Summary
Целью данного метода является демонстрация надежной и воспроизводимой методологии обогащения, генерации и расширения первичных линий опухолевых клеток из хирургически резецированной мезотелиомы плевры.
Abstract
Современные методологии расширения линий первичных опухолевых клеток из редких типов опухолей отсутствуют. Этот протокол описывает методы расширения первичных опухолевых клеток из хирургически резецированной злокачественной мезотелиомы плевры (MPM), предоставляя полный обзор процесса от пищеварения до обогащения, расширения, криоконсервации и фенотипической характеристики. Кроме того, этот протокол вводит концепции для генерации опухолей, которые могут быть полезны для нескольких типов опухолей, таких как дифференциальная трипсинизация и влияние методов диссоциации на обнаружение маркеров клеточной поверхности для фенотипической характеристики. Основным ограничением этого исследования является отбор опухолевых клеток, которые будут расширяться в двумерной (2D) системе культур. Вариации этого протокола, включая трехмерные (3D) системы культивирования, добавки для среды, покрытие пластин для улучшения адгезии и альтернативные методы дезагрегирования, могут улучшить этот метод и общий показатель успеха создания опухолевой линии. В целом, этот протокол обеспечивает базовый метод для установления и характеристики опухолевых клеток из этой редкой опухоли.
Introduction
Злокачественная мезотелиома плевры (МПМ) является редкой опухолью, тесно связанной с воздействием асбеста. Хотя подходы, основанные на иммунотерапии, показали обнадеживающие результаты, существует нехватка вариантов лечения, доступных для пациентов, у которых развивается это заболевание, а общая 5-летняя выживаемость составляет 1,2. В настоящее время в нескольких учреждениях предпринимаются усилия по лучшему пониманию этого заболевания и выявлению новых терапевтических целей, которые могут улучшить результаты лечения пациентов. Хотя существует несколько моделей мезотелиомы мыши, доступ к первичным опухолевым клеткам мезотелиомы более ограничен3. Расширение in vitro опухолевых клеток первичной мезотелиомы обеспечит ценную модельную систему, которая может быть использована для непосредственного изучения опухолевых клеток и их взаимодействия с аутологичными иммунными клетками, такими как инфильтрирующие опухоль лимфоциты. Хотя были сообщения о расширении линий первичных опухолевых клеток мезотелиомы, они немногочисленны и не предоставляют подробной стандартной процедуры операции (SOP). Кроме того, несколько клеточных линий доступны из коммерческих источников, таких как American Type Culture Collection (ATCC). Хотя доступность первичных опухолевых линий ограничена, было продемонстрировано, что опухолевые клетки могут быть расширены из плевральных выпотов и непосредственно из опухолевой ткани 4,5. Кроме того, было показано, что расширенные линии опухолевых клеток сохраняют молекулярный профиль исходной опухоли 4,5,6.
Наша лаборатория изучает опухоле-иммунную микросреду MPM и разработала метод расширения линий первичных опухолевых клеток MPM из хирургически резецированных случаев. Этот метод адаптирован из нашего опыта в установлении первичных метастатических меланомных опухолевых клеточных линий. Целью данной работы является предоставление подробного, практического подхода к расширению линии первичной опухоли мезотелиомы с использованием системы 2D-моделей и последующего фенотипического профилирования. Учитывая недавний успех стратегий блокады контрольных точек, нацеленных на CTLA4 и PD-1 в условиях первой линии2, способность генерировать множество первичных опухолевых линий может способствовать пониманию обоих внутренних механизмов резистентности опухоли, а также обеспечить важную модельную систему для оценки распознавания Т-клеток, тем самым углубляя наше понимание иммунного ответа в MPM.
Основным ограничением этого протокола является то, что каждая опухоль содержит различную микросреду, и существует высокая степень вариабельности успеха расширения. Кроме того, этот метод подбирает для опухолевых клеток, которые могут расширяться в системе 2D-культуры. Другие методы, которые включают производство 3D-сфероида или органоидной культуры, могут обеспечить альтернативный подход, который может обеспечить более высокую скорость успеха расширения или привести к способности выводить клеточные линии, которые не могут расширяться в традиционной 2D-системе. Было продемонстрировано, что такие 3D-культуры полезны для генерации типов опухолей, которые трудно расширить, например, рака поджелудочной железы7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Советом по обзору учреждений (IRB) Онкологического центра Андерсона при Техасском университете. Это относится к стандартным, хирургически резецированным опухолям MPM, удаленным после информированного согласия.
1. Подготовка опухолевых сред пищеварения и других связанных с ними сред
- Чтобы подготовить опухолевую среду для пищеварения, добавьте 5 мл 100% Pen/Strep (Пенициллин/Стрептомицин) к 500 мл стерильной среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 в ламинарной вытяжке.
