Waiting
登录处理中...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Эффективный и экономичный метод электропорации для изучения первичных реснично-зависимых сигнальных путей в предшественнике гранулярной клетки

Published: November 30, 2021 doi: 10.3791/63283
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry, Faculty of Science, Hong Kong Baptist University

Summary

Здесь мы представляем воспроизводимый протокол электропорации in vitro для генетических манипуляций с первичными предшественниками клеток гранул мозжечка (GCP), который является экономически эффективным, эффективным и жизнеспособным. Кроме того, этот протокол также демонстрирует простой метод молекулярного исследования первичных реснечно-зависимых сигнальных путей Hedgehog в первичных клетках GCP.

Abstract

Первичная ресничка является критической сигнальной органеллой, обнаруженной почти на каждой клетке, которая преобразует сигнальные стимулы Hedgehog (Hh) с поверхности клетки. В предшественнике гранулярной клетки (GCP) первичная ресничка действует как ключевой сигнальный центр, который организует пролиферацию клеток-предшественников, модулируя сигнальный путь Hh. Исследование первичного ресничково-зависимого сигнального механизма Hh облегчается генетическими манипуляциями in vitro с компонентами пути для визуализации их динамической локализации в первичной ресничке. Однако трансфекция трансгенов в первичных культурах ГКП с использованием известных в настоящее время методов электропорации, как правило, является дорогостоящей и часто приводит к низкой жизнеспособности клеток и нежелательной эффективности трансфекции. В этой статье представлен эффективный, экономичный и простой протокол электропорации, который демонстрирует высокую эффективность трансфекции ~ 80-90% и оптимальную жизнеспособность ячейки. Это простой, воспроизводимый и эффективный метод генетической модификации, который применим к изучению первичного ресничковозависимого сигнального пути ежа в первичных культурах GCP.

Introduction

Мозжечковые GCP широко используются для изучения механизма сигнального пути Hh в нейронных типах клеток-предшественников из-за их высокой распространенности и высокой чувствительности к сигнальному пути Hh in vivo1,2,3,4. В GCP первичная ресничка действует как ключевой сигнальный узел трансдукции Hh5, который управляет пролиферацией клеток-предшественников6,7,8. Визуализация in vitro сигнальных компонентов Hh на первичной ресничке часто является сложной задачей из-за их низких эндогенных базальных уровней. Следовательно, трансгенная модификация уровней экспрессии белка и флуорофорная маркировка интересующего гена являются полезными подходами к изучению пути с молекулярным разрешением. Однако генетическое манипулирование первичными культурами GCP с использованием подходов к трансфекции на основе липосом часто приводит к низкой эффективности трансфекции, препятствуя дальнейшим молекулярным исследованиям9. Электропорация повышает эффективность, но обычно требует непомерных электропорационных реагентов, специфичных для конкретного производителя и ограниченных по типу ячейки10.

В данной работе представлен высокоэффективный и экономически эффективный метод электропорации для манипулирования компонентами сигнального пути Hh в первичных культурах GCP. Используя этот модифицированный протокол электропорации, зеленый флуоресцентный белок (GFP), помеченный сглаженным трансгеном (pEGFP-Smo), был эффективно доставлен в GCP и достиг высокой выживаемости клеток и скорости трансфекции (80-90%). Кроме того, как свидетельствует иммуноцитохимическое окрашивание, трансфектированные GCP показали высокую чувствительность к сглаженной агонист-индуцированной активации сигнального пути Hh путем транспортировки EGFP-Smo в первичные реснички. Этот протокол должен быть непосредственно применим и полезен для экспериментов, которые включают генетическую модификацию in vitro типов клеток, которые трудно трансфектировать, таких как культуры первичных клеток человека и грызунов, а также индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были выполнены в соответствии с руководящими принципами обращения с животными и протоколом, утвержденным Департаментом здравоохранения Гонконга. Лицензии на эксперименты на животных в соответствии с Постановлением о контроле за экспериментами на животных (глава 340) были получены от Министерства здравоохранения правительства Гонконга. Работа с животными проводилась в соответствии с этикой безопасности животных, утвержденной Исследовательским офисом HKBU и Комитетом по безопасности лабораторий. Обратитесь к Таблице материалов для получения подробной информации обо всех материалах, используемых в этом протоколе.

