forsiktig pipettering opp og ned for å oppnå encellede suspensjoner.
- Aspirer matriksløsningen fra en forhåndsbelagt plate og frø cellene i de forhåndsbelagte platene i NSC SF Medium (3 ml per brønn i en 6-brønns plate). Fôr cellene hver 2-3 dag og del cellene når de er sammenflytende.
MERK: Fra dette stadiet og fremover kan NSC-er utvides og fryses ned.
- Glia astrocyte differensiering
- Astrocyttdifferensiering fra NSC-er
- Forbered 500 ml astrocyttdifferensieringsmedium.
- Frø NSC på Poly-D-Lysin (PDL)-belagte plater/deksler med NSC SF Medium.
- Neste dag, skyll cellene med DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-fri) (4 ml per brønn i en 6-brønns plate) og tilsett Astrocyte Differentiation Medium (3 ml per brønn i en 6-brønns plate). Sett opp som dag 0.
- Følg NSC-ene under mikroskopet daglig og erstatt Astrocyte Differentiation Medium (3 ml per brønn i en 6-brønns plate) hver 2. dag fra dag 1 til 27.
- Astrocytt modning
- Forbered astrocyttmodningsmedium.
- På dag 28, skyll cellene med DPBS (1x) (4 ml per brønn i en 6-brønnplate) og tilsett Astrocyte Maturation Medium (3 ml per brønn i en 6-brønns plate).
- På dag 29 og fremover, observer cellene under mikroskopet daglig og erstatt Astrocyte Maturation Medium (3 ml per brønn i en 6-brønns plate) hver 2.
- Etter en måneds modning, utvid cellene og kryopreserver dem fra dette stadiet og fremover.
MERK: I løpet av denne fasen vil antall celler øke. Ved splitting av cellene er PDL-belagte deksler ikke nødvendig for dyrking.
- Astrocyttdifferensiering fra NSC-er
2. Cellekarakterisering ved immuncytokjemi og immunfluorescensfarging
- På slutten av kulturperioden overfører du dekslene med cellene til en 12-brønns plate.
Skyll cellene med fosfatbufret saltvann (PBS) (1x) to ganger og inkuber i 10 minutter i 4% paraformaldehyd (PFA) (0,5 ml per brønn i en 12-brønns plate) ved RT.
MERK: Den faste prøven kan dekkes med 2 ml PBS (1x) og lagres ved 4 °C til det er nødvendig for immunfarging. PFA er giftig og mistenkes for å forårsake kreft. Forhindre hud- og øyeeksponering, og arbeid under en kjemisk avtrekkshette. - Blokker og permeabiliser cellene og inkuberer med blokkerende buffer som inneholder PBS (1x), 0,3% Triton X-100 og 10% normalt geiteserum i 1 time ved RT.
- Inkubere med primære antistoffer i blokkeringsbuffer over natten ved 4 °C: flekk iPSC med antioktamerbindende transkripsjonsfaktor 4 (okt4) og anti-stadium-spesifikt embryonalt antigen-4 (SSEA4), NSC med anti-kjønnsbestemmende region Y boks-2 (Sox2) og anti-Nestin, nevrale sfærer med anti-paret boks-6 (Pax6) og anti-Nestin, astrocytter med anti-glial fibrillær surt protein (GFAP) og anti-S100 kalsiumbindende protein β (S100β), og DA-nevroner med anti-tyrosinhydroksylase (TH), anti-β III Tubulin (Tuj 1), anti-synaptofysin og anti-PSD-95 (0,5 ml primær antistoffløsning per brønn i en 12-brønns plate; se materialtabellen for detaljer).
- Vask prøvene med PBS (1x) tre ganger i 10 minutter hver med forsiktig gynging.
- Inkuber med sekundær antistoffløsning (1:800 i blokkeringsbuffer, 0,5 ml Alexa Fluor sekundær antistoffløsning per brønn i en 12-brønns plate) i 1 time ved RT med forsiktig rocking.
- Inkuber cellene med Hoechst 33342 (1:5,000, 0,5 ml per brønn i en 12-brønns plate) i PBS (1x) i 15 minutter ved RT for å merke kjernene.
- Monter cellene med monteringsmedium og tørk over natten ved RT for avbildning under et fluorescensmikroskop i mørket. Se supplerende figur S1 for mikroskopinnstillinger og parametere.
3. Flowcytometrisk måling av mitokondriell volum, MMP og mitokondriell ROS i levende celler
- Frø cellene separat i 4 brønner i en 6-brønns plate til cellene når 50% -60% sammenløp. Merk disse fire brønnene som # 1, # 2, # 3 og # 4.
- På slutten av kulturperioden tilberedes 5 individuelle fargeløsninger (500 μL per brønn i en 6-brønnsplate) som følger: # 1 bare kulturmedium (til brønn # 1 som bare inneholder celler for kontroll); #2-1 som inneholder FCCP (100 μM); #2-2 som inneholder FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) i kulturmedium; #3 som inneholder TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) i kulturmedium; #4 som inneholder MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) i PBS (1x) med 10% FBS. Se figur 1A, tilleggstabell S2 og materialtabell for detaljer om disse forbindelsene og oppsett av flowcytometri.
MERK: Bruk kulturmediet til å klargjøre fargeløsningen. Varm opp mediet og PBS (1x) ved RT før bruk. FCCP er giftig; forhindre hud- og øyeeksponering og arbeid under en kjemisk avtrekkshette. - Aspirer mediet fra # 2-brønnen og legg til # 2-1-løsningen (kun FCCP). Inkuber cellene ved 37 °C i 10 minutter.
- Aspirer mediet fra #2 og #3 brønner og legg til #2-2 løsning (FCCP + TMRE + MTG) i #2 brønnen og #3 løsning (TMRE + MTG) i #3. Inkuber cellene ved 37 °C i 45 minutter.
- Aspirer mediet fra # 4-brønnen og legg til # 4-løsningen (MitoSox Red + MTG). Inkuber cellene ved 37 °C i 15 minutter.
- Aspirer mediet fra alle brønner. Vask med PBS (1x) (4 ml per brønn i en 6-brønns plate). Løsne cellene ved hjelp av 1 ml celledissosiasjonsreagens (1 ml per brønn i en 6-brønnsplate) ved 37 °C i 5 minutter. Nøytraliser celledissosiasjonsreagenset i 1 ml DMEM med 10% FBS (2 ml per brønn i en 6-brønns plate).
- Samle innholdet i alle brønnene i 15 ml koniske rør. Sentrifuge rørene ved 300 × g i 5 min. Vask pellets med PBS (1x) en eller to ganger.
- Aspirer supernatantene, men la ca. 100 μL ligge i rørene. Resuspender cellepellets i 300 μL PBS (1x). Overfør cellene til 1,5 ml mikrosentrifugerør. Hold rørene i mørket på RT.
- Analyser cellene ved hjelp av et flowcytometer (med en 3 blå og 1 rød laserkonfigurasjon). Oppdag MTG i filter 1 (FL1) ved hjelp av et 530/30 båndpassfilter, TMRE i filter 2 (FL2) ved hjelp av båndpassfilteret 585/40, og MitoSox Red i filter 3 (FL3) ved hjelp av et 510/580 båndpassfilter.
4. Flowcytometrimåling av MRC-kompleksunderenheter og TFAM i faste celler
- På slutten av kulturperioden løsner cellene (~ 106) ved å legge til celledissosiasjonsreagenset; Deretter pellet og samle cellene i et 15 ml rør. Vask cellene ved sentrifugering med PBS (1x) to ganger ved sentrifugering ved 300 × g i 5 minutter.
- Fest cellene i 1,6% PFA (1 ml 1,6% PFA i et 15 ml rør) ved RT i 10 minutter. Vask cellene ved sentrifugering med PBS (1x) to ganger ved sentrifugering ved 300 × g i 5 minutter.
- Permeabiliser cellene med iskald 90% metanol (1 ml 90% metanol i et 15 ml rør) ved -20 ° C i 20 minutter.
- Blokker prøvene i blokkeringsbuffer som inneholder 0,3 M glycin, 5% geitserum og 1% bovint serumalbumin (BSA) - Fraksjon V i PBS (1x) (1 ml blokkeringsbuffer i et 15 ml rør). Vask cellene ved sentrifugering med PBS (1x) to ganger (som i trinn 3.7).
- Inkuber cellene med følgende primære antistoffer i 30 minutter: anti-NDUFB10 (1: 1,000) for måling av kompleks I-subenhet, anti-succinat dehydrogenasekompleks flavoprotein subenhet A (SDHA, 1: 1,000) for måling av kompleks II underenhet og anti-COX IV (1: 1,000) for måling av kompleks IV underenhet, og anti-TFAM antistoff konjugert med Alexa Fluor 488 (1:400). Flekker samme antall celler separat med anti-TOMM20 antistoff konjugert med Alexa Fluor 488 (1:400) i 30 minutter (1 ml primær antistoffløsning i et 15 ml rør; se materialtabellen for detaljer om antistoffene).
- Vask cellene med PBS (1x) en gang med sentrifugering ved 300 × g i 5 minutter. Tilsett sekundært antistoff (1:400) i rør av NDUFB10, SDHA og COX IV og inkuber cellene med disse løsningene i 30 minutter.
- Vask cellene med PBS (1x) en gang ved sentrifugering ved 300 × g i 5 minutter. Aspirer supernatantene, og la ca. 100 μL i rørene. Resuspender cellepellets i 300 μL PBS (1x). Overfør cellene til 1,5 ml mikrosentrifugerør som holdes i mørket på is.
- Analyser cellene på flowcytometeret (med en 3 blå og 1 rød laserkonfigurasjon). Oppdag signaler i filter 1 (FL1) ved hjelp av et 530/30 båndpassfilter. Se supplerende figur S2 for mikroskopinnstillinger og parametere.
5. Innhenting og analyse av flowcytometri
- Bruk det ikke-fargede kontrollrøret til å angi fremoverspredningsområdet (FSC-A) og sidespredningsområdet (SSC-A) spredningsplott basert på størrelsen og kompleksiteten til den analyserte cellepopulasjonen. Se supplerende figur S2 for mikroskopinnstillinger og parametere.
Definer ikke-fargede kontroller for individuelle celletyper. - Bruk kontrollrørene uten flekker til å velge de positive portene, og bruk ensfargede kontrollrør for å kompensere for fluorescensspektraloverlappingen mellom MTG (fluorofor-1 [FL-1]) og TMRE (FL-2) i flerfarget flowcytometri. Bruk isotypekontroll for negativ kontroll for å overvåke bakgrunnsfarging i MRC- og TFAM-prøver. Bruk FCCP-røret som en depolariseringskontroll for TMRE-farging.
- Gate ut fremmede rusk for å velge levende celler og hovedgating fra fremover- og sidespredningsplottet (figur 2A). Gate ut dubletter ved hjelp av en fremover spredningshøyde (FSC-H) versus (vs.) FSC-A tetthetsplott for å ekskludere dubletter og også konstruere en sidespredningshøyde (SSC-H) vs. SSC-A-plott (figur 2A).
- Datainnsamling (flowcytometer)
- Ved å bruke de ufargede eller isotypeprøvene som en negativ kontroll, oppretter du en port over hovedpopulasjonen til enkeltcellehendelsene mens du ser på SSC-A og de forskjellige filtrene (FL1, FL2, FL3, FL4) (figur 1B og figur 2B).
- Dataanalyse (CFlow-programvare)
- Kopier plasseringen av portene på de fargede celleprøvene, og registrer mengden positivt fargede celler for den positive fargingen.
- For hver celleunderpopulasjon velger du et histogramplott og analyserer median fluorescensintensitet (MFI) for de forskjellige filterkanalene (FL1, FL2, FL3, FL4) (x-akse).
- Beregn TMRE-nivåene ved å trekke MFI av FL2 av # 2 FCCP-behandlede celler fra MFI av FL2 fra # 3 TMRE-fargede prøver i et histogram, som i Eq (1) nedenfor.
TMRE nivåer = MFI av FL2 fra # 3 TMRE-farget prøver - MFI av FL2 av # 2 FCCP-behandlede celler (1) - Beregn de spesifikke verdiene for MMP og mitokondriell ROS ved MFI i TMRE eller MitoSox Red, og del mitokondriell volumindikator MTG.
- Beregn den spesifikke verdien for kompleks underenhet og TFAM ved å bruke MFI i komplekst uttrykk eller TFAM, og dividere mitokondriell volumindikator TOMM20.
- Beregn TMRE-nivåene ved å trekke MFI av FL2 av # 2 FCCP-behandlede celler fra MFI av FL2 fra # 3 TMRE-fargede prøver i et histogram, som i Eq (1) nedenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk beskrivelse av differensieringsmetode og flowcytometriske strategier er vist i figur 3. Menneskelige iPSC-er differensieres i nevrale rosetter og løftes deretter inn i suspensjonskultur for differensiering i nevrale sfærer. Nevrale sfærer blir ytterligere differensiert og modnet til DA-nevroner. Nevrale sfærer dissosieres i enkeltceller for å generere glia-astrocytter, replisert i monolag som NSC-er, og deretter differensiert til astrocytter. Denne protokollen gir strategiene som trengs for å anskaffe og analysere prøvene ved flowcytometri for måling av MMP, mitokondrielt volum, mitokondrielle ROS-nivåer, ekspresjonsnivåer av MRC-komplekse underenheter og TFAM (en indirekte måling av relativt mtDNA-kopinummer). Spesielt ble samfarging med fluorescerende reportere, TMRE og MTG, brukt til å oppdage og kvantifisere endringer i MMP og mitokondriell volum. Samfarging med MitoSox Red og MTG tillater måling av mitokondriell ROS-produksjon i levende celler. Farging med antistoffer mot MRC-komplekse underenheter sammen med TOMM20 gjør det mulig å vurdere MRC og farging av TFAM og TOMM20 for indirekte vurdering av mtDNA-kopinummer. Det er viktig at MTG og TOMM20 tillater måling per mitokondrielt volum, og motvirker påvirkning av mitokondrielt volum på disse parametrene.
DA-nevroner genereres fra iPSC-er gjennom dobbel SMAD-hemming og eksponeres for FGF-8b og Sonic hedgehog (SHH) agonist PM, som vist i figur 4A. Humane iPSC-er er sådd i iPSC-kulturmedium på matrisebelagte plater. Når cellene når 50% -80% sammenløp, endres mediet til NIM ved hjelp av en CDM supplert med SB431542, AMPK-hemmer, forbindelse C og N-acetylcystein i 5 dager. Etter 5 dager går iPSCene (figur 4B, a) videre til et nevralt epitelstadium som viser klare nevrale rosettstrukturer (figur 4B, b). På dag 5 genereres nevrale sfærer ved å løfte nevralepitelet inn i suspensjonskulturen og dyrke dem i NSC SF-medium på en orbital shaker inne i inkubatoren. Runde, veldefinerte kuler er vist i figur 4B, c. På dag 7 endres mediet til CDM supplert med 100 ng/ml FGF-8b. På dag 14 endres mediet til CDM supplert med 100 ng / ml FGF-8b og 1 μM PM. På dag 21 dissosieres sfærene til DA-nevroner i et monolag ved å dissosiere dem til enkeltceller og dyrke dem i CDM supplert med 10 ng / ml BDNF og 10 ng / ml GDNF i PLO og lamininbelagte plater / coverslips. Nevroner (figur 4B, e) modnet i 15-30 dager brukes videre til mitokondrielle funksjonelle målinger.
NSC produseres ved å dissosiere nevrale sfærer i enkeltceller og deretter replating dem i monolag for å generere astrocytter. Disse NSC-ene viser et klassisk nevralt stamcelleutseende (figur 4B, d). NSC-er på dette stadiet kan lett utvides og bankes for videre bruk. For å initiere astrocyttdifferensieringen er NSC-er belagt på PDL-belagte deksler i NSC SF-medium. Dagen etter endres mediet til astrocyttdifferensieringsmedium i 28 dager. Etter 28 dager modnes de differensierte astrocytter ytterligere i astrocyttmodningsmedium. På dette stadiet skal astrocytter vise stjerneformet morfologi (figur 4B, f), og disse cellene kan utvides og bankes for videre bruk, inkludert mitokondriell funksjonsvurdering.
Under differensiering bekreftes celleidentitet ved bruk av immunfluorescensfarging. I figur 5A viser immunostaining at iPSCene uttrykker de spesifikke pluripotente markørene, SSEA4 og Oct4. Figur 5B viser at nevrale kuler viser positiv farging av Nestin og Pax6, mens figur 5C viser at iPSC-avledede NSC-er i monolag utviser positiv farging av Nestin og Sox2. For å identifisere DA-nevroner er celler farget med nevralmarkøren β III Tubulin (Tuj 1) og DA-nevronmarkøren tyrosinhydroksylase (TH) (figur 6B). I tillegg viser DA-nevroner farging for de synaptiske markørene, synaptofysin og PSD-95, og bekrefter deres funksjonelle synaptiske forbindelser (figur 5B). Immunostaining av iPSC-avledede astrocytter viser ekspresjonen av astrocyttmarkørene, glialfibrillært surt protein (GFAP) og S100 kalsiumbindende protein β (S100β).
Undersøkelsen av mitokondriell funksjon i differensierte nevroner og astrocytter ved bruk av flowcytometri utføres som beskrevet ovenfor i protokollavsnitt 3 og 4. Et flowcytometer ble brukt til datainnsamling og CFlow Sampler for dataanalyse, som vist i figur 1B.
Figur 2 viser metoden for gating av levende enkeltceller. Døde celler og celleavfall utelukkes ved hjelp av et FSC vs. SSC-plott (figur 2A, a). Celledubletter utelukkes ved hjelp av et FSC-H vs. FSC-A-plott (figur 2A, b) etterfulgt av et SSC-H vs. SSC-A-plott (figur 2A, c). Bakgrunnsfluorescens vurderes riktig dersom den negative populasjonen av en bestemt celletype sammenlignes med den positive populasjonen innenfor samme celletype (figur 2B, a). For MMP-prøver eliminerer behandling av cellene med FCCP interferens fra mitokondriell membranpotensial og TMRE-farging (figur 2B, b).
Disse flowcytometriske tilnærmingene har blitt brukt til å studere DA-nevroner generert fra de humane iPSCene som bærer mutasjon (er) i den katalytiske underenheten av mitokondriell DNA-polymerase, POLG (W748S), og sammenligne dem med sykdomsfrie prøver generert fra Detroit 551 fibroblaster. Som rapportert tidligere4, viste denne studien også redusert MMP og økte spesifikke mitokondrielle ROS-nivåer i POLG DA-nevroner (figur 7). Mitokondrievolumet, det totale MMP- og totale mitokondrielle ROS-nivået var imidlertid uendret. I figur 8 viser resultatene en reduksjon i de spesifikke komplekse I-nivåene, lavere totale og spesifikke TFAM-nivåer, men lignende spesifikke komplekse II-nivåer i mutante DA-nevroner sammenlignet med kontroller.
Denne tilnærmingen ble også brukt til å studere astrocytter generert fra de samme iPSC-linjene. Som rapportert tidligere7 og vist i figur 9, viser resultatene at POLG-muterte astrocytter hadde lavere total og spesifikk MMP, men tilsvarende mitokondriell volum og mitokondriell ROS sammenlignet med kontroller, samt reduserte nivåer av spesifikke komplekser I og IV (figur 10). Imidlertid var det ingen endringer i de totale nivåene av komplekser I og IV og ingen endring i de totale og spesifikke nivåene av kompleks II i POLG-astrocytter. Samlet sett antyder disse dataene at flowcytometrisk analyse av flere mitokondrielle parametere gir en førstetrinnstilnærming som er verdifull for å evaluere mitokondriell funksjon i celler som iPSC og deres nevrale og glialderivater.
Figur 1: Oppsett for flowcytometri. (A) MMP, mitokondrielt volum og mitokondriell ROS-farging; (B) et eksempel på datainnsamling i et C6 flowcytometer. Forkortelser: MMP = mitokondrielt membranpotensial; ROS = reaktive oksygenarter; FCCP = karbonylcyanid p-trifluormetoksyfenylhydrazon; TMRE = tetrametylrhodamin etylester; MTG = MitoTracker Grønn. Se også tilleggstabell S2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Gating-strategier. (A) Datainnsamling; (B) histogrammene av fluorescensen med MTG- og TMRE-farging i levende celler. Forkortelser: SSC-A = sidespredningsområde; FSC-A = fremover spredningsområde; SSC-H = sidespredningshøyde; FSC-H = fremover spredningshøyde; FL # -A = fluorofor # område; MTG = MitoTracker Grønn; FCCP = karbonylcyanid p-trifluormetoksyfenylhydrazon; TMRE = tetrametylrhodamin etylester. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Skjematisk fremstilling av protokollarbeidsflyten. Forkortelser: DA = dopaminergisk; MMP = mitokondriell membranpotensial; ROS = reaktive oksygenarter; NDUFB 10 = NADH: Ubiquinone oksidoreduktase underenhet 10; SDHA = succinat dehydrogenase kompleks flavoprotein subenhet A; COX IV = cytokrom c oksidasekompleks IV; mtDNA = mitokondrielt DNA; TFAM = mitokondriell transkripsjonsfaktor A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: iPSC-differensiering. (A) Flytskjema og (B) representative bilder for cellene fra forskjellige stadier under differensieringen, inkludert iPSCs (a), nevrale rosett (b), nevrale sfærer (c), NSC (d), DA-nevroner (e) og astrocytter (f). Skala barer = 25 μm. Forkortelser: iPSC = indusert pluripotent stamcelle; NSC = nevral stamcelle; DA = dopaminerg; SFM = serumfritt medium; CDM = kjemisk definert medium; FGF-8b = fibroblast vekstfaktor-8b; PM = purmorfamin; BDNF = hjerneavledet nevrotrofisk faktor; GDNF = glialcellelinje-avledet nevrotrofisk faktor; PLO = poly-L-ornitin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Representative konfokale bilder av iPSC-er og deres nevrale derivater . (A) Immunostaining av SSEA4 (rød) og Oct4 (grønn) i iPSCs. (B) Immunostaining av Nestin (rød) og Pax6 (grønn) i iPSC-avledede nevronsfærer. (C) Immunostaining av Nestin (rød) og Sox2 (grønn) i iPSC-avledede NSCs. Nuclei er farget med DAPI (blå). Skala barer = 50 μm. Forkortelser: iPSCs = induserte pluripotente stamceller; NSCs = nevrale stamceller; SSEA4 = stadiumspesifikt embryonalt antigen-4; Okt4 = oktamerbindende transkripsjonsfaktor 4; Pax6 = parret boks-6; Sox2 = kjønnsbestemmende region Y boks-2; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Representative konfokale bilder av iPSC-avledede astrocytter og DA-nevroner. (A) Immunostaining av GFAP (rød) og S100β (grønn) i iPSC-avledede astrocytter. (B) Immunostaining av nevral avstamningsmarkør TH (grønn), Tuj 1 (rød) og nevral funksjonell markør Synaptophysin (grønn) og PSD-95 (rød) i iPSC-avledede DA-nevroner. Kjerner er farget med DAPI (blå). Skala barer = 25 μm. Forkortelser: iPSCs = induserte pluripotente stamceller; GFAP = glial fibrillær surt protein; S100β = S100 kalsiumbindende protein β; Tuj 1 = β III Tubulin; PSD-95 = postsynaptisk tetthetsprotein 95; DA = dopaminerg; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Flowcytometrisk analyse for DA-nevroner avledet fra en klone av POLG-pasient-iPSCer og en klone av Detroit 551-kontroll-iPSCer. (A) Mitokondrielt volum målt ved MTG, (B) total MMP målt ved TMRE, (C) spesifikt MMP-nivå beregnet ved total TMRE/MTG, (D) total mitokondriell ROS målt ved MitoSox Red, og (E ) spesifikt mitokondrielt ROS-nivå beregnet ved total MitoSox Red/MTG. Data presentert som gjennomsnittlig ± standardfeil i gjennomsnittet (SEM) for antall prøver (n ≥ 3 per klon). Data analysert og produsert ved hjelp av GraphPad Prism programvare. Mann-Whitney U-test ble brukt til å vurdere statistisk signifikans for variabler. Betydning er angitt for P < 0,05. * P < 0,05; ns, ikke signifikant. Forkortelser: DA = dopaminergisk; POLG = DNA-polymerase-underenhet gamma; iPSCs = induserte pluripotente stamceller; MMP = mitokondriell membranpotensial; ROS = reaktive oksygenarter; MTG = MitoTracker Grønn; TMRE = tetrametylrhodamin etylester. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Flowcytometrisk analyse for astrocytter avledet fra en klone av POLG-pasient-iPSCer og en klone av Detroit 551 kontroll-iPSCer. (A) Mitokondrielt volum målt ved MTG, (B) totalt MMP målt ved TMRE, (C) spesifikt MMP-nivå beregnet ved total TMRE/MTG, (D) total Rmitokondriell ROS S målt ved MitoSox Red, og (E ) spesifikt mitokondrielt ROS-nivå beregnet ved total MitoSox Red/MTG. Data presentert som gjennomsnittlig ± standardfeil i gjennomsnittet (SEM) for antall prøver (n ≥ 3 per klon). Data analysert og produsert ved hjelp av GraphPad Prism programvare. Mann-Whitney U-test ble brukt til å vurdere statistisk signifikans for variabler. Betydning er angitt for P < 0,05. * P < 0,05; ns, ikke signifikant. Forkortelser: POLG = DNA-polymerase subenhet gamma; iPSC = indusert pluripotent stamcelle; MMP = mitokondriell membranpotensial; ROS = reaktive oksygenarter; MTG = MitoTracker Grønn; TMRE = tetrametylrhodamin etylester. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Flowcytometrisk analyse for DA-nevroner avledet fra en klone av POLG-pasient-iPSCer og en klon av Detroit 551-kontroll-iPSCer. (A) Totalt kompleks I målt ved NDUFB10, (B) spesifikt kompleks I-nivå beregnet ved totalt NDUFB10/TOMM20, (C) totalt kompleks II målt ved SDHA, (D) spesifikt kompleks II-nivå beregnet av totalt SDHA/TOMM20, (E) totalt TFAM målt ved TFAM, og (F) spesifikt TFAM-nivå beregnet av totalt TFAM/TOMM20. Data presentert som gjennomsnitt ± standardfeil i gjennomsnittet (SEM) for antall utvalg (n ≥ 3 per klon). Data analysert og produsert ved hjelp av GraphPad Prism programvare. Mann-Whitney U-test brukes til å vurdere statistisk signifikans for variabler. Betydning er angitt for P < 0,05. * P < 0,05; ns, ikke signifikant. Forkortelser: DA = dopaminergisk; POLG = DNA-polymerase-underenhet gamma; iPSC = indusert pluripotent stamcelle; NDUFB10 = NADH: Ubiquinone oxidoreductase subenhet 10; TOMM20 = translocase av ytre mitokondriell membran 20; SDHA = succinat dehydrogenase kompleks flavoprotein subenhet A; TFAM = mitokondriell transkripsjonsfaktor A. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10: Flowcytometrisk analyse for astrocytter avledet fra én klone av POLG-pasient-iPSC-er og én klone av Detroit 551-kontroll-iPSC-er. (A) Totalt kompleks I målt ved NDUFB10, (B) spesifikt kompleks I-nivå beregnet av totalt NDUFB10/TOMM20, (C) totalt kompleks II målt ved SDHA, (D) spesifikt kompleks II-nivå beregnet av totalt SDHA/TOMM20, (E) totalt kompleks IV målt ved COX IV, (F) spesifikt komplekst IV-nivå beregnet av COX IV/TOMM20, (G) totalt TFAM målt ved TFAM, og (H) spesifikt TFAM-nivå beregnet av totalt TFAM/TOMM20. Data presentert som gjennomsnitt ± standardfeil i gjennomsnittet (SEM) for antall utvalg (n ≥ 3 per klon). Data analysert og produsert ved hjelp av GraphPad Prism programvare. Mann-Whitney U-test ble brukt til å vurdere statistisk signifikans for variabler. Betydning er angitt for P < 0,05. * P < 0,05; ** P < 0,01; ns, ikke signifikant. Forkortelser: POLG = DNA-polymerase subenhet gamma; iPSC = indusert pluripotent stamcelle; NDUFB10 = NADH: Ubiquinone oxidoreductase subenhet 10; TOMM20 = translocase av ytre mitokondriell membran 20; SDHA = succinat dehydrogenase kompleks flavoprotein subenhet A; TFAM = mitokondriell transkripsjonsfaktor A; COX IV = cytokrom c oksidasekompleks IV. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur S1: Innstillinger for det konfokale laserskanningsfluorescensmikroskopet og trinn for å ta bilder. (A) Velg konfigurasjonsverktøyet og velg riktig lasertype fra Gjeldende tilgjengelig laser og still inn strømmen. (B) Velg Acquire-Acquisition Mode-SEQ og velg den tilsvarende fluorescensbølgelengdefotomodusen fra databasen. (C) Velg Sekvensiell Scan-Load og importer tilsvarende modus. (D) Velg 40x objektivlinse og legg til dråpevis. (E) Spesifikke innstillingsparametere for å ta bilder på forskjellige bølgelengder. (F) Angi fotoparametere, forhåndsvis og lagre bildet. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Trinn og innstillinger for flowcytometri. (A) Åpne Cflow-programvare, velg filverktøyet og velg Åpne CFlow-fil eller mal. (B) Sett opp 40000 hendelser og velg porten som bare inneholder de aktive enkeltcellene i Run Limits-panelet. Velg Middels hastighet i Fluidics-panelet. (C) Velg FSC-A vs. FSC-A plot (a) for å sette opp hovedgatingen. Velg FSC-A vs. FSC-H-plott (b) og SSC-A vs. SSC-H-plott (c) for å ekskludere dubletter. Velg de tilsvarende filtrene, for eksempel FL1 eller FL2, og bruk FL1-A vs. FSC-A-plott (d) eller FL2-A vs. FSC-A-plott for å tegne de positive hendelsene når du kjører de ufargede cellene. (D) Sett opp de samme parametrene, forhåndsvis, kjør de fargede prøvene og lagre bildet. Se også tilleggstabell S2. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende tabell S1: Medie- og løsningsoppskrifter. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Tilleggstabell S2: Oppsett for flowcytometrisk farging. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her er protokoller for å generere iPSC-avledede nevroner og astrocytter og evaluere flere aspekter av mitokondriell funksjon ved bruk av flowcytometri. Disse protokollene tillater effektiv konvertering av humane iPSCs til både nevroner og glial astrocytter og detaljert karakterisering av mitokondriell funksjon, hovedsakelig i levende celler. Protokollene gir også en samfarging av flowcytometribasert strategi for å anskaffe og analysere flere mitokondrielle funksjoner, inkludert volum-, MMP- og mitokondrielle ROS-nivåer i levende celler og MRC-komplekser og TFAM i faste celler. Spesielt tillater disse protokollene estimering av både totale og spesifikke nivåer per mitokondrielt volum. Mens denne strategien oppdager mitokondriell dysfunksjon i en kjent mitokondriell sykdom (POLG) i DA-nevroner og astrocytter, gjelder disse teknikkene for alle typer celler og sykdommer. Videre er protokollen robust og reproduserbar. Flere tidligere studier har med hell anvendt denne protokollen for å analysere mitokondrielle endringer i fibroblaster, iPSCs, NSCs, DA-nevroner og astrocytter 2,3,13,17.
Det er noen kritiske punkter å vurdere når du utfører denne protokollen. For å sikre konsistent og høyeffektiv differensiering er det avgjørende å starte konverteringen med høykvalitets iPSC-er (celler som inneholder <5% differensierte celler). Selv om andre kommersielt tilgjengelige definerte medier kan være gyldige alternativer, tok ikke denne studien for seg alternativene. Siden mediumsammensetning og klonale forskjeller i iPSC-linjer kan påvirke både spredning av startcellepopulasjonen og differensieringseffektivitet, vil tilpasning av denne protokollen til andre vedlikeholdsmedier sannsynligvis kreve optimalisering.
Forholdet mellom MTG og MMP fluorescens har blitt studert tidligere3. Dette er viktig da MTG-fluorescens rapporteres å være både uavhengig av18 og følsom for MMP 19,20. I tidligere studier der iPSC ble titrert med forskjellige konsentrasjoner av TMRE og farget med 150 nM MTG, forble MTG-nivået det samme ved lavere konsentrasjoner av TMRE (5-100 nM), mens et redusert MTG-signal ble observert for høyere TMRE-konsentrasjoner (over 100 nM). Derfor ble 100 nM TMRE og 150 nM MTG valgt for å måle den spesifikke MMP. Siden dette forholdet kan være cellespesifikt, må korrelasjonen mellom MTG og MMP-fluorescens vurderes før man bruker MTG og TMRE dual staining for å måle MMP.
Celletetthet kan også påvirke mitokondriell funksjon og cellemetabolisme. I denne studien ble celletetthetsavhengige endringer i MMP observert, noe som også er vist i andre studier21. Derfor er det viktig å velge en lignende celletetthet i alle prøver - ikke for høy eller lav - for å minimere variasjon når man etablerer samfargingsprotokollen for forskjellige celletyper. Sammenlignet med andre mikroskopibaserte analyser har flowcytometri fordelene med hastighet og reproduserbarhet ved analyse av et stort antall celler. I analysen av mikroskopiske bilder vil forskernes bias forvride resultatene til en viss grad, noe som ikke er et problem ved bruk av flowcytometri. I tillegg krever flowcytometrianalyse mindre enn en million celler, og analyse av en prøve tar bare noen få minutter, noe som betyr at dusinvis av prøver kan analyseres på 1-2 timer. Denne teknikken kan også brukes på et bredt spekter av celletyper, inkludert de fra andre nevrodegenerative sykdommer, og bør derfor være nyttig for å forstå mekanismer og teste potensielle terapier i forskjellige neurodegenerative sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Vi takker Molecular Imaging Centre og kjernefasiliteten for flowcytometri ved Universitetet i Bergen. Dette arbeidet ble støttet med finansiering fra Norges forskningsråd (Tilskuddsnummer: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat og China Scholarship Council (prosjektnummer: 201906220275).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857, RRID:AB_445175 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-SSEA4 | Abcam | ab16287, RRID:AB_778073 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Sox2 | Abcam | ab97959, RRID:AB_2341193 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Pax6 | Abcam | ab5790, RRID:AB_305110 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Nestin | Santa Cruz Biotechnology | sc-23927, RRID:AB_627994 | Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-GFAP | Abcam | ab4674, RRID:AB_304558 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-S100β conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab196442, RRID:AB_2722596 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; |
| anti-TH | Abcam | ab75875, RRID:AB_1310786 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-Tuj 1 | Abcam | ab78078, RRID:AB_2256751 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody. |
| anti-Synaptophysin | Abcam | ab32127, RRID:AB_2286949 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody. |
| anti-PSD-95 | Abcam | ab2723, RRID:AB_303248 | Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody. |
| anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488 | Abcam | ab198308 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488 | Santa Cruz Biotechnology | Cat# sc-17764 RRID:AB_628381 | Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a Alexa Fluor® 488 as an isotype control. |
| anti-NDUFB10 | Abcam | ab196019 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-SDHA | Abcam | ab137040 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control. |
| anti-COX IV | Abcam | ab14744, RRID:AB_301443 | Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control. |
| Activin A | PeproTech | 120-14E | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| ABM Basal Medium | Lonza | CC-3187 | Basal medium for astrocyte culture |
| AGM SingleQuots Supplement Pack | Lonza | CC-4123 | Supplement for astrocyte culture |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | CDM ingredient |
| Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | Basal medium for dilute Geltrex |
| Bovine Serum Albumin | Europa Bioproducts | EQBAH62-1000 | Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | DA neurons medium ingredient |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer | BD Biosciences, USA | ||
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermo Fisher Scientific | 11905031 | CDM ingredient |
| Collagenase IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G | Leica Microsystems, Germany | ||
| Corning non-treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430589 | Suspension culture |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Used for a variety of cell culture wash |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 10565018 | Astrocyte differentiation basal Medium |
| EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| Essential 8 Basal Medium | Thermo Fisher Scientific | A1516901 | Basal medium for iPSC culture |
| Essential 8 Supplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Supplement for iPSC culture |
| EGF Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0314 | Supplement for NSC culture |
| FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0024 | Supplement for NSC culture |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12103C | Medium ingredient |
| FGF-basic | PeproTech | 100-18B | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| FCCP | Abcam | ab120081 | Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining |
| Fluid aspiration system BVC control | Vacuubrand, Germany | ||
| Formaldehyde (PFA) 16% | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Cell fixation |
| Geltrex | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Used for attachment and maintenance of human iPSCs |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Supplement for NSC culture |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | DA neurons medium ingredient |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | Used for blocking buffer |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 31765027 | Basal medium for CDM |
| Heregulin beta-1 human | Sigma-Aldrich | SRP3055 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H1399 | Stain the nuclei for confocal image |
| Heracell 150i CO2 Incubators | Fisher Scientific, USA | ||
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 21980032 | Basal medium for CDM |
| Insulin | Roche | 1376497 | CDM ingredient |
| InSolution AMPK Inhibitor | Sigma-Aldrich | 171261 | Neural induction medium ingredient |
| Insulin-like Growth Factor-I human | Sigma-Aldrich | I3769 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| KnockOut DMEM/F-12 medium | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Basal medium for NSC culture |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems, Germany | ||
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | CDM ingredient |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | Used for mitochondrial volume indicator |
| MitoSox Red | Thermo Fisher Scientific | M36008 | Used for mitochondrial ROS indicator |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | Neural induction medium ingredient |
| N-2 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Astrocyte differentiation medium ingredient |
| Normal goat serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Used for blocking buffer |
| Orbital shakers - SSM1 | Stuart Equipment, UK | ||
| Poly-L-ornithine solution | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7405 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Purmorphamine | STEMCELL Technologies | 72204 | Promotes DA neuron differentiation |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Mounting the coverslip for confocal image |
| PBS 1x | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | Used for a variety of wash |
| Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein | R&D Systems | 423-F8-025/CF | Promotes DA neuron differentiation |
| SB 431542 | Tocris Bioscience | TB1614-GMP | Neural Induction Medium ingredient |
| StemPro Neural Supplement | Thermo Fisher Scientific | A10508-01 | Supplement for NSCs culture |
| TrypLE Express Enzyme | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | Cell dissociation reagent |
| Transferrin | Roche | 652202 | CDM ingredient |
| TRITON X-100 | VWR International | 9002-93-1 | Used for cells permeabilization in immunostaining assays |
| TMRE | Abcam | ab113852 | Used for mitochondrial membrane potential staining |
| Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments | Grant Instruments, USA |
References
- Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
- Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304 (2021).
- Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146 (2020).
- Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
- Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
- Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583 (2019).
- Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311 (2019).
- Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
- Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449 (2020).
- Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337 (2021).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17 (2012).
- Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
- Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
- Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400 (2019).
- Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
- Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536 (2021).
- Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
- Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
- Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
- Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).