- Перенесите среду в стерильный фильтр 500 мл, 0,22 мкм полиэфирсульфона (PES) для вакуумной фильтрации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы фильтрации и аспирации должны выполняться при стандартном вакуумном давлении 75-150 торр. - Маркируйте и датируйте среду пищеварения опухоли и храните ее при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Носитель может храниться в течение 1 месяца при температуре 4 °C.
- Перенесите среду в стерильный фильтр 500 мл, 0,22 мкм полиэфирсульфона (PES) для вакуумной фильтрации.
- Для приготовления ферментативного коктейля, переваривающего опухоль, добавляют 2,5 мл 3% коллагеназы типа 1, 1 мл 1,5 мг/мл гиалуронидазы, 20 мкл 250 000 единиц/мл ДНК от 1 до 16,5 мл среды пищеварения в конической трубке объемом 50 мл в ламинарной вытяжке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем переваривающего опухоль ферментативного коктейля составляет 20 мл; однако на образец опухоли требуется только 10 мл. Таким образом, оставшийся коктейль можно хранить при -20 °C до тех пор, пока это не понадобится. Не замораживайте аликвоты повторно. - Чтобы подготовить полную опухолевую среду, добавьте 5 мл 100% Pen/Strep и 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) к 500 мл стерильного RPMI 1640 в ламинарной вытяжке.
- Переведите среду в стерильный фильтр PES объемом 500 мл, 0,22 мкм для вакуумной фильтрации.
- Маркируйте и датируйте полную опухолевую среду и храните ее при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Носитель может храниться в течение 1 месяца при температуре 4 °C.
- Чтобы подготовить восстановленную сывороточную среду для голодания, добавьте 5 мл 100% Pen/Strep и 5 мл FBS до 500 мл стерильного RPMI 1640 в ламинарную проточную вытяжку.
- Переведите среду в стерильный фильтр PES объемом 500 мл, 0,22 мкм для вакуумной фильтрации.
- Нанесите этикетку и датируйте среду с восстановленной сывороткой и храните при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Носитель может храниться в течение 1 месяца при температуре 4 °C.
- Чтобы приготовить морозильную среду, добавьте 5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) к 45 мл FBS в ламинарной проточной вытяжке.
- Переведите среду в 50 мл, 0,22 мкм PES стерильный фильтр для вакуумной фильтрации.
- Этикетка и дата пяти конических трубок по 15 мл.
- Переложите 10 мл морозильной среды в каждую трубку и храните трубки при -20 °C.
- Чтобы подготовить среду без антибиотиков для тестирования микоплазмы, добавьте 50 мл FBS к 500 мл стерильного RPMI 1640 в ламинарную вытяжку.
- Переведите среду в 50 мл, 0,22 мкм PES стерильный фильтр для вакуумной фильтрации.
- Маркируйте и датируйте среду, свободную от антибиотиков, и храните ее при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Носитель может храниться в течение 1 месяца при температуре 4 °C.
- Чтобы подготовить флуоресцентно-активированный буфер сортировки клеток (FACS) для фенотипического анализа, добавьте 16,6 мл стерильного бычьего сывороточного альбумина к 500 мл стерильного 1x фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) в ламинарный проточный капюшон.
- Маркируйте и датируйте буфер FACS и храните его при температуре 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер FACS не требует стерилизации фильтра, если оба компонента хранятся стерильными. Буфер FACS может храниться до вскрытия в течение 6 месяцев при 4 °C.
- Маркируйте и датируйте буфер FACS и храните его при температуре 4 °C.
2. Переваривание опухолевой ткани
- Переведите 10 мл переваривающего опухоль ферментативного коктейля со стадии 1.2 в диссоциационную трубку.
- Перенесите кусочек опухолевой ткани в стерильную 6-луночную пластинчатую крышку с помощью стерильного скальпеля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество среды, которое переносится с опухолевой тканью, достаточно для обработки.- Удалите всю жировую ткань, некротическую ткань и / или сгустки крови с помощью нового стерильного скальпеля и щипцов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жировая ткань обычно желтоватая по внешнему виду и полутвердая. Некротическая ткань темнее окружающих тканей по внешнему виду и очень мягкая; как жировая, так и некротическая ткань будет легко распадаться. Кровавая ткань кажется ярко-красной и может выпускать кровь в среду при манипулировании. После удаления полученная опухолевая ткань должна сохранять форму и быть бледной или розовой, в зависимости от типа ткани. - Разрезают всю опухолевую ткань на 1 мм3 небольших фрагмента. Чтобы ткань не пересыхала, добавьте 500 мкл стерильного 1x сбалансированного солевого раствора Хэнка (HBSS) в опухолевую ткань.
