Summary
Her har vi brukt alizarinrød farging for å vise at blyacetateksponering forårsaker en benmasseendring i sebrafisklarver. Denne fargemetoden kan tilpasses undersøkelsen av bentap hos sebrafisklarver forårsaket av andre farlige giftstoffer.
Abstract
Kjemisk indusert bentap på grunn av bly (Pb) eksponering kan utløse en rekke negative virkninger på både menneskelige og dyr skjelettsystemer. De spesifikke effektene og mekanismene hos sebrafisk er imidlertid fortsatt uklare. Alizarinrødt har høy affinitet for kalsiumioner og kan bidra til å visualisere benet og illustrere skjelettmineralmasse. I denne studien hadde vi som mål å påvise blyacetat (PbAc)-indusert bentap hos sebrafisklarver ved bruk av alizarinrød farging. Sebrafiskembryoer ble behandlet med en rekke PbAc-konsentrasjoner (0, 5, 10, 20 mg/L) mellom 2 og 120 timer etter befruktning. Helmontert skjelettfarging ble utført på larver 9 dager etter befruktning, og det totale flekkete arealet ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ-programvare. Resultatene indikerte at det mineraliserte vevet var farget i rødt, og det fargede området reduserte betydelig i PbAc-eksponeringsgruppen, med en doseavhengig endring i beinmineralisering. Dette papiret presenterer en fargeleggingsprotokoll for å undersøke skjelettendringer i PbAc-induserte beindefekter. Metoden kan også brukes i sebrafisklarver for påvisning av bentap indusert av andre kjemikalier.
Introduction
Nylige studier har bekreftet at osteoporose på grunn av glukokortikoider, aromatasehemmere og overdreven alkoholforbruk er vanlig 1,2. Bly (Pb) er et giftig metall som finnes i planter, jord ogvannmiljøer. Selv om de negative effektene av Pb på menneskekroppen har tiltrukket seg mye oppmerksomhet, må den irreversible effekten på bein undersøkes nærmere. Blyforgiftning forårsaker et mangfoldig utvalg av patologiske forandringer i både utviklings- og voksenskjelettet, som påvirker normale livsaktiviteter. Studier har funnet en sammenheng mellom kronisk Pb-eksponering og beinskade4, inkludert nedsatte beinstrukturer5,6, redusert beinmineraltetthet og til og med økt risiko for osteoporose7.
Mineralisert vev er av stor betydning for beinstyrke8, og benmineraliseringsmatriseavsetning er en kritisk indeks for beindannelse9. Alizarinrødt har høy affinitet til kalsiumioner, og alizarinrød farging er en standard prosedyre for vurdering av bendannelse10. Ifølge denne metoden er mineralisert vev farget rødt, mens alt annet vev forblir gjennomsiktig. Det flekkete området kvantifiseres deretter ved digital bildeanalyse11.
Sebrafisk er en viktig modellorganisme som er mye brukt i legemiddeloppdagelse og sykdomsmodeller. Genetiske studier på sebrafisk og mennesker har vist likheter i de underliggende mekanismene for skjelettmorfogenese på molekylært nivå12. Videre er høy gjennomstrømningsmedisin eller biomolekylscreening mer gjennomførbart i store koblinger av sebrafisk enn murine modeller, noe som letter den mekanistiske studien av proosteogene eller osteotoksiske molekyler13. Differensiell farging av skjelettet i toto10 brukes ofte til å studere skjelettdysplasi hos små vertebrater og pattedyrfostre. Alizarinrød farging ble utført for å undersøke beinutviklingstoksisitet av kjemikalier i sebrafisklarver. Her brukte vi bly som eksempel for å beskrive en protokoll for påvisning av blyacetatinduserte beindefekter hos sebrafisklarver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrer som er skissert her, er gjennomgått og godkjent av Animal Care Institute of The Ethics Committee of Soochow University.
1. Fiskehold og embryoinnsamling 14
- Fôr fisk tre ganger hver dag; Sørg for at sebrafisken holdes på 28,5 ± 0,5 °C med en 14:10 timers lys/mørk syklus.
- Skill den mannlige og kvinnelige voksne fisken med isolasjonstavler i gytetanker i forholdet 2: 1 mann til kvinne om kvelden.
