Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering av murine retinale endotelceller for neste generasjons sekvensering

Published: October 11, 2021 doi: 10.3791/63133
Automatic Translation
1,2, 1, 2,3,4, 1,2,4,5
1Department of Cell Biology, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Cardiology, University of Virginia School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, University of Virginia School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for isolering av murine postnatale retinale endotelceller optimalisert for celleutbytte, renhet og levedyktighet. Disse cellene er egnet for neste generasjons sekvenseringsmetoder.

Abstract

Nylige forbedringer i neste generasjons sekvensering har avansert forskernes kunnskap om molekylær og cellulær biologi, med flere studier som avslører nye paradigmer i vaskulær biologi. Bruk av disse metodene til modeller for vaskulær utvikling krever optimalisering av celleisolasjonsteknikker fra embryonale og postnatale vev. Celleutbytte, levedyktighet og renhet må alle være maksimale for å oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater fra neste generasjons sekvenseringsmetoder. Neonatal mus retinal vaskulariseringsmodell brukes av forskere til å studere mekanismer for vaskulær utvikling. Forskere har brukt denne modellen til å undersøke mekanismer for angiogenese og arteriell venøs skjebnespesifikasjon under blodkardannelse og modning. Bruk av neste generasjons sekvenseringsteknikker for å studere retinal vaskulær utviklingsmodell krever optimalisering av en metode for isolering av retinale endotelceller som maksimerer celleutbyttet, levedyktighet og renhet. Denne protokollen beskriver en metode for murine retinal vevsisolering, fordøyelse og rensing ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Resultatene indikerer at den FACS-rensede CD31 + / CD45- endotelcellepopulasjonen er svært beriket for endotelcellegenuttrykk og viser ingen endring i levedyktighet i 60 minutter etter FACS. Inkludert er representative resultater av neste generasjons sekvenseringsmetoder på endotelceller isolert ved hjelp av denne metoden, inkludert bulk RNA-sekvensering og encellet RNA-sekvensering, noe som viser at denne metoden for retinal endotelcelleisolasjon er kompatibel med neste generasjons sekvenseringsapplikasjoner. Denne metoden for retinal endotelcelleisolasjon vil tillate avanserte sekvenseringsteknikker for å avsløre nye mekanismer for vaskulær utvikling.

Introduction

Den høye gjennomstrømningskapasiteten til sekvensering av nukleinsyrer via neste generasjons sekvenseringsmetoder har i stor grad avansert forskernes kunnskap om molekylær og cellulær biologi. Disse avanserte teknikkene inkluderer hele transkriptom-RNA-sekvensering, DNA-sekvensering av målrettede regioner for å identifisere Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), DNA-sekvensering av bundne transkripsjonsfaktorer i Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) sekvensering, eller åpne kromatinregioner i Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC) sekvensering og enkeltcellet RNA-sekvensering1 . I vaskulær biologi har disse fremskrittene gjort det mulig for forskere å belyse kompliserte mekanismer for utvikling og sykdom, sammen med å skille genuttrykksmønstre langs et kontinuum av varierende fenotyper 2,3. Fremtidige eksperimenter kan videre definere komplekse mekanismer ved å kombinere neste generasjons sekvensering med evaluerte modeller for vaskulær utvikling, men metodene for prøvepreparering må være kompatible med de avanserte sekvenseringsteknikkene.

Kvaliteten, nøyaktigheten og reproduserbarheten av neste generasjons sekvenseringsmetoder avhenger av metoden for prøvepreparering. Når du isolerer en delmengde av celler eller genererer enkeltcellesuspensjoner fra vev, er optimale fordøyelses- og rensemetoder avgjørende for å maksimere cellenummer, levedyktighet og renhet av cellepopulasjonen 4,5. Dette krever en balanse i fordøyelsesmetoden: sterk fordøyelse er nødvendig for å frigjøre celler fra vevet og få nok celler til nedstrøms tilnærminger, men cellens levedyktighet vil bli negativt påvirket hvis fordøyelsen er for sterk 6,7. I tillegg er renhet av cellepopulasjonen nødvendig for robuste resultater og nøyaktig analyse av data, som kan oppnås gjennom FACS. Dette fremhever viktigheten av å optimalisere celleisolasjonsmetoder for å anvende neste generasjons sekvensering på etablerte modeller for vaskulær utvikling.