- Удалите всю жировую ткань, некротическую ткань и / или сгустки крови с помощью нового стерильного скальпеля и щипцов.
- Перенос опухолевых фрагментов в диссоциационную трубку, содержащую 10 мл переваривающего опухоль ферментативного коктейля (этап 2.1). Плотно закройте трубку, поместите ее колпачком вниз на тканевый диссоциатор и добавьте нагревательный аппарат, наложив его как рукав на диссоциационную трубку и надавив, чтобы щелкнуть его на месте.
ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная емкость для каждой пробирки составляет 4 г опухоли и объем 10 мл. - Выберите предварительно запрограммированную настройку на 37C_h_TDK_1 диссоциатора. Проверьте состояние через 10 минут, чтобы убедиться, что нет ошибки засорения, как указано мигающим красным светом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта программа обрабатывается при 1,865 об/мин в течение 1 ч с температурой при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если происходит засорение, удалите диссоциационную трубку и вручную закрутите ее, чтобы выбить любую ткань, попавшую в крышку; затем замените трубку на диссоциатор и возобновите программу. - После 1-часового пищеварения снимите диссоциационную трубку и поместите ее в ламинарную вытяжку. Отфильтруйте переваренную опухоль, поместив 70-мкм клеточный ситечко поверх конической трубки объемом 50 мл и пипеткой переваренной опухоли с помощью пипетки объемом 10 мл на фильтр. Если фильтр засоряется, переключитесь на новый фильтр.
- Промыть диссоциационную трубку 10 мл свежей опухолевой среды пищеварения и пропустить промывку через фильтр.
- Снимите фильтр 70 мкм и выбросьте его.
- Доведите общий объем до 40 мл с опухолевой средой пищеварения.
- Центрифуга при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Используя аспирационную пипетку объемом 2 мл, прикрепленную к вакуумному источнику, аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу, и повторно суспендируйте клетки, используя 10 мл стерильной полной опухолевой среды.
- Повторите шаг 2.6.
- Аспирировать супернатант, как описано в шаге 2.7. Повторно суспендировать клетки в 3 мл стерильной полной опухолевой среды и перенести клеточную суспензию в одну лунку стерильной 6-луночной пластины.
- Держите пластину в инкубаторе при 37 °C с 5% CO2.
- Через 24 ч перенести использованную среду из переваренной опухоли в 1 лунку в новую лунку (скважину 2) в ту же 6-луночную пластину. Добавьте 3 мл стерильной полной опухолевой среды в хорошо 1.
- Перенесите использованную среду из скважин 1 и 2 и соедините в скважину 3 в той же 6-луночной плите через 24 ч после шага 2.11. Добавьте 3 мл стерильной полной опухолевой среды в лунки 1 и 2.
- Аспирировать среду из всех 3 лунок и пипетки по 3 мл полной опухолевой среды в каждую лунку через 48 ч после шага 2.12.
3. Генерация первичной линии опухолевых клеток
- С помощью инвертированного фазового микроскопа определяют процент загрязнения фибробластами в культуре раннего прохождения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фибробласты, как правило, длинные и нерегулярные и имеют плохо определенную клеточную мембрану. Они кажутся тонкими или плоскими на шкале Z.- Если загрязнение фибробластами превышает 20% клеток в культуре раннего прохождения, продолжайте культивирование после замены полной среды восстановленной сывороточной средой.
- Повторяют замену уменьшенной сывороточной средой на стадии 3,1,1 два раза в неделю в течение 3-4 недель.
- Когда культура достигает 80% сливания, пропускают клетки, расщепляя 50:50 на 2 новые лунки из 6-луночной пластины. Продолжайте прохождение 50:50 в восстановленных сывороточных средах, как только клетки достигнут 80% конфлюентности.
- Повторяйте шаг 3.1.3 в течение 4 недель, проходя в более крупные колбы для культивирования по мере необходимости, раскалывая 50:50, как только культура достигает 80% слива. Если популяция фибробластов не уменьшается до 10% или менее, перейдите к шагу 3.2, чтобы попытаться использовать метод дифференциальной трипсинизации для удаления загрязнения фибробластами. В противном случае перейдите к шагу 3.3.
- Чтобы обогатить опухолевые клетки, аккуратно промойте лунку 1x PBS, чтобы удалить среду, содержащую сыворотку.
- Добавьте трипсин следующим образом: 1 мл на лунку, если в 6-луночной пластине, 2 мл для колбы T25, 3 мл для колбы T75.
- Поместите 6-луночную пластину или колбу в инкубатор при 37 °C в течение 1 мин. Извлеките пластину или колбу из инкубатора и проверьте адгезию клеток с помощью перевернутого микроскопа. Если клетки частично поднимаются или плавают, осторожно удалите взвешенные клетки и только трипсин. Поместите клетки в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую равный или больший объем полной опухолевой среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта частичная коллекция ячеек, основанная на адгезионных свойствах, является первой из нескольких фракций. - Повторяйте шаги 3.2.1 и 3.2.2 до тех пор, пока не будут подняты все ячейки или не будут удалены 4 фракции.
- Центрифугировать все независимые фракции при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирировать супернатант, как описано на этапе 2.7, и повторно суспендировать клетки, используя 5 мл стерильной, восстановленной сывороточной среды.
- Поместите ячейки в колбу T25 для каждой фракции и поместите колбы в инкубатор при 37 °C.
- Оцените культуру через 48 ч, чтобы определить, какая фракция обогащена опухолевыми клетками по сравнению с фибробластами. Откажитесь от колб, богатых фибробластами. Если контаминация фибробластов составляет <10%, продолжайте расширение в полной опухолевой среде и переходите к шагу 4. Если загрязнение фибробластами составляет 10-30%, повторите шаги 3.1.2-3.1.4. Если загрязнение фибробластами превышает 30%, повторите шаги 3.2-3.2.7.
- Если в культуре раннего прохождения обнаружено мало или вообще нет фибробластов, продолжайте прохождение клеток в полной опухолевой среде, расщепляя 50:50, как только клетки на 80% сливаются в их 6-луночную пластину или колбу.
4. Расширение линии первичных опухолевых клеток раннего прохождения
- Как только первичная опухолевая культура содержит 10% или менее загрязнения фибробластами, аспирируйте среду и заменяйте ее стерильной полной опухолевой средой два раза в неделю.
ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный объем среды для T25 составляет 5 мл; T75 составляет 12 мл; T150 составляет 25 мл.- Переместите культуру 50:50 в более крупные колбы по мере необходимости, как только она достигнет 80% слияния в пластине или колбе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Культуру, возможно, потребуется пройти с более высоким соотношением в зависимости от ее роста. Отрегулируйте так, чтобы культура достигала 80% сливания каждые 3-5 дней.
- Переместите культуру 50:50 в более крупные колбы по мере необходимости, как только она достигнет 80% слияния в пластине или колбе.
- Проход до тех пор, пока культура не окажется в отрывке 4 или выше. Как только культура на 80% сольется как минимум в две колбы T75, перейдите к шагу 5.
5. Характеристика и хранение установленной первичной линии опухолевых клеток
- Криоконсервируйте одну колбу T75 в качестве ранней заморозки. Для тестирования микоплазмы оставшихся колб T75 перейдите к шагу 5.2.
- Для криоконсервации клеток раннего прохода размораживают 1 пробирку аликвотированной морозильной среды, приготовленной на стадии 1.5.
- Соберите клетки путем трипсинизации, сначала промыв пластину 1x PBS, как описано на этапе 3.2, и добавив трипсин, как описано в шаге 3.2.1.
- Поместите колбу в инкубатор при 37 °C на 3 мин. Извлеките колбу из инкубатора и проверьте адгезию клеток с помощью перевернутого микроскопа. Если клетки поднимаются или плавают, осторожно удалите взвешенные клетки и трипсин. Поместите клетки в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую равный или больший объем полной опухолевой среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки остаются адгезионными через 3 мин, поместите колбу обратно в инкубатор еще на 2 мин. - Хорошо перемешайте трубку путем пипетки аккуратно и удалите 20 мкл для подсчета.
- Центрифугируют пробирку при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Пока клетки вращаются, подсчитывайте, используя лабораторный протокол подсчета, такой как трипан синий или акридин оранжевый / йодид пропидия (AO / PI).
- Повторное суспендирование клеток после центрифугирования в морозильной среде с минимум 2 × 106 клеток /1 мл замороженной среды.
- Переведите 1 мл клеточной суспензии со стадии 5.1.7 на предварительно маркированные криовиалы объемом 1,5 мл.
- Поместите криовиалы в камеру замораживания с контролируемой скоростью и немедленно перенесите их при -80 °C.
- Храните клетки при -80 °C в течение 1 недели, прежде чем перенести их в жидкий азот для длительного хранения.
- Разделите колбу T75 50:50 для тестирования микоплазмы. Замените среду на среду без антибиотиков, приготовленную на этапе 1.6.
- Через 72 ч разморозьте реагент обнаружения микоплазмы, субстрат и контроль при комнатной температуре в течение 15 мин перед тестированием.
- Соберите 1 мл супернатанта из каждой культуры, подлежащей тестированию, и поместите его в коническую трубку объемом 15 мл.
- Гранулируют любые взвешенные ячейки путем центрифугирования супернатанта при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Загрузите 100 мкл проб супернатантов и элементов управления в белую 96-луночную пластину. Добавьте 100 мкл реагента для обнаружения микоплазмы к каждому образцу и контролю.
- Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Поместите пластину в считыватель пластин и прочитайте люминесценцию (чтение A, т.е. первое чтение).
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол производителя набора микоплазмы указывает на сохранение настроек по умолчанию на многофункциональных считывателях пластин. Считывание устанавливается в конечной точке люминесценции со временем интеграции 1 с и усилением 135. Считыватель пластин использует процедуру автоматического масштабирования для оптимизации сигнала усиления для каждого эксперимента. Время интеграции 1 с является стандартным по умолчанию. Обе настройки используются для регулировки интенсивности люминесцентного сигнала, интерпретируемого считывателем пластин, и, возможно, их потребуется отрегулировать в зависимости от отдельного считывателя пластин. - Снимите пластину со считывателя пластин и добавьте 100 мкл субстрата для обнаружения микоплазмы к каждому образцу и контрольной группе.
- Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Поместите пластину в считыватель пластин и считывайте люминесценцию (чтение B, т.е. второе чтение).
- Для определения положительности микоплазмы определяют соотношение чтения В к чтению А.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициенты позитивности микоплазмы описаны в протоколе производителя набора микоплазмы. Показания A и B приобретаются с одинаковыми настройками и просто отражают порядок чтения.- Рассмотрим соотношение < 1 как микоплазмоотрицательное.
- Считайте соотношение 1-1,2 неубедительным и повторите шаг 5,2.
- Считать соотношение > 1,2 микоплазмо-положительным и контролировать эту культуру; при необходимости прекратить использование языка и региональных параметров.
- Характеристика проточной цитометрии микоплазмоотрицательных опухолевых клеток
- Вытесняйте опухолевые клетки с помощью буфера диссоциации клеток.
- Подсчитайте ячейки и повторно суспендируйте ячейки при 1 × 106/мл в буфере FACS с шага 1.7.
- Удалите 100 мкл клеточной суспензии в отдельные пробирки для окрашивания поверхности.
- Центрифуга при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирировать супернатант и блокировать Fc-рецепторы путем инкубации клеток в 500 мкл 5% козьей сыворотки в буфере FACS при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Добавьте 2 мл буфера FACS и центрифугируйте суспензию при 500 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Аспирировать супернатант и добавить поверхностную пятнистую смесь антител (табл. 1) и буфер FACS так, чтобы конечный объем составлял 100 мкл. Накройте образцы и окрашивайте их на льду в течение 30 мин.
- Повторите шаг 5.3.6.
- Аспирировать супернатант и зафиксировать клетки путем повторного использования в 200 мкл 1% параформальдегида (PFA) плюс 0,25% EtOH. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 мин с образцами, защищенными от света.
- Повторите шаг 5.3.6. Повторное суспендирование клеток в 200 мкл буфера FACS для получения с помощью соответствующего проточного цитометра.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидается, что опухолевые клетки мезотелиомы будут положительными для мезотелина и N-кадгерина. Некоторые могут также экспрессировать CD90.
- Расширяйтесь в полной опухолевой среде и банке, как описано в шагах 4.1 и 5.1 соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы определить загрязнение фибробластами культур раннего прохождения, клетки оценивают с использованием инвертированного фазового микроскопа для определения частоты фибробластов относительно других присутствующих адгезивных клеток. На рисунке 1 показаны примеры увеличения загрязнения фибробластами на 80% (рисунок 1A), 50% (рисунок 1B) и 30% (рисунок 1C) по сравнению с культурой без загрязнения фибробластами (рисунок 1D). На основе этой визуальной оценки вносятся коррективы в условия расширения, как описано выше. Как только установлена культура без микоплазмы с загрязнением <10% фибробластов, для определения чистоты линии опухоли мезотелиомы используется проточная цитометрия.
На рисунке 2A,B показано репрезентативное окрашивание поверхности проточной цитометрии двух первичных линий опухоли мезотелиомы (MESO171 и MESO176) по сравнению с установленными ATCC линиями опухоли мезотелиомы (NCI-H2452 и MSTO-211H) с линией опухоли меланомы (MEL526) в качестве отрицательного контроля. Опухолевые клетки мезотелиомы могут экспрессировать мезотелин (рисунок 2A) и N-кадгерин (рисунок 2B). Подробная информация, относящаяся к используемой панели проточной цитометрии, приведена в таблице 1. Стратегия гаширования показана на дополнительном рисунке 1. Следует отметить, что CD90 не может быть использован в качестве фибробласт-специфического маркера, поскольку он также может быть экспрессирован опухолевыми клетками мезотелиомы. Важность тестирования влияния ферментативной отслойки на экспрессию поверхностных белковых маркеров также показана, поскольку как трипсин, так и смесь протеазы-коллагеназы привели к потере поверхностной экспрессии N-кадгерина (рисунок 2C), в то время как CD90 не подвергался воздействию (рисунок 2D).
Рисунок 1: Репрезентативные изображения возрастающей частоты загрязнения фибробластов в культурах раннего пассажа и установленная опухолевая линия. (А) изображение культуры раннего прохождения, содержащей 80% загрязнения фибробластами. (B) Изображение культуры раннего прохождения, содержащей 50% загрязнения фибробластами. (C) Изображение культуры раннего прохождения, содержащей 30% загрязнения фибробластами. (D) Изображение установленной первичной линии опухоли мезотелиомы. Шкала = 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Фенотипирование репрезентативной проточной цитометрии установленной клеточной линии опухоли мезотелиомы. (A и B) Гистограммы, показывающие картину поверхностной экспрессии мезотелина и N-кадгерина на клеточных линиях мезотелиомы ATCC, линии опухоли контрольной меланомы и первичных опухолевых линиях мезотелиомы. (С и D) Влияние трипсина, смеси протеазы-коллагеназы и буфера диссоциации клеток на N-кадгерин и CD90. Сокращения: Comp-X-A = компенсированная площадь флуорофора X; ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Поверхностные антитела | Канал Фортесса X20 | Лазер | Клон | Изотип | Объем/ Образец (мкл) |
| Живой/Мертвый Желтый | БВ510 | ФИОЛЕТОВЫЙ | Н/Д | Н/Д | 1 |
| антимезотелинный БТР | БТР | Красный | РЭА1057 | ИгГ1 | 2 |
| анти-CD325 (N-Кадерин) ПЭ | ЧП | ЮГ | 8С11 | ИгГ1 | 5 |
| анти-CD90 PE-Cy7 | ПЭ-Ци7 | ЮГ | 5Э10 | ИгГ1 | 5 |
Таблица 1: Проточная цитометрия антитела, используемые для фенотипирования опухолевых линий. Сокращения: ПЭ = фикоэритрин; APC = аллофикоцианин.
Дополнительный рисунок S1: Стратегия гейтинга для фенотипического анализа опухолевых линий. Точечные графики показаны для каждого шага в стратегии гатинга, ведущего к оценке выражения маркеров интереса. Любой начальный затвор, использующий свойства прямого рассеяния и бокового рассеяния, предназначен для идентификации интересующих ячеек, за которым следует затвор QC на основе временного признака. Затем ячейки подвешиваются для удаления любых дублетов с использованием свойств прямого и бокового рассеяния. Окончательный затвор QC основан на жизнеспособности, при этом мертвые клетки окрашиваются положительно для красителя. Следуя за воротами жизнеспособности, подложка может быть выполнена на основе панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя этот протокол прост, есть несколько критических шагов, которые необходимо тщательно соблюдать. Замораживание раннего прохождения важно для сохранения способности повторять процесс обогащения опухолевых клеток, если изначально безуспешный. Способность оценивать фибробластное загрязнение глазами для принятия решения о правильном методе расщепления и голодания среды имеет жизненно важное значение для предотвращения чрезмерного роста фибробластов в культуре. Кроме того, метод дифференциальной трипсинизации требует тщательного наблюдения за клетками во время инкубации. Клетки могут отрываться от пластиковой пластины с разной скоростью, и это будет варьироваться от клеточной линии к клеточной линии. Изучая этот процесс и совершенствуя этот этап принятия решений, часть исходной культуры может быть сохранена в 6-луночной пластине с использованием среды голодания с восстановленной сывороткой (RPMI 1640 с 1% Pen/ Strep и 1% FBS) до тех пор, пока не будет наблюдаться обогащение опухолевых клеток.
Одним из важных факторов, отмеченных в подтвержденной фенотипической характеристике линий опухоли мезотелиомы, было влияние трипсинизации и смеси протеазы-коллагеназы на экспрессию маркера поверхности опухолевых клеток мезотелиомы, N-кадгерина8. Мы наблюдали потерю поверхностного маркера, если клетки были отделены с помощью этих ферментов, что было ранее описано9. Хотя было показано, что на большинство поверхностных белков трипсин не оказывает негативного влияния, важно проверить каждый поверхностный маркер во время проектирования проточной панели10. Кроме того, настоятельно рекомендуется культивировать или расширять опухолевые клетки до тех пор, пока клетки не достигнут логарифмической фазы расширения и не успеют переэкспрессировать эти маркеры. Использование клеточной диссоциационной среды позволило сохранить экспрессию N-кадгерина для обнаружения с помощью проточной цитометрии. Другие типы диссоциационных сред также могут допускать удержание маркеров; однако отдельные лаборатории должны тщательно протестировать эти среды перед созданием панели проточной цитометрии.
Основным ограничением этого исследования является то, что вероятность успеха создания клеточной линии составляет всего 50%. Это может быть связано с гетерогенной природой микроокружения опухоли. Пути улучшения этого процесса могут включать использование систем 3D-культивирования, добавление добавок среды для содействия расширению опухолевых клеток, улучшенные методы дезагрегации, использование ксенотрансплантатов, полученных от пациента, или покрытие пластин для улучшения адгезии опухолевых клеток11. Действительно, было показано, что 3D-культуры успешны в генерации сложных линий опухолевых клеток, таких как рак поджелудочной железы7.
Одним из способов отбора, который не включен в этот протокол, является обогащение опухолевых клеток путем сортировки клеток на основе опухолевого маркера мезотелиомы, такого как мезотелин. Поскольку опухолевые клетки мезотелиомы могут экспрессировать стандартный маркер фибробластов, CD90, положительный отбор может быть лучшей альтернативой. Предостережением к этому методу является низкая степень клеточности в ранних культурах, что потребовало бы сортировки в небольшую объемную многоядерную пластину, такую как пластина из 384 или 96 скважин. Кроме того, поскольку этот протокол включает использование коллагеназы для переваривания тканей, неизвестно, может ли это также влиять на поверхностную экспрессию N-кадгерина или мезотелина. Хотя механизм экспрессии мезотелина относительно неизвестен, N-кадгерин играет важную роль в клеточной адгезии, и удаление этого белка может негативно повлиять на создание опухолевой линии12. В настоящее время проводится оценка этого показателя.
Этот метод имеет большое значение, поскольку он позволяет генерировать модельную систему in vitro для изучения этого редкого типа опухоли. Это может включать исследования, идентифицирующие новые поверхностные мишени мезотелиомы, такие как мезотелин с CAR-T-клетками, и выявление присущих опухоли свойств резистентности к таргетной или иммунотерапии. Кроме того, если эти клетки могут быть расширены in vivo в мышиных моделях, это также создаст источник для тестирования клеточных и антител, а также малых молекул. Будущим направлением для этого протокола будет тестирование способности расширять другие подтипы MPM, такие как саркоматоидные и двухфазные подмножества.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
CH является членом SAB для Briacell Therapeutics и Фонда прикладных исследований мезотелиомы. Всем остальным авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Ракель Лаза-Бривьеска за ее вклад в запуск этого протокола, а также докторов Бориса Сепеси, Резу Мехран и Дэвида Райса за сотрудничество в области коллекций тканей. Никакого дополнительного финансирования, связанного с этой работой, нет.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mL serological pipettes | BD Falcon | 357551 | |
| 15 mL conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| 2 mL aspirating pipettes | BD Falcon | 357558 | |
| 5 mL serological pipettes | BD Falcon | 357543 | |
| 50 mL conical tubes | BD Falcon | 352098 | |
| 6-well microplates, tissue culture treated | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | A protease-collagenase mixture considered to be more effective in preserving epitopes for flow cytometry. |
| anti-CD325 (N-Cadherin) PE | Invitrogen | 12-3259-42 | |
| anti-CD90 PE-Cy7 | BD Biosciences | 561558 | |
| anti-Mesothelin APC | Miltenyi | 130-118-096 | |
| Bovine Serum Albumin 30% | Sigma | A8577-1L | |
| Cell Dissociation buffer, enzyme-free | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Cell strainer (70 µm) | Greiner Bio-One | 542-070 | |
| Centrifuge with 15 mL and 50 mL adaptors | |||
| Collagenase Type 1 | Sigma-Aldrich | C-0130 | Dissolve 1.5 g of Collagenase type I into 100 mL of sterile DMEM and aliquot in 5 mL volumes. Label well and store at -20 °C. |
| Controlled-rate freezing chamber | Thermo Fisher Scientific | 15-350-50 | |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 5000-0020 | |
| CulturPlate-96 | Packard Instrument Company | 6005680 | White, opaque 96-well microplate. |
| Dimethyl sulfoxide | Thermo Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DNAse I (from bovine pancreas) | Sigma-Aldrich | D4527 | Aliquot at 50 μL, label well and store at -20 °C. After thawing, keep at 4 °C for up to 1 month. |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline solution 1x | Corning | 21-031-CV | |
| Ethanol 200 proof | Thermo Fisher Scientific | A4094 | |
| FACS tubes-filter top | BD Falcon | 352235 | |
| Fetal bovine serum | Gemini-Bio | 100-106 | |
| GentleMACS C-tubes | Miltenyi | 130-093-237 | |
| GentleMACS Octo-dissociator with heater apparatus | Miltenyi | 130-096-427 | Includes specialized heater apparatus sleeves used to apply heat to the C-tubes during dissocation. |
| Goat serum | Sigma-Aldrich | G9023 | Aliquot and store at -20 °C. |
| Hank's Balanced Salt solution, 500 mL | Corning | MT21022CV | |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | Dissolve 0.15 g of Hyaluronidase into 100 mlLof sterile DMEM and distribute into 1.0 mL aliquots. Label well and store at -20 °C. |
| Inverted-phase microscope | |||
| Laminar flow hood | |||
| Live/dead yellow dye | Life Technologies | L-34968 | |
| Micropipettor tips, 20 µL | ART | 2149P | |
| Micropipettor, 0.5-20 µL | |||
| Mycoalert assay control set | Lonza | LT07-518 | Aliquot positive controls and store at -20 °C. |
| Mycoalert Plus mycoplasma detection kit | Lonza | LT07-710 | Aliquot reagent and substrate and store at -20 °C. Save remaining buffer and aliquot for negative control and store at -20°C. |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Prepare stock by filtering through a PVDF syringe filter (Millex cat. no. SLVV033RS) and aliquot under a fume hood. Store at -20 °C. |
| Penicillin-streptomycin 10,000 U/mL | Gibco | 15140-122 | |
| Pipet aid | |||
| Plate reader with luminescent capabilities | BioTek | Synergy HT | any plate reader with these specifications can be used |
| RPMI 1640 media | Corning | 10-040-CV | |
| Scalpel | Andwin | 2975#21 | |
| Stericup Quick Release-GP sterile vacuum filtration system, 0.22 µm PES Express PLUS, 500 mL | EMD Millipore | S2GPU05RE | |
| Steriflip-GP filter, 0.22 µm PES Express PLUS, 50 mL | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile forceps | Thermo Fisher Scientific | 12-000-157 | |
| T25 flasks, tissue culture treated | Corning | 430639 | |
| T75 flasks, tissue culture treated | Corning | 430641U | |
| Trypan blue solution 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin EDTA 0.05% | Corning | 25-052-CI | |
| ViaStain acridine orange/propidium iodide (AO/PI) solution | Nexcelom | CS2-0106-5ML |
References
- Guzman-Casta, J., et al. Prognostic factors for progression-free and overall survival in malignant pleural mesothelioma. Thoracic Cancer. 12 (7), 1014-1022 (2021).
- Baas, P., et al. First-line nivolumab plus ipilimumab in unresectable malignant pleural mesothelioma (CheckMate 743): a multicentre, randomised, open-label, phase 3 trial. Lancet. 397 (10272), 375-386 (2021).
- Testa, J. R., Berns, A.
- Usami, N., et al. Establishment and characterization of four malignant pleural mesothelioma cell lines from Japanese patients. Cancer Science. 97 (5), 387-394 (2006).
- Kobayashi, M., Takeuchi, T., Ohtsuki, Y. Establishment of three novel human malignant pleural mesothelioma cell lines: morphological and cytogenetical studies and EGFR mutation status. Anticancer Research. 28 (1), 197-208 (2008).
- Chernova, T., et al. Molecular profiling reveals primary mesothelioma cell lines recapitulate human disease. Cell Death and Differentiation. 23 (7), 1152-1164 (2016).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Han, A. C., et al. Differential expression of N-cadherin in pleural mesotheliomas and E-cadherin in lung adenocarcinomas in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Human Pathology. 28 (6), 641-645 (1997).
- Tachibana, K. N-cadherin-mediated aggregate formation; cell detachment by Trypsin-EDTA loses N-cadherin and delays aggregate formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (2), 414-418 (2019).
- Donnenberg, V. S., Corselli, M., Normolle, D. P., Meyer, E. M., Donnenberg, A. D. Flow cytometric detection of most proteins in the cell surface proteome is unaffected by trypsin treatment. Cytometry A. 93 (8), 803-810 (2018).
- Pham, K., et al. Isolation of pancreatic cancer cells from a patient-derived xenograft model allows for practical expansion and preserved heterogeneity in culture. American Journal of Pathology. 186 (6), 1537-1546 (2016).
- Derycke, L. D., Bracke, M. E. N-cadherin in the spotlight of cell-cell adhesion, differentiation, embryogenesis, invasion and signalling. International Journal of Developmental Biology. 48 (5-6), 463-476 (2004).