1. Предэкспериментная подготовка

  1. Подготовка питательных сред и буферов
    1. Среда без сыворотки (SFM)
      1. Для получения 50 мл SFM добавляют 500 мкл 100x L-заменителя глутамина, 500 мкл пенициллина-стрептомицина, 1 мМ пирувата натрия и 12,5 мкл 1 M KCl (конечные 250 мкМ) до 49 мл нейробазальной среды.
      2. Разделите SFM на 2 аликвоты по 10 мл и 40 мл в конических трубках по 50 мл и храните их при 4 °C в течение одного месяца.
    2. Среда, блокирующая пищеварение: 10% FBS в SFM
      1. Добавьте 1,1 мл термоинактивированного FBS к 10 мл аликвоты SFM для приготовления среды, блокирующей пищеварение.
    3. Культуральная среда GCP: SFM с B27
      1. Чтобы приготовить культуральную среду GCP, добавьте 800 мкл добавки B-27 без сыворотки к 40 мл аликвоты SFM.
        ПРИМЕЧАНИЕ: SFM, дополненный B-27, можно хранить при температуре 4 °C в течение одного месяца. Однако свежеприготовленные носители дают оптимальные результаты.
    4. Буфер рассечения: EBSS с глюкозой + HEPES
      1. Добавьте 6 г / л глюкозы в сбалансированный солевой раствор Эрла (EBSS), содержащий 10 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновая кислота).
      2. Стерилизуют раствор, проходя через шприцевой фильтр 0,2 мкм, и хранят при 4 °C для длительного хранения.
    5. Буфер пищеварения
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте заново перед использованием.
      1. Приготовьте 2 мл буфера пищеварения для переваривания 2-4 мозжечковых тканей и 4 мл на 4-10 тканей. Для приготовления 4 мл буфера пищеварения растворяют 1,5 мг L-цистеина (конечная концентрация 200-400 мкг/мл) в 4 мл ЭБСС. Переверните трубку несколько раз, пока порошок полностью не растворится.
      2. Стерилизуют раствор с помощью шприцевого фильтра 0,2 мкм и шприца 5 мл и переложат раствор в стерильную чашку для культивирования клеток 35 мм.
      3. Добавьте 4 мкл папаина (разбавление 1:1000 из исходной концентрации 20 единиц/мг) и 40 мкл ДНКазы I (разведение 1:100 из запаса 10 мг/мл для конечной концентрации 0,1 мг/мл).
      4. Инкубируют раствор при 37°С в CO2-инкубаторе в течение не менее 30 мин или до использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение для активации папаина. Для достижения оптимальных результатов не превышайте 45 мин при 37 °C перед использованием. Убедитесь, что раствор становится прозрачным и перед использованием нет белых осадков.
  2. Обшивки предварительного покрытия
    1. Чтобы подготовить крышки для прикрепления клеток, инкубируют автоклавные стеклянные крышки 12 мм со 100 мкг/мл поли-D-лизина (PDL, 1 мг/мл в стерильном dH2O) в течение не менее 1 ч при 37 °C. Храните крышки в том же растворе PDL при температуре 4 °C до использования.
    2. В день первичной культуры клеток соберите PDL в чистую коническую трубку и трижды промойте крышки стерильным dH2O, чтобы удалить остаточный PDL.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PDL можно хранить при температуре 4 °C для повторного использования.
    3. Переложите стеклянные крышки с покрытием PDL на пластину с 24 лунками, поместив по одному крышке в каждую скважину.
    4. Удалите лишнюю воду и добавьте 200-300 мкл Матригеля (восстановленного в соответствии с инструкциями в техническом описании продукта в бессывороточном DMEM-F12), чтобы полностью покрыть крышки.
    5. Инкубируйте крышки в Matrigel в течение 1 ч при 37 °C в CO2-инкубаторе .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите Матригель перед посевом клеток. Этот Matrigel можно собирать и хранить при температуре 4 °C для многократного повторного использования.
  3. Приготовление блюда для предварительной обработки культуры
    1. Покройте чашку для культивирования клеток 60 мм 2 мл 100 мкг/мл PDL (восстановите 1 мг/мл раствора PDL в стерильном dH2O) путем инкубации при 37 °C в течение 1 ч.
    2. Непосредственно перед посевом клеток удалите и соберите использованный PDL в чистую коническую трубку и храните его при 4 °C для многократного повторного использования. Промыть и вымыть посуду, покрытую PDL, три раза стерильным dH2O. Перед посевом клеток высушите на воздухе.
    3. Используйте одну чашку для культивирования клеток толщиной 60 мм, чтобы посеять клетки, собранные максимум из 2 тканей цельного мозжечка.
    4. Приготовьте дополнительные культуральные блюда для дополнительных мозжечков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. этапы 2.1.18 и 2.1.19 для использования формы для предварительной обработки культуры.