En godt karakterisert modell for å undersøke vaskulær utvikling er murine retinal vaskulær utviklingsmodell. Murine retinal vaskulatur utvikler seg postnatalt i en todimensjonal overfladisk plexus, med initial angiogen spiring fra synsnerven synlig på barseldag (P)3, angiogen front med stilk- og spissceller og initial karmodning synlig ved P6, og modning av vaskulær plexus synlig etter P9 8,9. Under ombyggingen av den første vaskulære plexus gjennomgår endotelceller spesifikasjon mot arterielle, kapillære og venøse fenotyper i forskjellige kar for å generere et sirkulasjonsnettverk10,11. Derfor tillater denne metoden forskere å visualisere angiogen vaskulær plexusdannelse og endotelial arteriell venøs spesifikasjon og modning på ulike tidspunkter under utvikling9. I tillegg gir denne modellen en metode for å undersøke effekten av transgen manipulasjon på angiogenese og vaskulær plexusutvikling, som har blitt brukt til undersøkelse av vaskulær utvikling, arterielle venøse misdannelser og oksygenindusert neovaskularisering 12,13,14,15,16 . For å kombinere neste generasjons sekvenseringsmetoder med murine retinal vaskulær utviklingsmodell, er det nødvendig med en optimalisert protokoll for isolering av endotelceller fra retinalt vev.

Denne protokollen beskriver en optimalisert metode for å fordøye retinalvev fra mus ved P6 for å maksimere celleutbytte, renhet og levedyktighet. Retinalt vev isoleres fra P6-mus, fordøyes i 20 minutter, immunostaineres for CD31 og CD45, og renses gjennom FACS for å isolere en enkeltcellesuspensjon av endotelceller i ca. 2,5 timer (figur 1A). Disse endotelcellene ble funnet å opprettholde høy levedyktighet i 60 minutter etter isolasjon17, noe som gjorde det mulig å forberede bibliotekforberedelser for neste generasjons sekvenseringsmetoder. I tillegg er det gitt representative resultater for FACS-gating- og kvalitetskontrollresultater fra to separate neste generasjons sekvenseringsmetoder ved bruk av denne isolasjonsprotokollen: hel transkriptom RNA-sekvensering og encellet RNA-sekvensering. Denne metoden gjør det mulig å bruke neste generasjons sekvenseringsmetoder i forbindelse med retinal vaskulariseringsmodellen for å belyse nye mekanismer for vaskulær utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De institusjonelle dyrepleie- og brukskomiteene ved Yale University og University of Virginia godkjente alle dyreforsøk som er oppført i denne protokollen.

1. Få museøyne for retinal isolasjon

  1. Forbered 1x iskald PBS og tilsett 500 μL til hver brønn på en 48-brønns plate.
  2. Avlive nyfødte mus på barseldag seks (P6) i henhold til godkjente institusjonelle retningslinjer. I dette forsøket avlives kull på ca. 4-8 nyfødte mus ved P6 via isofluraninhalering i minst tre minutter etter respirasjonsstansen, etterfulgt av halshugging.
  3. Fjern øynene fra hver av musene. Klipp bort huden og membranen over øyet ved å kutte vinkelrett på øyelokket ved hjelp av disseksjonssaks. Bruk deretter tang til å trykke forsiktig ned over og under øyet slik at øyet beveger seg ut av kontakten.
    1. Klyp forsiktig under øyet med tangen og kutt optisk nerve som holder øyet festet. Legg deretter hvert øye i 48-brønnsplaten i den forberedte 1x iskalde PBS til ferdig høsting.
      MERK: Bruk en brønn per mus, med begge øynene fra en enkelt mus i samme brønn.

