原发性恶性胸膜间皮瘤肿瘤细胞系的建立与扩增

摘要

本方法论文的目的是展示一种稳健且可重复的方法，用于从手术切除的胸膜间皮瘤组织中富集、生成并扩增原代肿瘤细胞系。

摘要

目前尚缺乏从罕见肿瘤类型中扩增原代肿瘤细胞系的有效方法。本实验方案介绍了一种从手术切除的恶性胸膜间皮瘤（MPM）组织中扩增原代肿瘤细胞的方法，全面概述了从组织消化、富集、扩增、冻存到表型鉴定的全过程。此外，本方案还引入了一些可能适用于多种肿瘤类型的肿瘤细胞培养概念，例如差异胰蛋白酶消化法，以及解离方法对细胞表面标志物检测在表型鉴定中影响的分析。本研究的主要局限性在于所筛选的肿瘤细胞仅能在二维（2D）培养系统中扩增。对该方案的若干改进，包括采用三维（3D）培养系统、添加培养基补充物、使用包被培养板以增强细胞贴附性，以及采用其他组织解离方法，可能有助于优化该技术并提高建立肿瘤细胞系的整体成功率。总体而言，本方案为从此类罕见肿瘤中建立和鉴定肿瘤细胞提供了一种基础性方法。

引言

恶性胸膜间皮瘤（MPM）是一种与石棉暴露高度相关的罕见肿瘤。尽管基于免疫治疗的方法已显示出令人鼓舞的效果，但对于罹患此疾病的患者而言，目前可用的治疗选择仍然有限，总体5年生存率较低^1,2。目前多个研究机构正在努力深入理解该疾病，并识别可能改善患者预后的新型治疗靶点。尽管已有多种间皮瘤小鼠模型，但获取原代间皮瘤肿瘤细胞的途径仍较为有限³。体外扩增原代间皮瘤肿瘤细胞将提供一个有价值的模型系统，可用于直接研究肿瘤细胞及其与自体免疫细胞（如肿瘤浸润性淋巴细胞）之间的相互作用。虽然已有少数关于原代间皮瘤肿瘤细胞系扩增的报道，但数量稀少且未提供详细的标准操作流程（SOP）。此外，来自美国典型培养物保藏中心（ATCC）等商业来源的细胞系也较少。尽管原代肿瘤细胞系的可及性有限，已有研究表明，肿瘤细胞可从胸腔积液以及肿瘤组织中直接扩增获得^4,5。此外，扩增后的肿瘤细胞系已被证实能够保留原始肿瘤的分子特征^4,5,6。

方案

本文所述所有方法均已获得德克萨斯大学MD安德森癌症中心机构审查委员会（IRB）的批准。这涉及在获得知情同意后，通过标准临床护理手术切除的恶性胸膜间皮瘤（MPM）肿瘤样本。

1. 肿瘤消化培养基及其他相关培养基的制备

1. 在超净工作台中，向500 mL无菌RPMI 1640培养基中加入5 mL 100%青霉素/链霉素（Pen/Strep），以配制肿瘤消化液。
   1. 将培养基转移至500 mL、0.22 µm聚醚砜（PES）无菌滤器中进行真空过滤。
      注意：过滤和抽吸步骤应使用75–150 torr的标准真空压力进行。
   2. 标记并注明肿瘤消化液的配制日期，于4 °C保存。
      注意：该培养基可在4 °C保存1个月。
2. 在超净工作台中，于50 mL锥形管内，向16.5 mL消化液中加入2.5 mL 3% I型胶原酶、1 mL 1.5 mg/mL透明质酸酶和20 µL 250,000 单位/mL DNA酶1，以配制用于肿瘤消化的酶混合液。
   注意：肿瘤消化用酶混合液总体积为20 mL；但每份肿瘤样本仅需10 mL。因此，剩余的酶混合液可于-20 °C保存以备后续使用。切勿反复冻融分装液。
3. 在超净工作台中，向500 mL无菌RPMI 1640培养基中加入5 mL 100%青霉素/链霉素和50 m....

结果

为确定早期传代培养物中的成纤维细胞污染情况，使用倒置相差显微镜观察细胞，以评估成纤维细胞相对于其他贴壁细胞的出现频率。 图1 显示成纤维细胞污染程度增加至80%的示例（图1A), 50% (图1B)，以及30%（图1C），与无成纤维细胞污染的培养物相比（图1D）。根据此视觉评估结果，按照上述方法调整扩增条件。一旦获得无支原体污染的培养物， <当建立10%的成纤维细胞污染后，采用流式细胞术测定间皮瘤肿瘤细胞系的纯度。

图2A、B展示了两个原代间皮瘤肿瘤细胞系（MESO171和MESO176）与ATCC建立的间皮瘤肿瘤细胞系（NCI-H2452和MSTO-211H）的代表性流式细胞术表面染色结.......

讨论

尽管该实验方案较为简单，但仍有一些关键步骤必须严格遵循。早期传代冻存对于保留肿瘤细胞富集过程的可重复性至关重要，以防初次尝试失败。通过肉眼评估成纤维细胞污染情况，以确定正确的传代和培养基饥饿技术，对于防止成纤维细胞在培养中过度生长至关重要。此外，差速胰酶消化法在孵育过程中需要对细胞进行仔细观察。细胞从培养皿表面脱落的速度可能不同，且不同细胞系之间存在差异。在学习和优化这一操作及决策步骤时，可将部分原始培养物保存在6孔板中，使用低血清饥饿培养基（含1%青霉素/链霉素和1%胎牛血清的RPMI 1640培养基），直至观察到肿瘤细胞的富集现象。

在已验证的间皮瘤肿瘤细胞系表型表征中，一个重要的因素是胰蛋白酶消化及蛋白酶-胶原酶混合液对间皮瘤肿瘤细胞表面标志物 N-钙黏蛋白表达的影响⁸。我们观察到，若使用这些酶进行细胞解离，会导致该表面标志物的丢失，此前已有相关报道⁹。尽管已有研究表明大多数表面蛋白不受胰蛋白酶的负面影响，但在设计流式抗体组合时，仍需对每个表面标志物进行单独验证

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 血清移液管	BD Falcon	357551
15 mL 圆底离心管	BD Falcon	352097
2 mL 吸液移液管	BD Falcon	357558
5 mL 血清移液管	BD Falcon	357543
50 mL 圆底离心管	BD Falcon	352098
6孔细胞培养板，经组织培养处理	Corning	3516
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	一种蛋白酶-胶原酶混合物，被认为在流式细胞术中更有效地保护表位。
anti-CD325 (N-钙黏蛋白) PE	Invitrogen	12-3259-42
anti-CD90 PE-Cy7	BD Biosciences	561558
抗间皮素 APC	Miltenyi	130-118-096
30% 牛血清白蛋白	Sigma	A8577-1L
无酶细胞解离缓冲液	Thermo Fisher Scientific	13151014
细胞筛（70 µm）	Greiner Bio-One	542-070
配备15 mL和50 mL转子的离心机
I型胶原酶	Sigma-Aldrich	C-0130	将1.5 g I型胶原酶溶解于100 mL无菌DMEM中，并分装为5 mL每份。做好标记后于-20 °C保存。
程序降温冻存盒	Thermo Fisher Scientific	15-350-50
冻存管	Thermo Fisher Scientific	5000-0020
CulturPlate-96	Packard Instrument Company	6005680	白色不透明96孔微孔板。
二甲基亚砜	Thermo Fisher Scientific	BP231-100
脱氧核糖核酸酶I（来源于牛胰腺）	Sigma-Aldrich	D4527	分装为50 μL每份，做好标记后于-20 °C保存。解冻后可于4 °C保存一个月。
1×杜氏磷酸盐缓冲液	Corning	21-031-CV
200度乙醇	Thermo Fisher Scientific	A4094
FACS管—带滤膜盖	BD Falcon	352235
胎牛血清	Gemini-Bio	100-106
GentleMACS C管	Miltenyi	130-093-237
带加热装置的GentleMACS Octo解离仪	Miltenyi	130-096-427	包含专用加热套筒，用于在解离过程中对C管加热。
山羊血清	Sigma-Aldrich	G9023	分装后于-20 °C保存。
Hank's平衡盐溶液，500 mL	Corning	MT21022CV
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H3506	将0.15 g透明质酸酶溶解于100 mL无菌DMEM中，并分装为1.0 mL每份。做好标记后于-20 °C保存。
倒置显微镜
层流罩
活/死细胞黄色染料	Life Technologies	L-34968
微量移液器吸头，20 µL	ART	2149P
微量移液器，0.5–20 µL
支原体检测试剂盒对照组	Lonza	LT07-518	将阳性对照分装后于-20 °C保存。
Mycoalert Plus支原体检测试剂盒	Lonza	LT07-710	将试剂和底物分装后于-20 °C保存。剩余缓冲液分装作为阴性对照，同样于-20 °C保存。
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710	通过PVDF注射器滤器（Millex货号SLVV033RS）过滤制备储备液，并在通风橱中分装。于-20 °C保存。
青霉素-链霉素溶液，10,000 U/mL	Gibco	15140-122
移液器辅助器
具备发光检测功能的酶标仪	BioTek	Synergy HT	任何满足此规格的酶标仪均可使用
RPMI 1640培养基	Corning	10-040-CV
手术刀	Andwin	2975#21
Stericup Quick Release-GP 无菌真空过滤系统，0.22 µm PES Express PLUS，500 mL	EMD Millipore	S2GPU05RE
Steriflip-GP 滤器，0.22 µm PES Express PLUS，50 mL	EMD Millipore	SCGP00525
无菌镊子	Thermo Fisher Scientific	12-000-157
T25细胞培养瓶，经组织培养处理	Corning	430639
T75细胞培养瓶，经组织培养处理	Corning	430641U
0.4% 台盼蓝溶液	Gibco	15250-061
0.05% 胰蛋白酶-EDTA溶液	Corning	25-052-CI
ViaStain吖啶橙/碘化丙啶（AO/PI）溶液	Nexcelom	CS2-0106-5ML