2. Экспериментальный день 0

  1. Выделение и культивирование первичных GCP мышей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Метод языка и региональных параметров GCP был модифицирован по сравнению со стандартным протоколом, а краткий протокол был кратко описан в нашей предыдущей работе.6,11,12. Для оптимального выхода GCP используйте послеродовых (P) щенков 6-го или P7-го дня для выделения GCP. Выполните следующие этапы рассечения 2.1.6-2.1.10 как можно быстрее для оптимальной жизнеспособности клеток.
    1. Предваренный SFM, среда, блокирующая пищеварение, культуральная среда и Opti-MEM при 37 °C во время рассечения.
    2. На чистом стенде предварительно замочите весь рассеченный аппарат в 70% этаноле для дезинфекции.
    3. Наполните тарелку для культивирования клеток 60 мм 2-3 мл буфера для рассечения и охладите ее на льду.
    4. Подготовьте свежий буфер для пищеварения, как описано в разделе 1.1.5, и держите его в тепле при 37 °C.
    5. Используйте 70% этанол, чтобы протереть голову щенка для дезинфекции.
    6. Обезглавить щенка без анестезии. Используйте щипцы, чтобы держать голову и стерилизованные хирургические ножницы, чтобы вырезать из задней части черепа, чтобы обезглавить щенка. Осторожно удалите кожу и череп, чтобы раскрыть мозг с помощью щипцов.
    7. Используйте щипцы, чтобы отщипнуть мозжечок и быстро замочить его в предварительно охлажденном буфере рассечения, подготовленном на этапе 2.1.3.
    8. Удалите мозговые оболочки мозжечком, погруженным в буфер рассечения под рассекающим микроскопом. Обогащенные кровеносными сосудами мозговые оболочки должны казаться розоватыми под рассекающим микроскопом.
    9. Удалите все мозговые оболочки с помощью щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мозжечок без мозговых оболочек должен иметь беловатый вид.
    10. Удалите все видимые ткани среднего мозга и сосудистое сплетение из мозжечка.
    11. Переложите мозжечок в 35 мм культуральную чашку, предварительно заполненную теплым буфером пищеварения, приготовленным на этапе 2.1.4. Избегайте переноса избыточного буфера рассечения. Разрежьте мозжечок на мелкие кусочки с помощью ножниц с микропрыжкой как можно быстрее.
    12. Немедленно высиживать измельченный мозжечок при 37 °C в течение 15 мин в CO2-инкубаторе . Продлите время инкубации до 20 мин, если необходимо обработать более 4 мозжечков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После инкубации ткань будет слипаться вместе.
    13. Немедленно перенесите переваренную ткань на дно новой стерильной центрифужной трубки объемом 15 мл с помощью наконечника пипетки P1000 с блокирующей средой для пищеварения (избегайте переноса буфера пищеварения).
    14. Добавьте соответствующий объем блокирующей среды пищеварения (1 мл на 1 мозжечок), чтобы прекратить пищеварение и пипетку вверх и вниз осторожно 30 раз, используя микропипетку P1000 для дальнейшего диссоциации ткани на одноклеточную суспензию. Избегайте образования пузырьков воздуха.
    15. Осторожно пропустите клеточную суспензию через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм в новую стерильную центрифужную трубку, чтобы удалить клеточные сгустки.
    16. Пропустите дополнительно 1 мл свежей блокирующей среды пищеварения через клеточный ситечко для сбора остаточных клеток из клеточного ситечка.
    17. Центрифугируют фильтрат при 200 × г в течение 5 мин при комнатной температуре (РТ). Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу с 1 мл SFM. Повторите этот шаг дважды. Избегайте образования пузырьков воздуха.
    18. Повторно суспендируют гранулу в конечном объеме 2 мл питательной среды GCP и переложат клеточную суспензию в покрытую PDL 60 мм форму для предварительного покрытия, приготовленную на стадии 1.3. Инкубировать в течение 15 мин при 37 °C в CO2-инкубаторе .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте 20 мин.
    19. После инкубации постучите по чашке для культивирования сбоку, чтобы выбить слабо прилипшие клетки GCP. Соберите адгезивные клетки GCP в культуральную среду путем щадящей пипетки с использованием пипетки P1000. Соберите эту суспензию GCP в новую центрифужную трубку объемом 15 мл. Отбросьте тарелку толщиной 60 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сильно адгезионные клетки астроглии и фибробластов останутся прикрепленными на дне тарелки толщиной 60 мм и будут разделены на этом этапе. Пропуск этого шага поставит под угрозу чистоту культуры GCP.
    20. Подсчитайте ячейки и немедленно приступайте к электропорации.
  2. День in vitro (DIV) 0: Электропорация для гиперэкспрессии трансгена Hh рецептора: pEGFP-Smo
    1. Для электропорации с использованием кюветы с зазором 2 мм готовят следующую плазмидно-клеточную электропорационную смесь для каждой реакции электропорации: 1,2 × 106 клеток и 10 мкг pEGFP-mSmo (отрегулируйте концентрацию запаса ДНК до ~2-5 мкг/мкл в буфере Tris-EDTA или стерильном dH2O) в 100 мкл Opti-MEM.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшите общее количество ячеек, если ячеек недостаточно (хотя это может снизить эффективность электропорации). Однако не корректируйте количество плазмиды или общий объем Opti-MEM, используемого на кювету. Если общее количество ячеек, необходимое для эксперимента, превышает 1,5 × 106 ячеек, соответственно увеличьте электропорационную смесь и выполните несколько реакций электропорации отдельно. Кювету можно повторно использовать до 5 раз.
    2. Подготовьте пластину для посева клеток после электропорации, добавив 0,5 мл питательной среды в каждую лунку 24-луночной культуральной пластины, содержащей покрытые крышками (со стадии 1.2), и держите ее в тепле при 37 °C в инкубаторе CO2 .
    3. Начиная со стадии 2.1.20, пипетка необходимого количества клеток в стерильную микроцентрифужную трубку 1,5 мл и вращение при 200 × г в течение 5 мин при РТ. Выбросьте надосадочный и повторно суспендируйте ячейку гранулы в 200 мкл Opti-MEM. Повторите этот шаг дважды с Opti-MEM, чтобы убедиться, что в пробирке нет остаточной питательной среды.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На каждую лунку/крышку 24-луночной пластины, электропората и семенного 1,2-1,3 × 106 клеток/лунок для получения ~70-75% клеточной стючки на следующий день посева.
    4. Задайте параметры электропорации, как показано в таблице 1.
    5. Пипетку электропорационной реакции осторожно перемешать хорошо и использовать длинный наконечник Р200 для переноса точного объема 100 мкл смеси в 2 мм зазор кюветы. Избегайте образования пузырьков.
    6. Поместите кювету в камеру кюветы.
    7. Нажмите кнопку Ω электропоратора (см. Таблицу материалов) и запишите значение импеданса, которое должно быть ~30-35. Чтобы убедиться, что значение электрического импеданса Ω находится в пределах 30-35, придерживайтесь точного объема 100 мкл.
    8. Нажмите кнопку запуска , чтобы запустить импульс.
    9. Запишите значения измеренного тока и джоулей, отображаемые на кадре считывания.
    10. Извлеките кювету из камеры кюветы.
    11. Немедленно добавьте в кювету 100 мкл предварительной питательной среды и повторно суспендируйте ее путем мягкой пипетки вверх и вниз 2-3 раза. Немедленно перенесите клеточную суспензию на 24-луночную пластину, подготовленную на этапе 2.2.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму гибель клеток, засейте клетки сразу после электропорации.
    12. Инкубируйте клетки при 37 °C в CO2-инкубаторе . Оставьте клетки нетронутыми в течение 3 ч, чтобы избежать отслоения клеток.
    13. Через 3 часа после посева аккуратно аспирировать и выбросить половину надосадочной среды, чтобы удалить плавающие мертвые клетки и мусор и заменить таким же количеством предварительно расплавленной питательной среды.
    14. Инкубируйте клетки при 37 °C в CO2-инкубаторе и пополняйте половину среды через день.
    15. Наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом на следующий день, т.е. DIV1 (рисунок 1) для сигнала GFP для определения эффективности сверхэкспрессии Smo.
    16. Для стимуляции сигнального пути Hh на DIV 1 после пополнения половины среды добавьте 0,2 мкМ сглаженного агониста (SAG) к клеткам, добавив равный объем DMSO в контроль. Инкубировать в течение 24 ч до фиксации клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите добавленный объем DMSO/SAG как можно ниже. Здесь на 500 мкл среды на скважину добавляли 0,5 мКЛ ДМСО или 0,5 мкл 0,2 мМ SAG, что представляет собой коэффициент разрежения 1:1000.