2. Isoler musens retinale vev

  1. Fyll en petriskål, foret med en disseksjonspute på bunnen, med 500 μL 1x iskald PBS for å senke øynene og legg den under et disseksjonsmikroskop satt til 4,0x forstørrelse.
    1. Heng øynene i disseksjonsputen ved hjelp av en overføringspipette med en bred spiss for ikke å skade øynene.
      MERK: Sørg for at øynene er helt dekket med PBS.
  2. Ved hjelp av to fine disseksjonstang holder du synsnerven med en av tangene for stabilisering, og med den andre tangen stikker du hull gjennom det fremre kammeret der hornhinnen og sklera kobles sammen (figur 1B). Riv hullet i en sirkel omtrent 75% av veien rundt hornhinnen.
    1. Mens du fortsatt holder optisk nerve med en av tangene, bruk den andre tangen til å forsiktig rive scleraen av retinalvevet.
    2. Som ovenfor, bruk den andre tangen til å forsiktig rive av glasslegemet i retinalvevet.
    3. Igjen, bruk den andre tangen, fjern forsiktig linsen og hyaloid plexuskarene som ikke kom av når glasslegemet ble fjernet. For å gjøre dette, nå inn i netthinnen med åpne tang til du nesten berører netthinnen, lukk tangene for å ta tak i linsen og hyaloid plexuskarene, og trekk tangene ut fra netthinnen. Dette kan gjentas til alle fartøyene er fjernet.
      MERK: Hyaloid plexus ligner en klar, nettlignende struktur.
  3. Fyll 2 ml mikrosentrifugerør med 500 μL 1x iskald PBS og plasser netthinnene i rørene. Isoler alle netthinner fra øynene og legg dem i iskald PBS før du går videre.
    MERK: Bruk ett rør per mus, med to netthinner fra samme mus som deler et rør. Hvis retinalvev er revet, overfør det i flere stykker. Den totale tiden for retinal vevsdisseksjon for et kull av mus bør ta 15-60 minutter, som starter med eutanasi og slutter med endelig retinalvevisolasjon.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over isolasjonsprotokollen. (A) Skjematisk for isolasjonstidslinjen med en estimert tid for hvert trinn: Isolering av retinalvev, fordøyelse, antistofffarging, FACS og celle levedyktighetsvindu. (B) Trinnvis veiledning for isolering av retinalvev fra øyet, med nummererte disseksjonstrinn: 1) pierce hornhinnen, 2) rive hornhinnen, 3) rive sclera, 4) fjern sclera fra netthinnen, 5) fjern sclera og bindevev fra netthinnen, 6) fjern glasslegemet og glasslegemet fra netthinnen. (C) Representative bilder av retinalvev under ulike fordøyelsestrinn: Pre-digest, Post-digest, Pellet (svarte piler markerer retinalvev eller cellepellet). Republisert med tillatelse fra Chavkin et al. publisert i S. Karger AG, Basel17. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Fordøye retinalt vev i en enkeltcellesuspensjon

  1. Forbered 500 μL fordøyelsesløsning for hver to retinas isolert. Legg FBS og kollagenase type II til DMEM til en endelig konsentrasjon på 10% FBS og 1 mg / ml kollagenase type II. Bland og varm oppløsningen til 37 °C ved hjelp av et vannbad.
  2. Fjern overflødig PBS fra 2 ml mikrosentrifugerør ved forsiktig pipettering. La det være nok PBS til å dekke retinalvevet helt, ca. 100 μL i hvert rør.
  3. Tilsett 500 μL av fordøyelsesløsningen til hvert rør med retinalvev (figur 1C).
    1. Bruk en P1000-pipetor og pipettespiss til å pipette opp og ned i netthinnevevet i fordøyelsesløsningen fem ganger.
  4. Inkuber fordøyelsesblandingen i et 37 °C vannbad i 20 minutter.
    1. Bruk en P1000 pipettor og pipettespiss til å pipetter fordøyelsesblandingen opp og ned hvert 5. minutt. Etter inkubering har retinalvevet oppløst seg i en enkeltcellesuspensjon, slik at fordøyelsesblandingen skal være uklar (figur 1C).