- Neste morgen, fjern isolasjonsbrettene klokken 9:00 og samle embryoene 2 timer senere.
- Plasser embryoene i en biokjemisk inkubator opprettholdt ved 28,5 °C før forsøket.
2. Kjemisk eksponering
- Forbered moderstammen: Vei blyacetattrihydrat (5 g), og oppløs det i ultrarent vann (50 ml) under omrøring.
FORSIKTIG: PbAc er giftig. Bruk egnede støvmasker, verneklær og hansker. Utfør eksperimentet under en avtrekkshette. - Velg og fordel sebrafiskembryoer tilfeldig i rene 6-brønnsplater (30 embryoer per brønn i 3 ml sebrafiskavlsvann; se tabell 1 for sammensetningen). Behandle embryoene med PbAc (0, 5, 10, 20 mg / L) fra 2 til 120 timer etter befruktning (hpf).
MERK: Konsentrasjonene av PbAc ble valgt i henhold til doseområde-finne eksperimenter. Resultatene viste at LC50 av blyacetat på sebrafiskembryoer var 41.044 mg / L ved 120 hpf. Derfor ble den høyeste konsentrasjonen satt til halvparten av LC50 og en serie løsninger fremstilt ved 2 ganger fortynning. - Fôr larvene to ganger om dagen fra 5 dager etter befruktning (dpf). Oppretthold sebrafiskembryoene ved 28,5 ± 0,5 °C med en lys/mørk syklus på 14:10 timer.
- Oppdater det Pb-frie mediet (sebrafisk avlsvann) hver 24. time til 9 dpf.
MERK: Etter at eksperimentene var fullført, ble alle blyholdige løsninger hellet i en utpekt væsketank og behandlet av eksperimentstyringssenteret.
3. Alizarin rød farging
MERK: Bruk egnede støvmasker, verneklær og hansker under hele fargeprosessen. Sammensetningene av alle løsninger er vist i tabell 1.
- Spesifikke fargetrinn
MERK: Fargingsprosessen ble utført i en 24-brønns plate ved romtemperatur. Etter at hver løsning er tilsatt, plasser platen med 24 brønner på ristingsbordet med lav hastighet.- Fjern 10 sebrafisklarver tilfeldig fra hver gruppe ved 9 dpf og fest fisken i 1 ml 2% paraformaldehyd/1x fosfatbufret saltvann i 2 timer.
- Dekanter oppløsningen og vask sebrafisklarvene med 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2 i 10 min.
- Dekanter løsningen og inkuber larvene i følgende løsninger i 5 minutter hver for avfarging: vannfri etanol (EtOH) løsning (80% EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) / 10 mM MgCl2, 50% EtOH / 100 mM Tris-HCl (pH = 7,5) og 25% EtOH / 100mM Tris-HCl (pH = 7,5).
- Dekanter løsningen, fjern pigmentet ved bleking med en løsning bestående av 3% H 2 O2og 0,5% KOH, og observer en gang hvert 10. minutt til pigmentet er helt fjernet.
- Skyll sebrafisklarvene flere ganger med 25 % glyserin/0,1 % KOH i 10 minutter hver til det ikke er bobler.
MERK: Det er viktig å unngå bobler; Ellers vil boblene i sebrafisklegemet vises som et svart synsfelt under mikroskopet, noe som vil påvirke observasjoner og kvantitativ analyse. - Flekk larvene ved å suge i 1 ml 0,01% alizarin i 50 minutter.
- Dekanter løsningen og tilsett 1 ml 50% glyserin / 0,1% KOH i 10 minutter for å fjerne bakgrunnen. Oppbevar fiskene i fersk 50% glyserin / 0,1% KOH for senere observasjon.
4. Bilde oppkjøp
- Overfør en larve på glassglasset hver gang, og hold larven midt i væskefallet.
- Observer larvene under et stereomikroskop.
- Slå på kameraet, åpne programvaren (se materialtabellen) og behold standardinnstillingene.
- Klikk på AE, og velg en passende eksponeringstid (60 ms i dette eksperimentet) for å få det beste bildet.
- Ta alle bildene under de samme innstillingene. Lagre bildene i .tif format for senere analyse.
5. Bildeanalyse
MERK: Se tilleggsfilen for et eksempel med et sett med eksempelgrafer for bildeanalyse.
- Dobbeltklikk på ImageJ-ikonet og analyser bildene som ble lagret i trinn 4.5.
- Klikk på Fil | Åpne for å åpne bildene som er lagret i trinn 4.5.
- Klikk på bildet | Skriv inn, velg 8-biters.
- Klikk på Rediger | Inverter.
- Klikk på Analyser | Kalibrer, velg Ukalibrert OD i popup-grensesnittet, sjekk Global kalibrering nederst til venstre i det nedre grensesnittet, og klikk OK.
- Klikk på Analyser | Sett skala | Klikk for å fjerne skala i popup-grensesnittet, sjekk Global nedenfor, og klikk OK.
- Klikk på Analyser | Angi mål, velg elementområdet i popup-grensesnittet, merk av for Grense til-terskel nedenfor (for å måle bare det valgte området), og klikk OK.
- Klikk på bildet | Juster| Terskel, skyv glidebryteren midt i popup-grensesnittet for å velge riktig terskel (endre terskelen for hvert bilde) slik at alle målene som skal testes i ett bilde, er valgt, og klikk Angi.
- Klikk på Analyser | Mål. Registrer datoene for hver gruppe.
- Bruk enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys multiple comparison test for å analysere forskjellene, og sett signifikansnivået til p < 0,001 (***).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Alizarinrød farging er en sensitiv og spesifikk metode for å måle endringer i beinmineralisering hos sebrafisklarver. I denne studien har vi observert at PbAc hadde negative effekter på sebrafisklarver, inkludert død, misdannelse, redusert hjertefrekvens og forkortelse av kroppslengde. Videre ble mineralskjelettområdene til sebrafisklarver evaluert for å undersøke PbAc-indusert bentap. Ved 9 dpf (figur 1A) er mange bein i hodeskjelettet mineralisert og dermed farget i rødt, som parasfenoid (PS), operkel (OP), ceratobranchial (CB) og notochord (NC). I motsetning til dette virker otolitter (OT) (ikke-benete strukturer) brunsvarte i stedet for røde. Digital analyse ble utført for å kvantifisere det totale flekkete området i hvert bilde. Sammenlignet med kontrollgruppen viste blyacetatgrupper behandlet med 10 og 20 mg/l PbAc en signifikant reduksjon (p < 0,001) i det fargede området (figur 1B). Endringene i beinmineralisering viste doseavhengighet.
Figur 1: Effekter av ulike konsentrasjoner av PbAc på sebrafisk larver hodeskallen . (A) Bilder av det dorsale aspektet av hodebenet farget med alizarinrødt i larver ved 9 dpf. Det mineraliserte vevet er farget i rødt. Skalastenger = 0,5 mm. (B) Endringer i relativt mineralisert areal ved 9 dpf; 10 larver per gruppe. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM. Tre replikasjoner ble utført. p < 0,001 ***. Forkortelser: PS = parasphenoid; OP = operkel; OT = otolith; CB = ceratobranchial; NC = notochord; dpf = dager etter befruktning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Løsning | Komposisjon | |
| Sebrafisk avlsvann | pH 7-7,3, 27-29 °C, konduktivitet 450-550 μs, saltholdighet 0,25-0,75 %0, oppløst oksygen >6 mg/l, fotoperiode 14/10 timer, hardhet 100-200 mg/l, klor 0 mg/l, ammoniakknitrogenkonsentrasjon <0,02 mg/l, nitritt <1 mg/l, nitrat <50 mg/l, karbondioksid <50 mg/l | |
| Blandet oppløsning (50 ml) av 2% paraformaldehyd og 1x PBS | 25 ml 4 % paraformaldehyd, 5 ml 10x PBS buffer og dobbelt destillert vann (ddH2O) q.s. til 50 ml | |
| Blandet oppløsning (50 ml) av 100 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 10 mM MgCl2 | 5 ml på 1 M Tris-HCl (pH=7,5), 0,5 ml på 1 M MgCl 2 og ddH2 O q.s. til 50 ml | |
| Blandet oppløsning (50 ml) av 80 % vannfri etanol, 10 mM MgCl2 og 100 mM Tris-HCl (pH = 7,5) | 42,1 ml 95 % vannfri etanol, 5 ml 1 M Tris-HCl (pH=7,5), 0,5 ml 1 M MgCl 2 og ddH2 O q.s. til 50 ml | |
| Blandet oppløsning (50 ml) av 50% vannfri etanol og 100 mM Tris-HCl (pH = 7,5) | 26,3 ml 95% vannfri etanol, 5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7,5) og ddH2O q.s. til 50 ml | |
| Blandet oppløsning (50 ml) av 25 % vannfri etanol og 100 mM Tris-HCl (pH = 7,5) | 13,2 ml 95 % vannfri etanol, 5 ml 1 M Tris-HCl (pH = 7,5) og ddH2O q.s. til 50 ml | |
| Blandet oppløsning av 3% H 2 O2løsning og 0,5% KOH løsning | Like mengder 6% H 2 O2og 1% KOH blandet før bruk | |
| Blandet oppløsning (50 ml) av 25% glyserin og 0,1% KOH | 12,5 ml 100 % glyserin, 0,25 ml 20 % KOH og ddH2o/q.s. til 50 ml | |
| 0,01 % Alizarin (50 ml) | 1 ml 0,5 % alizarin, 12,5 ml 100 % glyserin, 5 ml 1 M Tris-HCl (pH=7,5) og ddH2O/q.s. til 50 ml | |
| Blandet oppløsning (50 ml) av 50% glyserin og 0,1% KOH | 25 ml 100 % glyserin, 0,25 ml 20 % KOH og ddH2o/q.s. til 50 ml | |
Tabell 1: Sammensetning av løsninger brukt i alizarinrød fargeprotokoll. Forkortelse: q.s. = kvante tilstrekkelig (etter behov).
Tilleggsfil: Et sett med eksempelgrafer for bildeanalyse. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sebrafisken er en egnet modell for å studere bein metabolsk sykdom. Sammenlignet med gnagermodeller er sebrafiskmodeller relativt raske å etablere, og måling av alvorlighetsgraden av sykdommen er lettere. I sebrafisklarver av villtype forekommer mineralisering av hodeskjelettet ved 5 dpf og det aksiale skjelettet ved 7 dpf15. Dermed er kraniale bein som PS, OP, CB og NC godt utviklet ved 9 dpf. Etter at larvene var helt destained og bleket, ble det myke vevet ryddet, noe som resulterte i et gjennomsiktig utseende av fiskekroppen. Alizarinrødfargingsreagenset ble tilsatt for å flekke og visualisere mineralbeina i sebrafisk i rødt.
Bildeanalyse er avgjørende for å oppnå pålitelige eksperimentelle konklusjoner i dette eksperimentet. Fotografier av sebrafisk med god holdning og ren bakgrunn ble valgt for kvantitativ analyse. Når vi kvantifiserer det beisede området for et enkelt bilde, beregnes alle mineraliserte bein farget i rødt av en fisk. Dermed kan vi sammenligne beinmasseendringene mellom de blyeksponerte og kontrollgruppene. I denne studien forårsaket PbAc-eksponering utviklingstoksisitet hos sebrafisk, og en signifikant reduksjon i det fargede området av mineralbein ble observert i 10 og 20 mg/l PbAc-eksponeringsgruppene ved 9 dpf. Dermed reduserte tidlig embryonal eksponering for PbAc benmassen til sebrafisklarver. Figur 1 viser PbAc-indusert bentap visualisert ved alizarinrød farging i sebrafisklarvene.
Fargestoffer som binder seg til forkalket matrise brukes til å merke hele skjelettet. Calcein er en fluorescerende kromofor som også spesifikt kan binde seg til kalsium i levende vev og har blitt brukt til å merke beinstrukturer og studere beinvekst10. I motsetning til calcein genererer alizarinrød farging av fast vev en permanent registrering av skjelettforandringer som kan lette sammenligninger av flere prøver. Mikrocomputertomografi (Micro CT) kan gi nøyaktig kvantitativ analyse av mineralisert vev ved å anskaffe en serie 2D-røntgenstråler. På grunn av at den lille størrelsen på sebrafisk og mange av beinene i det utviklende sebrafiskskjelettet er tynne, kan Micro CT-analyseverktøy imidlertid ikke nøyaktig karakterisere disse beinene16.
Fluorescerende transgene reporterlinjer bidrar også til å visualisere skjelettutvikling hos levende larver eller enda mer moden fisk i sanntid17. På samme måte tillater alizarinrød S in vivo-farging evaluering av levende fisk og kontinuerlig sporing av misdannelser18. Alizarinrød farging er således en nyttig og kostnadseffektiv måte å analysere bentap i sebrafisklarver. På grunn av kompleksiteten i de eksperimentelle trinnene og antall løsninger som brukes, kan de endelige resultatene av analysen av alizarinrødfargede bilder imidlertid påvirkes av den eksperimentelle operasjonen. Videre er det vanskelig å bruke denne fargemetoden for voksen sebrafisk på grunn av økt kroppsvolum og bløtvev; Mikro CT-analyse eller transgene linjer ville være et bedre valg for skjelettavbildning av voksen sebrafisk. Oppsummert kan protokollen som presenteres her brukes til å studere endringene i beinmineralisering i sebrafisklarver etter kjemisk toksisk eksponering. Denne prosedyren kan være nyttig for å etablere en sebrafiskmodell for å studere beinsykdom og utvikle nye terapeutiske legemidler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse om.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) og prioritert akademisk programutvikling av Jiangsu høyere utdanningsinstitusjoner (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 M Tris-HCl (pH=7.5) | Solarbio,Beijing,China | 21 | for detaining |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution | BBI,Shanghai,China | 14 | fixing tissues |
| 10x PBS buffer | BBI,Shanghai,China | 15 | for fixing |
| 35% H2O2 | Yonghua,Jiangsu,China | 8 | removing pigment |
| 50 mL Centrifuge tube | AKX,Jiangsu,China | 4 | |
| 95% Anhydrous ethanol | Enox,Jiangsu,China | 2 | destaining |
| Alizarin red (Purity 99.5%) | Solarbio,Beijing,China | 1 | staining |
| Biochemical incubator | Yiheng,Shanghai,China | 3 | raising zebrafish embryos |
| Electronic scale | Sartorius,Germany | 5 | weighing the solid raw materials |
| Glycerin (Purity 99.5%) | BBI,Shanghai,China | 7 | storing the stained fish |
| ImageJ (software) | USA | 9 | digital analysis |
| KOH (Purity 99.9%) | Sigma,America | 10 | bleaching solution |
| Lead acetate trihydrate (Purity 99.5%) | Aladdin,Shanghai,China | 11 | |
| MgCl2 (Purity 99.9%) | Aladdin,Shanghai,China | 12 | cleaning solution |
| NIS-Elements F (software) | Nikon, Japan | 13 | observing and taking photos |
| Pipe | AKX, Jiangsu, China | 18 | removal of embryos and solution |
| plates (24-well) | Corning,America | 17 | container for staining embryos |
| plates (6-well) | Corning,America | 16 | container for breeding embryos |
| Shaking table | Beyotime, China | 19 | mixing the solution |
| Stereo microscope | Nikon,Japan | 20 | observing and taking photos |
| Zebrafish | Zebrafish Experiment Center of Soochow University,Suzhou,China | 22 | experimental animal |
References
- Compston, J., et al. Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science. Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).
- Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).
- Kataba, A., et al. Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 227, 105607 (2020).
- Morin, S. N., et al. Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos). Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147 (2020).
- Lee, C. M., et al. Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis. Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).
- Theppeang, K., et al. Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women. Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).
- Sun, Y., et al. Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead. American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).
- Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. Exercise and bone mass in adults. Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).
- Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. Collagen structure and functional implications. Micron. 32 (3), 251-260 (2001).
- Kelly, W. L., Bryden, M. M. A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates. Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).
- Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis. Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. Fish as a model to assess chemical toxicity in bone. Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).
- Wang, L., et al. Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos. Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820 (2020).
- Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds. Frontiers in Endocrinology. 10, 6 (2019).
- Charles, J. F., et al. Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis. Bone. 101, 162-171 (2017).
- Hammond, C. L., Moro, E. Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo. Frontiers in Endocrinology. 3, 91 (2012).
- Bensimon-Brito, A., et al. Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration. BMC Developmental Biology. 16, 2 (2016).