3. DIV 2: Визуализация первичных ресничек и исследование сигнального пути Hh

  1. Фиксация клеток
    1. Через 24 ч после обработки удалите культуральную среду и промывайте клетки 2-3 раза фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) с использованием одноразовой пипетки Пастера, избегая смещения клеток.
    2. Зафиксируйте клетки, добавив ~400 мкл 4% параформальдегида (приготовленного в PBS) и инкубируйте на RT в течение 10 мин.
    3. Промыть и вымыть 2-3 раза ПБС с помощью одноразовой пипетки Пастера.
    4. Хранить в PBS при температуре 4 °C до 2 месяцев или перейти к иммуноокрашиванию.
  2. Иммуноцитохимическое окрашивание GCP и первичного маркера реснички
    1. В 24-луночной пластине дважды промывайте клетки в PBS с легким встряхиванием в течение 5 минут каждый раз.
    2. Добавьте в клетку 0,5 мл хлорида аммония 100 мМ и инкубируйте на RT в течение 10 мин для гашения фиксатора.
    3. Промыть один раз и промыть 2-3 раза ПБС с нежным встряхиванием в течение 10 мин каждый раз.
    4. Аккуратно пипетку 30 мкл блокирующего буфера (BB: 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 2% термоинактивированной конской сыворотки в PBS) на кусок парапленки с образованием капли без пузырьков воздуха.
    5. Аккуратно перенесите крышку из колодца на капельку BB с клеточной стороной, обращенной вниз. Инкубируют клетки с ВВ во влажной камере в течение 1 ч при РТ.
    6. Готовят первичную смесь антител в ВВ, как показано в Таблице материалов. Чтобы исследовать клетки с первичным антителом, повторите шаги 3.2.4 и 3.2.5, заменив BB первичной смесью антител. Инкубируют клетки с первичным антителом в течение 2 ч при РТ.
    7. Используя щипцы, перенесите крышки обратно на 24-луночную пластину с засеянной клетками стороной, обращенной вверх. Промыть клетки один раз и промыть 3-4 раза в PBS с легким встряхиванием в течение 10 мин каждый раз.
    8. Готовят смесь вторичных антител в ВВ, как показано в Таблице материалов. Чтобы инкубировать клетки с вторичным антителом, повторите шаги 3.2.4 и 3.2.5, заменив BB смесью вторичных антител. Инкубировать в темноте в течение 1 ч при РТ.
    9. Повторите этап 3.2.7 для послевториальной инкубационной промывки антител.
    10. Установите крышку на чистую микроскопическую стеклянную горку с помощью монтажного носителя.
    11. Высушите горку в темноте на ночь и приступайте к конфокальной визуализации13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя Opti-MEM (см. Таблицу материалов) в качестве универсального реагента, эта предлагаемая методология электропорации может достичь стабильно высокой эффективности электропорации при ~80-90% (рисунок 1). Эффективность электропорации вектора Smo-EGFP определяли при DIV 2 после электропорации путем количественной оценки процента зеленых флуоресцентно-положительных клеток во всех парных бокс-белках-6 (Pax6)-экспрессирующих GCP-клетках. Эффективность электропорации групп, обработанных ДМСО и SAG, оказалась сопоставимой (рис. 1 и табл. 2).

Кроме того, иммуноокрашивание первичного маркера ресничек, Arl13b, показывает, что скорость цилиации GCP при DIV 2 культуры составляла ~18% как в группах, обработанных транспортным средством, так и в группе, получавшей SAG (DMSO: 17,35% ± 0,59%; SAG: 18,24% ± 0,88%). Скорость циляции проиллюстрирована как процент Pax6-экспрессирующих GCP, несущих первичную ресничку (Arl13b-положительную) на поверхности клетки при DIV 2 после электропорации (рисунок 2 и таблица 3).

Чтобы расшифровать первичный реснечно-зависимый сигнальный путь Hh, агонист Smo, SAG, был использован для активации сигнального пути Hh. При активации пути Hh рецептор Smo обогащается на аксонеме первичной реснички14. Наши результаты показывают значительное увеличение локализации Smo-EGFP на первичной аксонеме реснички Pax6-экспрессирующих клеток GCP через 24 ч после лечения SAG (рисунок 3, количественные данные, модифицированные из предыдущей работы6), что указывает на глубокую активацию первичного ресничкового сигнального пути Hh.

Figure 1
Рисунок 1: Электропорационная установка и эффективность электропорации ГКП. (A) Электропорационная установка. Справа черный наконечник стрелки обозначает электропорационную кювету. (В, С) Репрезентативные изображения показывают эффективность электропорации вектора Smo-EGFP, определяемую количественной оценкой процента GFP-положительных клеток во всех Pax6-экспрессирующих GCP-клетках (таблица 2). Репрезентативные изображения изображают зеленые флуоресцентные сигналы на Pax6-экспрессирующих (фиолетовых) клетках GCP на DIV 2 после электропорации после 24-часовой обработки (B) DMSO и (C) SAG. Ядра были помечены DAPI (синим цветом). Шкала стержней = 20 мкм. Сокращения: ГКП = предшественники гранулированных клеток; GFP = зеленый флуоресцентный белок; Pax6 = парный коробчатый белок-6; DIV = день in vitro; ДМСО = диметилсульфоксид; SAG = Сглаженный агонист; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Процент реснитизации на DIV 2 первичной культуры GCP. (A, B) Репрезентативные изображения изображают процент реснитизации на DIV 2 первичной культуры GCP. Репрезентативные изображения изображают первичные реснички (зеленый) на Pax6-экспрессирующих (красных) клетках GCP на DIV 2 после электропорации после 24-часовой обработки (A) DMSO и (B) SAG. Ядра были помечены DAPI (синим цветом). Первичная ресничка (зеленая) обозначается белыми наконечниками стрел. Шкала баров = 20 мкм. (C) График иллюстрирует количественные данные 4 независимых экспериментов. Статистический анализ, T-тест непарного студента. На панелях ошибок изображен ±SEM. Сокращения: GCP = предшественник гранулированной клетки; Pax6 = парный коробчатый белок-6; DIV = день in vitro; ДМСО = диметилсульфоксид; SAG = Сглаженный агонист; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; n.s. = Незначимо; SEM = стандартная погрешность среднего значения; Arl13b = ADP рибозилирующий фактор-подобный белок 13B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Повышенная локализация Smo на первичной ресничке Pax6-экспрессирующих клеток GCP при лечении SAG. (A) Репрезентативные изображения изображают локализацию Smo-EGFP (зеленый) на первичной ресничке (красная, белая квадратная коробка) на Pax6-экспрессирующих (фиолетовых) клетках GCP при DIV 2 после электропорации после 24-часовой обработки DMSO и SAG. Ядра были помечены DAPI (синим цветом). Шкала баров = 5 мкм. (B) График иллюстрирует количественные данные 4 независимых экспериментов. Статистический анализ, непарный студенческий t-тест. P ≤ 0,001. Полосы ошибок отображают ± SEM. Общее n для группы DMSO = 97, общее n для группы SAG = 130. Рисунок 3B был изменен с 6. Сокращения: GCP = предшественник гранулярной клетки; Smo = Сглаженный; Pax6 = парный коробчатый белок-6; DIV = день in vitro; ДМСО = диметилсульфоксид; SAG = Сглаженный агонист; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; SEM = стандартная погрешность среднего значения; Arl13b = ADP рибозилирующий фактор-подобный белок 13B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Настройка импульса порирования Настройка импульса передачи
Основные GCP мыши Первичные нейроны Основные GCP мыши Первичные нейроны
Напряжение 275 В 275 В 20 В 20 В
Длина 1 мс 0,5 мс 50 мс 50 мс
Интервал 50 мс 50 мс 50 мс 50 мс
Лол 2 2 5 5
D ставка 10% 10% 40% 40%
Полярность + + ± ±

Таблица 1: Параметры электропорации первичных GCP мыши и первичных нейронов с использованием суперэлектропоратора NEPA21 TYPE II. Аббревиатура: GCP = предшественник гранулярной клетки.

Эффективность электропорации Exp. 1 (n = 486) Exp. 2 (n = 1314) Exp. 3 (n = 704) Exp. 4 (n = 476) Средний
Группа, получающая ДМСО 90.57% ± 10.12% 96.62% ± 3.09% 98.89% ± 0.97% 90.72% ± 11.31% 94.02% ± 1.36%
Группа, получающая SAG 91,8% ± 8,69% 79.97% ± 2.77% 89,35% ± 5,67% 88.59% ± 13.54% 87,42% ± 1,71%
Средняя эффективность электропорации 91.31% ± 7.99% 88.27% ± 10.81% 94,12% ± 6,36% 89.65% ± 11.21% 90,84% ± 0,84%

Таблица 2: Электропорационная эффективность вектора Smo-EGFP определяется количественной оценкой процента GFP-положительных клеток во всех Pax6-экспрессирующих GCP-клетках. Показаны данные четырех независимых экспериментов (Exp.). (Всего n = 2980). Сокращения: Смо = Сглаженный; GFP = зеленый флуоресцентный белок; GCP = предшественник гранулированных клеток; Pax6 = парный коробчатый белок-6.

Exp. 1 Exp. 2 Exp. 3 Exp. 4 средний
Норма силировки - ДМСО 18,88% ± 3,61% 19,58% ± 7,42% 16.60% ± 1.48% 14.35% ± 7.99% 17.35% ± 0.59%
Норма силировки - SAG 13.93% ± 3.39% 17.30% ± 2.15% 22.19% ± 10.35% 19.56% ± 1.15% 18.24% ± 0.88%

Таблица 3: Процент цилиации на DIV 2 первичной культуры GCP. Показаны данные четырех независимых экспериментов (Exp.). (Всего n для группы DMSO = 1169, Total n для группы SAG = 816). Сокращения: GCP = предшественник гранулярной клетки; DIV = день in vitro; ДМСО = диметилсульфоксид; SAG = Сглаженный агонист.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Трансфекция трансгенов в первичной культуре GCP методом электропорации обычно связана с низкой жизнеспособностью клеток и плохой эффективностью трансфекции9,10. В настоящем документе представлен экономически эффективный и воспроизводимый протокол электропорации, который продемонстрировал высокую эффективность и жизнеспособность. Кроме того, мы также демонстрируем простой метод изучения первичного ресничковозависимого сигнального пути Hh в первичных клетках GCP.

Другие распространенные методы электропорации часто требуют дорогостоящих электропорационных реагентов для конкретных элементов, которые необходимо приобрести у конкретных производителей. Метод, описанный здесь, считается благоприятным, поскольку он использует общий и экономичный электропорационный реагент для различных типов клеток. Более того, эти данные показали, что эффективность электропорации достигала ~80-90%, что является высокоэффективным по сравнению с другими методами электропорации и трансфекции9,10.

Чтобы поддерживать более высокую жизнеспособность клеток, есть несколько критических шагов, которые следует принять во внимание. Процедуры рассечения и диссоциации мозжечка должны быть завершены в кратчайшие сроки в 1-2 ч. Другим важным шагом является предотвращение образования пузырьков в электропорационной смеси плазмидных ячеек перед импульсами во время электропорации. После зернобобовых в кюветы следует сразу же добавить предварительно приготовленную питательную среду и как можно быстрее засеять клетки. Клетки должны быть нетронутыми в течение первых 3 ч после посева клеток. Вышеупомянутые меры предосторожности повысят жизнеспособность клеток примерно до 70-80% на второй день культивирования.

Одним из заметных ограничений изучения первичной реснички в платформе первичной культуры является то, что скорость реснитчатки в культивируемых клетках, как правило, ниже, чем наблюдаемая in vivo. Предыдущие данные 6 показали, что скорость милиции in vivo на GCP как при E15,5, так и при P15 составляла примерно 60-80%. Напротив, скорость цилиации in vitro в первичной культуре GCP составляла ~ 20%6. Тем не менее, это общее явление, которое различимо в большинстве (если не во всех) типах клеток при сравнении скорости цилиации между исследованиями in vitro и in vivo .

Примечательно, что этот метод также применим к другим первичным культурам, таким как нейронные клетки-предшественники и культура корковых и гиппокампальных нейронов, что достижимо путем изменения параметра электропорации, то есть напряжения порпинга импульса, длины и количества импульсов. Чтобы распространить применение этого протокола на более широкую область исследований, рекомендуемые параметры электропорации для первичных нейронов приведены в таблице 1. Кроме того, универсальный электропорационный реагент, т.е. Opti-MEM, используемый в этом протоколе, также помогает избежать дополнительных утомительных усилий по оптимизации по сравнению с другими протоколами электропорации, которые требуют оптимизации в отношении совместимости реагентов. Этот оптимизированный, экономически эффективный протокол электропорации для исследования первичной реснички и передачи сигналов Hh в первичных культурах GCP может быть использован в качестве эталонной процедуры для других исследований, связанных с первичной ресничкой, с использованием первичных культур.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано Посевным фондом HKBU и грантом tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Советом по исследовательским грантам-Фондом совместных исследований (CRF-C2103-20GF) для C.H.H. Hor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GCP Culture
B27 supplement Life Technologies LTD 17504044
Cell strainer, 70 µm Corning 352350
DNase I from bovine pancreas Roche 11284932001
Earle’s Balanced Salt Solution Gibco, Life Technologies 14155063
FBS, qualified Thermo Scientific SH30028.02
GlutamMAXTM-I ,100x Gibco, Life Technologies 35050061 L-glutamine substitute
L-cysteine Sigma Aldrich C7352
Matrigel BD Biosciences 354277 Basement membrane matrix
Neurobasal Gibco, Life Technologies 21103049
Papain,suspension Worthington Biochemical Corporation LS003126
Poly-D-lysine Hydrobromide Sigma Aldrich P6407
SAG Cayman Chemical 11914-1 Smoothened agonist
IF staining
Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A7906
Paraformaldehyde Sigma Aldrich P6148
Triton X-100 Sigma Aldrich X100
Primary antibody mix
Anti-GFP-goat ab Rockland 600-101-215 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Arl13b mouse monoclonal ab NeuroMab 75-287 Dilution Factor: 1 : 1000
Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab Covance PRB-278P Dilution Factor: 1 : 1000
Secondary antibody mix
Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG Invitrogen A-11055 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG Invitrogen A-31570 Dilution Factor: 1 : 1000
Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG Invitrogen A-31573 Dilution Factor: 1 : 1000
DAPI Thermo Scientific 62247 Dilution Factor: 1 : 1000
Electroporation
CU 500 cuvette chamber Nepagene CU500
EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) Nepagene EC-002
Opti-MEM Life Technologies LTD 31985070 reduced-serum medium for transfection
pEGFP-mSmo Addgene 25395
Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation Nepagene NEPA21 electroporator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
  2. Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
  3. Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
  4. Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
  5. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
  6. Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
  7. Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
  8. Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
  9. Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
  10. Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
  11. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
  12. Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
  13. Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York, NY. 235-247 (2014).
  14. Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).

Tags

Неврология Выпуск 177 Первичные реснички предшественник мозжечковых гранул электропорация in vitro сигнальный путь ежа первичная культура GCP Сглаженная
Эффективный и экономичный метод электропорации для изучения первичных реснично-зависимых сигнальных путей в предшественнике гранулярной клетки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C.… More

Lo, J. C. W., Wong, W. L., Hor, C. H. H. Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor. J. Vis. Exp. (177), e63283, doi:10.3791/63283 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter