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Neuroscience

ग्रेन्युल सेल अग्रदूत में प्राथमिक सिलियम-निर्भर सिग्नलिंग मार्गों का अध्ययन करने के लिए कुशल और लागत प्रभावी इलेक्ट्रोपोरेशन विधि

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63283
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

Summary

यहां, हम प्राथमिक अनुमस्तिष्क ग्रेन्युल सेल अग्रदूतों (जीसीपी) के आनुवंशिक हेरफेर के लिए एक पुनरुत्पादक इन विट्रो इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो लागत प्रभावी, कुशल और व्यवहार्य है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल प्राथमिक जीसीपी कोशिकाओं में प्राथमिक सिलियम-निर्भर हेजहोग सिग्नलिंग मार्गों के आणविक अध्ययन के लिए एक सीधी विधि भी प्रदर्शित करता है।

Abstract

प्राथमिक सिलियम एक महत्वपूर्ण सिग्नलिंग ऑर्गेनेल है जो लगभग हर सेल पर पाया जाता है जो हेजहोग (एचएच) को सेल की सतह से सिग्नलिंग उत्तेजनाओं को ट्रांसड्यूस करता है। ग्रेन्युल सेल अग्रदूत (जीसीपी) में, प्राथमिक सिलियम एक निर्णायक सिग्नलिंग केंद्र के रूप में कार्य करता है जो एचएच सिग्नलिंग मार्ग को संशोधित करके अग्रदूत सेल प्रसार को ऑर्केस्ट्रेट करता है। प्राथमिक सिलियम-निर्भर एचएच सिग्नलिंग मशीनरी की जांच को प्राथमिक सिलियम में उनके गतिशील स्थानीयकरण की कल्पना करने के लिए मार्ग घटकों के इन विट्रो आनुवंशिक हेरफेर द्वारा सुविधाजनक बनाया जाता है। हालांकि, वर्तमान में ज्ञात इलेक्ट्रोपोरेशन विधियों का उपयोग करके जीसीपी की प्राथमिक संस्कृतियों में ट्रांसजीन का अभिकर्मक आमतौर पर महंगा होता है और अक्सर कम सेल व्यवहार्यता और अवांछनीय अभिकर्मक दक्षता में परिणाम होता है। यह पेपर एक कुशल, लागत प्रभावी और सरल इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल का परिचय देता है जो ~ 80-90% और इष्टतम सेल व्यवहार्यता की एक उच्च अभिकर्मक दक्षता को दर्शाता है। यह एक सरल, पुनरुत्पादक और कुशल आनुवंशिक संशोधन विधि है जो प्राथमिक जीसीपी संस्कृतियों में प्राथमिक सिलियम-निर्भर हेजहोग सिग्नलिंग मार्ग के अध्ययन पर लागू होती है।

Introduction

सेरेबेलर जीसीपी का व्यापक रूप से न्यूरोनल पूर्वज सेल-प्रकारों में एचएच सिग्नलिंग मार्ग की मशीनरी का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि विवो 1,2,3,4 में एचएच सिग्नलिंग मार्ग के लिए उनकी उच्च बहुतायत और उच्च संवेदनशीलता के कारण। जीसीपी में, प्राथमिक सिलियम एक निर्णायक एचएच सिग्नल ट्रांसडक्शन हब 5 के रूप में कार्य करता है जो अग्रदूत कोशिकाओं के प्रसार को व्यवस्थित करता है6,7,8। प्राथमिक सिलियम पर एचएच सिग्नलिंग घटकों का इन विट्रो विज़ुअलाइज़ेशन अक्सर उनके कम अंतर्जात बेसल स्तरों के कारण चुनौतीपूर्ण होता है। इसलिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर का ट्रांसजीन संशोधन और ब्याज के जीन के फ्लोरोफोर टैगिंग आणविक संकल्प पर मार्ग का अध्ययन करने के लिए उपयोगी दृष्टिकोण हैं। हालांकि, लिपोसोम-आधारित अभिकर्मक दृष्टिकोण का उपयोग करके जीसीपी प्राथमिक संस्कृतियों के आनुवंशिक हेरफेर के परिणामस्वरूप अक्सर कम अभिकर्मक दक्षता होती है, जो आगे आणविक जांच में बाधा डालती है। Electroporation दक्षता बढ़ाता है, लेकिन आमतौर पर अत्यधिक विक्रेता-विशिष्ट और सेल प्रकार-प्रतिबंधित electroporation अभिकर्मकों 10 की आवश्यकता होती है।

यह पेपर जीसीपी प्राथमिक संस्कृतियों में एचएच सिग्नलिंग मार्ग घटकों में हेरफेर करने के लिए एक उच्च दक्षता और लागत प्रभावी इलेक्ट्रोपोरेशन विधि का परिचय देता है। इस संशोधित इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एक हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) - टैग किए गए स्मूडेन्ड ट्रांसजीन (पीईजीएफपी-एसएमओ) को कुशलतापूर्वक जीसीपी को वितरित किया गया था और उच्च सेल अस्तित्व और अभिकर्मक दर (80-90%) प्राप्त की गई थी। इसके अलावा, जैसा कि immunocytochemical धुंधला द्वारा प्रमाणित है, transfected जीसीपी प्राथमिक सिलिया के लिए EGFP-Smo तस्करी द्वारा Hh सिग्नलिंग मार्ग के Smoothened एगोनिस्ट-प्रेरित सक्रियण के लिए उच्च संवेदनशीलता दिखाया। यह प्रोटोकॉल सीधे लागू होगा और उन प्रयोगों के लिए फायदेमंद होगा जो सेल प्रकारों के इन विट्रो आनुवंशिक संशोधन को शामिल करते हैं, जिन्हें ट्रांसफेक्ट करना मुश्किल होता है, जैसे कि मानव और कृंतक प्राथमिक सेल संस्कृतियों के साथ-साथ मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाएं।

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Protocol

सभी पशु-संबंधित प्रक्रियाओं को पशु हैंडलिंग दिशानिर्देशों और स्वास्थ्य विभाग, हांगकांग द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुपालन में किया गया था। पशु (प्रयोगों का नियंत्रण) अध्यादेश (कैप 340) के बाद पशु प्रयोग लाइसेंस स्वास्थ्य विभाग, हांगकांग सरकार से प्राप्त किए गए थे। पशु कार्य एचकेबीयू अनुसंधान कार्यालय और प्रयोगशाला सुरक्षा समिति द्वारा अनुमोदित पशु सुरक्षा नैतिकता के अनुपालन में किया गया था। इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों के बारे में विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. पूर्व-अनुभव की तैयारी

  1. संस्कृति मीडिया और buffers की तैयारी
    1. सीरम मुक्त माध्यम (SFM)
      1. SFM के 50 mL तैयार करने के लिए, 100x L-glutamine विकल्प के 500 μL, पेनिसिलिन-Streptomycin के 500 μL, सोडियम पाइरूवेट के 1 mM, और Neurobasal माध्यम के 49 mL के लिए 1 M KCl (अंतिम 250 μM) के 12.5 μL जोड़ें।
      2. SFM को 50 mL शंक्वाकार ट्यूबों में 10 mL और 40 mL के 2 एलीकोट में विभाजित करें और उन्हें एक महीने तक 4 °C पर स्टोर करें।
    2. पाचन अवरुद्ध माध्यम: SFM में 10% FBS
      1. पाचन अवरुद्ध माध्यम तैयार करने के लिए SFM के 10 mL ऐलीकोट में गर्मी-निष्क्रिय FBS के 1.1 mL जोड़ें।
    3. GCP संस्कृति माध्यम: B27 के साथ SFM
      1. जीसीपी संस्कृति माध्यम तैयार करने के लिए, एसएफएम के 40 एमएल एलीकोट में सीरम-मुक्त बी -27 पूरक के 800 μL जोड़ें।
        नोट: बी -27-पूरक SFM को एक महीने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। हालांकि, ताजा तैयार मीडिया इष्टतम परिणाम उत्पन्न करता है।
    4. विच्छेदन बफर: ग्लूकोज + HEPES के साथ EBSS
      1. कैल्शियम में 6 ग्राम / एल ग्लूकोज जोड़ें- और मैग्नीशियम मुक्त अर्ले के संतुलित नमक समाधान (ईबीएसएस) जिसमें 10 एमएम एचईपीईएस (4-(2-हाइड्रॉक्सीएथिल)-1-पिपराज़िनेथेनसल्फोनिक एसिड होता है)।
      2. एक 0.2 μm सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पारित करके समाधान sterilize और लंबी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इसे स्टोर.
    5. पाचन बफर
      नोट: उपयोग करने से पहले ताजा तैयार करें।
      1. 2-4 अनुमस्तिष्क ऊतकों के पाचन के लिए 2 मिलीलीटर और 4-10 ऊतकों के लिए 4 एमएल पाचन बफर तैयार करें। पाचन बफर के 4 मिलीलीटर तैयार करने के लिए, EBSS के 4 mL में 1.5 मिलीग्राम एल-सिस्टीन (अंतिम एकाग्रता 200-400 μg / mL) को भंग करें। ट्यूब को बार-बार उलटें जब तक कि पाउडर पूरी तरह से भंग न हो जाए।
      2. एक 0.2 μm सिरिंज फिल्टर और एक 5 mL सिरिंज का उपयोग कर समाधान sterilize, और एक बाँझ 35 मिमी सेल संस्कृति पकवान के लिए समाधान हस्तांतरण.
      3. पपेन के 4 μL जोड़ें (20 इकाइयों / मिलीग्राम की स्टॉक एकाग्रता से 1: 1,000 कमजोर पड़ने) और DNase I के 40 μL (0.1 mg / mL की अंतिम एकाग्रता के लिए 10 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक से 1: 100 कमजोर पड़ने)।
      4. कम से कम 30 मिनट के लिए या उपयोग तक एक CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को इनक्यूबेट करें।
        नोट:: यह चरण पपेन को सक्रिय करने के लिए महत्वपूर्ण है। इष्टतम परिणामों के लिए, उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट से अधिक न करें। सुनिश्चित करें कि समाधान पारदर्शी हो जाता है और उपयोग से पहले कोई सफेद अवक्षेप नहीं होता है।
  2. प्रीकोटिंग कवरलिप्स
    1. सेल अनुलग्नक के लिए coverslips तैयार करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 1 घंटे के लिए पॉली-डी-लाइसिन (पीडीएल, बाँझ dH2O में 1 मिलीग्राम / एमएल) के 100 μg / mL के साथ ऑटोक्लेव्ड 12 मिमी ग्लास कवरलिप्स को इनक्यूबेट करें। उपयोग करने तक कवरलिप्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर एक ही पीडीएल समाधान में रखें।
    2. प्राथमिक सेल संस्कृति के दिन, एक साफ शंक्वाकार ट्यूब में पीडीएल एकत्र करें और अवशिष्ट पीडीएल को हटाने के लिए बाँझ dH2O के साथ कवरलिप्स को तीन बार अच्छी तरह से कुल्ला करें।
      नोट: PDL पुन: उपयोग के लिए 4 °C पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. प्रत्येक कुएं में एक कवरस्लिप रखकर पीडीएल-लेपित ग्लास कवरलिप्स को 24-अच्छी तरह से प्लेट पर स्थानांतरित करें।
    4. अतिरिक्त पानी निकालें और पूरी तरह से coverslips को कवर करने के लिए Matrigel के 200-300 μL जोड़ें (सीरम मुक्त DMEM-F12 में उत्पाद डेटाशीट में निर्देशों के अनुसार पुनर्गठित)।
    5. CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए Matrigel में coverslips incubate.
      नोट:: सेल सीडिंग से पहले Matrigel निकालें। इस Matrigel एकत्र किया जा सकता है और एकाधिक पुन: उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. Preplating Culture Dish की तैयारी
    1. 100 μg / mL PDL के 2 mL के साथ एक 60 मिमी सेल संस्कृति पकवान कोट करें (बाँझ dH2O में 1 मिलीग्राम / एमएल पीडीएल स्टॉक समाधान का पुनर्गठन) 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन द्वारा।
    2. सेल सीडिंग से तुरंत पहले, एक साफ शंक्वाकार ट्यूब में उपयोग किए गए पीडीएल को हटा दें और एकत्र करें और इसे कई पुन: उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। कुल्ला और बाँझ dH2O के साथ तीन बार पीडीएल लेपित पकवान धोना. सेल सीडिंग से पहले संस्कृति पकवान एयर-सूखी.
    3. अधिकतम 2 पूरे सेरिबैलम ऊतकों से काटे गए बीज कोशिकाओं के लिए एक 60 मिमी सेल संस्कृति पकवान का उपयोग करें।
    4. अतिरिक्त सेरिबैलम के लिए अतिरिक्त संस्कृति व्यंजन तैयार करें।
      नोट:: प्रीप्लेटिंग संस्कृति डिश के उपयोग के लिए चरण 2.1.18 और 2.1.19 देखें।

2. प्रयोगात्मक दिन 0

  1. अलगाव और माउस प्राथमिक जीसीपी की culturing
    नोट:: GCP संस्कृति विधि एक मानक प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया था, और संक्षिप्त प्रोटोकॉल संक्षेप में हमारे पिछले काम में वर्णित किया गया था6,11,12. इष्टतम जीसीपी उपज के लिए, जीसीपी के अलगाव के लिए प्रसवोत्तर (पी) दिन 6 या पी 7 पिल्ले का उपयोग करें। इष्टतम सेल व्यवहार्यता के लिए जितनी जल्दी हो सके निम्न विच्छेदन चरणों को पूरा करें 2.1.6-2.1.10।
    1. प्रीवार्म एसएफएम, पाचन अवरुद्ध मध्यम, संस्कृति माध्यम, और विच्छेदन के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस पर ऑप्टी-एमईएम।
    2. एक साफ बेंच पर, कीटाणुशोधन के लिए 70% इथेनॉल में सभी विच्छेदन उपकरण presoak।
    3. विच्छेदन बफर के 2-3 मिलीलीटर के साथ एक 60 मिमी सेल संस्कृति पकवान भरें और इसे बर्फ पर ठंडा करें।
    4. धारा 1.1.5 में वर्णित के रूप में ताजा पाचन बफर तैयार करें और इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म रखें।
    5. कीटाणुशोधन के लिए पिल्ला के सिर को पोंछने के लिए 70% इथेनॉल का उपयोग करें।
    6. संज्ञाहरण के बिना पिल्ला decapitate. पिल्ला को नष्ट करने के लिए खोपड़ी के पीछे से काटने के लिए सिर और निष्फल सर्जिकल कैंची को पकड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें। संदंश का उपयोग करके मस्तिष्क को उजागर करने के लिए त्वचा और खोपड़ी को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    7. सेरिबैलम को बंद करने के लिए संदंश का उपयोग करें और इसे चरण 2.1.3 में तैयार पूर्व-ठंडा विच्छेदन बफर में जल्दी से भिगोदें।
    8. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत विच्छेदन बफर में डूबे सेरिबैलम के साथ meninges निकालें। रक्त वाहिका-समृद्ध मेनिन्जेस को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे गुलाबी दिखाई देना चाहिए।
    9. संदंश का उपयोग करके सभी मेनिंजेस को हटा दें।
      नोट: मेनिन्जेस के बिना एक सेरिबैलम में एक सफेद उपस्थिति होनी चाहिए।
    10. सेरिबैलम से किसी भी दिखाई देने वाले मिडब्रेन ऊतकों और कोरॉइड प्लेक्सस को हटा दें।
    11. सेरिबैलम को चरण 2.1.4 में तैयार गर्म पाचन बफर के साथ पहले से भरे गए 35 मिमी संस्कृति डिश में स्थानांतरित करें। अतिरिक्त विच्छेदन बफर को स्थानांतरित करने से बचें। जितनी जल्दी हो सके माइक्रोस्प्रिंग कैंची का उपयोग करके सेरिबैलम को ठीक टुकड़ों में काट लें।
    12. तुरंत एक CO2 इनक्यूबेटर में 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कीमा बनाया हुआ सेरिबैलम इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन समय को 20 मिनट तक बढ़ाएं यदि 4 सेरिबैलम से अधिक संसाधित किया जाना है।
      नोट: इनक्यूबेशन के बाद, ऊतक एक साथ clump जाएगा।
    13. पाचन को अवरुद्ध करने वाले माध्यम के साथ एक P1000 पिपेट टिप प्रीवेट का उपयोग करके एक नए बाँझ 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के तल पर पचे हुए ऊतक को तुरंत स्थानांतरित करें (पाचन बफर को स्थानांतरित करने से बचें)।
    14. पाचन को समाप्त करने के लिए पाचन अवरुद्ध माध्यम (1 सेरिबैलम के लिए 1 एमएल) की एक उपयुक्त मात्रा जोड़ें और एक P1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके धीरे-धीरे 30 बार पिपेट को ऊपर और नीचे करें ताकि ऊतक को एक एकल-सेल निलंबन में अलग किया जा सके। एयर बबल गठन से बचें।
    15. धीरे से एक 70 μm सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन एक नए बाँझ centrifuge ट्यूब में सेल clumps को हटाने के लिए पारित.
    16. सेल छलनी से अवशिष्ट कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए सेल छलनी के माध्यम से ताजा पाचन अवरुद्ध माध्यम का एक अतिरिक्त 1 मिलीलीटर पास करें।
    17. कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिनट के लिए 200 × ग्राम पर फिल्टर को सेंट्रीफ्यूज करें। supernatant निकालें और SFM के 1 mL के साथ गोली resuspend. इस चरण को दो बार दोहराएं। हवा के बुलबुले बनाने से बचें।
    18. जीसीपी संस्कृति माध्यम के 2 एमएल की अंतिम मात्रा में गोली को फिर से निलंबित करें और चरण 1.3 में तैयार पीडीएल-लेपित 60 मिमी प्रीप्लेटिंग संस्कृति पकवान में सेल निलंबन को स्थानांतरित करें। एक CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट: 20 मिनट से अधिक न करें।
    19. इनक्यूबेशन के बाद, ढीले अनुयायी जीसीपी कोशिकाओं को हटाने के लिए साइड से संस्कृति पकवान को टैप करें। एक P1000 पिपेट का उपयोग कर कोमल pipetting द्वारा संस्कृति माध्यम में अनुयायी जीसीपी कोशिकाओं ले लीजिए. एक नया 15 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में इस GCP निलंबन ले लीजिए. 60 मिमी पकवान को छोड़ दें।
      नोट: दृढ़ता से अनुयायी एस्ट्रोग्लिया और फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाएं 60 मिमी डिश तल पर जुड़ी रहेंगी और इस चरण में अलग हो जाएंगी। इस कदम को छोड़ना जीसीपी संस्कृति की शुद्धता से समझौता करेगा।
    20. कोशिकाओं की गणना करें और तुरंत इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए आगे बढ़ें।
  2. दिन इन विट्रो (DIV) 0: Hh रिसेप्टर ट्रांसजीन overexpression के लिए Electroporation: pEGFP-Smo
    1. एक 2 मिमी गैप क्यूवेट का उपयोग करके इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए, इलेक्ट्रोपोरेशन की प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए निम्नलिखित प्लास्मिड-सेल इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण तैयार करें: 1.2 × 106 कोशिकाएं और पीईजीएफपी-एमएसएमओ के 10 μg (डीएनए स्टॉक एकाग्रता को ट्रिस-ईडीटीए बफर या बाँझ dH2O में ~ 2-5 μg / μL में समायोजित करें) ऑप्टी-एमईएम के 100 μL में।
      नोट:: कक्ष अपर्याप्त हैं, तो कुल सेल संख्या को कम करें (हालांकि यह electroporation दक्षता को कम कर सकता है)। हालांकि, प्लास्मिड की मात्रा को समायोजित न करें और न ही प्रति क्यूवेट उपयोग किए जाने वाले ऑप्टी-एमईएम की कुल मात्रा। यदि प्रयोग के लिए आवश्यक कुल सेल संख्या 1.5 × 106 कोशिकाओं से अधिक है, तो तदनुसार इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण को बढ़ाएं और कई इलेक्ट्रोपोरेशन प्रतिक्रियाओं को अलग से करें। क्यूवेट को 5 बार तक पुन: उपयोग किया जा सकता है।
    2. पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन सेल सीडिंग प्लेट को 24-वेल कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में 0.5 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम जोड़कर तैयार करें जिसमें लेपित कवरलिप्स (चरण 1.2 से) शामिल हैं और इसे सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म रखें।
    3. चरण 2.1.20 से, कोशिकाओं की आवश्यक संख्या को एक बाँझ 1.5 mL माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में पिपेट करें और RT पर 5 मिनट के लिए 200 × g पर स्पिन करें। supernatant को छोड़ दें और Opti-MEM के 200 μL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें। ऑप्टी-एमईएम के साथ इस चरण को दो बार दोहराएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ट्यूब में कोई अवशिष्ट संस्कृति माध्यम मौजूद नहीं है
      नोट: एक 24-अच्छी तरह से प्लेट, इलेक्ट्रोपोरेट और बीज 1.2-1.3 के हर अच्छी तरह से / कवरस्लिप × के लिए 106 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 106 कोशिकाओं / अच्छी तरह से संस्कृति के अगले दिन ~ 70-75% सेल confluency प्राप्त करने के लिए।
    4. इलेक्ट्रोपोरेशन के पैरामीटर सेट करें जैसा कि तालिका 1 में दिखाया गया है।
    5. Pipette electroporation प्रतिक्रिया धीरे से अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और एक लंबे P200 टिप का उपयोग करने के लिए 2 मिमी अंतर cuvette में मिश्रण के 100 μL की एक सटीक मात्रा को स्थानांतरित करने के लिए. बुलबुले बनाने से बचें।
    6. क्यूवेट कक्ष में क्यूवेट रखें।
    7. इलेक्ट्रोपोरेटर के Ω बटन को दबाएं ( सामग्री की तालिका देखें) और प्रतिबाधा मूल्य का एक नोट बनाएं, जो ~ 30-35 होना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए कि विद्युत प्रतिबाधा मूल्य Ω 30-35 की सीमा के भीतर आता है, 100 μL की सटीक मात्रा का पालन करें।
    8. पल्स शुरू करने के लिए स्टार्ट बटन दबाएं।
    9. पठन फ़्रेम पर दिखाए गए मापे गए वर्तमान और जूल के मानों को रिकॉर्ड करें.
    10. क्यूवेट कक्ष से क्यूवेट निकालें।
    11. तुरंत cuvette में prewarmed संस्कृति माध्यम के 100 μL जोड़ें और 2-3 बार ऊपर और नीचे कोमल pipetting द्वारा इसे resuspend. तुरंत चरण 2.2.2 में तैयार 24-अच्छी तरह से प्लेट के लिए सेल निलंबन स्थानांतरित करें।
      नोट: सेल मृत्यु को कम करने के लिए, इलेक्ट्रोपोरेशन के तुरंत बाद कोशिकाओं को बीज दें।
    12. एक CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। सेल टुकड़ी से बचने के लिए कोशिकाओं को 3 घंटे के लिए अबाधित छोड़ दें।
    13. 3 ज पोस्ट सीडिंग पर, धीरे से एस्पिरेट करें और फ्लोटिंग मृत कोशिकाओं और मलबे को हटाने और पूर्वव्यापी संस्कृति माध्यम की समान मात्रा के साथ बदलने के लिए supernatant माध्यम के आधे हिस्से को त्याग दें।
    14. CO2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें और हर दूसरे दिन माध्यम के आधे हिस्से को फिर से भरें।
    15. अगले दिन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें, यानी, एसएमओ ओवरएक्सप्रेशन की दक्षता निर्धारित करने के लिए जीएफपी सिग्नल के लिए DIV1 (चित्रा 1)।
    16. माध्यम के आधे हिस्से को फिर से भरने के बाद DIV 1 पर Hh सिग्नलिंग मार्ग की उत्तेजना के लिए, नियंत्रण में DMSO की समान मात्रा जोड़ते हुए कोशिकाओं में 0.2 μM स्मूथनेड एगोनिस्ट (SAG) जोड़ें। सेल निर्धारण से पहले 24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
      नोट:: DMSO/SAG की मात्रा के रूप में संभव के रूप में कम के रूप में जोड़ा रखें। यहां, 0.5 μL DMSO या 0.2 mM SAG के 0.5 μL को प्रति 500 μL प्रति अच्छी तरह से मध्यम के प्रति जोड़ा गया था, जो 1: 1,000 का कमजोर पड़ने का अनुपात है।

3. DIV 2: प्राथमिक सिलिया के विज़ुअलाइज़ेशन और Hh सिग्नलिंग मार्ग की जांच

  1. सेल निर्धारण
    1. 24 घंटे के बाद के उपचार में, संस्कृति माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (पीबीएस) के साथ 2-3 बार कुल्ला करें, जबकि एक डिस्पोजेबल पाश्चर पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को विस्थापित करने से बचें।
    2. 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीबीएस में तैयार) के ~ 400 μL जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें और 10 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
    3. कुल्ला और एक डिस्पोजेबल पाश्चर पिपेट का उपयोग कर पीबीएस के साथ 2-3 बार धोना।
    4. पीबीएस में 2 महीने तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या इम्यूनोस्टेनिंग के लिए आगे बढ़ें।
  2. जीसीपी और प्राथमिक सिलियम मार्कर के immunocytochemical धुंधला
    1. एक 24-अच्छी तरह से प्लेट में, पीबीएस में कोशिकाओं को हर बार 5 मिनट के लिए कोमल हिलाते हुए दो बार धोएं।
    2. सेल में 100 mM अमोनियम क्लोराइड के 0.5 mL जोड़ें और fixative को बुझाने के लिए 10 मिनट के लिए RT पर इनक्यूबेट करें।
    3. एक बार कुल्ला और हर बार 10 मिनट के लिए कोमल मिलाते हुए पीबीएस के साथ 2-3 बार धोएं।
    4. धीरे से पिपेट बफर (बीबी: 0.1% ट्राइटन एक्स -100, 1% बीएसए, पीबीएस में 2% गर्मी-निष्क्रिय घोड़े के सीरम) को अवरुद्ध करने के 30 μL पैराफिल्म के एक टुकड़े पर हवा के बुलबुले के बिना एक बूंद बनाने के लिए।
    5. धीरे से सेल-बीज वाले पक्ष के साथ बीबी बूंद पर अच्छी तरह से कवरस्लिप को स्थानांतरित करें जो नीचे की ओर सामना कर रहा है। आरटी में 1 ज के लिए एक आर्द्र कक्ष में बीबी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    6. सामग्री की तालिका में दिखाए गए अनुसार बीबी में प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें। प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं की जांच करने के लिए, चरण 3.2.4 और 3.2.5 को दोहराएं, बीबी को प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण के साथ बदल दें। आरटी में 2 ज के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    7. संदंश का उपयोग करते हुए, कवरलिप्स को 24-अच्छी तरह से प्लेट में वापस स्थानांतरित करें, जिसमें सेल-सीडेड साइड ऊपर की ओर सामना करना पड़ रहा है। कोशिकाओं को एक बार कुल्ला करें और हर बार 10 मिनट के लिए कोमल झटकों के साथ पीबीएस में 3-4 बार धोएं।
    8. सामग्री की तालिका में दिखाए गए अनुसार बीबी में द्वितीयक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें। द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने के लिए, चरण 3.2.4 और 3.2.5 को दोहराएं, बीबी को द्वितीयक एंटीबॉडी मिश्रण के साथ बदल दें। आरटी में 1 ज के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करें।
    9. पोस्ट-सेकंडरी एंटीबॉडी इनक्यूबेशन धोने के लिए चरण 3.2.7 को दोहराएं।
    10. बढ़ते माध्यम का उपयोग कर एक साफ माइक्रोस्कोपिक ग्लास स्लाइड पर coverslip माउंट.
    11. रात भर अंधेरे में स्लाइड को एयर-ड्राई करें और कॉन्फोकल इमेजिंग 13 पर आगे बढ़ें।

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Representative Results

ऑप्टी-एमईएम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग सार्वभौमिक अभिकर्मक के रूप में, यह प्रस्तावित इलेक्ट्रोपोरेशन पद्धति ~ 80-90% (चित्रा 1) पर लगातार उच्च इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता प्राप्त कर सकती है। Smo-EGFP वेक्टर की electroporation दक्षता DIV 2 पोस्ट electroporation पर सभी युग्मित बॉक्स प्रोटीन -6 (Pax6) में हरे प्रतिदीप्ति सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत के परिमाणीकरण द्वारा निर्धारित किया गया था - जीसीपी कोशिकाओं को व्यक्त करते हुए। DMSO- और SAG-उपचारित समूहों की इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता तुलनीय दिखाई दी (चित्रा 1 और तालिका 2)।

इसके अलावा, प्राथमिक सिलियम मार्कर, Arl13b के immunostaining, यह दर्शाता है कि संस्कृति के DIV 2 में GCP की सिलिकरण दर वाहन- और SAG-उपचारित समूहों (DMSO: 17.35% ± 0.59% दोनों में ~ 18% थी; एसएजी: 18.24% ± 0.88%। सिलिएशन दर को पैक्स 6-व्यक्त जीसीपी के प्रतिशत के रूप में चित्रित किया गया है, जो सेल की सतह पर एक प्राथमिक सिलियम (Arl13b-positive) को DIV 2 पोस्ट इलेक्ट्रोपोरेशन (चित्रा 2 और तालिका 3) पर दर्शाता है।

प्राथमिक सिलियम-निर्भर एचएच सिग्नलिंग मार्ग को समझने के लिए, एसएमओ के एक एगोनिस्ट, एसएजी का उपयोग एचएच सिग्नलिंग मार्ग को सक्रिय करने के लिए किया गया था। एचएच मार्ग सक्रियण पर, एसएमओ रिसेप्टर प्राथमिक सिलियम 14 के एक्सोनेम पर समृद्ध होता है। हमारे परिणामों से पता चलता है कि Pax6 के प्राथमिक सिलियम axoneme पर Smo-EGFP स्थानीयकरण में काफी वृद्धि हुई है- SAG उपचार के बाद 24 h पोस्ट GCP कोशिकाओं को व्यक्त करते हैं (चित्रा 3, पिछले work6 से संशोधित परिमाणीकरण डेटा), प्राथमिक सिलियम-निर्भर Hh सिग्नलिंग मार्ग के गहन सक्रियण का संकेत देता है।

Figure 1
चित्रा 1: Electroporation सेटअप और GCPs की electroporation दक्षता। (ए) इलेक्ट्रोपोरेशन सेटअप। दाएँ, काले एरोहेड इलेक्ट्रोपोरेशन क्यूवेट को दर्शाता है। (B, C) प्रतिनिधि छवियां सभी Pax6-व्यक्त GCP कोशिकाओं (तालिका 2) में GFP-सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत के परिमाणीकरण द्वारा निर्धारित Smo-EGFP वेक्टर की इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता को दर्शाती हैं। प्रतिनिधि छवियों Pax6 पर हरे फ्लोरोसेंट संकेतों को दर्शाते हैं-व्यक्त (बैंगनी) जीसीपी कोशिकाओं DIV 2 पर 24 घंटे (बी) डीएमएसओ और (सी) एसएजी के साथ उपचार के बाद इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद। नाभिक को DAPI (नीले) के साथ लेबल किया गया था। स्केल सलाखों = 20 μm. संक्षेप: जीसीपी = ग्रेन्युल सेल अग्रदूत; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; Pax6 = युग्मित बॉक्स प्रोटीन -6; DIV = दिन इन विट्रो; DMSO = dimethyl sulfoxide; SAG = Smoothened एगोनिस्ट; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: GCP प्राथमिक संस्कृति के DIV 2 पर ciliation का प्रतिशत. (A, B) प्रतिनिधि छवियाँ GCP प्राथमिक संस्कृति के DIV 2 पर ciliation के प्रतिशत को दर्शाती हैं। प्रतिनिधि छवियों में प्राथमिक सिलिया (हरे) को Pax6-expressing (लाल) GCP कोशिकाओं पर दर्शाया गया है DIV 2 पोस्ट इलेक्ट्रोपोरेशन (ए) डीएमएसओ और (बी) एसएजी के साथ 24 घंटे के उपचार के बाद। नाभिक को DAPI (नीले) के साथ लेबल किया गया था। प्राथमिक सिलियम (हरे) को सफेद एरोहेड्स द्वारा दर्शाया जाता है। स्केल बार = 20 μm. (C) ग्राफ 4 स्वतंत्र प्रयोगों के परिमाणीकरण डेटा को दर्शाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण, Unpaired छात्र का टी-टेस्ट। त्रुटि पट्टियाँ ±SEM को दर्शाती हैं। संक्षेप: GCP = ग्रेन्युल सेल अग्रदूत; Pax6 = युग्मित बॉक्स प्रोटीन -6; DIV = दिन इन विट्रो; DMSO = dimethyl sulfoxide; SAG = Smoothened एगोनिस्ट; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; n.s. = महत्वपूर्ण नहीं; SEM = माध्य की मानक त्रुटि; Arl13b = ADP राइबोसाइलेशन कारक की तरह प्रोटीन 13B. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: SAG उपचार पर Pax6-अभिव्यक्त GCP कोशिकाओं के प्राथमिक सिलियम पर Smo स्थानीयकरण में वृद्धि हुई है। (A) प्रतिनिधि छवियाँ DMSSO और SAG के साथ 24 घंटे के उपचार के बाद DIV 2 पोस्ट इलेक्ट्रोपोरेशन पर प्राथमिक सिलियम (लाल, सफेद वर्ग बॉक्स) पर Smo-EGFP स्थानीयकरण (हरे रंग) को दर्शाती हैं। नाभिक को DAPI (नीले) के साथ लेबल किया गया था। स्केल बार = 5 μm. (B) ग्राफ 4 स्वतंत्र प्रयोगों के परिमाणीकरण डेटा को दर्शाता है। सांख्यिकीय विश्लेषण, unpaired छात्र टी परीक्षण. पी ≤ 0.001. त्रुटि पट्टियाँ SEM ± दर्शाती हैं। DMSO समूह के लिए कुल n = 97, SAG समूह के लिए कुल n = 130 चित्रा 3B को 6 से संशोधित किया गया था। संक्षेप: GCP = ग्रेन्युल सेल अग्रदूत; Smo = Smoothened; Pax6 = युग्मित बॉक्स प्रोटीन -6; DIV = दिन इन विट्रो; DMSO = dimethyl sulfoxide; SAG = Smoothened एगोनिस्ट; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; SEM = माध्य की मानक त्रुटि; Arl13b = ADP राइबोसाइलेशन कारक की तरह प्रोटीन 13B. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पोरिंग पल्स सेटिंग पल्स सेटिंग स्थानांतरण
माउस प्राथमिक जीसीपी प्राथमिक न्यूरॉन्स माउस प्राथमिक जीसीपी प्राथमिक न्यूरॉन्स
वोल्टेज 275 वोल्ट 275 वोल्ट 20 वोल्ट 20 वोल्ट
लंबाई 1 ms 0.5 ms 50 ms 50 ms
अंतराल 50 ms 50 ms 50 ms 50 ms
नहीं। 2 2 5 5
D दर 10% 10% 40% 40%
विपरीतता + + ± ±

तालिका 1: माउस प्राथमिक जीसीपी और प्राथमिक न्यूरॉन्स के इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर सुपर इलेक्ट्रोपोरेटर NEPA21 TYPE II का उपयोग करते हैं। संक्षिप्त नाम: GCP = ग्रेन्युल सेल अग्रदूत।

विद्युत्-पोषण दक्षता Exp. 1 (n = 486) Exp. 2 (n = 1314) Exp. 3 (n = 704) Exp. 4 (n = 476) औसत
DMSO-उपचारित समूह 90.57% ± 10.12% 96.62% ± 3.09% 98.89% ± 0.97% 90.72% ± 11.31% 94.02% ± 1.36%
SAG-उपचारित समूह 91.8% ± 8.69% 79.97% ± 2.77% 89.35% ± 5.67% 88.59% ± 13.54% 87.42% ± 1.71%
औसत विद्युत् पोषण दक्षता 91.31% ± 7.99% 88.27% ± 10.81% 94.12% ± 6.36% 89.65% ± 11.21% 90.84% ± 0.84%

तालिका 2: सभी पैक्स 6-अभिव्यक्त जीसीपी कोशिकाओं में जीएफपी-पॉजिटिव कोशिकाओं के प्रतिशत के परिमाणीकरण द्वारा निर्धारित एसएमओ-ईजीएफपी वेक्टर की इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता। चार स्वतंत्र प्रयोगों (Exp.) के डेटा दिखाए गए हैं। (कुल n = 2980)। संक्षिप्त रूप: Smo = Smoothened; GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; GCP = ग्रेन्युल सेल अग्रदूत; Pax6 = युग्मित बॉक्स प्रोटीन -6।

Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 औसत
सिलिएशन दर - DMSO 18.88% ± 3.61% 19.58% ± 7.42% 1.48% ± 16.60% 14.35% ± 7.99% 0.59% ± 17.35%
सिलिअशन दर - SAG 13.93% ± 3.39% 17.30% ± 2.15% 22.19% ± 10.35% 19.56% ± 1.15% 18.24% ± 0.88%

तालिका 3: जीसीपी प्राथमिक संस्कृति के DIV 2 पर सिलिएशन का प्रतिशत। चार स्वतंत्र प्रयोगों (Exp.) के डेटा दिखाए गए हैं। (DMSO समूह के लिए कुल n = 1169, SAG समूह के लिए कुल n = 816)। संक्षेप: GCP = ग्रेन्युल सेल अग्रदूत; DIV = दिन इन विट्रो; DMSO = dimethyl sulfoxide; SAG = Smoothened एगोनिस्ट।

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Discussion

इलेक्ट्रोपोरेशन विधि द्वारा प्राथमिक जीसीपी संस्कृति में ट्रांसजीन का अभिकर्मक आमतौर पर कम सेल व्यवहार्यता और खराब अभिकर्मक दक्षता 9,10 से जुड़ा होता है। यह पेपर एक लागत प्रभावी और पुन: प्रस्तुत करने योग्य इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल का परिचय देता है जिसने उच्च दक्षता और व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, हम प्राथमिक जीसीपी कोशिकाओं में प्राथमिक सिलियम-निर्भर एचएच सिग्नलिंग मार्ग का अध्ययन करने की एक सीधी विधि भी प्रदर्शित करते हैं।

अन्य सामान्य इलेक्ट्रोपोरेशन विधियों को अक्सर महंगे सेल-प्रकार-विशिष्ट इलेक्ट्रोपोरेशन अभिकर्मकों की आवश्यकता होती है जिन्हें विशिष्ट निर्माताओं से खरीदा जाना चाहिए। यहां वर्णित विधि को अनुकूल माना जाता है क्योंकि यह विभिन्न सेल प्रकारों के लिए एक सामान्य और किफायती इलेक्ट्रोपोरेशन अभिकर्मक का उपयोग करता है। इसके अलावा, इन आंकड़ों से पता चला है कि इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता ~ 80-90% तक पहुंच गई है, जो अन्य इलेक्ट्रोपोरेशन और अभिकर्मक विधियों 9,10 की तुलना में अत्यधिक कुशल है।

उच्च सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए, कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें किसी को ध्यान में रखना चाहिए। सेरिबैलम विच्छेदन और पृथक्करण प्रक्रियाओं को 1-2 घंटे की कम से कम संभव समय खिड़की के भीतर पूरा किया जाना चाहिए। एक और महत्वपूर्ण कदम इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान दालों से पहले प्लास्मिड-सेल इलेक्ट्रोपोरेशन मिश्रण में बुलबुले के गठन से बचना है। दालों के बाद, prewarmed संस्कृति माध्यम तुरंत cuvettes में जोड़ा जाना चाहिए और कोशिकाओं के रूप में जल्दी के रूप में संभव के रूप में seeded. कोशिकाओं को पहले 3 घंटे के बाद सेल सीडिंग में अबाधित होना चाहिए। उपर्युक्त सावधानियां संस्कृति के दूसरे दिन लगभग 70-80% तक सेल व्यवहार्यता को बढ़ाएगी।

प्राथमिक संस्कृति मंच में प्राथमिक सिलियम का अध्ययन करने की एक उल्लेखनीय सीमा यह है कि सुसंस्कृत कोशिकाओं में सिलिएशन की दर आमतौर पर विवो में देखी गई तुलना में कम होती है। पिछले डेटा 6 से पता चला है कि E15.5 और P15 दोनों पर GCP पर सिलिअशन की इन विवो दर लगभग 60-80% थी। इसके विपरीत, प्राथमिक जीसीपी संस्कृति में सिलिएशन की इन विट्रो दर ~ 20% 6 थी। फिर भी, यह एक सामान्य घटना है जो इन विट्रो और विवो अध्ययनों के बीच सिलिएशन की दर की तुलना करते समय अधिकांश (यदि सभी नहीं) सेल प्रकारों में स्पष्ट है।

विशेष रूप से, यह विधि अन्य प्राथमिक संस्कृतियों जैसे तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं और कॉर्टिकल और हिप्पोकैम्पल न्यूरॉन संस्कृति पर भी लागू होती है, जो इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर को संशोधित करके प्राप्त करने योग्य है, यानी, पल्स वोल्टेज, लंबाई और दालों की संख्या को पोरिंग करना। अध्ययन के एक व्यापक क्षेत्र में इस प्रोटोकॉल के आवेदन का विस्तार करने के लिए, प्राथमिक न्यूरॉन्स के लिए अनुशंसित इलेक्ट्रोपोरेशन पैरामीटर तालिका 1 में प्रदान किए गए हैं। इसके अलावा, सार्वभौमिक इलेक्ट्रोपोरेशन अभिकर्मक, यानी, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले ऑप्टी-एमईएम भी अन्य इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल की तुलना में अतिरिक्त थकाऊ अनुकूलन प्रयास से बचने में मदद करता है, जिन्हें अभिकर्मक संगतता के संबंध में अनुकूलन की आवश्यकता होती है। प्राथमिक जीसीपी संस्कृतियों में प्राथमिक सिलियम और एचएच सिग्नलिंग की जांच के लिए इस अनुकूलित, लागत प्रभावी इलेक्ट्रोपोरेशन प्रोटोकॉल का उपयोग प्राथमिक संस्कृतियों का उपयोग करके अन्य प्राथमिक सिलियम से संबंधित अध्ययनों के लिए संदर्भ प्रक्रिया के रूप में किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन को एचकेबीयू बीज निधि और टियर -2 स्टार्ट-अप अनुदान (आरजी-एसजीटी 2 / 18-19 / एससीआई / 009), अनुसंधान अनुदान परिषद-सहयोगी अनुसंधान कोष (सीआरएफ-सी 2103-20जीएफ) द्वारा सीएचएच होर को समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GCP Culture
B27 supplement Life Technologies LTD 17504044
Cell strainer, 70 µm Corning 352350
DNase I from bovine pancreas Roche 11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution Gibco, Life Technologies 14155063
FBS, qualified Thermo Scientific SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x Gibco, Life Technologies 35050061 L-glutamine substitute
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
Matrigel BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix
Neurobasal Gibco, Life Technologies 21103049
Papain,suspension Worthington Biochemical Corporation LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma Aldrich P6407
SAG Cayman Chemical 11914-1 Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab Rockland 600-101-215 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab NeuroMab 75-287 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab Covance PRB-278P Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG Invitrogen A-11055 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A-31570 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A-31573 Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI Thermo Scientific 62247 Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber Nepagene CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) Nepagene EC-002
Opti-MEM Life Technologies LTD 31985070 reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo Addgene 25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation Nepagene NEPA21 electroporator

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References

  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
  3. Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
  4. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
  5. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
  6. Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
  7. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
  8. Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
  9. Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
  10. Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
  11. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
  12. Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
  13. Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York, NY. 235-247 (2014).
  14. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).

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