4. Telle celler

  1. Sett en bordsentrifuge ved 4 °C og plasser fordøyelsesblandingsslangene inni. Pellet fordøyelsesblandingen ved sentrifugering ved 375 x g i 5 minutter.
  2. Fjern forsiktig supernatant fordøyelsesløsning ved pipettering. Ikke forstyrr cellepelleten (figur 1C). Heng pelleten på nytt i 500 μL iskald 1x PBS ved å blande forsiktig opp og ned med pipetten.
  3. Tell cellene med et hemocytometer under et mikroskop.
    MERK: Celletall er omtrent 1 x 106 celler per to netthinner.
  4. Forsikre deg om at cellene er riktig resuspendert ved forsiktig blanding, og deretter aliquot 20 μL cellesuspensjon i tre rør for kontrollfarging (rør 1: IgG-kontroll, rør 2: CD31-kontroll og rør 3: CD45-kontroll), som beskrevet og brukt tidligere17,18.
  5. Sett en bordsentrifuge ved 4 °C og plasser rør som inneholder celler inni. Pellet cellene ved sentrifugering ved 375 x g i 5 minutter.

5. Immunostain cellene med antistoffer

  1. Forbered 100 μL fargebuffer per to netthinner farget pluss fire kontrollrør. Legg FBS, HEPES og D-glukose til HBSS-bufferen til en endelig konsentrasjon på 10% FBS, 10 mM HEPES og 1 mg / ml D-glukose.
  2. Oppnå fluorescerende konjugerte antistoffer mot CD31 og CD45. Tilsett antistoffene ved en 1:100 fortynning i fargebufferen (slange 1: Kun IgG-antistoff, slange 2: Kun CD31-antistoff og srør 3: CD45-antistoff). Tilsett 1 μL antistoff per 100 μL av fargebufferen for en endelig antistoffkonsentrasjon på 2 μg/ml.
  3. Fjern PBS forsiktig fra den vaskede cellepelleten ved pipettering.
  4. Resuspend pelleten i 100 μL antistofffargingsløsning per 0,5 x 106 celler.
    1. Inkuber enkeltcellesuspensjonen med antistofffargingsløsningen i 30 minutter på is i mørket. Knips rørene hvert 10. minutt for å blande cellene forsiktig.

6. Forbered deg på fluorescensaktivert cellesortering

  1. Sett en bordsentrifuge ved 4 °C og plasser rørene som inneholder celler inni. Pelletceller ved sentrifugering ved 375 x g i 5 min.
    1. Fjern supernatanten og resuspend disse cellene i 500 μL 1x PBS for å vaske.
  2. Sett en bordsentrifuge ved 4 °C og plasser rørene som inneholder celler inni. Pelletceller ved sentrifugering ved 375 x g i 5 minutter
  3. Forbered 1,5 ml FACS-buffer (1% FBS i 1x PBS).
    1. Fjern supernatanten og resuspend cellepelleten i 300 μL FACS Buffer ved å blande forsiktig med en pipetator.
  4. Tilsett propidiumjodid (PI) til prøverørene som inneholder FACS-bufferen til en endelig konsentrasjon på 0,5 μg / ml. PI brukes som en levedyktighetsmarkør.
  5. Overfør og kombiner cellesuspensjonene til 5 ml reagensrør gjennom en cellesil snap cap. Cellesilen snap cap skal inneholde et 35 μm filter, og cellesuspensjonene kan pipetteres direkte på filteret.
    1. Hold FACS-rørene på is i mørket og overfør dem til cellesortereren.

7. Sett opp FACS-instrumentet

  1. Installer en 100 μm dyse i et FACS-instrument.
    MERK: Denne størrelsesdysen minimerer oppsamlingsvolumet og maksimerer isolert celletetthet.
  2. Forbered 250 μL 1x PBS i et 1,5 ml mikrosentrifugerør som et oppsamlingsrør som skal installeres i FACS-instrumentet.

8. Isoler levedyktige endotelceller via FACS

  1. Slå på FACS-instrumentet og datamaskinen. Klikk på FACS-programvareikonet for å åpne FACS-programvaren på datamaskinen for å kjøre og betjene FACS-instrumentet. Utfør rutinemessige kvalitetskontrolltester.
  2. Legg de kontrollfargede prøvene i FACS-instrumentet for å justere aksene. Start med IgG-antistoff bare celler for å generere og justere FSC og SSC, deretter CD31-antistoff bare for å generere og justere CD31, og deretter CD45-antistoff bare for å generere og justere CD45. Registrer data fra kontrolleksempler.
  3. Legg fargede prøveceller inn i FACS-instrumentet og kjør prøven.
  4. Gate cellene basert på henholdsvis fremover-scatter og side-scatter (FSC-A og SSC-A) parametere (figur 2A).
    FSC-A- og SSC-A-parameterne brukes til å velge celler basert på størrelse, tetthet, granularitet, overflateegenskaper og brytningsindeks.
  5. Gate celler av FSC-A og FSC-H for å identifisere celle dubletter og bare samle enkeltceller (figur 2A).
    MERK: FSC-A- og FSC-H-parametrene brukes til å velge enkeltceller basert på prinsippet om at under fremoverspredning vil celledubletter være dråper som inneholder et større forhold mellom område og høyde.
  6. Gate celler etter PI og SSC-A for å identifisere levedyktige celler (figur 2A).
    MERK: Levedyktige celler vil være PI-negative.
  7. Lag en CD31+/CD45-port med kontroller og portceller med CD31 og CD45 (figur 2A,B).
    1. Sett inn et oppsamlingsrør med 250 μL FACS-buffer.
    2. Begynn å sortere celler som er CD31-positive/CD45-negative, i det installerte oppsamlingsrøret.
    3. Hold oppsamlingsrørene på is for videre analyse. Prøver kan behandles for neste generasjons sekvenseringsprogrammer på dette trinn1.

9. Utfør levedyktighetsanalyse

  1. Bland 10 μL celler med 10 μL 0,4% trypanblå løsning for å vurdere cellens levedyktighet.
  2. Tell levedyktige celler ved å pipettere den fargede blandingen på et hemocytometerglass. Plasser lysbildet under et mikroskop for nøyaktige levedyktighetstall. Tell blå celler som ikke-levedyktige og tell klare celler som levedyktige.
    1. Del det levedyktige celletallet med det totale celletallet for å beregne prosent levedyktighet.

10. Utfør genuttrykksanalyse

  1. Få 10.000-20.000 celler per prøve og utfør RNA-isolasjon for å analysere murine retinal endotelcellegenuttrykk. RNA-isolasjon utføres ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig sett som bruker etanolbasert RNA-utfelling, og deretter sentrifugering og membrankolonner for å vaske og eluere renset RNA fra cellelysat. Prøver kan behandles for noen neste generasjons sekvenseringsprogrammer på dette trinn1.
  2. Konverter RNA til cDNA ved hjelp av revers transkriptase enzym og støttende reagenser19.
  3. Kvantifiser ved hjelp av et DNA-bindende fargestoff og en kvantitativ PCR (qPCR) maskin20. Last cDNA-prøver i en 384-brønns qPCR-plate med primere for å forsterke gener av interesse. Reaksjonsvolumet bør være totalt til 10 μL, inkludert DNA-bindende fargestoff, som vil bli brukt til å kvantifisere genforsterkning.
    1. Bruk CD31, VE-Cadherin, CD45 og β-aktin fremover og bakover primere for å måle genuttrykk.
  4. Bruk eksemplet for neste generasjons sekvenseringsprogrammer1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fordøyelse av retinalt vev og immunfarging for CD31 og CD45 resulterer i en identifiserbar populasjon av CD31+/CD45-endotelceller etter gating for celler, enkeltceller og levedyktighet (figur 2A). CD45-immunostaining er nødvendig for å eliminere CD31+/CD45+-celler, som inkluderer blodplater og noen leukocytter21. Kontroller bør utføres for hvert forsøk for å vise antistoffspesifisitet og veiledningsstrategi (figur 2B). Denne prosentandelen er relativt lav, rundt 0,5% -1,0% av alle celler i fordøyd enkeltcellesuspensjon.

Levedyktighet og renhet kan vurderes gjennom kvantifisering av propidiumjodidfarging og genuttrykksanalyse av RNA isolert fra forskjellige populasjoner. Varierende fordøyelsestid påvirker celleutbyttet og levedyktighetsprosenten, med 20 min fordøyelsestid som resulterer i optimalt utbytte med en lav prosentandel av ikke-levedyktige endotelceller (figur 3A). Isolerte endotelceller holdt seg levedyktige i 60 minutter etter isolering, målt ved påfølgende propidiumjodidfarging (figur 3B). Cellepopulasjonens renhet ble vurdert ved qPCR-analyse av ekspresjonen av endotelcellegener (CD31 og VE-Cadherin) sammenlignet med leukocyttspesifikk CD45 normalisert til β-aktin (ActB), som viste sterk anrikning for endotelcellegener i CD31+/CD45-populasjonen (figur 3C).

Isolerte endotelceller fra denne protokollen kan brukes i neste generasjons sekvenseringsteknikker. Rensing av RNA fra de isolerte endotelcellene, konvertering og forsterkning av cDNA gjennom bibliotekforberedelse og sekvensering av cDNA-biblioteket resulterte i > 16 000 gener identifisert i ni uavhengige prøver, med et frafall i transkripsjoner per million avlesninger (TPM) observert i gener under denne terskelen (figur 4A). Encellet RNA-sekvensering av isolerte retinale endotelceller gjennom 10x Genomics-rørledningen resulterte i en median på 1,171 gener per celle, 15,247 totale gener oppdaget, og en median på 2,255 unike molekylære identifikatorer (UMI) teller per celle i 917 celler (figur 4B).

Figure 2
Figur 2: Fluorescerende aktivert cellesorteringsstrategi. (A) Cellesortering for CD31+/CD45- endotelceller etter FSC-A/SSC-A for celler, FSC-A/FSC-H for enkeltceller, Propidium Iodide (PI) negativitet for levedyktighet og CD31+/CD45- for endotelceller. (B) Kontrollfarging for PI, IgG-kontroll, CD31+-kontroll og CD45+-kontroll for å vise antistoffspesifisitet og gatingstrategi for hver fluorescerende avlesning. Republisert med tillatelse fra Chavkin et al. publisert i S. Karger AG, Basel17. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Isolering levedyktighet og renhet av isolerte endotelceller. (A) Antall levedyktige og ikke-levedyktige endotelceller isolert etter forskjellige fordøyelsestider normalisert til antall mus som brukes i hver isolasjon. (B) Prosentandel av ikke-levedyktige endotelceller etter isolering ved FACS-sortering over tid. (C) qPCR for endotelspesifikke gener (CD31, VE-Cadherin) og leukocyttspesifikke CD45 i CD31-/CD45- (negativ), CD31+/CD45- (endotelcelle) og CD31-/CD45+ (leukocytt) populasjoner (A.U. = vilkårlige enheter). Alle data representert ved gjennomsnitt med feilfelt med standardavvik, statistiske tester av ANOVA post-hoc Tukey, p-verdier angitt (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Republisert med tillatelse fra Chavkin et al. publisert i S. Karger AG, Basel17. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Kvalitetskontroll av neste generasjons sekvenseringsavlesning for RNA-sekvensering og encellet RNA-sekvensering etter isolering. (A) Transkripsjoner per million leser (TPM) plottet versus gener rangert etter overflod for ni uavhengige RNA-sekvenseringsprøver etter bibliotekforberedelse og Illumina-sekvensering, med gjennomsnittlig antall sekvenser per gen oppført til høyre for hver prøve. (B) CellRanger-rapport for encellet RNA-sekvensering av P6 retinale endotelceller etter isolering og forberedelse ved bruk av 10x Genomics-rørledningen. Denne analysen viser unike molekylidentifikatortellinger (UMI) som representerer råsekvensutdata for hver strekkode som representerer en individuell sekvensert celle. Viktige kvalitetskontrollmålinger vises i nedre del av figuren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen beskriver en metode for isolering av endotelceller fra postnatal murine retinalt vev som er optimalisert for høyt celletall, renhet og levedyktighet. Cellerenhet oppnås ved FACS-isolering av endotelcellepopulasjoner fra fordøyd enkeltcellesuspensjon ved CD31 + / CD45- immunostaining. Kvaliteten på isolasjon kvantifiseres i analyser for levedyktighet ved Trypan blå farging og genuttrykk av qPCR for CD31, CD45 og VE-Cadherin (selv om VE-Cadherin ikke ble brukt til immunostaining). De kritiske trinnene i denne protokollen er retinalvevisolasjon og vevsfordøyelse. Retinal vevsisolering bør utføres raskt for å opprettholde cellens levedyktighet og nøyaktig for å øke cellerenheten. Vevsfordøyelse bør utføres, som beskrevet, for å optimalisere celleutbyttet og cellens levedyktighet.

Endringer i denne protokollen kan gjøres når du bruker denne metoden på forskjellige tidspunkter, mus med transgene modifikasjoner eller forskjellige nedstrøms applikasjoner. Dette kan være spesielt viktig når man undersøker voksent retinalvev, da vevet kan være mer modent enn P6-retinalvevet og kan kreve mer fordøyelsestid for å isolere rene og levedyktige endotelceller. Isolering av retinalt vev og fordøyelsestid må optimaliseres ved endring av protokollen. Lavt celleutbytte kan kreve friske fordøyelsesenzymer, lengre fordøyelsestid eller nye antistoffer for FACS. Lav renhet kan kreve nye antistoffer for FACS. Lav levedyktighet kan kreve raskere retinal vevisolasjon, kortere fordøyelsestid eller en raskere cellesorteringshastighet. Følgende feilsøkingstrinn kan bidra til å forbedre celleutbyttet, renheten og levedyktigheten. En høy prosentandel av dubletter eller ikke-levedyktige celler kan skyldes dårlig fordøyelse. En ikke-identifiserbar populasjon av CD31+/CD45-endotelceller kan skyldes dårlig antistofffarging. Dårlig levedyktighet under sortering eller etter isolasjon kan skyldes fordøyelse som er for hard, men dårlig cellerenhet kan skyldes svak fordøyelse eller dårlig antistofffarging. Dårlig RNA-kvalitet vil gi færre unike gener i et RNA-sekvenseringsdatasett, og dårlig levedyktighet vil gi færre celler og gener i et enkeltcellet RNA-sekvenseringsdatasett.

Det er flere begrensninger for denne metoden. For det første resulterer denne metoden i et lavt utbytte av retinale endotelceller, noe som kan begrense nedstrøms neste generasjons sekvenseringsapplikasjoner. De representative resultatene oppnådd gjennom encellet RNA-sekvensering ga 917 endotelceller. Et tilsvarende antall celler har blitt isolert og brukt i andre enkeltcellede RNA-sekvenseringsstudier for å undersøke retinal endotelcelleutvikling22; Høyere utbytter kan avsløre ytterligere forskjell på celleklynger. Dyr og kull kan samles for å øke celleutbyttet for å nå prøveinngangen som kreves for ulike applikasjoner. I tillegg kan levedyktigheten til endotelceller etter isolering begrense andre nedstrøms applikasjoner. Det er vanskelig å utvide levedyktighetsvinduet, og ikke-levedyktige celler vil forstyrre visse applikasjoner som krever intakte cellemembraner. Justeringer av andre metoder i nedstrømsapplikasjoner kan være nødvendig for å kunne bruke denne metoden.

Denne metoden for retinal endotelcelleisolasjon er en forbedring i forhold til tidligere publiserte applikasjoner som bruker CD31-antistoffkonjugerte magnetiske perler for å rense endotelceller ved at denne protokollen er optimalisert for parametere som er nødvendige for å oppnå en ren og levedyktig cellepopulasjon som vil forbedre suksessen til neste generasjons sekvenseringsapplikasjoner22,23 . Høye grader av levedyktighet og renhet er avgjørende for både hel transkriptom RNA-sekvensering og encellet RNA-sekvensering. Derfor er denne metoden en betydelig forbedring ved bruk av neste generasjons sekvenseringsmetoder til retinal vaskulariseringsmodellen.

Bruken av denne retinale endotelcelleisolasjonsprotokollen, i kombinasjon med neste generasjons sekvenseringsapplikasjoner og tilhørende beregningsanalyse, har potensial til å avsløre komplekse underliggende mekanismer for vaskulær utvikling. Studier av postnatal retinal vaskularisering hos transgene mus har gjort det mulig å undersøke mange signalveier som påvirker angiogenese og blodkarmodning (Hedgehog, VEGF, Wnt, Notch, TGF-β, BMP) 24,25,26,27,28,29,30. Disse studiene har vist at signalveier er svært sammenkoblet i endotelceller for å kontrollere celleskjebnen31,32,33. Bruken av denne optimaliserte metoden for retinal endotelcelleisolasjon fra å utvikle postnatal retinalvev, i kombinasjon med neste generasjons sekvenseringsmetoder og biocomputational tilnærminger34,35,36,37, kan ytterligere belyse mekanismene for sammenhengende signalveier som regulerer vaskulær utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen relevante avsløringer.

Acknowledgments

Takk til Yale Flow Cytometry Facility, University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, Yale Center for Genomic Analysis og University of Virginia Genome Analysis and Technology Core for deres innsats, kompetanse og råd for å bidra til de presenterte eksperimentene. Denne studien ble finansiert av NIH-tilskudd til N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) og K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2 mL Eppendorf safe-lock tubes USA Scientific 4036-3352
5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
60 mm Non TC-treated Culture Dish Corning 430589
APC Rat Anti-Mouse CD31 BD Biosciences 551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control BD Biosciences 553932
BD FACSChorus Software BD Biosciences FACSCHORUS
BD FACSMelody Cell Sorter BD Biosciences FACSMELODY
Collagenase Type II Sigma-Aldrich 234115
Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile Corning 3548
D-Glucose Gibco A2494001
Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisher Scientific 12-711-9AM
Dissecting Pan Wax Carolina 629100
Dissection scissors Fine Science Tools 14085-08
Dissection Stereo Microscope M165 FC Leica M165FC
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-052
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190144
Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL Sigma-Aldrich 22364120
Fetal Bovine Serum (FBS) Gemini Bio 100-106
Fine dissection forceps Fine Science Tools 11250-00
Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) Gibco 14175095
HEPES (1M) Gibco 15630130
iScript cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708890
Isoflurane, USP Covetrus 11695067772
Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath Fisher Scientific FSGPD20
Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
RNeasy Plus Mini Kit Qiagen 74134
Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated ThermoFisher 75002477
SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 172-5120
Trypan Blue Solution ThermoFisher 15250061
V450 Rat Anti-Mouse CD45 BD Biosciences 560501
V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control BD Biosciences 560457

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).
  2. Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
  3. Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
  4. Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
  5. Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
  6. Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  7. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
  8. Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D'Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
  9. Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
  10. dela Paz, N. G., D'Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
  11. Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
  12. Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
  13. Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
  14. Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
  15. Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
  16. Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
  17. Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
  18. Hulspas, R., O'Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
  19. Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
  20. Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
  21. Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
  22. Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
  23. Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
  24. Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
  25. Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
  26. Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
  27. Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
  28. Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
  29. Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
  30. Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
  31. Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
  32. Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
  33. Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
  34. Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. 0, 35-43 (2015).
  35. Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
  36. Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
  37. Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).

Tags

Utviklingsbiologi utgave 176 endotelcelle vaskulær utvikling murine retinal vaskularisering neste generasjons sekvensering primær celleisolasjon levedyktighet renhet
Isolering av murine retinale endotelceller for neste generasjons sekvensering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chavkin, N. W., Cain, S., Walsh, K., … More

Chavkin, N. W., Cain, S., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (176), e63133, doi:10.3791/63133 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter